Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Rest-spesifikk innlemmelse av Noncanonical Amino Acids inn Modell Proteiner Bruke en Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54273
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 3, 2, 1
1Department of Experimental Physics, Saarland University, 2Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3School of Physics and Astronomy, University of Minnesota

Abstract

Den kanoniske settet av aminosyrer fører til en usedvanlig bredt spekter av proteinfunksjonalitet. Likevel, det sett av rester fortsatt pålegger begrensninger på potensielle protein applikasjoner. Inkorporering av noncanonical aminosyrer kan forstørre dette omfang. Det er to komplementære fremgangsmåter for inkorporering av noncanonical aminosyrer. For stedsspesifikke inkorporering, i tillegg til de endogene kanoniske translasjonsforskning machineries, en ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetase-tRNA pair må gis som ikke samhandler med de kanoniske seg. Følgelig er et kodon som ikke er tilordnet til en kanonisk aminosyre, vanligvis et stoppkodon, er også nødvendig. Denne genetiske kode utvidelse muliggjør inkorporering av en noncanonical aminosyre ved en enkelt, gitt område i proteinet. Den her presenterte arbeidet beskriver rest-spesifikk innlemmelse hvor den genetiske koden er overført innenfor den endogene translasjonell system. Oversettelsen maskineri enccepts den noncanonical aminosyren som et surrogat for å innlemme den i kanonisk foreskrevne steder, det vil si, er alle forekomster av en kanonisk aminosyre i proteinet erstattes av en noncanonical. Inkorporering av noncanonical aminosyrer kan forandre proteinstrukturen, forårsaker betydelig modifiserte fysikalske og kjemiske egenskaper. Noncanonical aminosyreanaloger ofte virke som cellevekst-inhibitorer for ekspresjonsverter siden de modifisere endogene proteiner, noe som begrenser in vivo proteinproduksjon. In vivo-inkorporering av toksiske noncanonical aminosyrer i proteiner forblir spesielt utfordrende. Her blir en celle-fri tilnærming for en fullstendig erstatning av L-arginin ved den noncanonical aminosyren L-canavanine presentert. Det omgår de iboende vanskelighetene med in vivo-ekspresjon. I tillegg er en protokoll for å forberede målproteiner for massespektralanalyse inkludert. Det er vist at L-lysin kan erstattes av L-hydroksy-lysin,om enn med lavere effektivitet. I prinsippet kan en hvilken som helst noncanonical aminosyreanalog inkorporeres ved å bruke den fremlagte fremgangsmåten, så lenge den endogene in vitro-translasjonssystem gjenkjenner det.

Introduction

Den genetiske koden er universell til biosfæren. Det koder for et sett med 20 kanoniske aminosyrer, som er noen ganger forlenges med selenocystein en eller pyrrolysine to. Det er ribosomet som oversetter den genetiske koden ved hjelp av tRNA til kjeder av aminosyrer som foldes inn i proteiner. De funksjonelle gruppene av den kanoniske aminosyrer, i kombinasjon med posttranslational modifikasjoner, bidra til et usedvanlig bredt spekter av proteinfunksjon 3,4. I prinsippet kan funksjonelle begrensninger på grunn av begrenset sett med kanoniske aminosyrer bli overvunnet ved å innlemme ytterligere, noncanonical aminosyrer (ncAAs) som gjør det mulig for nye kjemikalier og ny funksjonalitet 3,4.

Det er to komplementære fremgangsmåter for inkorporering av ncAAs: den site eller den rest-spesifikk innlemmelse. Den tidligere metoden innebærer betydelige tekniske problemer, siden den kanoniske sett aminoacyl-tRNA-synthetases (Aars) og tRNAs må utvides med en ortogonal Aars-tRNA par som ikke må samhandle med endogen oversettelse maskiner. Basert på grundig engineering, inkorporerer denne tilnærmingen de ncAAs som enkeltpunktmutasjoner på de ønskede protein nettsteder. Sete-spesifikk innlemmelse av ncAAs er genetisk kodet for av et kodon som ikke er tilordnet til en kanonisk aminosyre (CAA), vanligvis et stoppkodon 5-9. Denne metoden medfører endringer i funksjon på et gitt område snarere enn på tvers av hele proteinet 10-13.

I kontrast, avhengig rest-spesifikk innlemmelse på feilaktig anerkjennelse av noncanonical aminosyre ved den kanoniske oversettelse maskiner. Inkorporeringen oppstår på grunn av manglende substrat spesifisitet av Aars. Resten spesifikke inkorporering av ncAAs, bygget på arbeidet til Cohen og medarbeidere 14, har ført til viktige applikasjoner 3,10, blant dem bio-ortogonale merking 15-17 av proteinereller strukturoppklaring av proteiner i røntgenkrystallografi 18.

Som naturlige Aars generelt foretrekker deres beslektet aminosyre over en isostrukturelle NCAA, effektiv in vivo rest-spesifikk innlemmelse vanligvis krever en auksotrop uttrykk verten ikke i stand til å syntetisere den kanoniske analog av NCAA. Vertscellene blir dyrket i vekstmedium som gir bare en lav konsentrasjon av det analoge CAA. Dens utmattelse i kombinasjon med påfølgende tilskudd med NCAA tvinger uttrykk vert å innlemme NCAA i modellen protein på flere, kanonisk foreskrevet nettsteder. I motsetning til den setespesifikke tilnærming, vanligvis har dette en dyp innvirkning på hele proteinstruktur, hvilket fører til betydelig modifisert fysikalske og kjemiske egenskaper av proteiner 19,20. Imidlertid har de fleste av de ncAAs er vekst inhibitorer for ekspresjon verten 3, som de er inkorporert i mange andre proteins foruten de av interesse i løpet av rekombinant genekspresjon. Dette begrenser klart in vivo tilnærming. In vivo-inkorporering av aminosyrer som er giftige eller har sterk innvirkning på proteinstrukturen forblir spesielt utfordrende. Men disse molekylene er blant de mest lovende for å konstruere proteiner med ekstraordinære funksjoner.

Et eksempel er giftig, noncanonical, naturlig forekommende L-canavanine (CAN), en analog av L-arginin (Arg). Det påvirker og blokker Arg tilhørende regulatoriske og katalytiske reaksjonsveier, og sin tilstedeværelse i den levende celle kan føre til umiddelbar død 3,21-23. Dens innlemmelse i proteiner på arginin posisjoner kan redusere proteinstabilitet 21-23. På grunn av den resulterende toksisitet, forblir ekspresjonen av canavanine inneholdende proteiner i Escherichia coli (E. coli) og andre vanlige ekspresjonsverter en utfordring. Av disse grunner, komplett in vivo incorporation av Can på alle Arg stillinger har riktig blitt bekreftet bare en gang 24, ved hjelp av en utdypet single-protein produksjonssystem. Kan imidlertid blitt foreslått som et middel mot kreft 25-27, og som en stimulator for autoimmune sykdommer i mennesker 28. I tillegg er det gjenstand for ulike studier på sin anti-metabolske, antibakteriell, soppdrepende og antivirale egenskaper 25. Disse egenskapene heve et behov for effektiv og enkel å utføre metoder for å uttrykke Kan inneholder proteiner for Farmasøytiske, medisinske og funksjonelle studier.

Selv om mange problemer som er knyttet til in vivo produksjon kan omgås ved å bruke cellefrie ekspresjonssystemer, in vitro rest-spesifikke tilnærmingsmåter har bare vært dårlig utforsket. Den celle-frie rest-spesifikk innlemmelse av en L-tryptofan analog 29 og multippel ncAAs 30 er rapportert. Disse fremgangsmåtene er basert på den meget efficient T7 RNA polymerase. T7 RNA polymerase innebærer bakteriofag-lignende transkripsjon, og dermed redusere genetisk funksjonalitet i forhold til endogen transkripsjon.

Den komplette rest-spesifikk innlemmelse av Can inn i en modell protein ved alle Arg posisjoner ble nylig rapportert 31, ved hjelp av et cellefritt ekspresjonssystem 32. En liten modifikasjon av det samme system aktivert sete-spesifikk innlemmelse av forskjellige pyrrolysine analoger inn i en modell-protein ved stoppkodon undertrykkelse 33. Den anvendte cellefritt system 31-33 er basert på en helt E. coli transkripsjon-oversettelse system. Ikke desto mindre gjør det proteinekspresjon så effektivt som i dagens bakteriofag systemer (0,5 til 1 mg / ml av rekombinant protein) 32, og samtidig beholde mye av den opprinnelige transkripsjon-translation modularitet.

I dette arbeidet er en detaljert protokoll gitt på hvordan residue-spesifikk innlemmelse av ncAAs kan realiseres, ved hjelp av denne alt E. coli cellefritt system 32. I tillegg er ytterligere skritt for å forberede de uttrykte proteiner for nødvendig utredning via HPLC-ESI massespektroskopi foreslått. Å utvide egenskapene til denne cellefritt system, gjør dette arbeidet ikke bare henvise til den publiserte inkorporering av Can 31, men presenterer også nye data knyttet til noncanonical L-lysin analog L-hydroxy-lysin.

Den følgende protokoll for rest-spesifikk innlemmelse av ncAAs er en tilpasning av en protokoll nylig publisert i Jove 34. Sistnevnte protokollen beskriver hvordan du utfører svært effektiv celle-frie uttrykk med standard aminosyrer. Videre presenterer det ved fremstillingen av det urene cellefrie ekstrakt, aminosyreoppløsningen, energien stamløsning og energibufferen som brukes i denne fremgangsmåten. Følgende protokoll fokuserer på modifiserte fremgangsmåten i forhold til den foregående protocol for å aktivere rest-spesifikke inkorporering av ncAAs. Kalibrerte pipetter, lav-bindende pipettespisser og mikro-sentrifugerør anbefales for preparatet. I det følgende er IUPAC-forkortelser for aminosyrene anvendes.

Protocol

Forsiktig! Ta kontakt med alle relevante sikkerhetsdatablad (MSDS) før bruk. Flere av kjemikaliene er akutt giftige. Personlig verneutstyr er nødvendig (eyeshield, støvmaske, hansker, frakk, full lengde bukser, lukket-toe sko) så vel som arbeider i en avtrekkshette.

1. aminosyreløsning Fremstilling

  1. Stamløsning utarbeidelse av NCAA (168 mm)
    MERK: stamløsning utarbeidelse av NCAA er beskrevet for Arg analog Kan som et eksempel. Følgelig tilpasse verdiene for andre ncAAs.
    1. Plasser en 1,5 ml reaksjonsrøret på en mikro. Veie ut 46,1 mg av Can inne i reaksjonsrøret for fremstilling av 1 ml av en 168 mM oppløsning. Bruk en steril microspatula. For en racemisk blanding av svømming, doble konsentrasjonen av stamløsningen.
    2. Legg 977 mL sterilt DDH 2 O. Grundig vortex før Can er jegn fullstendig oppløsning.
      NB: For et totalt oppløsningsvolum på 1 ml, har de fysiske volumet av den oppløste aminosyre som skal erstattes. For en hvilken som helst av aminosyrene, anslag halvparten av den faste masse i mg som det tilsvarende volumøkningen i pl (100 mg fast stoff tar et volum på 50 ul i løsningen) 35. De fleste aminosyrer kan oppløses ved denne konsentrasjonen. Hvis ikke, redusere konsentrasjonen inntil fullstendig oppløsning.
    3. Direkte bruke NCAA stamløsning for utarbeidelse av aminosyre løsninger i kapittel 1.2 eller flash fryse den i flytende nitrogen og lagre det ved -20 ° C. OBS! For sikkerhets skyld bære en eyeshield og Kryotermostater hansker for å være beskyttet mot væske nitrogen sprut.
  2. Fremstilling av amino-syreoppløsninger
    MERK: For utarbeidelse av aminosyre løsninger, bruker aminosyren sampler gir L-isomerer av de 20 CAAS i eget lageroppløsninger (1,5 ml, bufret med HEPES / KOH, <0.1% NaN3, pH 7,5), hver ved en konsentrasjon på 168 mM, med unntak av L-leucin (140 mM). For en hjemmelaget utarbeidelsen av stamløsninger (bufret med KOH), følg denne protokollen 35.
    1. Tine stamløsninger av de 20 CAAS (aminosyre sampler eller utarbeidet i henhold til 35) og av NCAA (utarbeidet i avsnitt 1.1) ved RT.
    2. Etter tining, ofte Vortex lager løsninger for å oppløse eventuelle utfelte aminosyrer. Som noen aminosyrer er vanskeligere å oppløse, inkubere dem i en varmeblokk ved 37 ° C inntil fullstendig oppløsning. Cys kanskje ikke fullt oppløses. Legg alle aminosyrene på is, bortsett fra Asn, Phe og Cys - holde disse ved RT for å unngå utfelling.
    3. Bruk følgende verdier å bruke en syvendedel av hele settet.
      MERK: skalere ned hensiktsmessig å arbeide med mindre volumer og for å spare deler av kit for videre eksperimenter. Skalere opp for innarbeidelseion av ncAAs inn i modellproteiner i stor skala. For å hindre hyppig tining, som er egnet til å redusere stabiliteten av aminosyrene, alikvot de individuelle aminosyrerstamløsninger i volumer på 200 pl. Denne 200 ul alikvot volum og alikvoten volumer som benyttes i trinn 1.2.4.1 står for tap på grunn av pipettering.
    4. Først forberede en aminosyre mester mix løsning som vil bli delt i trinn 1.2.4.3 å fullføre utarbeidelsen av 3 annerledes sammensatt aminosyre løsninger (pkt 1.2.5 - 1.2.7). I disse løsningene, konsentrere alle aminosyrene i 6 mM, bortsett fra Leu (5 mM).
      1. Overføring 1,4 ml sterilt DDH 2 O inn i et 15 ml sentrifugerør. Sett det på is. Legg 175 ul av hver aminosyre stamløsning. Legge til den ene etter den andre, med unntak av stamløsningen av den CAA (f.eks Arg) for å bli erstattet av svømming (f.eks, Can). Grundig vortex etter hvert tillegg og sette oppløsningen tilbake på isen.
        NOTAT:Leu er på 5 mM i 3 forskjellig komponert aminosyreoppløsninger, sammenlignet med 6 mM for de andre aminosyrer. Den reduserte konsentrasjonen reduserer ikke uttrykket effektivitet. Skalere opp til 6 mM egner seg også.
      2. Overfør aminosyren stamløsninger i følgende rekkefølge for å unngå utfelling: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr Leu, og Cys. Husk å ikke legge til stamløsning av Luftfartstilsynet (f.eks Arg) som er analog til NCAA (f.eks Can). Endelig grundig vortex. Inkuber ved 37 ° C for å gjøre oppløsningen så klart som mulig.
      3. Splitte denne aminosyren masterblanding løsning i tre like store volumer av 1,35 ml. Overfør hver av de splittede volumer i 1,5 ml reaksjonsrørene. Hold dem på is.
    5. Fremstille en aminosyre løsning som består av alle 20 CAAS ved en konsentrasjon på 6 mM av hver, med unntak av Leu det er 5 mM. Til første bind of 1,35 ml, som et resultat av den delte i trinn 1.2.4.3, tilsett 50 pl av 168 mM stamløsning av CAA (f.eks Arg) som er analog med svømming (f.eks Can). Grundig vortex.
      1. Sett tilbake på isen. Alikvoter av denne løsning 1,4 ml i volumer på 16 ul til reaksjonsrørene. Legg merke til at denne løsningen volum ca. fører til 85 aliquoter. Merk disse porsjoner "+ CAA" (f.eks + Arg).
      2. Flash fryse porsjoner i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. OBS! For sikkerhets skyld bære en eyeshield og Kryotermostater hansker til beskyttelse mot flytende nitrogen sprut.
    6. Forbered en aminosyre løsning som består av 19 CAAS bortsett fra CAA (f.eks Arg) som er analog til NCAA (f.eks, Can). Legge til hver aminosyre i en konsentrasjon på 6 mm, med unntak av Leu (5 mM).
      1. Tilsett 50 ul sterilt DDH 2 O til den andre volum på 1,35 ml, som et resultat av den deltei trinn 1.2.4.3. Grundig vortex og satt tilbake på isen. Alikvoter av denne løsning 1,4 ml i volumer på 16 ul til reaksjonsrørene. Legg merke til at denne løsningen volum ca. fører til 85 aliquoter. Merk disse porsjoner "- CAA" (f.eks - Arg).
      2. Flash fryse porsjoner i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. OBS! For sikkerhets skyld bære en eyeshield og Kryotermostater hansker for å være beskyttet mot nitrogen sprut.
    7. Forbered en aminosyre blanding som inneholder 19 CAAS og NCAA (f.eks Can) som erstatter den kanoniske (f.eks Arg). Legge til hver aminosyre i en konsentrasjon på 6 mm, med unntak av Leu (5 mM). Til den siste 1,35 ml volum, som et resultat av den delte i trinn 1.2.4.3, tilsett 50 pl av 168 mM stamløsning av svømming (f.eks Can). Merke det "+ NCAA" (f.eks + Can). Grundig vortex og satt tilbake på isen.
      1. Alikvoter av denne løsning 1,4 ml i volumer på 16 & #181; l til reaksjonsrørene. Legg merke til at denne løsningen volum ca. fører til 85 aliquoter. Merk disse porsjoner "+ NCAA" (f.eks + Can).
      2. Flash fryse porsjoner i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C. OBS! For sikkerhets skyld bære en eyeshield og Kryotermostater hansker for å være beskyttet mot nitrogen sprut.
        MERK: De 16 mL delmengde volumer som brukes i trinn 1.2.5.1, 1.2.6.1 og 1.2.7.1 er litt høyere enn nødvendig for å ta høyde for tap på grunn av pipettering.

2. Energi Buffer Klargjøring

MERK: Hver batch av råolje ekstrakt er unik og krever optimalisert konsentrasjoner av Mg- og K-glutamat 34. Det rå ekstrakt alikvot volum er avhengig av proteinkonsentrasjonen 34. Bruk den medfølgende beregningsmal (Supplemental Material 1) for forskjellige verdier. Finn flere instruksjoner i Supplemental Material en figur legende, explaining hvordan å ansette denne malen.

  1. Forbered og oppbevares ved -80 ° C til 14x energiløsning og råolje ekstrakt porsjoner i henhold til den umodifiserte protokoll 34. Kalibrere olje ekstrakt avhengig av Mg- og K-glutamat konsentrasjoner for optimal uttrykk effektivitet 34.
    MERK: Den endelige sammensetningen av 14x energiløsningen er: 700 mm HEPES (pH 8), 21 mM ATP, 21 mM GTP, 12,6 mM CTP, 12,6 mM UTP, 2,8 mg / ml tRNA, 3,64 mM CoA, 4,62 mM NAD, 10,5 mM cAMP, 0,95 mM folinsyre, 14 mM spermidin, 420 mm 3-PGA.
  2. Tine på is 100 mM Mg-glutamat stamløsning, 3 M K-glutamat stamløsning, 14x energiløsning og 40% PEG-8000 for å forberede master mix. Hold dem på is.
  3. Bland 9,18 mL 100 mM Mg-glutamat stamløsning, 3,06 mL av 3 M K-glutamat stamløsning, 21,86 mL av 14x energiløsning, 15,3 mL av 40% PEG-8000 og 1,6 mL sterilt DDH 2 O i en reaksjon tube. Grundig vortex denne mastener bland etter hvert tillegg, og holde den på is.
  4. Delmengde master mix (51 mL) i volum av 16 pl (3 porsjoner) i reaksjonsrørene. Ofte vortex master mix under alikvoteringsprosessen. Flash fryse alikvotene i flytende nitrogen.
    MERK: 16 ul alikvot volum samt konsentrat-blanding volum er litt høyere enn det som kreves for å ta hensyn til tap på grunn av pipettering.
  5. Bruk en sil for å samle energi buffer rør. Oppbevar rørene ved -80 ° C. OBS! Bruk en eyeshield og Kryotermostater hansker for å være beskyttet mot nitrogen sprut.

3. Forberedelse og gjennomføring av Cell-free reaksjoner for Residue-spesifikk innlemmelse av ncAAs

  1. Først forberede DNA vektor løsning i DDH 2 O.
    1. For svært effektiv protein uttrykk, bruker uttrykket vektor pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. Klone genet som koder for proteinet modellen inn i denne vektoren 36,37 </ Sup>.
      MERK: Du kan også bruke andre arrangører som er anerkjent av σ 70 også, men merk at uttrykket effektivitet kan reduseres.
    2. Transform 37,38 vektoren i E. coli stamme KL 740 32 (Yale CGCs #: 4382), rense amplifisert vektor DNA 37,39 og kvantifisere konsentrasjonen av DNA-oppløsningen 40-42. Oppbevar DNA løsningen ved -20 ° C eller direkte bruke det for celle-fee reaksjon forberedelse (trinn 3.4.1, 3.4.2 og 3.4.3).
  2. Kalibrer cellefrie ekspresjon effektivitet avhengig av den anvendte konsentrasjon vektorkonstruksjonen i henhold til den umodifiserte protokollen 34. Bruke den optimale konsentrasjonen som fører til høyeste proteinutbytter for det cellefrie preparat reaksjon (trinn 3.4.1, 3.4.2 og 3.4.3).
    MERK: Fremstillingen av cellefrie reaksjoner er eksemplifisert ved hjelp av en 90 nM vektor-DNA stamoppløsning som fører til en endelig vektor konsentrasjon på 10 nM i det cellefriereaksjon og følger de ovennevnte optimale verdier av Mg- og K-glutamat samt ekstrakten alikvoten volum. Bruk beregningen mal for forskjellige verdier.
  3. Tine på is 3 råekstrakt alikvoter hver på 30 ul volum (fremstilt i henhold til ikke-modifisert protokoll 34), en aminosyreoppløsning aliquot merket "+ CAA" (for eksempel + Arg), en aminosyreoppløsning aliquot merket "- CAA" (f.eks - Arg) og en aminosyre løsning delmengde merket "+ NCAA" (f.eks + Kan) (fremstilt i avsnitt 1.2.5 - 1.2.7), 3 energi buffere porsjoner (utarbeidet i seksjon 2) og vektor-DNA løsningen ( utarbeidet i avsnitt 3.1).
    MERK: Den rå ekstrakt er litt tyktflytende, og det kan inneholde luftbobler. Fjerne luftbobler ved sentrifugering ved 10 000 xg i 30 sekunder ved 4 ° C. Sett råolje ekstrakt porsjoner tilbake på isen.
  4. Forbered 3 annerledes komponert cellefrie reaksjoner (hver 90 mL endelig volum) ved å blande rå ekstrakt (33,33%), energibuffer (16,67%), en av de 3 på en annen måte sammensatt aminosyreløsning alikvoter (16,67%) og vektor-DNA oppløsning. Eventuelt legge til flere biomolekyler (DNA, proteiner, tRNA, etc.), men på riktig måte redusere volumet av DDH 2 O.
    1. Forbered referansecellefrie reaksjon (90 ul) som uttrykker det ikke-modifiserte modell protein.
      1. Tilsett 15 ul energibuffer, 15 ul av aminosyren løsning aliquot merket "+ CAA" (for eksempel + Arg), 10 ul 90 nM vektor DNA-oppløsningen og 20 ul sterilt DDH 2 O til 30 pl av råolje ekstrakt. Bland ved å pipettere opp og ned og forsiktig vortex etter tilsetningen av hver ingrediens.
      2. Alikvoter på 90 ul cellefrie reaksjon i 15 like volumer av 6 ul. Overfør hver av de 15 volumer inn i en separat reaksjonsrøret. Lukk rørene og sette dem tilbake på isen. Merk alle reaksjonsrørene som "CFR (+ CAA)" (f.eks CFR (+ Arg)).
      2. (f.eks Arg) og heller ikke noncanonical analog (f.eks, Can) tilsettes.
      1. Tilsett 15 ul energibuffer, 15 ul av aminosyren løsning aliquot merket "- CAA" (for eksempel, - Arg), 10 ul 90 nM vektor DNA-oppløsningen og 20 ul sterilt DDH 2 O til 30 pl av råolje ekstrakt. Bland ved å pipettere opp og ned og forsiktig vortex etter tilsetningen av hver ingrediens.
      2. Alikvoter på 90 ul cellefrie reaksjon i 15 like volumer av 6 ul. Overfør hver av de 15 volumer inn i en separat reaksjonsrøret. Lukk rørene og sette dem tilbake på isen. Merk alle reaksjonsrørene som "CFR (CAA)" (f.eks CFR (Arg)).
    2. Forbered cellefrie reaksjon (90 mL) som er ment til rest-spesifikt innlemme NCAA (f.eks, Can) i uttrykt modell protein.
      1. Tilsett 15ul av energi-buffer, 15 pl av aminosyreløsning aliquot merket "+ svømming" (for eksempel + Can), 10 ul 90 nM DNA-oppløsningen og 20 ul sterilt DDH 2 O til 30 pl av råekstrakt. Bland ved å pipettere opp og ned og forsiktig vortex etter tilsetningen av hver ingrediens.
        MERK: Uttrykket effektiviteten kan bli redusert sammenlignet med ekspresjon med standard aminosyrer. Hvis det er nødvendig, er det bare å skalere opp den cellefrie reaksjonsvolum.
      2. Alikvoter på 90 ul cellefrie reaksjon i 15 like volumer av 6 ul. Overfør hver av de 15 volumer inn i en separat reaksjonsrøret. Lukk rørene og sette dem tilbake på isen. For økt reaksjonsvolumer følgelig delmengde i ytterligere volumer av 6 pl. Merk alle reaksjonsrørene som "CFR (+ NCAA)" (f.eks CFR (+ Can)).
  5. Inkuber alle rør ved 29 ° CO / N.
    MERK: Bare små reaksjonsvolumer aktiver tilstrekkelig oksygen diffusion i reaksjons som er avgjørende for svært effektiv proteinekspresjon. Reaksjonsvolumer større enn 10 mL krever aktiv oksygenering gjennom agitasjon 34. For store volumer, delt inn i reaksjonsvolumet er mindre enn 15 ul.
  6. Etter celle ytringsfrihet, bassenget alle likt sammensatt delt celle-frie reaksjoner av 6 pl. Først basseng alle 15 delte celle-frie reaksjoner av 6 ul merket "CFR (+ CAA)" (f.eks CFR (+ Arg)). Deretter, pool alle 15 delte celle-frie reaksjoner av 6 ul merket "CFR (CAA)" (f.eks CFR (Arg)). Til slutt, basseng alle 15 delte celle-frie reaksjoner av 6 ul merket "CFR (+ NCAA)" (f.eks CFR (+ Can)). For økt reaksjonsvolumer følgelig basseng ytterligere volumer av 6 pl.
  7. Sjekk uttrykket nivået av modellen protein i alle tre samlet, annerledes sammensatt cellefrie reaksjoner ved å utføre denaturerende SDS-PAGE 43,44 (punkt 4.1).
    MERK: Bruk denne meto d for en foreløpig evaluering av inkorporering forsøket.
  8. Forbered cellefrie uttrykte modell proteiner for en hensiktsmessig analyse via HPLC-ESI massespektroskopi (punkt 4.4). Først rense 45 dem (punkt 4.2). Til slutt, bytte buffer (punkt 4.3) for å unngå høye bakgrunnsstøy under massespektroskopi.
    MERK: Seksjonene 3.4.1, 3.4.2 og bly 3.4.3 til typiske cellefrie reaksjonsbetingelser 34: 08.09 til 09.09 mg / ml protein (fra rå ekstrakt), 04.05 til 10.05 mM Mg-glutamat, 40-160 mm K-glutamat, 1 mM av hver aminosyre, bortsett fra leucin, 0,83 mM leucin, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP og GTP, 0,9 mM CTP og UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP , 0,068 mM folinsyre, 1 mM spermidin, 30 mm 3-PGA, 2% PEG-8000 og 10 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Om ønsket, kan en annen fremgangsmåte av cellefritt preparat reaksjon gjennomføres som fører til de ovenstående reaksjonsbetingelser.
le "> Foreløpig evaluering via SDS-PAGE 43,44 og klargjøring av Cell-free Uttrykt Modell Proteiner for HPLC-ESI massespektrometri 4.

  1. SDS-PAGE av cellefritt reaksjoner
    MERK: Utfør denaturere SDS-PAGE for en rask og foreløpig analyse av de uttrykte proteiner uten ytterligere rensing eller utvinning, og utføre følgende trinn.
    1. Tine protein standard på is. Sikre at den består av proteiner med molekylvekter tilsvarende til det uttrykte proteinet modell for dens lokalisering på gelen (trinn 4.1.13).
      MERK: Her tilveiebringer den brukte standard proteiner over et bredt område av molekylvekter (myosin: 212 kDa, maltose-bindende-protein-β-galaktosidase: 158 kDa, β-galaktosidase: 116 kDa, fosforylase b: 97 kDa, serumalbumin : 66 kDa, glutaminsyre-dehydrogenase: 56 kDa, maltose-bindende protein: 43 kDa, tioredoksinreduktase: 35 kDa, triosefosfatisomerase: 27 kDa, trypsin inhibitor: 20 kDa, lysozyme: 14 kDa, aprotinin: 7 kDa, insulin A: 3 kDa, B-kjeden: 2 kDa).
    2. Siden cellefrie reaksjoner er lett viskøs på grunn av det høye proteinkonsentrasjon, fortynne dem med sterilt DDH 2 O 5 - 10 ganger før SDS-PAGE for å sikre hensiktsmessig gel migrering og for å unngå metning etter farging. For ikke å kaste bort for mye prøven, fortynn 1 mL av cellefrie reaksjon i 4 ul sterilt DDH 2 O. Forbered fortynning i reaksjonsrørene, grundig vortex og kort tid spinne væsken ned med en mini sentrifuger i 2-3 sek ved 2000 x g.
    3. Tilsett 5 ul av 2x ladningsbuffer til 5 ul fortynnet cellefritt reaksjon. Grundig vortex og spinne ned med en mini sentrifuger i 2-3 sek ved 2000 x g.
      MERK: Her, etter tilsetning, er biomolekyler ble oppløst i 62,5 mM Tris / Cl -, 10% glycerol, 2% SDS, og 0,0025% bromfenolblått ved pH 6,8, en typisk sammensetning. Bruk av andre lastefargestoffer som fører til litt forskjellig fortynning cold kan være egnet i tillegg.
    4. Grundig vortex-proteinet standard og overfør 15 pl av den inn i et reaksjonsrør.
      MERK: Avhengig av gel størrelse og for andre protein standarder, kan det anbefalte volumet avvike fra de ovennevnte.
    5. Plasser reaksjonsrørene inn i en varmeblokk. Sjekk om lokkene av rørene er ordentlig lukket. Oppvarm til 95-100 ° C i 3 - 5 min. Gjør dette for å denaturere proteiner og for å aktivere SDS-innpakning rundt protein ryggrad.
      MERK: Noen protein standarder må ikke varmes opp, se leverandørens anvisninger.
    6. I mellomtiden overføre buffer til gelelektroforese kammeret. Innholdet av 1 x rennende buffer er 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS ved pH 8,3 (med HCl).
    7. Feste den ferdigstøpte 4-20% gradient Tris-Glysin-SDS-gel (10 cm x 10 cm x 1 mm) til det elektroforese kammeret. Fjern kammen og skyll brønnene med en sprøyte lastet med rennende buffer.
      MERK: Gelen konsentrasjon strongly avhenger av størrelsen og arten av det uttrykte proteinet modell. Ovennevnte konsentrasjon skiller E. coli-råekstraktet proteiner samt lav molekylvekt modellproteiner. Selvstøpt geler egner seg også.
    8. Fjern rørene fra varmeblokken. Spinn væsken ned med en mini sentrifuger i 2-3 sek ved 2000 x g. Kort tid vortex og gjenta spinne ned for 2-3 sek ved 2000 x g.
    9. Overfør 15 ul proteinstandard (i 24 - 48 ug protein) og 10 ul (11-22 pg protein) av hver prøve inn i brønnene og begynne elektroforese. Her blir SDS-PAGE utført ved 125 V og 20 - 40 mA i ca. 90 min, en typisk protokoll.
    10. trekke forsiktig gel fra kassetten. Overfør den inn i fikseringsløsning (50% metanol, 10% eddiksyre, 40% DDH 2 O) i 30 min. OBS! Metanol er giftig ved innånding og hudkontakt. Bruk vernehansker og arbeid under en avtrekkshette.
    11. Overfør gelen til fargeløsning (0,025% Coomassie brilliant blue G-250, 10% eddiksyre, 90% DDH 2 O). Flekk i 60 min.
    12. Overfør gelen til avfarging oppløsning (10% eddiksyre, 90% DDH 2 O) i 60 - 120 min.
      MERK: Reparasjon, farging og avfarging sterkt avhengig av størrelsen og arten av det uttrykte protein. Denne protokollen gjelder for et bredt spekter av proteiner av ganske små molekylvekter 46.
    13. Forskyve gelen på en matt transparent på en hvit bakgrunn som genererer en passende kontrast til de fargede proteinbåndene.
  2. Rensing av His-merket 45 modellproteiner fra den cellefrie reaksjoner
    MERK: For protein rensing, flere metoder finnes som leverer lignende resultater. Denne protokollen renser cellefrie uttrykte modell proteiner som har en C-terminal polyhistidin-tag (His-tag). Den bruker en rensing kit egnet for proteiner som er expressed i de små reaksjonsvolumer av cellefri proteinekspresjon. Det er identisk for rensing av innfødte eller modifiserte modell proteiner. Således er det generelt beskrevet på basis av en enkelt cellefritt reaksjon.
    1. For en passende HPLC-ESI massespektroskopi, trekke ut og rense modell proteiner fra cellen frie reaksjon og utføre følgende trinn.
      1. Blande like volumer av 90 - 150 ul av His-bindingsbuffer og 90 - 150 ul av cellefritt reaksjon. Pipettere opp og ned, etterfulgt av forsiktig risting.
        MERK: Ved hjelp av Hans-bindingsbuffer anbefales. Imidlertid kan celle-frie reaksjonsmediet være et utgangsmateriale, så lenge produktet er løselig protein, er pH mellom 7,5 - 8, imidazol / His-konsentrasjonen er <10 mM, konsentrasjonen av sterke reduksjonsmidler er <15 mM og ikke metall- chelaterende midler er til stede. Hvis blandingen volum overstiger 300 gl, dele den i like store volumer og delmengde teser volumer i ulike reaction rør for følgende rensetrinn.
      2. Forbered kolonnen system. Grundig vortex stamløsning av His-affinitetsgel til gelen harpiksen er fullstendig oppløst. Overfør 250 ul av gel-resin kolonnen. Bruk en 1 ml pipette tips for viskøs gel harpiks. Plasser kolonne i et oppsamlingsrør.
      3. Sentrifuger kolonne / oppsamlingsrør i 5 - 10 s ved 13 000 - 15 000 x g. Sørg for at gelen harpiksen er helt utladet. Hvis ikke, forlenge sentrifugeringstid av ytterligere 5-10 sek, men vær oppmerksom på at affinitet gel er ikke over-tørket. Følgelig forlenge sentrifugeringstid i trinn 4.2.1.5, 4.2.1.7 og 4.2.1.9.
        MERK: Gelen harpiks er helt utladet hvis det blir stiv og ingen supernatant forblir på toppen.
      4. Overfør 150 - 300 ul av den cellefrie reaksjon / His-bindingsbuffer til kolonnen. Hvis blandingen volum overstiger anbefalte volum, fordelt over flere spinn kolonner. Resuspender gel harpiks av frequent tapping og forsiktig vortexblanding ved en inkubasjonstid på minst 2 min. For volum større enn 200 gl, inkuber i ytterligere 1-2 min.
        MERK: Tilstrekkelig inkubasjonstiden er avgjørende for binding av modellproteiner til gelen harpiksen.
      5. Sentrifuger kolonne / oppsamlingsrør i 5 - 10 s ved 13 000 - 15 000 x g. Kast gjennomstrømnings og plassere kolonnen tilbake inn i oppsamlingsrøret.
      6. Tilsett 250 mL av Hans-vaskebuffer. Resuspender gel harpiks ved å trykke og skånsom virvling.
      7. Sentrifuger kolonne / oppsamlingsrør i 5 - 10 s ved 13 000 - 15 000 x g. Kast gjennomstrømnings og plassere kolonnen tilbake inn i oppsamlingsrøret. Gjenta trinn 4.2.1.6 og sentrifuger igjen for 5-10 sek på 13 000 - 15 000 x g.
      8. Plasser kolonne inn i en standard 1,5 ml reaksjonsrøret. Legg 150 ul elueringsbuffer og resuspender gelen harpiks ved å velge og forsiktig risting. Reduser volumet til 100 pl for høyere renset modell protein contrasjoner etter eluering i neste trinn 4.2.1.9.
        NB: Den totale mengde av renset modell proteinet kan bli redusert på grunn av mulig ufullstendig eluering av alle gel harpiksbundne proteiner, hvis elueringsbufferen volumet reduseres.
      9. Sentrifuger kolonne / reaksjonsrøret i 5 - 10 s ved 13 000 - 15 000 x g for å fortynne det rensede protein i elueringsbufferen. Hvis delt før, basseng alle løsninger i en stamløsning.
      10. Før man utfører bufferbytte, bestemme proteinkonsentrasjonen ved hjelp av standardmetoder, f.eks, Bradford assay 47,48.
        MERK: For en passende HPLC-ESI massespektroskopi (punkt 4.4), bruker optimale proteinkonsentrasjoner som er vanligvis ca 0,5 mg / ml med nødvendige volumer av 20 - 50 pl. Dersom konsentrasjonen er lavere enn 0,2 mg / ml, konsentrere proteinløsningen etter at bufferbytte ved hjelp av en roterende vakuum-konsentratoren. I dette tilfellet først lese avsnittet 4.3.8 til riktig tilpasse utveksle buffer.
  3. Buffer bytte for HPLC-ESI massespektroskopi
    MERK: Skift ut His-tag elueringsbuffer for å unngå høy bakgrunnsstøy i massespektroskopianalyse på grunn av høy konsentrasjon av imidazol (> 150 mM) og andre salter, så som NaH 2PO 4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM) 49. Følgende buffer utveksling protokollen bruker en prehydratiseres gelfiltrering spinnkolonne system. Den er identisk utført for native eller modifiserte modell proteiner. Således er det generelt beskrevet på basis av en enkelt cellefritt reaksjon. Legg merke til at det er andre som er enkle å utføre bufferutvekslingsmetoder, for eksempel mini-dialyse patroner.
    1. Fremstille 100 ml protein lagringsbuffer (50 mM Tris-Cl pH 8, 100 mM NaCl og 10% glycerol). Vei ut i en autoklaveres 100 ml flaske 605,7 mg Tris-Base, 584,4 mg NaCl og tilsett 10 ml glyserol. Fyll opp til ca 80 ml og justere pH-verdien til 8 ved hjelp av endding NaOH. Stadig kontrollere pH-verdien med et pH-meter. Til slutt, fyll opp til 100 ml.
      Merk Bruk denne buffer for å stabilisere et bredt spekter av modellproteiner og ikke å forstyrre massespektroskopi, så lenge HPLC utføres før massen spektroskopiske måling. Imidlertid, avhengig av naturen av det uttrykte proteinet modellen, bruke andre buffere som kan være bedre egnet. Hvis målet ditt protein er ikke stabilt ved pH 8, justere pH tilsvarende. Ikke bruk høyere glyserol konsentrasjoner.
    2. Varm opp gel filtrering spinnkolonner i minst 15 min til RT.
    3. Resuspender prehydratiseres gel ved forsiktig tapping eller virvling og fjerne luftbobler.
    4. Først fjerne bunnlokket, og deretter ta den øverste cap unna. Plasser kolonne inn i en vaske rør (minst 2 ml). Overfør kolonne / vaskerøret inn i sentrifugen. Hver kolonne besitter en orientering mark. Sentrifuger ved 1000 x g i 2 min for å fjerne gelen lagringsbuffer. Plateard gjennomstrømnings.
      MERK: Vær oppmerksom på videre i denne rekkefølgen. Sørg for at kolonnen har samme retning i alle ytterligere sentrifugeringstrinn.
    5. Legg opp til 400 mL av protein lagring buffer. Sentrifuge i 2 minutter ved 1000 x g. Gjenta dette til helt laste protein lagring buffer i gel. Tilsett forsiktig opp til 100 pl av oppløsningen av det rensede protein modell. Pipetter direkte på sentrum av gellaget.
      MERK: Løsnings volumer av rensede proteiner, særlig av modifiserte proteiner, kan være høyere. Splitte slike løsninger gjennom flere buffer utveksling kolonner. Proteiner må ha molekylvekter høyere enn 5 kDa for denne type bufferbytte.
    6. Plasser kolonne i et oppsamlingsrør og sentrifuge i 2 minutter ved 1000 x g.
      MERK: Dette trinnet fører til fortynning av det rensede modellprotein i proteinlagringsbuffer. Hvis delt før, basseng alle løsninger i en stamløsning.
    7. Flash fryse the proteinløsning i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C eller direkte analysere den via HPLC-ESI massespektroskopi 50 (punkt 4.4). OBS! Bruk en eyeshield og Kryotermostater hansker for å være beskyttet mot nitrogen sprut.
    8. Utfør følgende trinn i protokollen for å konsentrere proteinet løsning ved hjelp av en roterende vakuum konsentrator som nøye fordamper løsemiddelet 51.
      MERK: Disse trinn er nødvendig hvis proteinkonsentrasjonen er for lav for HPLC-ESI massespektroskopi (<0,2 mg / ml). Løsningen volum og modell proteinkonsentrasjonen er omtrent den samme før og etter bufferbytte. Konsentrasjonsprosessen er beskrevet ved hjelp av følgende eksempel: Etter His-tag rensing, er modellen proteinet løst opp i 100 ul His elueringsbuffer (trinn 4.2.1.9) og har en konsentrasjon på 0,07 mg / ml (trinn 4.2.1.10) .
      1. For å sikre at proteinkonsentrasjonen og oppløsningsvolumet er etter fordampning vedminst 0,2 mg / ml og 20 ul henholdsvis fortynnet, før bufferbytte, proteinlagringsbuffer fremstilt i trinn 4.3.1 minst tredoblet men høyst femdobbelte. Like fordampe i følgende minst to tredje (66,67 mL) eller høyst fire femte (80 mL).
        MERK: Fortynning av proteinet lagringsbuffer før buffer utveksling er viktig å ta hensyn til at konsentrasjonsverdier av denne buffer (trinn 4.3.1) fremdeles er realisert på tross av fordampning. Etter fortynning av proteinet lagring buffer, først utføre buffer utveksling (trinn 4.3.2 - 4.3.6) før du utfører følgende trinn 4.3.8.2 - 4.3.8.4.
      2. Etter buffer utveksling, sette den komplette 100 ul modell protein løsning i et åpent rør inn i dreie vakuum konsentrator.
        MERK: Modellen protein blir oppløst i den fortynnede protein lagring buffer. Helle mot rotasjonssenteret for å unngå væsketapet under rotasjon. Sørg for at en åpen tomt med samme volumH 2 O er symmetrisk plassert for å balansere den roterende system.
      3. Lukk lokket på konsentratoren og starte rotasjon. For å sikre proteinstabilitet, konsentrere seg ved romtemperatur eller ved lave temperaturer opp til 30 ° C.
        MERK: Det brukte konsentrator akselererer automatisk til 170 xg og etablerer vakuum. I det følgende akselererer den til sin maksimale hastighet på 240 x g.
      4. Ofte avbryte konsentrasjonen prosess for å kartlegge væskevolum. Stoppe den konsentrasjon, da den gjenværende oppløsning volum er mellom 20 ul og 33 ul.
        MERK: Følgelig tilpasse trinnene 4.3.8.1 - 4.3.8.4 for andre løsnings volumer (trinn 4.2.1.9) og andre proteinkonsentrasjoner (trinn 4.2.1.10). Flash fryse konsentrert protein løsning i flytende nitrogen og oppbevares ved -80 ° C, eller direkte analysere den via HPLC-ESI massespektroskopi 50. FORSIKTIGHET! Bruk en eyeshield og Kryotermostater hansker for å være beskyttet mot nitrogen sprut.
  4. HPLC-ESI massespektrometrisk analyse 50 av modellproteiner
    1. Utføre HPLC-separasjon av 5 - 15 ul proteinløsning (fremstilt i avsnitt 4.3) på en C5 omvendt-fase kolonne (3 um, 100 x 2,1 mm) med en gradient av 20% - 90% acetonitril og 0,1% maursyre over 25 minutt og påfølgende ESI massespektroskopi med deteksjon på en time-of-flight masse analysator i området fra 300 - 3000 m / z.
      MERK: Avhengig av innholdet i uttrykt modell protein, bruk andre løsemidler eller kolonner som kan være bedre egnet.
    2. Deconvolute målt massespektra ved hjelp av egnet programvare 52 for å beregne nulllade massene.

Representative Results

Denne protokollen leder gjennom den cellefrie rest-spesifikk innlemmelse av ncAAs inn i modellproteiner. Det foreslås SDS-PAGE for en foreløpig evaluering av innlemmelse eksperiment og ytterligere skritt for å forberede modellen proteiner etter en passende HPLC-ESI massespektroskopi.

Her er representative resultater fra den cellefrie rest-spesifikk innlemmelse av Arg analoge kan, i tillegg til den analoge Lys L-hydroksy-lysin (Hyl) presentert. De forskjellige aminosyreoppløsninger, til energibufferen, blir den vektor-DNA som koder for modellen protein og cellefrie reaksjoner fremstilt som beskrevet ovenfor. Referansecellefrie reaksjon er forsynt med aminosyren oppløsning bestående av 20 CAAS. For hvert eksperiment, blir en negativ kontrollcelle-fri reaksjon som følger med aminosyreoppløsning som mangler den kanoniske analog av svømming i spørsmålet. For hver ca.oach, en cellefri reaksjons uttrykker modellen protein i nærvær av aminosyreløsning, hvor CAA er substituert med den noncanonical analog. His-tag rensing bufferbytte og HPLC-ESI massespektrometrisk analyse utføres i henhold til den ovenfor beskrevne protokoll.

Modellen protein er den C-terminal His-tagget deGFP 32, en avkortet versjon av EGFP 53. Dens en bokstav aminosyre-sekvens kan finnes i (Supplemental Material 2). Denne modellen protein inneholder seks Arg og Lys 18 posisjoner, respektivt. Ekspresjonsvektoren er pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.

I tilfelle av fullstendig innarbeidelse av svømming, kan man anta at den negative kontrollreaksjonen ikke uttrykker deGFP, siden en av de 20 CAAS mangler. I motsetning, deGFP må være synlig i de to andre reaksjoner: den opprinnelige ett i RefeRence cellefritt reaksjon og den modifiserte protein i cellefrie reaksjon som er utstyrt med NCAA.

Figur 1A viser foreløpige SDS-PAGE evaluering av Can innlemmelse eksperiment. Referansecellefritt reaksjon har det høyeste deGFP ekspresjonsnivået. I det cellefrie reaksjon som er forsynt med Can er deGFP uttrykkes ved noe lavere konsentrasjon. Ingen deGFP ekspresjon kan påvises i den negative kontroll. Dette SDS-PAGE resultatet er en god indikasjon for en vellykket inkorporering av Can til målproteinet deGFP.

For å bevise en hypotese fullstendig innlemmelse av Can inn deGFP, både rene modell proteiner, visualisert i Figur 1B, er analysert gjennom HPLC-ESI massespektroskopi. Figur 1C viser deconvoluted massespektra av de rensede deGFP molekyler. Den deconvoluted masse deGF P som er uttrykt i referansecellefrie reaksjon er 26,192.8 Da. For deGFP uttrykt i Can inneholdende cellefritt reaksjons en masse på 26202,5 ​​Da vises. De forventede masser for de innfødte deGFP6Arg og den modifiserte deGFP6Can med Arg blir fullt erstattet av Can er 26193 Da og 26 204 Da, henholdsvis. Massen forskjell på 1,5 Da for deGFP6Can er innenfor feil av spekteret deconvolution. Dermed blir hele inkorporering av Can inn deGFP på alle 6 Arg stillinger bekreftet.

De to toppene redusert intensitet tilsvarer den opprinnelige deGFP6Arg og modifiserte deGFP6Can som ikke vil oppnå sin modne fluorophore. Fluoroforen er autocatalytically dannet ved eliminering av et H 2 O molekylet, etterfulgt av oksydasjon. Dette fører til en masse økes med 20 Da hvis denne prosessen ikke forløper.

pg "/>
Figur 1. SDS-PAGE evaluering av den kan innlemmes eksperimentet og HPLC-ESI massespektroskopi av de cellefrie uttrykte og rensede deGFP molekyler. (A) En foreløpig vurdering av den kan innlemmes eksperiment ved hjelp av SDS-PAGE. Fra venstre til høyre: Protein standard referanse cellefri reaksjons, negativ kontroll og cellefrie reaksjon som gir kan i stedet for Arg. (B) SDS-PAGE etter His-tag rensing og buffer utveksling av de uttrykte deGFP molekyler. Fra venstre til høyre: Protein standard, renset deGFP fra referanse reaksjon, renset deGFP fra Can inneholder reaksjon. (C) Bekreftelse av full innlemmelse av Can ved HPLC-ESI massespektroskopi. De forventede masser av de innfødte deGFP og den modifiserte deGFP med Arg fullt erstattet av Can er 26193 Da og 26 204 Da, henholdsvis. Hver spekteret er normalisert til sitt høyeste intensitet (teller). Toppenes posisjoner er indikerti Da. For visualisering formål, er gel baner hentet fra gel bildene, sammenføyd, konverteres til gråtoner format, størrelse optimalisert og kontrast samt lysstyrke er forbedret. Originale gel baner er presentert i Supplemental Material 3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2A viser den innledende SDS-PAGE evaluering av Hyl inkorporering eksperimentet. I det cellefrie reaksjon som er forsynt med Hyl, er deGFP uttrykt. I motsetning til den første eksperiment, kan en svak deGFP bånd observeres i det negative kontrollreaksjonen. Dette kan være på grunn av Lys-rester i den cellefrie reaksjoner. Dette muliggjør en svak deGFP uttrykk i den negative kontrollreaksjon, hvor hverken Lys eller Hyl tilsettes.

for H PLC-ESI massespektroskopi, er deGFP molekyler av den cellefrie reaksjon forsynt med Hyl er renset og buffer utvekslet (figur 2B).

Figur 2
Figur 2. SDS-PAGE evaluering av Hyl inkorporering eksperimentet (A) Fra venstre til høyre:. Negativ kontroll cellefri reaksjons, cellefri reaksjonsinneholdende Hyl og proteinstandard. (B) SDS-PAGE etter His-tag rensing og buffer utveksling av de uttrykte deGFP molekyler. Fra venstre til høyre: Renset deGFP fra Hyl inneholder reaksjon og protein standard. For visualisering formål, er gel baner hentet fra gel bildene, sammenføyd, konverteres til gråtoner format, størrelse optimalisert og kontrast samt lysstyrke er forbedret. Originale gel baner er presentert i Supplemental Material tre.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3 viser massespekteret av deconvoluted rensede deGFP molekyler. 3A bekrefter hypotesen om allerede er tilstede Lys-rester i den cellefrie reaksjoner. Den dominerende toppen av spekteret tilsvarer det native deGFP (forventet masse: 26 193 Da). Igjen, kan deGFP molekyler av en 20 Da høyere masse som ikke utvikler sin fluorophore bli oppdaget. Den Lys ester er fortrinnsvis applisert på tRNA Lys ved lysyl-tRNA-syntetase fører til et høyt ekspresjonsnivå av de innfødte deGFP18Lys.

Massen forskjellen mellom Hyl og Lys er 16 Da. På grunn av tilstedeværelsen av Hyl som er i konkurranse til de Lys rester alle mulige deGFP arter er generert (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (figur 3B). Riktignok toppen av deGFP1Hyl + 17Lys overlapper med toppen av den native deGFP som ikke produserer sin fluorofor (figur 3A) og massen av noen topper avviker mer enn to Da fra den forventede masse. Disse masse forskjeller kan tilskrives høy støy på grunn av lave mengder av deGFP arter. Imidlertid er Hyl vanligvis innlemmet ved det cellefrie system. Ytterligere forbedringer må gjøres for å avskaffe Lys-rester i de cellefrie reaksjoner.

Figur 3
. Figur 3. HPLC-ESI massespektroskopi av de rensede deGFP molekyler av den cellefrie reaksjon inneholdende Hyl (A) Den opprinnelige deGFP18Lys hovedsakelig er detektert (forventede masser: med fluorofor 26 193 Da, uten modne fluoroforen 26 213 Da). (B)Forstørrelse avslører eksistensen av alle mulige deGFP arter (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Deres forventet massene er 26193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Spekteret er normalisert til sitt høyeste intensitet (teller). Toppenes posisjoner er angitt i Da. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1

Supplemental Materiale 1. Beregning mal. I seksjon 2 er fremstillingen av energibufferen konsentrat-blanding eksemplifisert ved hjelp av råekstraktet aliquoter på 30 pl og optimal Mg- og K-glutamat-konsentrasjoner på henholdsvis 3 og 30 mm. Dette eksempel fører til en masterblanding volum som gir 3 energibuffer alikvoter. i secsjon 3 er fremstilling av den cellefrie reaksjon eksemplifisert ved hjelp av en 90 nM DNA-stamløsning som fører til en optimal vektor-DNA konsentrasjon på 10 nM i cellefrie reaksjon. Klikk her for å laste ned denne filen.

For en passende sporbarhet, er bruken av beregningen malen eksemplifisert ved innsetting av disse typiske verdier som er forskjellige fra de ovennevnte eksempel: Rå ekstrakt volum: 28 ul, optimal Mg-glutamat: 2 mm, optimalt K-glutamat: 40 mM, antall av ønskede buffer alikvoter: 100, optimal vektor konsentrasjon i cellefritt reaksjon: 8 nM, DNA-vektor stamløsning: 150 nM.

Først inn 28 mL som råolje ekstrakt volum i det oransje feltet i den første malen delen. Deretter gå inn i andre malen seksjon 2 mM end 40 mm som optimal Mg- og K-glutamat konsentrasjoner i de oransje felt. Tatt i betraktning den optimale Mg- og K-konsentrasjonen, sammensetningen av en 15 ul buffer energi, samt en tilsvarende, oppskalert 16 pl prøve beregnes. Nedenfor følgelig angi 100 som ønsket antall energibuffer aliquoter (16 ul). Malen tilpasser volumene av de forskjellige bufferkomponenter for 1700 ul masterblanding som følger: 204 ul av 100 mM Mg-glutamat stamløsning, 136 ul av 3 M K-glutamat stamløsning, 728.73 pl 14x energi løsning, 510 ul 40% PEG-8000 og 121.27 mL sterilt DDH 2 O. Til slutt, i den tredje malen delen skriver 8 nM og 150 nM som en optimal vektor-konsentrasjon i cellefrie reaksjon og henholdsvis vektor-DNA stamoppløsning konsentrasjon. Malen tilpasser volumene av de forskjellige komponenter som må legges til de 28 ul av råekstraktet for å fullføre fremstillingen av en 90 ulcellefrie reaksjon som følger: 15 ul energibuffer, 15 ul av en av de 3 forskjellig komponert aminosyreoppløsninger, 4,80 mL av vektor-DNA-oppløsning (150 nM), og 27.20 ul sterilt DDH 2 O.

Figur 2
Supplemental Material 2. Ett brev aminosyresekvensen modellen protein deGFP. Denne modellen protein inneholder seks Arg og 18 Lys stillinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Supplemental Materiale 3. Full lengde og umodifiserte gel baner som tilsvarer de gel bilder presentert figur 1 og 2. gel baner presentert i hvert enkelt s ubfigure er hentet fra samme SDS polyakrylamid gel. I figur 1 og 2 i disse baner ble slått sammen for presentasjon formål. Molekylvektene av protein standard båndene er indikert ved tallene. (A.1) Ukuperte gel baner av Figur 1A. Fra venstre til høyre: Protein standard referanse cellefri reaksjons, negativ kontroll og cellefrie reaksjon som gir kan i stedet for Arg. (A.2) Ukuperte gel baner av figur 1B. Fra venstre til høyre: Protein standard, renset deGFP fra referanse reaksjon, renset deGFP fra Can inneholder reaksjon. (B.1) Ukuperte gel baner av figur 2A. Fra venstre til høyre: Negativ kontroll cellefritt reaksjon, cellefrie reaksjon inneholder Hyl og protein standard. (B.2) Ukuperte gel baner av figur 2B. Fra venstre til høyre: Renset deGFP fra Hyl inneholder reaksjon og protein standard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

An-enkel å bruke celle-fri ytring system som en levedyktig strategi til rest-spesifikt innlemme ncAAs til proteiner, blir presentert. For dette formål blir det rå ekstrakt supplert med vektor-DNA som koder for proteinet av interesse, energibufferen og de tilsvarende aminosyrer. Legg merke til at det rå ekstrakt alikvot volum avhenger av råekstraktet proteinkonsentrasjon 34. Den cellefrie ekspresjon effektivitet optimaliseres avhengig av vektor-DNA konstruksjon konsentrasjon. Volumene av de energibufferkomponenter varierer som funksjon av optimalisert Mg- og K-glutamat-konsentrasjoner for å muliggjøre høye utbytter av cellefritt uttrykte modell protein.

En foreløpig vurdering av inkorporeringen eksperimentet kan oppnås ved å utføre SDS-PAGE av det urensede cellefritt reaksjonsmedium. For en mer detaljert analyse, er HPLC-ESI massespektroskopi foreslått som et middel for å sjekke for fullstendig, rest-spesifikk INCORporation av NCAA. Som en forberedelse til sistnevnte, er spin kolonne systemer som brukes til å aktivere His-tag rensing og bufferutveksling med små volumer som vi bruker i denne protokollen.

Inkludert HPLC-ESI massespektroskopi, kan hele protokollen bli utført i løpet av 2 dager. Det inkluderer ikke særlig kritiske trinn. Imidlertid konsentrasjonsoptimaliseringer av Mg- og K-glutamat, så vel som av vektor-DNA er svært viktige for å uttrykke høye utbytter av modellen proteinet. Bruken av svært effektiv ekspresjonsvektor pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 anbefales sterkt. Eluering av Hans-merkede proteiner er vanligvis på grunn av høy konsentrasjon av imidazol (> 150 mM) og andre salter, så som NaH 2PO 4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM) som genererer høy bakgrunnsstøy i massespektroskopianalyse 49 . Utveksling av slike elueringsbuffere med en egnet protein lagring buffer stabiliserer modellen beskytti og drastisk reduserer bakgrunnsstøy under massespektroskopi.

Som et resultat, kan erstatte Arg ved alle seks stillinger innenfor modellen protein. I uttrykket system, kan ingen Arg-rester påvises. Dette forenkler rest-spesifikke inkorporering av Arg analoger sammenlignet med andre uttrykk systemer som krever ytterligere utarming strategier 29,30. Den presenterte celle-fri tilnærming omgår de iboende begrensningene i vivo tilnærminger som skyldes Can toksisitet, eller den sterke avhengigheten av mRNA sekvens i ett proteinproduksjonsstrategier 24,31. I motsetning til det som anvendes in vitro system, til in vivo spalting av Can homoserin og hydroxyguanidine forekommer 31.

Imidlertid beholder cellefritt system en tilstrekkelig mengde av Lys å konkurrere med analoger som Hyl. HPLC-ESI-massespektroskopianalyse viser at produktet inneholder både protein, canonical så vel som den analoge noncanonical i forskjellige mengdeforhold. Resten spesifikke inkorporering av Lys er mulig generelt, men for fullstendig substitusjon, ytterligere utarming strategier, eller spesialkonstruerte Aars og tRNA optimalisert for godkjenning av ncAAs må utvikles.

Vi oppnådde gode utbytter av cellefrie uttrykt, modifiserte modell proteiner ved å legge NCAA i samme konsentrasjon som de kanoniske seg. Inkorporeringen effektivitet avhenger av arten av svømming som skal inkorporeres. Selv høyere avkastning kan fortsatt være realiserbar ved å optimalisere konsentrasjonen av NCAA.

De presenterte resultater viser anvendbarheten av det anvendte system for rest-spesifikk innlemmelse av ncAAs så lenge de er akseptert av den kanoniske endogene translasjonelle system. For resten spesifikke inkorporering av spesifikke ncAAs, til en ytterligere behov sjekke om rester av den analoge CAA forstyrb ekspresjonssystemet.

Cell-free transkripsjon oversettelsessystemer kan være konstruert fra ulike organismer å svare på ulike krav 54. All E. coli transkripsjon-oversettings machineries av her presenteres cellefritt system aktivere bruk av bakteriofag og E. coli-arrangører, og de ​​kan fungere parallelt eller etter hverandre i kaskader 55. Den generelle anvendelighet og brukervennlighet gjør metoden et potent verktøy for videre forskning på aminosyren toksisitet og terapeutisk anvendelse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20% precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5,000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8%) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99% VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1 mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5 ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1 L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4 L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 1 L bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or equivalent shaker able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or equivalent 5,000 x g rotor for the centrifuge above, able to centrifuge 1 L bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or equivalent heating block able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C.
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or equivalent vortex.
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or equivalent ice flaker machine.
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or equivalent incubator able to heat samples at 29 °C.
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or equivalent electrophoresis chamber able to perform vertical gel electrophoresis with the above precast gels or other gels used.
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or equivalent power supply able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or equivalent microplate reader able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation - Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d'analogues structuraux d'aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -J., Lee, K. -H., Kim, H. -C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2015).
  37. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  38. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  39. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  40. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  41. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  42. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  43. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  44. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2015).
  45. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  46. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  47. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  48. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  49. Hurst, R., Kobs, G., Johnson, T. Mass Spectrometric Analysis of MagneHis Purified Proteins. Promega Corporation Web site. , http://www.promega.de/resources/pubhub/enotes/mass-spectrometric-analysis-of-magnehis-purified-proteins/ (2003).
  50. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  51. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  52. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  53. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  54. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  55. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Molecular Biology Cell-Free Expression Noncanonical Amino Acid Analog Residue-Specific innlemmelse L-Arginine Analog L-Canavanine bioteknologi syntetisk biologi, Unaturlig Amino Acid
Rest-spesifikk innlemmelse av Noncanonical Amino Acids inn Modell Proteiner Bruke en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cell-free transkripsjon-oversettelse System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Worst, E. G., Exner, M. P., De… More

Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter