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Biology

를 사용하여 모델 단백질로 비정규 아미노산의 잔류 특정 법인 설립 Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54273
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Experimental Physics, Saarland University, 2Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy, University of Minnesota

Abstract

아미노산의 표준 세트는 단백질 기능의 매우 넓은 범위로 이어집니다. 그럼에도 불구하고, 잔기의 집합은 여전히​​ 잠재적 단백질 응용에 한계를 부과한다. 비정규 아미노산의 혼입이 범위를 확대 할 수있다. 비정규 아미노산의 혼입이 상보적인 방식이있다. 부위 - 특이 적 결합을 위해, 내인성 표준 병진 기계 외에, 직교 아미노 아실 tRNA의 신테-tRNA의 쌍은 표준들과 상호 작용하지 않도록 제공되어야한다. 결과적으로, 정규의 아미노산, 일반적으로 종결 코돈에 할당되지 않은 코돈은 또한 요구된다. 이 유전자 코드 확장 단백질 내 단일의 특정 부위에서 비정규 아미노산의 혼입을 가능하게한다. 여기에 제시된 연구는 유전자 코드가 내생 번역 시스템 내에서 재 할당되는 잔류 고유의 통합에 대해 설명합니다. 번역 기계즉 canonically 소정의 위치에 그것을 통합하는 대리로 비정규 아미노산을 ccepts, 단백질의 표준 아미노산의 모든 항목은 비정규 하나에 의해 대체된다. 비정규 아미노산의 혼입이 현저하게 변형 된 물리적 및 화학적 특성을 일으키는 단백질 구조를 변경할 수있다. 들은 내인성 단백질을 수정 이후 비정규 아미노산 유사체들은 생체 내 단백질 생산에 제한 발현 호스트 세포 증식 억제제로서 작용한다. 단백질에 독성 비정규 아미노산의 생체 혼입 특히 도전 남아있다. 여기서, 비정규 아미노산 L-카나 바닌 (canavanine)에 의한 L- 아르기닌의 전체 교체를위한 무 세포 방법은 제시된다. 이는 생체 내 발현의 고유 한 문제를 회피. 또한, 질량 스펙트럼 분석을위한 표적 단백질을 제조하는 프로토콜을 포함한다. 즉 L이 L 라이신 하이드 록시 라이신으로 대체 될 수 도시낮은 효율이기는하지만. 원칙적으로, 임의의 비정규 아미노산 유사체 한 내인성 시험 관내 번역 시스템이 인식으로 제시된 방법을 사용하여 통합 될 수있다.

Introduction

유전 코드는 생물권 보편적이다. 때때로 셀레 노 시스테인 피 롤라이 신 1 또는 2에 의해 확장 20 표준 아미노산의 세트, 그것을 코드. 이 단백질에 접어 아미노산 사슬로 된 tRNA의 도움으로 유전자 코드 변환 리보솜이다. 정규 아미노산의 작용기는 번역 후 변형과 조합하여, 단백질 기능의 3,4- 매우 넓은 범위에 기여한다. 원칙적으로 인해 표준 아미노산의 제한된 기능에 제한이 더 혼입함으로써 극복 될 수 있고, 새로운 화학 새로운 기능 3,4- 있도록 비정규 아미노산 (ncAAs).

사이트 - 또는 잔류 별 통합 : ncAAs의 통합을위한 두 개의 보완적인 접근 방법이있다. 전자의 방법은 아미노 아실 tRNA의-신디사이저의 표준 세트 이후, 상당한 기술적 인 문제를 수반한다etases (Aars의)과의 tRNA는 내생 번역 기계와 상호 작용하지 않아야 직교​​ Aars의-tRNA의 쌍으로 확장해야합니다. 주의 깊은 설계에 기초하여,이 방법은 목적 단백질의 사이트에서 하나의 점 돌연변이로서 ncAAs를 포함한다. ncAAs의 부위 - 특이 적 결합은 유전자 정규 아미노산 (CAA), 5-9 코돈 보통 정지에 할당되지 않은 코돈에 의해 암호화된다. 이 방법은 오히려 전체 단백질의 10 ~ 13에 걸쳐보다 특정 사이트에서 기능의 변화를 수반한다.

반면, 잔류 별 통합은 정식 번역 기계에 의해 비정규 아미노산의 잘못된 인식에 의존합니다. 혼입 인해 Aars의 기질 특이성의 부족으로 발생한다. 코헨과 ​​동료 (14)의 작업을 기반으로 ncAAs의 잔류 고유의 통합은, 그 (것)들의 사이에서 중요한 응용 프로그램 3,10, 단백질의 바이오 직교 라벨 15-17하게되었다X 선 결정학 (18)에서 단백질 또는 구조 해명.

자연 Aars의 일반적으로 생체 잔류 특정 법인의 효율적인 등 구조적 NCAA를 통해 자신의 동족 아미노산을 선호 바와 같이 일반적으로 NCAA의 표준 아날로그를 합성 할 수없는 영양 요 발현 숙주가 필요합니다. 숙주 세포를 유사 CAA의 낮은 농도를 얻어 성장 배지에서 배양한다. 미식 축구와 연속적인 보완과 함께 그 피로는 여러 canonically 규정 사이트에서 모델 단백질로 NCAA를 통합하는 식 호스트를 강제로. 부위 특이 적 접근법과 대조적으로, 이는 일반적으로 상당히 19,20 단백질의 물리 화학적 성질을 변형 선도 전체 단백질 구조에 깊은 영향을 미친다. 그들은 많은 다른 PROT 혼입 된 바와 그러나 ncAAs 대부분은 발현 숙주 세 성장 억제제이다재조합 유전자 발현 동안 관심의 그 외에 고용주 식별 번호 (EIN). 이 명확하게 생체 내 접근을 제한한다. 독성 또는 단백질 구조에 강한 영향을 미치는 아미노산의 생체 혼입 특히 도전 남아있다. 그러나, 이러한 분자는 특별한 기능을 가진 단백질을 설계하기 위해 가장 유망한 중입니다.

한 가지 예는 독성, 비정규, 자연적으로 발생하는 L-카나 바닌 (canavanine) (수), L 아르기닌 (ARG) 선수의 아날로그입니다. 그것은 영향을 블록은 관련 규정 및 촉매 반응 경로를 인수하고, 살아있는 세포에서의 존재는 즉시 사망 3,21-23으로 이어질 수 있습니다. 아르기닌 위치에서 단백질로의 결합은 단백질 안정성 21-23을 줄일 수있다. 인해 얻어진 독성 대장균 (대장균) 및 다른 일반적인 호스트 발현 단백질을 함유 카나 바닌 (canavanine)의 발현 도전 남아있다. 이러한 이유로, 완전한 생체 전모든 위치에서의 Arg 캔 ncorporation 적절 정교 단일 단백질 생산 시스템을 사용하여, 24 단 한번 확인되었다. 그러나, 캔 항암제 25-27 제안, 인간 (28)자가 면역 질환을위한 자극제로서되었다. 또한, 그것의 반 대사, 항균, 항 곰팡이에 대한 다양한 연구 및 항 바이러스 성질 (25)의 적용을받습니다. 이러한 속성에 대한 요구를 제기 효율적이고 쉽게 수행 약국 및 기능 연구에 단백질을 포함 할 수 표현하는 방법을.

생체 내 생산에 연결되어 많은 문제점이 무 세포 발현 시스템을 이용하여 회피 할 수 있지만, 시험 관내 잔류 특정 방식으로 만 제대로 탐구되었다. L 자 트립토판 아날로그 29 복수 ncAAs (30)의 무 세포 잔사 특정 혼입보고되었다. 이러한 방법은 매우 effic에 기초ient T7 RNA 중합 효소. T7 RNA 중합시켜 내생 전사에 비해 유전 기능을 감소 박테리오파지와 같은 전사를 수반한다.

모든 위치에서의 Arg 모델 단백질로 캔의 완전한 잔류 특정 혼입 최근 무 세포 발현 시스템을 이용하여 32, 31을보고 하였다. 동일한 시스템의 약간의 수정은 억제 (33) 종결 코돈을 통해 모델 단백질에 다른 피 롤라이 신 유사체의 사이트 별 통합 할 수있었습니다. 채용 된 무 세포계 31-33은 모든 E.에 기초 대장균 전사 - 번역 시스템. 일본어 전사 - 번역 모듈을 많이 유지하면서, - (재조합 단백질의 1 ㎎ / ㎖, 0.5) 32 그럼에도 불구하고, 효율적으로 전류 박테리오파지 시스템 에서처럼 단백질 발현을 가능하게한다.

본 연구에서는 상세한 프로토콜은 어떻게 잔유에 제공ncAAs의 단말 특정 결합이 모두 E.를 사용하여 실현할 수있다 대장균 세포가없는 시스템 32. 또한, HPLC-ESI 질량 분광 분석을 통해 적절한 평가를 위해 발현 된 단백질을 제조하기 위해 추가 단계가 제안된다. 이 무 세포 시스템의 특성을 확장하려면,이 작품은 캔 (31)의 출판 통합을 참조뿐만 아니라 비정규 L- 라이신 아날로그 L 하이드 록시 라이신과 관련된 새로운 데이터를 제공하지 않습니다.

ncAAs의 잔류 별 통합하기위한 다음과 같은 프로토콜은 최근 조브 (34)에 발표 된 프로토콜의 적응이다. 후자의 프로토콜은 표준 아미노산과 고효율 셀 표현의 자유를 수행하는 방법을 설명합니다. 또한, 조 세포 추출액의 제조, 아미노산 용액, 에너지 원액 및이 방법에 사용 된 에너지 버퍼를 나타낸다. 다음 프로토콜은 이전 P에 비해 변경된 단계에 중점순서 rotocol는 ncAAs의 잔류 고유의 통합을 가능하게합니다. 보정 피펫, 낮은 결합 피펫 팁과 마이크로 원심 분리기 튜브는 준비하는 것이 좋습니다. 이하, 아미노산 IUPAC 약어가 사용된다.

Protocol

주의! 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 사용 된 화학 물질 중 일부는 급성 독성. 개인 보호 필요 장비뿐만 아니라 흄 후드에서 작업 (eyeshield, 먼지 마스크, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지, 신발 - 발가락을 휴관).

1. 아미노산 용액 준비

  1. 미식 축구의 재고 솔루션 준비 (168 밀리미터)
    참고 : NCAA의 원액을 준비 할 수있는 예제로의 Arg 아날로그에 대해 설명한다. 따라서 다른 ncAAs 값을 적응.
    1. 마이크로 저울에 1.5 ml의 반응 관을 놓습니다. 168 mM의 용액 1 ㎖를 제조하기위한 반응 관 내부 캔 46.1 밀리그램을 단다. 멸균 microspatula을 사용합니다. 미식 축구의 라 세미 혼합물의 경우, 원액의 농도를 두배.
    2. 멸균 DDH 2 O의 977 μl를 추가 철저하게 소용돌이 할 수 있습니까 때까지n은 완전히 용해.
      주 : 1 ㎖의 용액의 총 부피를 들어, 용해 된 아미노산의 물리적 체적을 보상해야한다. 아미노산 중 들어 μL의 해당 볼륨 증가함에 밀리그램의 고형분 추정 반 35 (100 mg의 고체를 용액에 50 μL의 부피를 취한다). 대부분의 아미노산이 농도에서 용해 될 수있다. 그렇지 않으면 완전히 용해 될 때까지 농도를 감소시킨다.
    3. 직접 eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑을 착용, 안전을 위해! 액체 질소에 냉동 및 C.주의 ° -20에서 보관 섹션 1.2 플래시의 아미노산 용액의 제조에 대한 NCAA의 원액을 사용하여 액체로부터 보호되어야 질소 밝아진.
  2. 아미노산 용액의 제조
    주 : 아미노산 용액의 제조는 별도의 재고 20 CAAS의 L 이성체를 제공 아미노산 샘플러를 사용하여 들어L - 류신 (140 밀리미터)를 제외하고 168 mm의 농도로, 각 (HEPES / KOH, <0.1 % NaN의 3, pH를 7.5으로 완충 1.5 ml의) 솔루션. (KOH로 버퍼링)이 재고 솔루션의 집에서 준비를 위해,이 프로토콜 35을 따르십시오.
    1. 상기 20 CAAS의 원액 해동 (아미노산 샘플러 또는 35에 따라 제조 됨)과 NCAA의 RT에 (섹션 1.1에서 제조).
    2. 해동 후, 자주있는 침전 된 아미노산을 재용하는 주식 솔루션을 소용돌이. 일부 아미노산이 녹기 어렵 같이, 완전히 용해 될 때까지 37 ℃에서 가열 블럭을 배양한다. 시스테인은 완전히 용해되지 않을 수 있습니다. 침전을 방지하기 위해 RT에서 이러한 유지 -에서 Asn,의 Phe 및 시스테인을 제외하고, 얼음에 모든 아미노산을 놓습니다.
    3. 전체 키트의 7 분의 1을 사용하여 다음 값을 사용합니다.
      참고 : 작은 볼륨 작업을 추가 실험 키트의 일부를 저장 적절하게 아래로 확장 할 수 있습니다. incorporat에 대한 확장대규모 모델 단백질로 ncAAs의 이온. 아미노산의 안정성을 감소시킬 가능성이 빈번 해동을 방지하기 위해, 200 μL의 양으로 각 아미노산 모액 나누어지는. 이 200 ㎕의 분취 량과 피펫에 의한 손실 단계 1.2.4.1 계정 사용 분취 볼륨.
    4. 제 3 다르게 구성된 아미노산 용액 (- 1.2.7 섹션 1.2.5)의 제조를 완성하는 단계 1.2.4.3에서 분할 될 아미노산 마스터 혼합 용액을 제조 하였다. 이러한 솔루션에서, 레우 (5 mM)을 제외한 6 mM의 모든 아미노산을 농축시킨다.
      1. 15 ㎖의 원심 분리 관에 멸균 DDH 2 O의 전송 1.4 ml의. 얼음에 넣어. 각각의 아미노산 원액 175 μl를 추가합니다. CAA의 원액 (예를 들어,의 Arg)는 NCAA에 의해 (예를 들어, 수) 교체 할를 제외하고, 다른 후 하나를 추가합니다. 철저하게 각 추가 후에 와동과 얼음에 다시 솔루션을했습니다.
        노트:레우 다른 아미노산 6 mm로 비해 3 다르게 합성 아미노산 용액에서 5 밀리미터이다. 감소 된 농도는 식의 효율성을 감소하지 않습니다. 6 밀리미터까지 확장하는 것은 물론 적합하다.
      2. 침전 방지하기 위해 다음과 같은 순서로 아미노산 재고 솔루션을 전송 : 알라,의 Arg,에서 Asn, ASP, Gln의, 글루,의 Gly, 그의, 일드,리스, 메트로,의 Phe, 프로 빼앗아,의 Thr, 발, TRP, 티르를, 레우 및 시스테인. (예 : 수) 미식 축구와 유사하다 CAA (예를 들어, ARG) 선수의 원액을 추가하지해야합니다. 마지막으로, 철저하게 소용돌이. 가능한 솔루션으로 명확하게하기 위해 37 ° C에서 품어.
      3. 1.35 ㎖의 세 가지 동일한 볼륨으로이 아미노산 마스터 믹스 솔루션을 분할합니다. 1.5 ml의 반응 관으로 분리 된 각 볼륨을 전송합니다. 얼음에 보관하십시오.
    5. 5 mm로 레우 제외한 6 mM의 각 농도의 20 개의 CAAS 구성 아미노산 용액을 제조 하였다. 첫 번째 볼륨 오에F 1.35 ㎖를, 단계 1.2.4.3에서 분할의 결과로 (예 : 수) 미식 축구와 유사하다 CAA의 168 mM의 원액 (예를 들어, ARG) 선수의 50 μl를 추가합니다. 철저하게 소용돌이.
      1. 얼음에 다시 넣습니다. 반응 튜브에 16 μL의 볼륨이 1.4 ml의 솔루션을 나누어지는. 이 솔루션의 볼륨이 약 85 분취로 연결합니다. 이 분취 "+ CAA"(예를 들어, +의 Arg)를 레이블.
      2. 플래시!에서 -80 ° C.주의 액체 질소와 저장소에 분취 량을 동결 안전 들어, eyeshield 및 극저온 장갑은 액체 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다.
    6. (CAN 예) 미식 축구 유사하다 CAA (예,의 Arg)를 제외한 19 CAAS 구성된 아미노산 용액을 제조 하였다. 레우 (5 mM)을 제외한 6 mm의 농도로 각 아미노산을 추가한다.
      1. 분할의 결과로서, 1.35 (M1)의 제 볼륨 멸균 DDH 2 O 50 μL를 추가단계 1.2.4.3한다. 철저하게 와동과 얼음에 다시 넣어. 반응 튜브에 16 μL의 볼륨이 1.4 ml의 솔루션을 나누어지는. 이 솔루션의 볼륨이 약 85 분취로 연결합니다. 이 분취 레이블 "- CAA를"(예를 들어, -의 Arg).
      2. 플래시!에서 -80 ° C.주의 액체 질소와 저장소에 분취 량을 동결 안전 들어, eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다.
    7. 19 CAAS를 포함하는 아미노산 혼합물 정식을 대입 미식 축구 (예를 들면, CAN) (예를 들어,의 Arg)를 준비한다. 레우 (5 mM)을 제외한 6 mm의 농도로 각 아미노산을 추가한다. 지난 1.35 ml의 볼륨에, 단계 1.2.4.3에서 분할의 결과로 NCAA의 168 mM의 원액의 50 μl를 (예를 들어, 수)를 추가합니다. (예를 들어, + 수)을 "+ NCAA"를 레이블. 철저하게 와동과 얼음에 다시 넣어.
      1. 16 & #의 볼륨이 1.4 ml의 솔루션을 나누어지는(181), 반응 튜브에 리터. 이 솔루션의 볼륨이 약 85 분취로 연결합니다. 이 분취 "+ NCAA"(예를 들어, + 수)를 레이블.
      2. 플래시!에서 -80 ° C.주의 액체 질소와 저장소에 분취 량을 동결 안전 들어, eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다.
        참고 : 단계 1.2.5.1, 1.2.6.1 및 1.2.7.1에 사용 된 16 μL 나누어지는 볼륨 피펫으로 인한 손실을 설명하는 데 필요한보다 약간 더 높다.

2. 에너지 버퍼 준비

주 : 조 추출물의 각 배치는 고유하며 MG-의 농도와 K-글루타메이트 (34)를 최적화가 필요합니다. 조 추출물 분취 량은 단백질 농도 (34)에 의존한다. 다른 값에 대한 제공 계산 템플릿 (보충 자료 1)를 사용합니다. 보충 자료 1 피겨 전설, expla에서 추가 지침을 찾기이 템플릿을 사용하는 방법을 ining.

  1. 수정되지 않은 프로토콜 (34)에 따라 14 배 에너지 솔루션과 조 추출물의 분취 량을 준비하고 -80 ° C에서 저장. 최적화 된 발현 효율 (34)에 대한 MG-및 K-글루타메이트 농도에 따라 조 추출물을 보정합니다.
    참고 : 14 배 에너지 솔루션의 최종 조성은 700 mM의 HEPES (pH를 8), 21 mM의 ATP, 21 mM의 GTP, 12.6 mM의 CTP, 12.6 mM의 UTP, 2.8 ㎎ / ㎖의 tRNA, 3.64 mM의 CoA를, 4.62 mM의 NAD, 10.5 mM의 캠프, 0.95 mM의 엽산, 14 MM의 스퍼 미딘, 420 mM의 3-PGA.
  2. 얼음에 녹여 100 mM의 마그네슘 - 글루타메이트 원액 3 M K 글루탐산 스톡 용액을 14 배의 에너지 용액 및 40 % PEG-8000은 마스터 믹스를 제조 하였다. 얼음에 보관하십시오.
  3. 반응 관의 DDH 2 O 멸균 100mM의 마그네슘 - 글루타메이트 원액 9.18 ㎕의 3 M K 글루탐산 원액 3.06 μL, 14 배의 에너지 용액 21.86 μL, 40 %의 PEG-8000의 15.3 μL 1.6 μl를 섞는다. 철저하게이 마스트 와동어 각 추가 후에 혼합하고 얼음에 보관하십시오.
  4. 반응 튜브 내로 16 μL (3 분취 량)의 볼륨으로 마스터 믹스 (51 μL)을 나누어지는. 자주 분취 동안 마스터 믹스를 소용돌이. 플래시는 액체 질소의 분취 량을 동결.
    참고 : 16 μL 분취 량뿐만 아니라 마스터 믹스 부피 피펫으로 인한 손실을 설명하기 위해 요구되는 것보다 약간 더 높다.
  5. 에너지 버퍼 튜브를 수집하는 스트레이너를 사용합니다. !. -80 ° C에서주의 튜브를 저장 eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다.

ncAAs의 잔류 특정 법인 3. 준비 및 무 세포 반응의 실행

  1. 첫째, DDH 2 O.에서 DNA 벡터 용액을 제조
    1. 고효율 단백질 발현을 위해, 발현 벡터 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1 - deGFP-T500 (32)를 사용합니다. 유전자를 클로닝하는 벡터 (36, 37)에이 모델 단백질을 코딩 </ SUP>.
      주 : 대안 적으로,도 σ (70)에 의해 인식되는 기타 프로모터를 사용하지만, 그 발현 효율이 감소 될 수 있습니다.
    2. 37, 38 E.의 벡터 변환 콜라이 균주 KL 740 32 (예일 CGCS 번호 : 4382)은 벡터 (37, 39) DNA를 증폭하고, DNA 용액을 40-42의 농도를 정량화 정제. -20 ° C에서 DNA 솔루션을 저장하거나 직접 세포 수수료 반응 준비를 위해 사용 (3.4.1, 3.4.2 및 3.4.3 단계).
  2. 수정되지 않은 프로토콜 34에 따라 사용되는 벡터 작 제물의 농도에 따라 무 세포 발현 효율 보정. 무 세포 반응 준비를위한 가장 높은 단백질 수율 (3.4.1, 3.4.2과 3.4.3 단계)에 이르는 최적의 농도를 사용합니다.
    주 : 무 세포 반응의 제조는 무 세포에 10 nM의 최종 농도 벡터 리드 90nm의 벡터 DNA 원액을 사용하여 예시반응은 MG-K 및 글루탐산의 상기 최적 값뿐만 아니라 추출 분취 량을 따른다. 다른 값에 대한 계산 템플릿을 사용합니다.
  3. 얼음 3 조 추출물의 분액에 녹여 "+ CAA"(예를 들면, +의 Arg), 1- 아미노산 용액을 분취 표지 라벨링 한 아미노산 용액의 분취 량 (변성 프로토콜 34에 따라 제조 됨) 30 μL 부피의 각 "- CAA"(예를 들어 - "+ NCAA"라벨의 Arg)과 1 아미노산 용액 나누어지는 (예는, +는 (섹션에서)를 제조 할 수 1.2.5 - 1.2.7), (3) 에너지 버퍼 씩 (섹션 2에서 제조)와 벡터 DNA 용액 ( ) 3.1 절에 준비했다.
    조 추출물이 약간 점성이며 기포를 포함 할 수 있습니다. 4 ° C에서 30 초 동안 10,000 XG에 원심 분리하여 기포를 제거합니다. 다시 얼음에 조 추출물 씩 넣습니다.
  4. 조 추출물 (33.33 %), 에너지를 혼합하여 3 다르게 합성 무 세포 반응 (각각 90 ㎕의 최종 부피)를 준비버퍼 (16.67 %) 3 다르게 구성된 아미노산 용액의 분취 량 (16.67 %) 및 ​​벡터 DNA 용액 1. 선택적으로, 상기 생체 분자 (DNA, 단백질의 tRNA, 등)을 추가 할 수 있지만 적절 DDH 2 O.의 부피를 줄일
    1. 기준 무 세포 반응 (90 μL)을 모델 변성 단백질 발현을 준비한다.
      1. 2 O 미정 30 μL로 에너지 완충액 15 μL, "+ CAA"(예를 들면, +의 Arg), 90nm의 벡터 DNA 용액 10 ㎕의 멸균 DDH 20 μL 표지 된 아미노산 용액의 분취 액 15 μL를 추가 추출하다. 각 성분의 첨가 한 후 아래로 부드럽게 소용돌이를 피펫 팅에 의해 섞는다.
      2. 6 μL의 15과 동일한 볼륨에서 무 세포 반응의 90 μl를 나누어지는. 별도의 반응 관에 15 부피의 각각을 전송. 튜브를 닫고 얼음에 다시 넣어. (예를 들면, CFR (+의 Arg)) "CFR (+ CAA)"모든 반응 튜브 라벨.
      2. (예를 들어,의 Arg)이나 비정규 아날로그 (예를 들어, 수)을 첨가되지 않은 음성 대조군 무 세포 반응 (90 μl를) 준비합니다.
      1. "- CAA"을 (예컨대, -의 Arg)를 미정의 30 μl를 90 nM의 벡터 DNA 용액 10 ㎕의 멸균 DDH 2 O 20 μL를, 아미노산 용액의 분취 액 15 μL 개는 에너지 버퍼의 15 μL를 추가 추출하다. 각 성분의 첨가 한 후 아래로 부드럽게 소용돌이를 피펫 팅에 의해 섞는다.
      2. 6 μL의 15과 동일한 볼륨에서 무 세포 반응의 90 μl를 나누어지는. 별도의 반응 관에 15 부피의 각각을 전송. 튜브를 닫고 얼음에 다시 넣어. 모든 반응 튜브 라벨 "CFR (-cAA)"(예를 들면, CFR (-Arg)).
    2. 발현 된 모델 단백질로 (예를 들면, CAN) 잔류 구체적 할 NCAA 통합 예상되는 무 세포 반응 (90 μL)을 준비한다.
      1. 15 추가에너지 버퍼 μL "+ NCAA"로 표시된 아미노산 용액의 분취 액 15 μL (예를 들어, + 수 있음), (90) 나노 DNA 용액 10 ㎕의 멸균 DDH 20 ㎕의 조 추출물 30 μL를 2 O. 각 성분의 첨가 한 후 아래로 부드럽게 소용돌이를 피펫 팅에 의해 섞는다.
        주 : 발현 효율 표준 아미노산 발현에 비해 감소 될 수있다. 필요한 경우 단순히 무 세포 반응 부피를 스케일 업.
      2. 6 μL의 15과 동일한 볼륨에서 무 세포 반응의 90 μl를 나누어지는. 별도의 반응 관에 15 부피의 각각을 전송. 튜브를 닫고 얼음에 다시 넣어. 증가 된 반응 볼륨의 경우, 이에 따라 6 μL의 추가 볼륨에 나누어지는. (예를 들면, CFR (+ 수)) "CFR (+ NCAA)"모든 반응 튜브 라벨.
  5. 29 ° CO / N 모든 튜브를 품어.
    참고 : 작은 반응 볼륨이 충분한 산소은 diff를 사용고효율 단백질 발현을위한 중요 반응에 usion. 10 μL 이상 반응 볼륨은 교반 (34)를 통해 활성 산소를 필요로한다. 큰 볼륨의 경우, 15 μl를보다 작은 볼륨으로 반응을 분할합니다.
  6. 무 세포 발현 후, 풀은 모두 동일하게 6 μL의 분할 무 세포 반응을 구성. 첫째, 수영장 "CFR (+ CAA)"라는 레이블이 붙은 6 μL의 모든 15 분할 무 세포 반응 (예를 들면, CFR (+의 Arg)). 그런 다음, 풀 라벨 6 μL의 모든 15 분할 무 세포 반응 "CFR (-cAA)"(예를 들면, CFR (-Arg)). 마지막으로, 풀 라벨 6 μL의 모든 15 분할 무 세포 반응 "CFR (+ NCAA)"(예를 들면, CFR (+ 수)). 증가 된 반응 볼륨의 경우, 이에 따라 6 μl를 더 볼륨을 풀.
  7. 다르게 변성 SDS-PAGE (43, 44) (4.1)를 수행함으로써 무 세포 반응 이루어지는 풀링 세에서 모델 단백질의 발현 수준을 확인한다.
    참고 :이 운전 방식을 사용하여 합동 실험의 예비 평가 라.
  8. HPLC-ESI 질량 분광법 (4.4 절)을 통해 적절한 분석을 위해 무 세포 발현 모델 단백질을 준비합니다. 첫째, 45 그들 (4.2 절)을 정화. 마지막으로, 질량 분광법 동안 높은 배경 잡음을 방지하기 위해 버퍼 (4.3 절)을 교환한다.
    참고 : 섹션 3.4.1, 3.4.2 전형적인 무 세포 반응 조건 34 3.4.3 납 : 8.9 - (조 추출물)에서 9.9 ㎎ / ㎖ 단백질, 4.5-10.5 밀리미터 밀리그램 - 글루타민산, 40-160 밀리미터 K 글루탐산, 류신 제외한 각 아미노산의 1 ㎜, 0.83 mM의 류신, 50 mM의 HEPES, 1.5 mM의 ATP와 GTP, 0.9 mM의 CTP 및 UTP, 0.2 ㎎ / ㎖의 tRNA, 0.26 mM의 CoA를 0.33 mM의 NAD, 0.75 밀리미터의 cAMP , 0.068 mM의 엽산, 1 ㎜의 스퍼 미딘, 30 mM의 3-PGA, 2 % PEG-8000 및 10 nM의 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1이-gene_of_model_protein-T500. 필요한 경우, 무 세포 반응 제제의 다른 절차는 상기 반응 조건에 이르게이 수행 될 수있다.
제작 "> 4. 예비 SDS-PAGE 43, 44을 통해 평가 및 HPLC-ESI 질량 분석을위한 세포가없는 표현 모델 단백질의 제조

  1. 무 세포 반응의 SDS-PAGE
    참고 : 더 정제 또는 추출없이 발현 된 단백질의 신속하고 예비 분석을위한 SDS-PAGE를 변성 수행하고 다음 단계를 실행합니다.
    1. 얼음에 단백질 표준을 녹여. 이 겔에 현지화 (단계 4.1.13)에 대한 표현 모델 단백질과 비슷한 분자량의 단백질로 구성되어 있는지 확인합니다.
      주 : 212 kDa의 말 토스 - 결합 단백질 - β 갈 락토시다 제 : 158 kDa의, β 갈 락토시다 제 : 116 kDa의, 포스 B : 97 kDa의 혈청 알부민 여기서, 사용되는 표준은 분자량 (미오신의 넓은 범위에 걸쳐 단백질을 제공한다 : 66 kDa의, 글루탐산 탈수소 효소 : 56 kDa의, 말토오스 결합 단백질 : 43 kDa의, 티 오레 독신 환원 : 35 kDa의, triosephosphate 이성화 : 27 kDa의, 트립신 억제제 : 20 kDa의, LYsozyme : 14 kDa의, 아프로 티닌 : 7 kDa의 인슐린 A : 3 kDa의, B 체인 : 2 kDa의).
    2. 적절한 겔 이동을 보장하고 염색 후 포화를 방지하기 위해 SDS-PAGE 이전에 10 배 - 무 세포 반응으로 인해 높은 단백질 농도에 약간의 점성 때문에 멸균 DDH 2 O 5 이들을 희석. 너무 많은 샘플을 낭비 멸균 DDH 2 O 4 μL에 무 세포 반응 1 μL로 희석하지 않도록 반응 튜브에 철저하게 소용돌이를 희석을 준비하고 곧 2 미니 원심 분리기로 액체를 스핀 다운 - 3 초에서 2,000 × g으로.
    3. 희석 무 세포 반응의 5 μL에 2 배 로딩 버퍼의 5 μl를 추가합니다. g X 2000에서 3 초 - 철저히 와동과 2 미니 원심 분리기와 스핀 다운.
      주 : 여기에서, 첨가 후, 생체 62.5 mM 트리스 / CL에 용해 -, pH가 6.8, 10 % 글리세롤, 2 % SDS, 및 0.0025 % 브로 모 페놀 블루, 전형적인 조성물. 약간 다른 희석 공동으로 이어질 다른 로딩 염료를 사용하여nditions도 적합 할 수있다.
    4. 철저히 단백질 표준 와동 및 반응 관으로의 15 μl를 옮긴다.
      참고 : 젤의 크기와 다른 단백질 표준을 따라 권장되는 볼륨이 상기와 다를 수 있습니다.
    5. 가열 블록에 반응 튜브를 놓습니다. 튜브의 뚜껑이 제대로 닫혀 있는지 확인합니다. 5 분 - 3 100 °의 C - 95에서 열. 이 단백질을 변성하는 마십시오과 단백질 백본 주위 SDS-포장을 가능하게 할 수 있습니다.
      참고 : 일부 단백질 표준은 공급 업체의 지침을 참조 가열해서는 안된다.
    6. 한편, 전기 영동 챔버로 실행하는 버퍼를 전송합니다. 런닝 버퍼 (1X)의 함유량은 25 mM 트리스, 192 mM의 글리신 (HCl로) pH를 8.3에서 0.1 % SDS이다.
    7. 전기 영동 챔버 20 % 구배 트리스 - 글리신 - SDS 겔 (10cm X 10cm X 1mm) - 프리 캐스트 넷을 수정합니다. 빗를 제거하고 버퍼를 실행하는로드 주사기로 우물을 씻어.
      참고 : 겔 농도 STROngly 발현 된 모델 단백질의 크기와 성격에 따라 달라집니다. 상기 농도는 E. 분리 콜라이 조 추출물의 단백질뿐만 아니라 저분자 모델 단백질. 자기 캐스트 젤도 적합하다.
    8. 가열 블록에서 튜브를 제거합니다. 3 초에서 2,000 × g으로 - 2 미니 원심 분리기로 액체를 스핀 다운. 2,000 x g에서 3 초 - 곧 소용돌이와 2 회전 수 반복합니다.
    9. 우물에 각 샘플의 - (22 μg의 단백질 11)과 전기 영동을 시작 - (48 μg의 단백질 24) 및 10 ㎕의 단백질 표준의 15 μl를 전송합니다. 약 90 분, 전형적인 프로토콜 40mA - 여기서, SDS-PAGE 125 V 및 20에서 수행된다.
    10. 조심스럽게 카세트에서 젤 압축을 풉니 다. 30 분 동안 고정 용액 (50 % 메탄올, 10 % 아세트산, 40 % DDH 2 O)로 전송합니다.주의! 메탄올은 흡입 및 피부에 접촉되면 유독이다. 흄 후드 보호 장갑과 작업을 착용 할 것.
    11. 염색 용액 (0.025 % 쿠마 화려한 푸른 G-250, 10 % 초산, 90 % DDH 2 O)로 젤을 전송합니다. 60 분 동안 얼룩.
    12. 120 분 - 60 탈색 용액 (10 % 아세트산, 90 % DDH 2 O)로 겔을 전송.
      참고 : 고정, 염색 강하게 탈색이 발현 된 단백질의 크기와 성격에 따라 달라집니다. 이 프로토콜은 오히려 작은 분자량 46 단백질의 넓은 범위에 적용된다.
    13. 염색 된 단백질 밴드의 적절한 콘트라스트를 생성하는 흰색 배경에 매트 상으로 투명 겔 변위.
  2. 무 세포 반응에서 그의 태그-45 모델 단백질 정제
    참고 : 단백질 정제를 들어, 몇 가지 방법이 유사한 결과를 제공 존재한다. 이 프로토콜은 C 말단 폴리 히스티딘 태그 (그의 태그)가 무 세포 단백질 발현 모델 정화. 그것은 특급 단백질에 적합한 정제 키트를 사용하여무 세포 단백질 발현의 작은 반응 부피에 ressed. 이것은 천연 또는 변형 모델 단백질의 정제와 동일하다. 따라서, 일반적으로 하나의 무 세포 반응에 기초하여 설명한다.
    1. 적절한 HPLC-ESI 질량 분광 분석을 위해 추출하여 무 세포 반응 모델 단백질을 정제하고 다음 단계를 실행한다.
      1. 그의 결합 버퍼의 150 μl를 90 - - 무 세포 반응의 150 μL (90)의 동일한 볼륨을 섞는다. 최대 피펫 아래로, 부드러운 텍싱 하였다.
        참고 : 그의 결합 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. 이미 다졸은 / 그의 농도는 8 <10 밀리미터가 강한 환원제의 농도는 <15 mM의 어떠한 금속 - 인 - 모델 단백질이 가용성 인 그러나, 무 세포 반응 매질만큼 원료가 될 수 7.5 사이의 pH는 킬레이트 제는 존재한다. 하여 혼합물을 부피 300 μl를 초과하면, 동일 볼륨으로 분할하고 다른 분취 R로 볼륨 논제다음 정제 단계에 대한 eaction 튜브.
      2. 열 시스템을 준비합니다. 겔 수지가 완전히 용해 될 때까지 철저하게 그의 친 젤의 원액을 소용돌이. 열로 겔 수지의 250 μl를 전송합니다. 점성 겔 수지의 1 ML의 피펫 팁을 사용합니다. 수집 튜브에 열을 놓습니다.
      3. 원심 분리기 칼럼 / 수집 관 5 - 15,000 × g으로 - 13,000에서 10 초. 겔 수지가 완전히 방전되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 추가로 5 원심 분리 시간을 연장 - 10 초이지만 친화 겔 위에 건조되지 않도록주의. 따라서 단계 4.2.1.5, 4.2.1.7 및 4.2.1.9에서 원심 분리 시간을 연장.
        참고 :이 뻣뻣하게 더 뜨는 상단에 남아없는 경우 겔 ​​수지가 완전히 방전된다.
      4. 컬럼에 무 세포 반응 / 그분의 결합 버퍼 300 μL - (150)을 전송합니다. 혼합물을 부피가 권장 양을 초과하는 경우, 여러 스핀 컬럼을 통해 분리. FR하여 겔 수지를 재현 탁equent 도청 부드러운 텍싱 적어도 2 분의 배양 시간 동안. 2 분 - 200 μL보다 큰 볼륨의 경우, 추가 1 품어.
        주 : 충분한 배양 시간은 겔 수지 모델 단백질 결합에 중요한 것이다.
      5. 원심 분리기 칼럼 / 수집 관 5 - 15,000 × g으로 - 13,000에서 10 초. 흐름 -을 통해 폐기하고 다시 수집 튜브에 열을 배치합니다.
      6. 그의 세척 버퍼의 250 μl를 추가합니다. 도청 부드러운 텍싱에 의해 겔 수지를 재현 탁.
      7. 원심 분리기 칼럼 / 수집 관 5 - 15,000 × g으로 - 13,000에서 10 초. 흐름 -을 통해 폐기하고 다시 수집 튜브에 열을 배치합니다. 15,000 × g으로 - 13,000에서 10 초 - 5 다시 단계를 반복 4.2.1.6 원심 분리기.
      8. 표준 1.5 ml의 반응 튜브에 열을 놓습니다. 용출 버퍼 150 μl를 추가하고 도청 부드러운 텍싱에 의해 겔 수지를 재현 탁. 높은 정제 된 모델 단백질 콘 100 μL에 볼륨을 줄입니다다음 단계 4.2.1.9에서 용출 후 centrations.
        주 : 용출 완충액 용적이 감소하는 경우 정제 모델 단백질의 총 존재 량으로 인해 모든 겔 수지 - 결합 단백질의 가능한 완전 용출이 감소 될 수있다.
      9. 원심 분리 컬럼 / 반응 튜브 5 - 13000 10 초 - 15,000 XG 용출 완충액에 정제 된 단백질을 희석. 전에 분할하는 경우, 하나의 원액에 모든 솔루션을 풀.
      10. 버퍼 교환을 실행하기 전에, 예를 들어, 표준 방법을 사용하여 단백질 농도를 결정은 브래드 포드 (47, 48)를 분석.
        참고 : - 50 μL 적절한 HPLC-ESI 질량 분광법 (4.4)의 경우, 일반적으로 20 필요한 볼륨이 약 0.5 ㎎ / ㎖있는 최적의 단백질 농도를 사용합니다. 농도가 0.2 mg을 밑도는 경우 / ㎖, 회전 진공 농축기를 이용하여 상기 버퍼 교환 후 단백질 용액을 농축시킨다. 이 경우, 제 적절히 교환 버프 적응 섹션 4.3.8 읽기어.
  3. HPLC-ESI 질량 분광법에 대한 버퍼 교환
    참고 : 인해 이미 다졸 (> 150 밀리미터) 등의 NaH 2와 같은 다른 소금의 높은 농도 PO 4 (> 300 밀리미터) 또는 염화나트륨 (> 50 mM)을 질량 분광 분석에서 높은 배경 잡음을 피하기 위해 자신의 태그 용출 버퍼를 교환 49. 다음 완충액 교환 프로토콜은 prehydrated 겔 여과 스핀 컬럼 시스템을 사용한다. 그것은 동일 네이티브 또는 수정 된 모델 단백질 실행됩니다. 따라서, 일반적으로 하나의 무 세포 반응에 기초하여 설명한다. 다른 쉬운 수행 버퍼 교환 방법, 예를 들어, 미니 투석 카트리지가 있습니다.
    1. 단백질을 저장 완충액 (50 mM 트리스 - CL pH를 8, 100 mM의 염화나트륨, 10 % 글리세롤) 100 ㎖를 준비한다. 605.7 mg의 트리스 자료, 584.4 mg의 염화나트륨을 병 및 글리세롤 10 ㎖를 추가 ㎖ 넣어 오토 클레이브 (100)에 달다. 약 80 ml의 최대 입력하고 의해 8 pH 값을 조정설정된 뒤 NaOH를. 꾸준히 pH 미터로 pH 값을 확인합니다. 마지막으로, 100 ㎖ 표시까지 채운다.
      참고 한 HPLC는 질량 분광 측정하기 전에 수행되는 한, 질량 분광 분석을 방해 모델 단백질의 다양한 안정하지 버퍼를 사용한다. 그러나, 발현 된 단백질 모델의 특성에 따라, 더 적합 할 수있는 다른 버퍼를 사용한다. 대상 단백질의 pH 8에서 안정하지 않은 경우, 그에 따라 pH를 조정합니다. 높은 글리세롤 농도를 사용하지 마십시오.
    2. RT 적어도 15 분 동안 겔 여과 스핀 열을 따뜻하게.
    3. 부드러운 도청 또는 텍싱에 의해 prehydrated 젤을 재현 탁하고 기포를 제거합니다.
    4. 먼저 하단 캡을 제거하고 멀리 상단 캡을. 세척 튜브 (최소 2 ㎖)에 열을 놓습니다. 원심 분리기에 열 / 세척 튜브를 전송합니다. 각 열은 오리엔테이션 마크를 보유하고있다. 겔 저장 버퍼를 제거하기 위해 2 분 동안 1000 × g으로 원심 분리기. 디스크플로우 스루 ARD.
      참고 :이 순서대로 진행주의를 기울이십시오. 열이 모든 추가 원심 분리 단계에서 같은 방향을 가지고 있는지 확인하십시오.
    5. 단백질 저장 버퍼 400 μL을 추가 할 수 있습니다. 1000 x g에서 2 분간 원심 분리한다. 완전히 젤에 단백질 저장 버퍼를로드하기 위해이 작업을 반복합니다. 조심스럽게 정제 된 모델 단백질의 용액 100 μL를 추가. 피펫 직접 겔 층의 중심 상.
      참고 : 정제 된 단백질의 솔루션 볼륨, 특히 변형 된 단백질의 높은 수 있습니다. 여러 버퍼 교환 컬럼을 통해 이러한 솔루션을 분할합니다. 단백질은 버퍼 교환 이런 종류의 5 kDa의보다 높은 분자량을 가지고 있어야합니다.
    6. 1,000 X g에서 2 분간 포집 관과 원심 분리기에 열을 놓습니다.
      주 :이 단계는 단백질 축적 버퍼의 정제 모델 단백질의 희석 리드. 전에 분할하는 경우, 하나의 원액에 모든 솔루션을 풀.
    7. 플래시 동결 번째전자 단백질 -80 ° C에서 액체 질소와 저장소에 솔루션을 직접는! HPLC-ESI 질량 분광법 (50) (4.4).주의를 통해 분석 eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 질소 밝아진으로부터 보호하기 위해 착용한다.
    8. 조심스럽게 증발하여 용매를 51 회전 진공 농축기를 이용하여 단백질 용액을 농축 프로토콜의 다음 단계를 수행한다.
      주 : 단백질 농도는 HPLC-ESI 질량 스펙트럼 (<0.2 ㎎ / ㎖)에 대해 너무 낮 으면이 단계는 필요하다. 용액의 부피와 모델 단백질 농도는 대략 전후 버퍼 교환 후 동일하다. 그의 태그 정제 한 후, 모델 단백질 그의 용출 완충액 (단계 4.2.1.9) μL (100)에 용해시키고, 0.07 ㎎ / ㎖ (단계 4.2.1.10)의 농도 : 농축 공정은 다음 예에 의해 설명된다 .
      1. 단백질 농도, 용액의 부피로 증발시킨 후되도록적어도 0.2 ㎎ / ㎖, 20 ㎕의 각각 버퍼 교환, 최대 다섯 배 이상의 삼중 단계 4.3.1에서 제조되지만 단백질 축적 버퍼 전에 희석. 마찬가지로 세번째 적어도 두 (66.67 μL) 또는 최대 네 개의 제 (80 μL)을 다음 증발시켰다.
        주 : 버퍼 교환이 중요한 단백질 축적 버퍼의 희석 전에 버퍼 (단계 4.3.1)의 농도 값이 여전히 증발 불구 실현되는 것을 고려해야. 4.3.8.4 - 4.3.8.2 단계 다음 실행 전에 - 단백질 축적 버퍼 희석 한 후, 먼저 버퍼 교환을 수행 (4.3.6 4.3.2 단계).
      2. 버퍼 교환 한 후, 회전 진공 농축기로 열린 관에서 모델 단백질 용액의 전체 100 μl를 넣어.
        주 : 모델 단백질은 단백질을 희석 저장 완충액에 용해시킨다. 회전 중에 액체 손실을 방지하기 위하여 회전 중심을 향해 경사. 확인이의 같은 볼륨의 개방 빈H 2 O 대칭 방사 시스템의 균형을 둔다.
      3. 집중의 뚜껑을 닫고 회전을 시작합니다. 단백질의 안정성을 보장하기 위해, RT에서 30 ° C까지 낮은 온도에 집중한다.
        주 : 사용 집중이 자동으로 170 XG에 가속 및 진공을 설정합니다. 다음으로는 240 × g으로의 최대 속도로 가속.
      4. 자주 액량을 조사하기 위해 농축 과정을 방해. 나머지 용액을 부피 20 ㎕를 33 ㎕의 사이에있을 때, 농도를 멈춘다.
        참고 : 따라서 단계 4.3.8.1 적응 - 다른 솔루션 볼륨 (단계 4.2.1.9) 및 기타 단백질 농도 (단계 4.2.1.10)에 대한 4.3.8.4을. 플래시는 -80 ℃에서 액체 질소에 저장 농축 단백질 용액을 동결 또는 직접 HPLC-ESI 질량 스펙트럼 (50)을 통해 분석한다. 주의! eyeshield 및 곳을 알아내는 장갑 착용 질소 밝아진으로부터 보호한다.
  4. 모델 단백질의 HPLC-ESI 질량 분광 분석 (50)
    1. 90 % 아세토 니트릴과 25 포름산 0.1 % - 20 %의 구배와 C5 역상 컬럼에 (섹션 4.3에서 제조) 15 ㎕의 단백질 용액 (이 3 μm, 100 × 2.1 mm) - (5)의 HPLC 분리를 수행 300 분 범위의 비행 시간 형 질량 analysator 검출에 후속 ESI 질량 스펙트럼 - 3,000m / z.
      참고 : 표현 모델 단백질의 특성에 따라 더 적합 할 수있는 다른 용매 또는 열을 사용합니다.
    2. Deconvolute 제로 충전 질량을 계산하는 적절한 소프트웨어 (52)를 이용하여 질량 스펙트럼을 측정 하였다.

Representative Results

이 프로토콜 모델 단백질로 ncAAs의 무 세포 잔사를 특이 결합을 통해 안내한다. 이 혼입 실험 적절한 HPLC-ESI 질량 분광 분석 모델 단백질을 제조하기 위해 추가 단계의 예비 평가를 SDS-PAGE를 제안한다.

여기서, 아날로그의 Arg 캔의 무 세포 잔사 특정 결합뿐만 아니라, 라이신 유사체 L 히드 록시 리신 (HYL)의 대표적인 결과가 제시되어있다. 다른 아미노산 용액, 에너지 버퍼 모델 단백질 및 무 세포 반응에 대한 벡터 DNA 코딩은 전술 한 바와 같이 제조된다. 레퍼런스 셀 무 반응은 20 CAAS 이루어진 아미노산 용액으로 제공된다. 각 실험에서, 음성 대조군 무 세포 반응은 당해 NCAA의 표준 아날로그 부족 아미노산 용액이 공급된다. 각 appr에 대한oach는 1 무 세포 반응은 CAA는 비정규 아날로그로 치환 된 아미노산 용액의 존재 하에서 단백질 모델을 표현한다. 그의 태그 정화 버퍼 교환 HPLC-ESI 질량 분석은 상기 프로토콜에 따라 실행된다.

모델 단백질은 deGFP (32), EGFP (53)의 잘린 버전 그분이-태그 C- 말단이다. 그 문자를 하나의 아미노산 서열 (보충 재 (2))에서 찾을 수있다. 이 모델 단백질 (6)의 Arg, 18리스 위치를 포함, 각각. 발현 벡터는 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1 - deGFP-T500이다.

미식 축구 완전히 혼입의 경우, 하나는 음성 대조군 반응이없는 20 CAAS 하나 이후 deGFP을 표현하지 않는다고 가정 할 수있다. 반대로, deGFP 다른 두 반응에서 감지해야 다음 REFE의 고유 한무 세포 반응과 NCAA 구비 무 세포 반응의 변성 단백질을 알수 있습니다.

도 1a는 캔 법인 실험의 예비 SDS-PAGE 평가를 보여줍니다. 레퍼런스 셀 무 반응 deGFP 높은 발현 수준을 갖는다. 캔 구비되는 무 세포 반응에서, deGFP 약간 낮은 농도로 표현된다. 어떤 deGFP 발현이 대조군에 감지 할 수 없습니다. 이는 SDS-PAGE 결과를 표적 단백질에 deGFP 캔의 성공적인 도입에 대한 좋은 표시이다.

, deGFP으로도 1b에 가시화 정제 모델 단백질 모두 캔의 가설 완전한 결합을 입증하기 위해, HPLC-ESI 질량 분광법으로 분석 하였다.도 1C 정제 deGFP 분자 deconvoluted 질량 스펙트럼을 나타낸다. DEGF의 deconvoluted 질량 기준 무 세포 반응으로 표현되는 P가 26,192.8 다이다. deGFP를 들어 26202.5 다의 질량이 나타납니다 무 세포 반응을 포함하는 캔 표현. 완전히 캔으로 대체되고 기본 deGFP6Arg과의 Arg와 수정 된 deGFP6Can의 예상 질량은 각각 26,193 다 및 26204 다 있습니다. deGFP6Can 1.5 다의 질량 차이 스펙트럼 컨벌루션의 오차 내에있다. 따라서, 6 개 위치에서의 Arg deGFP 캔에의 완전한 혼입은 확인된다.

감소 강도의 두 봉우리는 성숙한 형광을 달성하지 않은 기본 deGFP6Arg 수정 deGFP6Can에 해당합니다. 형광은 자기 촉매 산화 하였다하는 H 2 O 분자의 제거에 의해 생성된다. 이것은이 과정이 진행되지 않을 경우 20 다 증가 질량에 이르게.

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무 세포 발현되고 정제 deGFP 분자의 결합 수 실험 및 HPLC-ESI 질량 스펙트럼도 1의 SDS-PAGE 평가. (A) SDS-PAGE를 사용하여 혼입 할 실험의 예비 평가. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 단백질 표준, 기준 셀 무 반응, 음성 대조군 및 무 세포 반응 수 대신의 Arg의 제공. (B) 그 태그 정제 한 후 SDS-PAGE 및 표현 deGFP 분자의 교환 버퍼. 캔 포함하는 반응 deGFP 정제 단백질 표준, 기준 반응에서 정제 deGFP : 왼쪽에서 오른쪽으로. HPLC-ESI 질량 분광법에 의한 캔의 전체 법인의 (C) 확인. 완전히 캔으로 대체 기본 deGFP과의 Arg로 수정 deGFP의 예상 질량은 각각 26,193 다 및 26204 다 있습니다. 각각의 스펙트럼은 최고 강도 (카운트)로 정규화된다. 피크 위치가 표시됩니다다한다. 시각화를 위해 겔 레인이 젤 이미지로부터 추출되고, 접합, 그레이 스케일로 변환되어, 크기가 최적화되어 콘트라스트뿐만 아니라 휘도가 향상된다. 원래 젤 레인은 보충 자료 (3)에 제시되어있다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 2a는 HYL 법인 실험의 예비 SDS-PAGE 평가를 보여줍니다. HYL 구비되는 무 세포 반응에서, deGFP가 표현된다. 첫 번째 실험과는 달리 약한 deGFP 대역 음성 대조군 반응에서 관찰 될 수있다. 이 무 세포 반응에서리스 잔류 물에 의한 수 있습니다. 이리스도 HYL도 첨가 된 대조군 반응에서 희미한 deGFP 발현을 가능하게한다.

H에 대한 PLC-ESI 질량 스펙트럼, HYL 구비 무 세포 반응 deGFP 분자 정제 및 버퍼 (도 2B)를 교환한다.

그림 2
HYL 법인 실험 그림 2. SDS-PAGE 평가 (A) 왼쪽에서 오른쪽으로. 음성 대조군 세포 무 반응, HYL 단백질 표준을 포함하는 무 세포 반응. (B) 그 태그 정제 한 후 SDS-PAGE 및 표현 deGFP 분자의 교환 버퍼. HYL에서 정제 deGFP 반응 단백질 표준을 포함​​ : 왼쪽에서 오른쪽으로. 시각화를 위해 겔 레인이 젤 이미지로부터 추출되고, 접합, 그레이 스케일로 변환되어, 크기가 최적화되어 콘트라스트뿐만 아니라 휘도가 향상된다. 원래 젤 레인은 보충 자료 3에 제시되어있다.F = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg"대상 = "_ 빈">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

도 3은 정제 deGFP 분자 deconvoluted 질량 스펙트럼을 나타낸다.도 3a는 무 세포 반응에 이미 존재하는 라이신 잔기의 가설을 확인한다. 스펙트럼의 주된 피크는 기본 deGFP (:​​ 26193 다 예상 질량)에 해당한다. 다시, 그 형광 물질을 개발하지 않은 다 이상 20 질량 deGFP 분자를 검출 할 수있다. 개의 Lys 잔기 우선적 네이티브 deGFP18Lys 높은 발현 수준에 이르는 리실 -의 tRNA 신테 tRNA에 의해리스 상에 로딩된다.

HYL과 라이신 간의 질량 차이는 16 다이다. 때문에 (모든 가능한 deGFP 종 생성 된 라이신 잔기 경쟁 deGFP18Hyl이다 HYL의 존재,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (그림 3B). 틀림없이 deGFP1Hyl 17Lys +의 피크는 형광체 (도 3A) 및 일부 피크의 질량이 예상 질량에서 2 개 이상의 다 다르다 생성되지 않은 네이티브 deGFP의 피크와 중첩. 이러한 질량 차이 때문에 deGFP 종 소량 높은 잡음에 기인 할 수있다. 그러나, HYL은 일반적으로 무 세포 시스템으로 통합된다. 추가 개선은 무 세포 반응에 라이신 잔기를 폐지하기 위해 수행되어야한다.

그림 3
. (: 성숙한 형광 26213 다없이 형광 26193 다 예상 질량) HYL를 함유하는 무 세포 반응의 정제 deGFP 분자도 3 HPLC-ESI 질량 스펙트럼 (A) 네이티브 deGFP18Lys 주로 검출된다. (B)확대 가능한 모든 deGFP 종 (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys)의 존재를 알 수있다. 이들 예상 질량이 26,193 다 N + 16 다 (N = 1, ..., 18)를 X. 스펙트럼은 최고 강도 (카운트)로 정규화된다. 피크 위치가 다에 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 1

보충 재 (1) 계산 템플릿. 제 2 항에있어서, 에너지 버퍼 마스터 믹스의 제조는 조 추출물 분취 액 30 μL와 최적 MG-각각이 3mm K 글루타메이트 농도 및 30 mm의 사용을들 수있다. 이 예는 3 에너지 버퍼 분취를 산출 마스터 믹스 볼륨에 연결됩니다. 초에서기 3 무 세포 반응의 준비는 무 세포 반응에서 10 nM의 최적의 벡터 DNA 농도를 선도하는 90 나노 DNA 원액을 사용을들 수있다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

조 추출물의 부피 : 28 μL, 최적의 Mg 글루타메이트 2 mm의 최적 K 글루탐산 : 40 mm의 수가 적절한 추적의 경우, 계산 템플릿의 사용은 위의 예와 다를 이러한 전형적인 값을 삽입하여 예시 (100), 무 세포 반응에 최적의 벡터 농도 : 8 nm의, DNA 벡터 원액 : 150 nm의 원하는 버퍼 씩의.

먼저 첫 번째 템플릿 섹션의 오렌지 필드에 조 추출물 볼륨으로 28 μl를 입력합니다. 그런 다음 두 번째 템플릿 섹션에 2 mM의를 입력D 40 밀리미터로 최적의 MG-와 오렌지 필드에 K-글루타메이트 농도. 고려하여 최적의 K-MG-및 농도, 15 ㎕의 에너지 버퍼의 조성물뿐만 아니라, 대응하는 최대 스케일링 된 16 μL의 분취 량을 산출한다. 다음, 그에 따라 에너지 버퍼 씩의 원하는 숫자 (16 μL)으로 100을 입력합니다. 100 mM의 마그네슘 - 글루타메이트 원액 204 ㎕의 3 M K 글루탐산 스톡 용액의 136 μL, 14 배의 에너지 용액 728.73 μL, 510 μL : 템플릿은 다음과 같이 1700 ㎕의 마스터 믹스를위한 다른 버퍼 성분의 양을 적응 40 %의 PEG-8000 및 121.27 ㎕를 멸균 DDH 2 O. 마지막으로, 세번째 주형 섹션 8 nM 내지 무 세포 반응의 최적 벡터 농도 150 nM의 각각의 DNA 벡터 원액 농도를 입력한다. 템플릿은 90 μL의 준비를 마무리 조 추출물의 28 μl를 추가해야합니다 다른 기기의 볼륨을 적응무 세포 반응을 다음과 같이 에너지 완충액 15 μL, 3 개의 다른 합성 아미노산 용액 중 하나의 15 μL, 벡터 DNA 용액 (150 ㎚)의 4.80 μL, 멸균 DDH 2 O.의 27.20 μl를

그림 2
모델 단백질 deGFP의 보충 자료 2. 문자를 하나의 아미노산 서열이.이 모델 단백질 (6)의 Arg, 18리스 위치가 포함되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
개별 기업들에 제시된 재료 3. 전체 길이 겔 이미지에 대응하는 미 변성 겔 레인 제시된도 1 및도 2 겔 레인 ubfigure은 동일한 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔로부터 추출된다. 그림 1과 2 이러한 차선에서 프리젠 테이션을 위해 함께 합류했다. 단백질 표준의 밴드 분자량 도면 옆에 표시된다. (A.1) 그림 1A의 자르지 젤 레인. 왼쪽에서 오른쪽으로 : 단백질 표준, 기준 셀 무 반응, 음성 대조군 및 무 세포 반응 수 대신의 Arg의 제공. (A.2) 그림 1B의 자르지 젤 레인. 캔 포함하는 반응 deGFP 정제 단백질 표준, 기준 반응에서 정제 deGFP : 왼쪽에서 오른쪽으로. (B.1) 그림 2A의 자르지 젤 레인. 부정적인 제어 무 세포 반응, HYL 단백질 표준을 포함​​하는 무 세포 반응 : 왼쪽에서 오른쪽으로. (B.2)도 2b의 자르지 젤 레인. HYL에서 정제 deGFP 반응 단백질 표준을 포함​​ : 왼쪽에서 오른쪽으로.D / 54273 / 54273supfig3large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

한 - 쉬운 -에 잔류 특히 단백질에 ncAAs를 통합 할 수있는 실행 가능한 전략으로 무 세포 발현 시스템을 사용하여 표시됩니다. 이 때문에, 조 추출물은 관심의 단백질 에너지 버퍼 대응 아미노산 벡터 DNA 코딩으로 보충된다. 원유 추출 나누어지는 볼륨이 조 추출물의 단백질 농도 (34)에 달려 있습니다. 무 세포 발현 효율은 벡터 DNA 구조의 농도에 따라 최적화된다. 에너지 버퍼 기기의 볼륨은 무 세포 발현 모델 단백질의 높은 수율을 가능하게하기 위해 최적화 및 MG-K-글루타메이트 농도의 함수로서 변화한다.

혼입 실험의 예비 평가는 미정 무 세포 반응 매질의 SDS-PAGE를 수행하여 얻을 수있다. 자세한 분석을 위해 HPLC-ESI 질량 스펙트럼을 완료 잔류 특정 incor를 확인하기위한 수단으로 제안미식 축구의의 poration. 후자에 대한 준비로서, 스핀 열 시스템은 그의 태그 정화를 활성화하고 우리는이 프로토콜에서 사용하는 작은 볼륨과의 교류를 버퍼링하는 데 사용됩니다.

HPLC-ESI 질량 스펙트럼 포함한 전체 프로토콜 2 일 내에 수행 될 수있다. 그것은 어떤 특히 중요한 단계가 포함되어 있지 않습니다. 그러나 농도 MG-및 K-글루타메이트의 최적화뿐만 아니라 벡터의 같은 DNA 모델 단백질의 높은 수율을 표현하기 위해 매우 중요하다. 고효율 발현 벡터의 사용 pBEST-OR2-OR1-PR-UTR1이-gene_of_model_protein는-T500는 것이 좋습니다. 그의 - 태그 단백질의 용출로 인해 이미 다졸의 높은 농도 (> 150 밀리미터) 등의 NaH 2와 같은 다른 염을 일반적으로 질량 분광 분석 (49) 높은 배경 잡음을 발생 PO 4 (> 300 밀리미터) 또는 염화나트륨 (> 50 밀리미터)입니다 . 적합한 단백질 저장 버퍼와 같은 용출 버퍼 교환 모델을 안정화 보호 자전거과 크게 질량 분광 분석시 배경 잡음을 줄일 수 있습니다.

결과적으로, 모델 단백질 내의 모든 여섯 위치의 Arg을 대체 할 수 있습니다. 발현 시스템에서, 어떠한의 Arg 잔기가 검출 될 수 없다. 이것은 더 고갈 전략 (29, 30)을 필요로하는 다른 발현 시스템에 비해의 Arg 유사체의 잔류 고유의 통합을 단순화합니다. 제시된 무 세포 접근 방식은 캔 독성에 기인 생체 접근 방법의 본질적인 한계, 또는 단일 단백질 생산 전략 24,31에서 mRNA의 순서에 강한 의존성을 우회. 체외 시스템에 사용되는 달리, 캔의 생체 내 분열은 호모 세린하고 hydroxyguanidine (31)를 발생 않습니다.

그러나, 무 세포 시스템은 HYL 같은 유사체과 경쟁리스 충분한 양을 유지한다. HPLC-ESI 질량 분광 분석 모델 단백질 양으로 C를 포함 도시anonical뿐만 아니라 다른 비율로 비정규 아날로그. 라이신 잔기의 특이 결합은 일반적으로 가능하지만, ncAAs 인식 용으로 최적화 완료 치환, 상기 공핍 전략 또는 특수하게 설계 및 Aars의 tRNA가 개발되어야 할 필요가있다.

우리는 정식 것과 같은 농도에서 NCAA를 추가하여 무 세포 발현, 변형 모델 단백질의 우수한 수율을 달성했다. 혼입 효율이 통합 될 수있는 NCAA의 성격에 따라 달라집니다. 더 높은 금리는 여전히 NCAA의 농도를 최적화함으로써 실현 될 수 있습니다.

제시된 결과는 그들이이 정규 내인성 번역 시스템에 의해 허용됩니다로 ncAAs의 잔류 특정 법인의 고용 시스템의 적용 가능성을 보여줍니다. 특정 ncAAs의 잔류 특정 법인의 경우, 하나의 추가 요구를 조사하는 경우 유사한 CAA의 distur의 잔류발현 시스템을 ㄱ.

무 세포 전사 번역 시스템은 다른 요구 (54)에 대응하는 다른 생물로부터 설계 될 수있다. 모든 E. 여기에 제시 무 세포 시스템의 대장균 전사 - 번역 기계는 박테리오파지와 E의 사용을 가능하게 콜라이 촉진제, 이들은 병렬로 캐스케이드 또는 연속적으로 (55)에 작용할 수있다. 일반적인 적용과 유용성이 방법은 아미노산의 독성 및 치료 응용 프로그램에 더 연구를위한 강력한 도구합니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20% precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5,000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8%) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99% VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1 mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5 ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1 L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4 L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 1 L bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or equivalent shaker able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or equivalent 5,000 x g rotor for the centrifuge above, able to centrifuge 1 L bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or equivalent heating block able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C.
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or equivalent vortex.
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or equivalent ice flaker machine.
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or equivalent incubator able to heat samples at 29 °C.
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or equivalent electrophoresis chamber able to perform vertical gel electrophoresis with the above precast gels or other gels used.
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or equivalent power supply able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or equivalent microplate reader able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302

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References

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation - Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d'analogues structuraux d'aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -J., Lee, K. -H., Kim, H. -C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2015).
  37. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  38. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  39. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  40. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  41. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  42. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  43. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  44. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2015).
  45. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  46. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  47. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  48. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  49. Hurst, R., Kobs, G., Johnson, T. Mass Spectrometric Analysis of MagneHis Purified Proteins. Promega Corporation Web site. , http://www.promega.de/resources/pubhub/enotes/mass-spectrometric-analysis-of-magnehis-purified-proteins/ (2003).
  50. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  51. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  52. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  53. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  54. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  55. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

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