Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Återstod specifika Införande av Noncanonical aminosyror i modellproteiner Använda en Published: August 1, 2016 doi: 10.3791/54273

Abstract

Den kanoniska uppsättning av aminosyror leder till en ovanligt brett spektrum av proteiner fungerar. Ändå ställer uppsättningen av rester fortfarande begränsningar på potentiella proteinapplikationer. Införlivandet av noncanonical aminosyror kan förstora denna omfattning. Det finns två kompletterande metoder för införlivande av noncanonical aminosyror. För platsspecifik inkorporering, utöver de endogena kanoniska translationella maskiner, en ortogonal aminoacyl-tRNA-syntetas-tRNA par måste tillhandahållas som inte interagerar med de kanoniska dem. Följaktligen ett kodon som inte har tilldelats till en kanonisk aminosyra, vanligtvis en stoppkodon, även är nödvändig. Denna genetiska koden expansionen möjliggör införlivandet av en noncanonical aminosyra vid en enda, givet ställe inuti proteinet. Den här presenterade arbetet beskriver rester specifika inkorporering där den genetiska koden omtilldelas inom den endogena translationella systemet. Översättningen maskiner enccepts den noncanonical aminosyran som ett surrogat för att införliva det vid canonically föreskrivna platser, det vill säga är alla förekomster av en kanonisk aminosyra i proteinet ersättas med noncanonical en. Införlivandet av noncanonical aminosyror kan ändra proteinstrukturen, vilket orsakar avsevärt modifierade fysikaliska och kemiska egenskaper. Noncanonical aminosyraanaloger fungerar ofta som celltillväxthämmare för uttrycksvärdar eftersom de ändrar endogena proteiner, vilket begränsar in vivo proteinproduktion. In vivo inkorporering av giftiga noncanonical aminosyror i proteiner förblir särskilt utmanande. Här, är ett cellfritt tillvägagångssätt för en fullständig ersättning av L-arginin genom noncanonical aminosyran L-kanavanin presenteras. Det kringgår de inneboende svårigheterna för in vivo expression. Dessutom är ett protokoll för att framställa målprotein för masspektralanalys ingår. Det visas att L-lysin kan ersättas med L-hydroxi-lysin,om än med lägre effektivitet. I princip kan vilken som helst noncanonical aminosyraanalog införlivas med användning av den presenterade metoden så länge som den endogena in vitro translationssystem känner igen den.

Introduction

Den genetiska koden är universell till biosfären. Den kodar för en uppsättning av 20 kanoniska aminosyror, som ibland förlängs med selenocystein en eller pyrrolysine 2. Det är ribosomen som översätter den genetiska koden med hjälp av tRNA-sekvenser till kedjor av aminosyror som fälls in i proteiner. De funktionella grupperna i de kanoniska aminosyror, i kombination med posttranslationella modifieringar, bidra till en exceptionellt brett spektrum av proteinfunktion 3,4. I princip kan funktionsbegränsningar på grund av begränsad uppsättning kanoniska aminosyror övervinnas genom att införliva ytterligare noncanonical aminosyror (NCAAsen) som gör det möjligt för nya verksamma ämnen och nya funktioner 3,4.

Det finns två kompletterande metoder för införlivande av NCAAsen: den plats eller resten specifika inkorporering. Den tidigare metoden innebär betydande tekniska svårigheter, eftersom den kanoniska uppsättning av aminoacyl-tRNA-synthetases (Aars) och tRNA måste utökas med en ortogonal Aars-tRNA par som inte måste samverka med den endogena översättnings maskiner. Baserat på noggrann teknik, innehåller denna metod de NCAAsen som enskilda punktmutationer vid de önskade proteinställen. Platsspecifik inkorporering av NCAAsen är genetiskt kodas av ett kodon som inte har tilldelats till en kanonisk aminosyra (CAA), vanligtvis ett stoppkodon 5-9. Denna metod medför förändringar i funktion vid en given plats i stället för över hela proteinet 10-13.

Däremot förlitar rester specifika inkorporering på felaktig erkännande av noncanonical aminosyran av den kanoniska översättningen maskiner. Införlivandet sker på grund av bristen på substratspecificiteten av de AARS. Återstoden specifika inkorporering av NCAAsen, byggd på arbetet i Cohen och medarbetare 14, har lett till viktiga tillämpningar 3,10, bland dem bio-ortogonala märkning 15-17 av proteinereller struktur klarläggande av proteiner i röntgenkristallografi 18.

Som naturliga AARS allmänhet föredrar deras besläktade aminosyra över en isostrukturell NCAA, effektivt in vivo restspecifika införlivande kräver vanligen en auxotrof uttryck värd inte kan syntetisera den kanoniska analoga av NCAA. Värdcellerna odlas i tillväxtmedium som levererar endast en låg koncentration av den analoga CAA. Dess utmattning i kombination med den konsekutiva tillskott med NCAA tvingar expressionsvärden att införliva NCAA in i modellprotein vid multipla, kanoniskt föreskrivna platser. I motsats till den platsspecifika synsätt, har detta i allmänhet en djup inverkan på hela proteinstrukturen, vilket leder till betydligt modifierade fysikaliska och kemiska egenskaper hos proteiner 19,20. Men de flesta av NCAAsen är tillväxthämmare för expressionsvärden 3, eftersom de är införlivade i många andra protEins förutom de som är intressanta under rekombinant genuttryck. Detta begränsar klart in vivo tillvägagångssätt. In vivo-inkorporering av aminosyror som är giftiga eller har starkt inflytande på proteinstrukturen förblir särskilt utmanande. Men dessa molekyler är bland de mest lovande att konstruera proteiner med extra funktioner.

Ett exempel är giftiga, noncanonical, naturligt förekommande L-kanavanin (Can), en analog av L-arginin (Arg). Det påverkar och blockerar arg associerade regulatoriska och katalytiska reaktionsvägar, och dess närvaro i den levande cellen kan leda till omedelbar död 3,21-23. Dess införlivande i proteiner vid arginin positioner kan minska proteinstabilitet 21-23. På grund av den resulterande toxicitet, förblir uttrycket av kanavanin innehållande proteiner i Escherichia coli (E. coli) och andra vanliga expressionsvärdar en utmaning. Av dessa skäl, komplett in vivo incorporation Can på alla Arg positioner har lämpligt bekräftats endast en gång 24, med hjälp av en utarbetade enda proteinproduktionssystem. Emellertid har Can föreslagits som ett anti-cancermedel 25-27, och som en stimulator för autoimmuna sjukdomar hos människor 28. Dessutom är det föremål för olika studier på sin anti-metaboliska, antibakteriell, svampdödande och antivirala egenskaper 25. Dessa egenskaper upp en efterfrågan på effektiva och lätt utföra metoder för att uttrycka Kan proteiner för medicinska för apotek och funktionella studier.

Även om många problem som är anslutna till in vivo-produktion kan kringgås genom att använda cellfria expressionssystem, in vitro restspecifika tillvägagångssätt har endast varit dåligt utforskade. Det cellfria rest-specifik inkorporering av en L-tryptofan-analog 29 och multipel NCAAsen 30 har rapporterats. Dessa metoder är baserade på den mycket efficient T7 RNA-polymeras. T7 RNA-polymeras innebär bakteriofag liknande transkription, varigenom genetisk funktionalitet i jämförelse med endogena transkription.

Den kompletta återstoden specifika inkorporering av Can i ett modellprotein på alla Arg positioner rapporterades nyligen 31, med hjälp av ett cellfritt uttryckssystem 32. En liten ändring av samma system aktiverat platsspecifik inkorporering av olika pyrrolysine analoger i ett modellprotein via stoppkodon undertryckande 33. Sysselsatta cellfritt system 31-33 grundar sig på en allt E. coli transkriptionstranslationssystem. Icke desto mindre möjliggör den proteinuttryck så effektivt som i löpande bakteriofag system (0,5-1 mg / ml av rekombinant protein) 32, under bibehållande av mycket av den ursprungliga transkriptions-translations-modularitet.

I detta arbete är ett detaljerat protokoll lämnas om hur residue specifik inkorporering av NCAAsen kan realiseras med användning av detta hela E. coli cellfritt system 32. Dessutom är ytterligare åtgärder för att förbereda de uttryckta proteinerna för lämplig utvärdering via HPLC-ESI masspektroskopi föreslås. Att utöka egenskaperna hos denna cellfritt system, innebär detta arbete inte bara hänvisa till den publicerade införlivandet av Can 31 men också presenterar nya uppgifter om noncanonical L-lysin analog L-hydroxy-lysin.

Följande protokoll för återstoden specifika införlivande av NCAAsen är en anpassning av ett protokoll som nyligen publicerades i JUPITER 34. Den senare protokollet beskriver hur du utför effektiv cellfria uttryck med vanliga aminosyror. Vidare presenterar den vid framställningen av det råa cellfritt extrakt, aminosyralösningen, den energi stamlösningen och den energi buffert som används i detta tillvägagångssätt. Följande protokoll fokuserar på modifierade steg i jämförelse med föregående protocol så att återstoden specifika inkorporering av NCAAsen. Kalibrerade pipetter, låg bindande pipettspetsar och mikro centrifugrör rekommenderas för beredningen. I det följande, är lUPAC förkortningar för aminosyrorna används.

Protocol

Varning! Kontakta alla relevanta säkerhetsdatablad (SDB) före användning. Flera av de använda kemikalier är akut toxiska. Personlig skyddsutrustning krävs (Eyeshield, skyddsmask, handskar, skyddsrock, fullängds byxor, sluten tå skor) samt att arbeta i ett dragskåp.

1. aminosyralösning Beredning

  1. Stamlösning förberedelse av NCAA (168 mM)
    OBS: Förrådslösningen beredning av NCAA beskrivs för Arg analogen Can som ett exempel. Följaktligen anpassa värden för andra NCAAsen.
    1. Placera en 1,5 ml reaktionsrör på en mikrovåg. Väg upp 46,1 mg Can inuti reaktionsröret för framställning av en ml av en 168 mM lösning. Använd en steril microspatula. För en racemisk blandning av NCAA, dubbla koncentrationen av stamlösning.
    2. Lägg 977 ul steril DDH 2 O. Noggrant virvel tills Can är in fullständig upplösning.
      OBS: För en total lösningsvolym av 1 ml, har den fysiska volymen av den upplösta aminosyran som skall kompenseras. För någon av aminosyrorna, uppskattning hälften av den fasta massan i mg som motsvarande volymökningen i il (100 mg fast material kommer att ta en volym av 50 | j, l i lösningen) 35. De flesta aminosyror kan upplösas vid denna koncentration. Om inte, minska koncentrationen till fullständig upplösning.
    3. Direkt använda NCAA stamlösning för framställning av aminosyralösningar i avsnitt 1.2 eller blixt frysa i flytande kväve och förvaras vid -20 ° C. VARNING! Av säkerhetsskäl bära en Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från vätska kväve stänk.
  2. Framställning av de aminosyralösningar
    OBS: För framställningen av aminosyralösningar, använd aminosyra provtagaren ger L-isomerer av 20 caas i separata lagerlösningar (1,5 ml, buffrad med HEPES / KOH, <0,1% NaN3, pH 7,5), var och en vid en koncentration av 168 mM, med undantag av L-leucin (140 mM). För en hemmagjord framställning av dessa stamlösningar (buffrade med KOH), följer detta protokoll 35.
    1. Tina stamlösningar av 20 caas (aminosyra sampler eller framställas enligt 35) och NCAA (framställd i avsnitt 1.1) vid RT.
    2. Efter upptining, ofta virvel stamlösningarna att återupplösa eventuella utfällda aminosyror. Som vissa aminosyror är svårare att upplösa, inkubera dem i ett värmeblock vid 37 ° C till fullständig upplösning. Cys kanske inte helt lösa. Placera alla aminosyror på is, med undantag för Asn, Phe och Cys - hålla dessa vid RT för att undvika utfällning.
    3. Använd följande värden att använda en sjundedel av hela kitet.
      OBS: Skala ned så att de fungerar med mindre volymer och spara delar av kit för ytterligare experiment. Skala upp för incorporatjoner NCAAsen i modell proteiner i stor skala. För att förhindra frekvent upptining, vilket sannolikt kommer att minska stabiliteten hos aminosyror, Alikvotera individuella aminosyrastamlösningar i volymer av 200 | il. Denna 200 pl alikvot volym och de alikvoter volymer som används i steg 1.2.4.1 konto för förluster på grund av pipettering.
    4. Först förbereder en aminosyra Master Mix lösning som kommer att delas i steg 1.2.4.3 att slutföra framställningen av 3 olika sammansatta aminosyralösningar (avsnitt 1.2.5 - 1.2.7). I dessa lösningar, koncentrera alla aminosyror vid 6 mM, utom för Leu (5 mM).
      1. Överföring 1,4 ml steril DDH 2 O till ett 15 ml centrifugrör. La det på is. Lägg 175 | il av varje aminosyrastamlösning. Lägga en efter den andra, med undantag för den stamlösning av CAA (t.ex., Arg), som skall ersättas med Ncaa (t.ex., Can). Noggrant virvel efter varje tillsats och sätta lösningen tillbaka på is.
        NOTERA:Leu är 5 mm i 3 olika sammansatta aminosyralösningar, jämfört med 6 mm för andra aminosyror. Den reducerade koncentrationen minskar inte expressionseffektiviteten. Skalning upp till 6 mM är lämpliga.
      2. Överför aminosyrastamlösningarna i följande ordning för att undvika utfällning: Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, lie, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Val, Trp, Tyr, leu, och Cys. Kom ihåg att inte lägga till stamlösningen av den CAA (t.ex. Arg) som är analog till NCAA (t.ex., Can). Slutligen grundligt virvel. Inkubera vid 37 ° C för att göra lösningen så tydlig som möjligt.
      3. Split denna aminosyra Master Mix lösning i tre lika stora volymer av 1,35 ml. Överför varje delade volymerna i 1,5 ml reaktionsrör. Hålla dem på is.
    5. Förbereda en aminosyralösning som består av alla 20 caas vid en koncentration av 6 mM vardera, med undantag av Leu som är 5 mM. Till den första volymen of 1,35 ml, som ett resultat av den uppdelade i steg 1.2.4.3, tillsätt 50 pl av 168 mM stamlösning av CAA (t.ex. Arg) som är analog till NCAA (t.ex., Can). Grundligt virvel.
      1. Sätt tillbaka på is. Alikvotera detta 1,4 ml lösning i volymer av 16 pl i reaktionsrör. Observera att denna lösning volym leder ungefär 85 portioner. Märk dessa portioner "+ CAA" (t.ex. + Arg).
      2. Flash frysa alikvoter i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. VARNING! Av säkerhetsskäl bära en Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från stänk flytande kväve.
    6. Förbereda en aminosyralösning som är sammansatt av 19 caas utom för CAA (t.ex. Arg) som är analog till NCAA (t.ex., Can). Lägg varje aminosyra till en koncentration av 6 mM, med undantag för Leu (5 mM).
      1. Tillsätt 50 pl av steril DDH 2 O för att den andra volymen av 1,35 ml, som ett resultat av den deladei steg 1.2.4.3. Noggrant virvel och sätta tillbaka på is. Alikvotera detta 1,4 ml lösning i volymer av 16 pl i reaktionsrör. Observera att denna lösning volym leder ungefär 85 portioner. Märk dessa portioner "- CAA" (t.ex. - Arg).
      2. Flash frysa alikvoter i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. VARNING! Av säkerhetsskäl bära en Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från kväve stänk.
    7. Förbereda en aminosyrablandning som innehåller 19 caas och NCAA (t.ex., Can) som ersätter den kanoniska en (t.ex. Arg). Lägg varje aminosyra till en koncentration av 6 mM, med undantag för Leu (5 mM). Till den sista 1,35 ml volym, som ett resultat av den uppdelade i steg 1.2.4.3, tillsätt 50 pl av 168 mM stamlösning av NCAA (t.ex., Can). Märk det "+ NCAA" (t.ex. + Can). Noggrant virvel och sätta tillbaka på is.
      1. Alikvotera detta 1,4 ml lösning i volymer av 16 & #181; l in i reaktionsrören. Observera att denna lösning volym leder ungefär 85 portioner. Märk dessa portioner "+ NCAA" (t.ex. + Can).
      2. Flash frysa alikvoter i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C. VARNING! Av säkerhetsskäl bära en Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från kväve stänk.
        OBS: De 16 pl alikvoter volymer som används i steg 1.2.5.1, 1.2.6.1 och 1.2.7.1 är något högre än vad som krävs för att redovisa förluster på grund av pipettering.

2. energibuffert Förberedelse

OBS: Varje sats av rått extrakt är unik och kräver optimerade koncentrationer av Mg- och K-glutamat 34. Råextraktet alikvot volym beror på proteinkoncentrationen 34. Använd den medföljande beräkningsmallen (Supplemental Material 1) för olika värden. Närmare instruktioner i kompletterande material en siffra legend, instuktionernaining hur man använder den här mallen.

  1. Förbereda och förvara vid -80 ° C 14x energilösning och råextrakt portioner enligt den omodifierade protokollet 34. Kalibrera råextraktet beroende på Mg- och K-glutamatkoncentrationer för optimerad uttryck effektivitet 34.
    OBS: Den slutliga kompositionen av 14x energilösning är: 700 mM HEPES (pH 8), 21 mM ATP, 21 mM GTP, 12,6 mM CTP, 12,6 mM UTP, 2,8 mg / ml tRNA, 3,64 mM CoA, 4,62 mM NAD, 10,5 mM cAMP, 0,95 mM folsyra, 14 mM spermidin, 420 mM 3-PGA.
  2. Tö på is i 100 mM Mg-glutamatförrådslösning, 3 M K-glutamatförrådslösning, 14x energilösning och 40% PEG-8000 för att förbereda Master Mix. Hålla dem på is.
  3. Blanda 9.18 il 100 mM Mg-glutamat stamlösning, 3,06 pl 3 M K-glutamatstamlösning, 21,86 pl 14x energilösning, 15,3 pl 40% PEG-8000 och 1,6 l sterila DDH 2 O i ett reaktionsrör. Grundligt virvel denna master blanda efter varje tillsats, och hålla den på is.
  4. Alikvotera huvudblandning (51 | il) i volymer av 16 | j, l (3 alikvoter) i reaktionsrören. Vanliga virvel Master Mix under alikvotering. Flash frysa alikvoter i flytande kväve.
    OBS: 16 pl alikvot volym samt Master Mix volymen är något högre än vad som krävs för att redovisa förluster på grund av pipettering.
  5. Använd en sil för att samla energi buffertrören. Lagra rören vid -80 ° C. VARNING! Ha på ett Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från kväve stänk.

3. Upprättande och genomförande av Cellfria reaktioner för Rest-specifik Införande av NCAAsen

  1. Först förbereder DNA-vektorn lösning i DDH 2 O.
    1. För effektiv proteinuttryck, använda expressionsvek pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 32. Klona genen som kodar för modellprotein i denna vektor 36,37 </ Sup>.
      OBS: Du kan även använda andra promotorer som känns igen av σ 70 också, men observera att uttrycket effektivitet kan minskas.
    2. Omvandla 37,38 vektorn i E. coli-stam KL 740 32 (Yale CGC #: 4382), kan det renas amplifierat vektor-DNA 37,39 och kvantifiera koncentrationen av DNA-lösningen från 40 till 42. Förvara DNA-lösningen vid -20 ° C eller direkt använda den för cellavgiften reaktions preparat (steg 3.4.1, 3.4.2 och 3.4.3).
  2. Kalibrera cellfria expressionseffektiviteten beroende på den använda vektorkonstruktion koncentrationen enligt den omodifierade protokollet 34. Använd den optimala koncentrationen som leder till högsta proteinutbyten för den cellfria reaktions preparat (steg 3.4.1, 3.4.2 och 3.4.3).
    OBS: Framställningen av cellfria reaktioner exemplifieras med användning av en 90 nM-vektor-DNA-stamlösning som leder till en slutvektorkoncentration av 10 nM i den cellfriareaktion och följer de ovan angivna optimala värdena av Mg- och K-glutamat samt extraktet alikvot volym. Använd beräkningsmall för olika värden.
  3. Tö på is 3 råa extrakt alikvoter var och en av 30 | j, l volym (framställd enligt omodifierade protokollet 34), en aminosyralösning alikvot märkt med "+ CAA" (t.ex., + Arg), en aminosyralösning alikvot märkt "- CAA" (t.ex. - Arg) och en aminosyralösning delmängd märkt "+ NCAA" (t.ex. + Kan) (framställd i avsnitt 1.2.5 - 1.2.7), 3 energi buffertar portioner (framställd i avsnitt 2) och vektor-DNA-lösning ( framställd i avsnitt 3.1).
    OBS: Det råa extraktet är lätt viskös och det kan innehålla luftbubblor. Avlägsna luftbubblor genom centrifugering vid 10.000 xg under 30 sek vid 4 ° C. Sätt råextraktet portioner tillbaka på is.
  4. Förbereda 3 olika sammansatta cellfria reaktioner (vardera 90 ^ il slutlig volym) genom att blanda råextrakt (33,33%), energibuffert (16,67%), en av de 3 olika sammansatta aminosyralösning portioner (16,67%) och vektor-DNA-lösning. Du kan också lägga ytterligare biomolekyler (DNA, proteiner, tRNA, etc.), men ett lämpligt sätt att minska volymen av DDH 2 O.
    1. Förbereda referenscellfria reaktion (90 ^ il) som uttrycker det omodifierade modellprotein.
      1. Tillsätt 15 | il av energibuffert, 15 | il av aminosyralösningen alikvot märkt med "+ CAA" (t.ex., + Arg), 10 fil av 90 nM vektor-DNA-lösning och 20 | il av steril DDH 2 O för att de 30 ul av rå extrahera. Blanda genom att pipettera upp och ned och försiktigt skaka efter tillsatsen av varje ingrediens.
      2. Alikvot de 90 pl av cellfritt reaktion i 15 lika stora volymer av 6 | j, l. Överför de 15 volymerna i en separat reaktionsröret. Stäng rören och sätta tillbaka dem på is. Märk alla reaktionsrör som "CFR (+ CAA)" (t.ex. CFR (+ Arg)).
    2. (t.ex. Arg) eller noncanonical analog (t ex kan) tillsätts.
      1. Tillsätt 15 pl energibuffert, 15 pl av aminosyralösningen delmängd märkt "- CAA" (t.ex. - Arg), 10 pl 90 nM vektor DNA-lösning och 20 ul sterilt DDH 2 O till 30 pl av rå extrahera. Blanda genom att pipettera upp och ned och försiktigt skaka efter tillsatsen av varje ingrediens.
      2. Alikvot de 90 pl av cellfritt reaktion i 15 lika stora volymer av 6 | j, l. Överför de 15 volymerna i en separat reaktionsröret. Stäng rören och sätta tillbaka dem på is. Märk alla reaktionsrör som "CFR (-cAA)" (t.ex. CFR (-Arg)).
    3. Förbereda den cellfria reaktion (90 | j, l) som är tänkt till rest-specifikt inkorporera Ncaa (t.ex., Can) i det uttryckta modellprotein.
      1. Tillsätt 15il av energibuffert, 15 | il av aminosyralösningen alikvot märkt med "+ Ncaa" (t.ex., + Can), 10 fil av 90 nM DNA-lösning och 20 | il av steril DDH 2 O för att de 30 ul av råextrakt. Blanda genom att pipettera upp och ned och försiktigt skaka efter tillsatsen av varje ingrediens.
        OBS: Uttrycket effektivitet kan reduceras i jämförelse med uttrycket med vanliga aminosyror. Om så erfordras, att helt enkelt skala upp den cellfria reaktionsvolym.
      2. Alikvot de 90 pl av cellfritt reaktion i 15 lika stora volymer av 6 | j, l. Överför de 15 volymerna i en separat reaktionsröret. Stäng rören och sätta tillbaka dem på is. För ökad reaktionsvolymer därmed delprov i ytterligare volymer av 6 ul. Märk alla reaktionsrör som "CFR (+ NCAA)" (t.ex. CFR (+ Kan)).
  5. Inkubera alla rör vid 29 ° CO / N.
    OBS: Endast små reaktionsvolymer möjliggör adekvat syre diffusion i reaktionen som är avgörande för effektiv proteinuttryck. Reaktions större volymer än 10 pl kräver aktiv syresättning genom agitation 34. För stora volymer, dela reaktionen i volymer mindre än 15 l.
  6. Efter cellfritt uttryck, pool alla identiskt består split cellfria reaktioner av 6 ul. Först, pool alla 15 delade cellfria reaktioner av 6 pl märkta "CFR (+ CAA)" (t.ex. CFR (+ Arg)). Sedan, pool alla 15 delade cellfria reaktioner av 6 pl märkta "CFR (-cAA)" (t.ex. CFR (-Arg)). Slutligen, pool alla 15 delade cellfria reaktioner av 6 pl märkta "CFR (+ NCAA)" (t.ex. CFR (+ Kan)). För ökad reaktionsvolymer därför samla ytterligare volymer av 6 ul.
  7. Kontrollera uttrycksnivån för modellprotein i alla tre samman, annorlunda sammansatt cellfria reaktioner genom att utföra denaturerings SDS-PAGE 43,44 (avsnitt 4.1).
    OBS: Använd denna meto d för en preliminär utvärdering av införlivandet experimentet.
  8. Förbered cellfria uttryckta modellproteiner för en lämplig analys via HPLC-ESI masspektroskopi (avsnitt 4.4). Först rena 45 dem (4.2). Slutligen, byta ut bufferten (avsnitt 4.3) för att undvika höga bakgrundsljud under masspektroskopi.
    OBS: Avsnitten 3.4.1, 3.4.2 och 3.4.3 leder till typiska cellfria reaktionsbetingelser 34: 8,9-9,9 mg / ml protein (från råextrakt), 4,5-10,5 mM Mg-glutamat, 40-160 mM K-glutamat, 1 mM av varje aminosyra förutom leucin, 0,83 mM leucin, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP och GTP, 0,9 mM CTP och UTP, 0,2 mg / ml tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP , 0,068 mM folsyra, 1 mM spermidin, 30 mM 3-PGA, 2% PEG-8000 och 10 nM pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500. Om så önskas, kan ett annat förfarande för cellfri reaktions beredningen utföras som leder till de reaktionsbetingelser som ovan.
le "> 4. Preliminär utvärdering via SDS-PAGE 43,44 och Beredning av Cellfria Uttryckt modellproteiner för HPLC-ESI-masspektrometri

  1. SDS-PAGE av de cellfria reaktioner
    OBS: Utför denaturer SDS-PAGE för en snabb och preliminär analys av de uttryckta proteinerna utan någon ytterligare rening eller extraktion, och utföra följande steg.
    1. Tina proteinstandard på is. Se till att den består av proteiner med molekylvikter som liknar det uttryckta modellprotein för dess lokalisering på gelén (steg 4.1.13).
      OBS: Här tillhandahåller den använda standarden proteiner över ett brett intervall av molekylvikter (myosin: 212 kDa, maltos-bindningsprotein-β-galaktosidas: 158 kDa, β-galaktosidas: 116 kDa, fosforylas b: 97 kDa, serumalbumin : 66 kDa, glutaminsyra dehydrogenas: 56 kDa, maltosbindande protein: 43 kDa, tioredoxin reduktas: 35 kDa, triosfosfatisomeras: 27 kDa, trypsininhibitor: 20 kDa, lysozyme: 14 kDa, aprotinin: 7 kDa, insulin A: 3 kDa, B-kedjan: 2 kDa).
    2. Eftersom cellfria reaktioner är lätt viskös grund av den höga proteinkoncentrationen, späda ut dem med sterilt DDH 2 O 5-10 gånger innan SDS-PAGE för att säkerställa lämplig migrering gel och för att undvika mättning efter färgning. För att inte slösa för mycket prov, späd 1 pl cellfritt reaktion i 4 pl sterilt DDH 2 O. Förbered spädning i reaktionsrören, grundligt virvel och kort centrifugera vätskan ned med en mini-centrifug under 2-3 sek vid 2000 x g.
    3. Tillsätt 5 | il 2x laddningsbuffert till 5 pl av utspätt cellfria reaktionen. Noggrant virvel och snurra ner med en minicentrifug för 2-3 sek vid 2000 x g.
      OBS: Här, efter tillsats, är biomolekylerna löst i 62,5 mM Tris / Cl -, 10% glycerol, 2% SDS och 0,0025% bromfenolblått vid pH 6,8, en typisk sammansättning. Användning av andra last färgämnen som leder till något annorlunda utspädning conditions kan vara lämpliga också.
    4. Noggrant virvel proteinstandard och överför 15 pl det i ett reaktionsrör.
      OBS! Beroende på gel storlek och för andra proteinstandarder kan den rekommenderade volymen skiljer sig från ovanstående.
    5. Placera reaktionsrören i ett värmeblock. Kontrollera om locken på rören är ordentligt stängda. Värm vid 95 till 100 ° C under 3-5 minuter. Gör detta för att denaturera proteinerna och för att möjliggöra SDS-omslag runt proteinskelettet.
      OBS: Vissa proteinstandarder får inte värmas, se leverantörs instruktioner.
    6. Under tiden överför löpbufferten i gelén elektroforeskammare. Innehållet i 1x löpande buffert är 25 mM Tris, 192 mM glycin, 0,1% SDS vid pH 8,3 (med HCl).
    7. Fixera förgjuten 4-20% gradient Tris-Glycin-SDS-gel (10 cm x 10 cm x 1 mm) för att elektroforeskammaren. Ta bort kammen och skölj brunnarna med en spruta laddad med rinnande buffert.
      OBS: gelkoncentration strongly beror på storleken och arten av det uttryckta modellprotein. Ovanstående koncentration separerar E. coli-råextrakt proteiner samt lågmolekylära modellproteiner molekyl. Själv gjutna geler är lämpliga.
    8. Ta bort rören från värmeblocket. Snurra vätskan ned med en mini-centrifug under 2-3 sek vid 2000 x g. Strax virvel och upprepa snurra ner för 2-3 sek vid 2000 x g.
    9. Överför 15 ul av proteinstandard (24-48 mikrogram protein) och 10 pl (11-22 mikrogram protein) av varje prov i brunnarna och börja elektrofores. Här, är SDS-PAGE utfördes vid 125 V och 20-40 mA under ungefär 90 min, en typiskt protokoll.
    10. Noggrant extrahera gelén från kassetten. Överföra den till fixeringslösningen (50% metanol, 10% ättiksyra, 40% DDH 2 O) under 30 minuter Metanol är. VARNING! Giftig vid inandning och hudkontakt. Skyddshandskar och arbeta under ett dragskåp.
    11. Överför gelén i färgningslösning (0,025% Coomassie brilliant blue G-250, 10% ättiksyra, 90% DDH 2 O). Färga i 60 min.
    12. Överför gelén i avfärgning-lösning (10% ättiksyra, 90% DDH 2 O) för 60-120 min.
      OBS: Fastställande, färgning och avfärgning starkt beroende på storleken och arten av det uttryckta proteinet. Detta protokoll är tillämpligt på en rad olika proteiner av ganska små molekylvikt 46.
    13. Förskjuta gelen på en matt transparens på en vit bakgrund som genererar en lämplig kontrast för de färgade proteinbanden.
  2. Rening av His-taggat 45 modellproteiner från de cellfria reaktioner
    OBS: För proteinrening, existerar flera metoder som levererar liknande resultat. Detta protokoll renar cellfria uttryckta modellproteiner som har en C-terminal polyhistidin-tag (His-tag). Den använder en reningskit lämpligt för proteiner som expbehandlats på de små reaktionsvolymer av cellfri proteinuttryck. Den är identisk för rening av nativa eller modifierade modellproteiner. Sålunda är det allmänt beskrivs på grundval av en enda cellfritt reaktion.
    1. För ett lämpligt HPLC-ESI mass spektroskopisk analys, extrahera och rena modellproteiner från cellfria reaktion och utför följande steg.
      1. Blanda lika volymer av 90 - 150 | il av His-bindningsbuffert och 90 - 150 | il av cellfritt reaktion. Pipettera upp och ner, följt av försiktig virvling.
        OBS: Genom att använda hans bindande buffert rekommenderas. Emellertid kan cellfria reaktionsmediet vara ett utgångsmaterial, så länge som modellprotein är lösligt, är pH mellan 7,5-8, imidazol / His koncentrationen är <10 mM, är koncentrationen av starka reduktionsmedel <15 mM och inget metall- kelatbildande medel är närvarande. Om blandningsvolymen överstiger 300 pl, dela den i lika stora volymer och delprov avhandlingar volymer i olika reaction rör för följande reningssteg.
      2. Förbereda kolonnsystemet. Grundligt virvel stamlösning av His-affinitetsgel tills gelén hartset är helt upplöst. Överför 250 pl gel harts i kolonnen. Använda en 1 ml pipettspets för det viskösa gelet hartset. Placera kolonnen i en provröret.
      3. Centrifug kolumnen / uppsamlingsrör för 5-10 sek vid 13.000 - 15.000 x g. Se till att gelen hartset är helt urladdat. Om inte, förlänga centrifugeringstiden med ytterligare 5-10 sekunder, men uppmärksamma att affiniteten gelen inte övertorkas. Följaktligen förlänga centrifugeringstiden i steg 4.2.1.5, 4.2.1.7 och 4.2.1.9.
        OBS! Gel harts är helt urladdat om det blir stel och ingen supernatanten kvar på toppen.
      4. Överföra 150 - 300 ul av den cellfria reaktion / His-bindningsbuffert till kolonnen. Om blandningen volymen överstiger den rekommenderade volymen delas upp på flera spinnkolonner. Resuspendera gelen hartset genom frequent knacka och mild vortexa under en inkubationstid av minst två minuter. För större volymer än 200 l, inkubera under ytterligare 1-2 min.
        OBS: Tillräckligt inkubationstiden är avgörande för bindning av modellproteiner till gel harts.
      5. Centrifug kolumnen / uppsamlingsrör för 5-10 sek vid 13.000 - 15.000 x g. Kassera genomströmning och placera kolonnen tillbaka in i uppsamlingsröret.
      6. Tillsätt 250 pl av His-tvättbuffert. Suspendera gel harts genom att trycka och mild vortexa.
      7. Centrifug kolumnen / uppsamlingsrör för 5-10 sek vid 13.000 - 15.000 x g. Kassera genomströmning och placera kolonnen tillbaka in i uppsamlingsröret. Upprepa steg 4.2.1.6 och centrifugera igen i 5 - 10 sekunder vid 13.000 - 15.000 x g.
      8. Placera kolonnen i en standard 1,5 ml reaktionsrör. Tillsätt 150 pl elueringsbuffert och suspendera gel harts genom att trycka och mild vortexa. Minska volymen till 100 pl för högre renat modellprotein concentrationer efter eluering i nästa steg 4.2.1.9.
        OBS: Den totala förekomsten av renat modellprotein kan minskas på grund av eventuell ofullständig eluering av alla gel hartsbundna proteiner, om elueringsbufferten volymen minskas.
      9. Centrifugkolonn / reaktionsrör under 5 - 10 sek vid 13000 - 15000 xg för att späda det renade proteinet i elueringsbufferten. Om delas upp innan, pool alla lösningar i en stamlösning.
      10. Innan den verkbuffertutbyte, bestämma proteinkoncentrationen med hjälp av standardmetoder, t ex Bradford analys 47,48.
        OBS: För en lämplig HPLC-ESI masspektroskopi (avsnitt 4.4), använder optimala proteinkoncentrationer som vanligtvis ca 0,5 mg / ml med nödvändiga volymer av 20 - 50 ^. Om koncentrationen är under 0,2 mg / ml, koncentrera proteinlösningen efter buffertutbyte med hjälp av en snurrande vakuum anrikningsverk. I det här fallet, först läsa avsnitt 4.3.8 att på lämpligt sätt anpassa utbyte buffer.
  3. Buffertutbyte för HPLC-ESI masspektroskopi
    OBS: Byt ut His-tag elueringsbuffert för att undvika hög bakgrundsbrus i massanalys spektroskopisk grund av hög koncentration av imidazol (> 150 mM) och andra salter, såsom NaH 2 PO 4 (> 300 mM) eller NaCl (> 50 mM) 49. Följande buffertutbyte protokollet använder en prehydratiserad gelfiltrering spinnkolonnsystem. Det är identiskt utförs för infödda eller modifierade modellproteiner. Sålunda är det allmänt beskrivs på grundval av en enda cellfritt reaktion. Observera att det finns andra enkla att utföra buffertbyte metoder, t.ex. mini-dialyskassetter.
    1. Bereda 100 ml av proteinlagringsbuffert (50 mM Tris-Cl pH 8, 100 mM NaCl och 10% glycerol). Väg in i en autoklaverbar 100 ml flaska 605,7 mg Tris-bas, 584,4 mg NaCl och tillsätt 10 ml glycerol. Fyll upp till approximativt 80 ml och justera pH-värdet till 8 genom ettdding NaOH. Stadigt kontrollera pH-värdet med en pH-meter. Slutligen, fyll upp till 100 ml-märket.
      Anmärkning Använd denna buffert för att stabilisera ett brett spektrum av modellproteiner och inte störa massanalys spektroskopiska, så länge som HPLC utförs före mätningen masspektroskopisk. Men beroende på beskaffenheten av det uttryckta modellprotein, använda andra buffertar som kan vara bättre lämpade. Om målprotein är inte stabilt vid pH 8, justera pH därefter. Använd inte högre glycerolkoncentrationer.
    2. Värm upp gelfiltreringen spinnkolonner under minst 15 min till RT.
    3. Suspendera förhydratiserades gelén genom försiktig knackning eller vortexa och ta bort luftbubblor.
    4. Ta först bort bottenplatta och sedan ta den övre locket bort. Placera kolonnen i en tvättröret (minst 2 ml). Överföra kolonnen / tvätt röret i centrifugen. Varje kolumn besitter en orienteringsmärke. Centrifugera vid 1000 xg under 2 minuter för att avlägsna buffert gelén lagring. Skivaard genomströmning.
      OBS: Var uppmärksam att fortsätta i denna ordning. Se till att kolonnen har samma orientering i alla ytterligare centrifugeringssteg.
    5. Lägg till upp till 400 pl buffert protein lagring. Centrifugera i 2 min vid 1000 x g. Upprepa detta för att helt ladda bufferten protein lagring i gel. Tillsätt försiktigt upp till 100 | j, l av lösningen av det renade modellprotein. Pipett direkt på mitten av gelbädden.
      OBS: Solution volymer av renade proteiner, i synnerhet av modifierade proteiner, kan vara högre. Split sådana lösningar över flera buffertutbyteskolonner. Proteiner måste ha molekylvikter högre än 5 kDa för denna typ av buffertbyte.
    6. Placera kolonnen in i ett uppsamlingsrör och centrifugera i 2 min vid 1000 x g.
      OBS: Detta steg leder till utspädning av det renade modellprotein i buffert proteinet lagring. Om delas upp innan, pool alla lösningar i en stamlösning.
    7. Flash fryst the proteinlösning i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C eller direkt analysera den via HPLC-ESI masspektroskopi 50 (avsnitt 4.4). VARNING! Ha en Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från kväve stänk.
    8. Utför följande steg i protokollet att koncentrera proteinlösningen med hjälp av en snurrande vakuum koncentrator som noggrant avdunstar lösningsmedlet 51.
      OBS: Dessa steg krävs om proteinkoncentrationen är alltför låg för HPLC-ESI masspektroskopi (<0,2 mg / ml). Lösningens volym och modell proteinkoncentrationen är ungefär densamma före och efter buffertbyte. Koncentrationen processen beskrivs med hjälp av följande exempel: Efter His-tag reningen modellprotein upplöstes i 100 | il His elueringsbuffert (steg 4.2.1.9) och har en koncentration av 0,07 mg / ml (steg 4.2.1.10) .
      1. För att säkerställa att proteinkoncentrationen och lösningens volym är efter indunstning vidminst 0,2 mg / ml och 20 | j, l, respektive, utspädd, innan buffertbyte, buffert protein lagring som framställts i steg 4.3.1 åtminstone trefaldigt utan på sin höjd femfaldigt. Lika avdunsta i följande minst två tredjedelar (66,67 l) eller högst fyra femtedelar (80 pl).
        OBS: Spädning av buffert proteinet lagring innan buffertbyte är avgörande för att ta hänsyn till att koncentrationsvärden för denna buffert (steg 4.3.1) fortfarande realiseras trots avdunstning. Efter utspädning av buffert protein lagring, först utföra buffertbyte (steg 4.3.2 - 4.3.6) innan du utför följande steg 4.3.8.2 - 4.3.8.4.
      2. Efter buffertbyte, sätta hela 100 pl modellprotein lösning i ett öppet rör i spinnvakuumanrikningsverk.
        OBS! Modellprotein löses i den utspädda bufferten protein lagring. Luta den mot rotationscentrum för att undvika vätskeförlust under rotation. Se till att ett öppet ämne med samma volym avH2O är symmetriskt placerade för att balansera spinnsystemet.
      3. Stäng locket på koncentratorn och börja rotation. För att säkerställa proteinstabilitet, koncentreras vid RT eller vid låga temperaturer upp till 30 ° C.
        OBS: Den använda anriknings accelererar automatiskt till 170 xg och fastställer vakuum. I det följande accelererar till sin högsta hastighet på 240 x g.
      4. Ofta avbryta anrikningsprocessen att kartlägga vätskevolymen. Stoppa koncentrationen, när den återstående lösningen volymen är mellan 20 ^ och 33 pl.
        OBS: I enlighet anpassa stegen 4.3.8.1 - 4.3.8.4 för andra volymer lösning (steg 4.2.1.9) och andra proteinkoncentrationer (steg 4.2.1.10). Flash frysa den koncentrerade proteinlösningen i flytande kväve och förvaras vid -80 ° C, eller direkt analysera den via HPLC-ESI masspektroskopi 50. FÖRSIKTIGHET! Bära en Eyeshield och Cryo-handskar som skall skyddas från kväve stänk.
  4. HPLC-ESI masspektrometrisk analys 50 av modellproteiner
    1. Utför HPLC-separation av 5-15 | il proteinlösning (framställd i avsnitt 4.3) på en C5 omvänd-fas-kolonn (3 pm, 100 x 2,1 mm) med en gradient av 20% - 90% acetonitril och 0,1% myrsyra över 25 min och efterföljande ESI masspektrometri med detektering på en time-of-flight mass analysator i intervallet 300 - 3000 m / z.
      OBS! Beroende på beskaffenheten av det uttryckta modellprotein, använda andra lösningsmedel eller kolumner som kan vara bättre lämpade.
    2. Deconvolute mätt masspektra med hjälp av lämplig mjukvara 52 för att beräkna nollladdnings massorna.

Representative Results

Detta protokoll guidar genom den cellfria rest-specifik inkorporering av NCAAsen in i modellproteiner. Det föreslås SDS-PAGE för en preliminär utvärdering av införlivandet experiment och ytterligare åtgärder för att förbereda modellproteiner för ett lämpligt HPLC-ESI mass spektroskopisk analys.

Här, är representativa resultat av den cellfria rest-specifik inkorporering av Arg-analog kan, liksom Lys analogen L-hydroxi-lysin (Hyl) presenteras. De olika aminosyralösningar, energibuffert, är vektor-DNA som kodar för modellprotein och cellfria reaktioner som framställts såsom beskrivits ovan. Referenscellfria reaktion är försedd med aminosyralösning bestående av de 20 caas. För varje experiment är en negativ kontroll cellfri reaktion levereras med aminosyralösning som saknar den kanoniska analoga av NCAA i fråga. För varje ca.oach, ett cellfritt reaktion uttrycker modellprotein i närvaro av aminosyralösningen, där CAA är substituerad med den noncanonical analogen. His-tag rening, buffertbyte och HPLC-ESI masspektrometrisk analys genomförs enligt det ovan beskrivna protokollet.

Modellen proteinet är den C-terminala His-märkt deGFP 32, en stympad version av EGFP 53. Dess en bokstav aminosyrasekvens kan hittas i (Supplemental Material 2). Denna modell protein innehåller 6 Arg och 18 Lys positioner, respektive. Expressionsvektorn är pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500.

I fallet med fullständig inkorporering av NCAA, kan man anta att den negativa kontrollreaktionen inte uttrycker deGFP, eftersom en av de 20 caas saknar. Tvärtom deGFP måste vara detekterbar i de andra två reaktioner: den nativa en i RefeRENCE cellfria reaktionen och det modifierade proteinet i cellfria reaktion som är försedd med NCAA.

Figur 1A visar den preliminära SDS-PAGE-utvärdering av Can inkorporering experimentet. Referenscellfria reaktionen har den högsta deGFP expressionsnivån. I den cellfria reaktion som är försedd med Can, är deGFP uttrycks vid något lägre koncentration. Ingen deGFP expression kan detekteras i den negativa kontrollen. Detta SDS-PAGE-resultatet är en god indikation för en lyckad inkorporering av Can i målproteinet deGFP.

För att bevisa hypotes fullständigt införlivande av Can i deGFP båda renade modellproteiner, visualiserade i figur 1B, analyseras genom HPLC-ESI masspektroskopi. Figur 1C visar deconvoluted masspektra av de renade deGFP molekyler. Den deconvoluted massa av deGF P som är uttryckt i referenscellfria reaktion är 26,192.8 Da. För deGFP uttryckt i Can innehållande cellfria reaktion en massa av 26202,5 ​​Da visas. Det förväntade massorna för infödda deGFP6Arg och den modifierade deGFP6Can med Arg fullt ut ersättas av Can är 26.193 Da och 26.204 Da, respektive. Massan skillnad på 1,5 Da för deGFP6Can ligger inom felet spektrum avfaltning. Således är fullständigt införlivande av Can i deGFP på alla 6 Arg positioner bekräftas.

De två topparna av minskad intensitet motsvarar den nativa deGFP6Arg och modifierade deGFP6Can som inte nådde sin mogna fluorofor. Fluoroforen är autokatalytiskt genereras genom eliminering av en H 2 O molekyl, följt av oxidation. Detta leder till en massa ökade med 20 Da om denna process inte fortsätta.

pg "/>
Figur 1. SDS-PAGE-utvärdering av Kan införlivning experimentet och HPLC-ESI masspektroskopi av de cellfria uttryckta och renade deGFP molekyler. (A) Inledande utvärdering av Kan införlivning experimentet med användning av SDS-PAGE. Från vänster till höger: Protein standard, referenscellfritt reaktion, negativ kontroll och cellfritt reaktion ger kan istället för Arg. (B) SDS-PAGE efter His-tag rening och buffertutbytet de uttryckta deGFP molekyler. Från vänster till höger: Protein standard, renat deGFP från referensreaktionen, renat deGFP från Can innehåller reaktionen. (C) Bekräftelse av fullständig inkorporering av Can av HPLC-ESI masspektroskopi. Det förväntade massan av infödda deGFP och den modifierade deGFP med Arg helt ersatts av Can är 26.193 Da och 26.204 Da, respektive. Varje spektrum normaliseras till sin högsta intensitet (räknas). Toppositioner angesi Da. För visualiseringsändamål betraktas gelbanorna extraherades från gelén bilder, förenade med varandra, omvandlas till gråskala format, storlek optimeras och kontrast samt ljusstyrka förbättras. Ursprungliga gelbanorna presenteras i kompletterande material 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2A visar den preliminära SDS-PAGE-utvärdering av Hyl inkorporering experimentet. I den cellfria reaktion som är försedd med Hyl, är deGFP uttrycks. I motsats till det första experimentet, kan observeras en svag deGFP band i det negativa kontrollreaktionen. Detta kan bero på att Lys-rester i de cellfria reaktioner. Detta möjliggör en svag deGFP uttryck i den negativa kontrollreaktionen, där varken Lys eller Hyl tillsätts.

för H PLC-ESI masspektroskopi, de deGFP molekyler av det cellfria reaktions försedda med Hyl renas och bufferten byts ut (Figur 2B).

figur 2
Figur 2. SDS-PAGE utvärdering av Hyl inkorporering experiment (A) Från vänster till höger:. Negativ kontroll cellfri reaktion, cellfritt reaktion innehållande Hyl och proteinstandard. (B) SDS-PAGE efter His-tag rening och buffertutbytet de uttryckta deGFP molekyler. Från vänster till höger: Renat deGFP från Hyl innehåller reaktionen och proteinstandard. För visualiseringsändamål betraktas gelbanorna extraherades från gelén bilder, förenade med varandra, omvandlas till gråskala format, storlek optimeras och kontrast samt ljusstyrka förbättras. Ursprungliga gelbanorna presenteras i kompletterande material 3.f = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54273/54273fig2large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 visar den deconvoluted masspektrumet av renade deGFP molekyler. Figur 3A bekräftar hypotesen om redan finns närvarande Lys-rester i de cellfria reaktioner. Den dominerande toppen i spektrumet motsvarar den nativa deGFP (förväntade massan: 26.193 Da). Återigen kan deGFP molekyler av en 20 Da högre massa som inte utvecklar sin fluoroforen detekteras. De Lys-rester är företrädesvis lastas på tRNA Lys av lysyl-tRNA-syntetas som leder till en hög expressionsnivå av de nativa deGFP18Lys.

Mass skillnaden mellan Hyl och Lys är 16 Da. På grund av närvaron av Hyl som är i konkurrens med de Lys-rester samtliga möjliga deGFP arter genereras (deGFP18Hyl,deGFP17Hly + 1Lys, ..., deGFP16Hyl + 2Lys) (figur 3B). Visserligen toppen av deGFP1Hyl + 17Lys överlappar toppen av den infödda deGFP som inte producerar sin fluoroforen (Figur 3A) och massan av vissa toppar skiljer sig mer än 2 Da från den förväntade massan. Dessa massskillnader kan tillskrivas högt brus på grund av låga mängder av de deGFP arter. Emellertid är Hyl allmänhet införlivas genom det cellfria systemet. Ytterligare förbättringar måste göras för att avskaffa Lys-rester i de cellfria reaktioner.

Figur 3
. Figur 3. HPLC-ESI masspektroskopi av de renade deGFP molekyler av det cellfria reaktion innehållande Hyl (A) De nativa deGFP18Lys huvudsakligen detekteras (förväntade massorna: med fluorofor 26193 Da, utan mogna fluorofor 26213 Da). (B)Förstoring avslöjar existensen av alla möjliga deGFP arter (deGFP18Hyl, deGFP17Hly + 1Lys, deGFP16Hyl + 2Lys, ..., deGFP1Hyl + 17Lys). Deras förväntade massorna 26.193 Da + N x 16 Da (N = 1, ..., 18). Spektrumet är normaliserat till sin högsta intensitet (pulser). Toppositioner anges i Da. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 1

Kompletterande Material 1. Beräkning mall. I avsnitt 2, är framställningen av energibuffert Master Mix exemplifieras med hjälp av råextrakt portioner av 30 pl och optimal Mg- och K-glutamat koncentrationer av respektive 3 mM och 30 mM. Detta exempel leder till en Master Mix volym som ger 3 energibuffert portioner. i sektion 3, är framställningen av cellfria reaktion exemplifieras med hjälp av en 90 nM DNA stamlösning som leder till en optimal vektor DNA-koncentration av 10 nM i den cellfria reaktion. Klicka här för att ladda ner filen.

För en lämplig spårbarhet, är användningen av beräkningsmall exemplifieras genom införande av dessa typiska värden som skiljer sig från ovanstående exempel: Råextrakt volym: 28 ul, optimal Mg-glutamat: 2 mm, optimal K-glutamat: 40 mM, antal önskade buffert portioner: 100, optimal vektor koncentrationen i cellfria reaktion: 8 nM DNA-vektor stamlösning: 150 nM.

Ange först 28 pl som råextrakt volym i det orangefärgade fältet i första mallen sidan. Sedan in i den andra mallen avsnitt 2 mM end 40 mM som optimal Mg- och K-glutamat koncentrationer i det orangefärgade fälten. Med hänsyn till den optimala Mg- och K-koncentrationer, sammansättningen av en 15 | j, l energibuffert, samt en motsvarande, skalas upp 16 | il alikvot beräknas. Nedan därmed ange 100 som önskat antal energibuffert portioner (16 pl). Mallen anpassar volymerna för de olika buffertkomponenter för 1700 l Master Mix enligt följande: 204 pl av 100 mM Mg-glutamat stamlösning, 136 | il 3 M K-glutamatstamlösning, 728.73 pl 14x energilösning, 510 | il 40% PEG-8000 och 121.27 il steril DDH 2 O. Slutligen, i den tredje mallen avsnittet anger 8 nM och 150 nM som optimal vektor koncentrationen i cellfria reaktion respektive, vektor-DNA stamlösning koncentration. Mallen anpassar volymerna av de olika komponenter som måste läggas till de 28 fil av råextrakt för att slutföra framställningen av en 90 | j, lcellfria reaktion enligt följande: 15 | il av energibuffert, 15 | il av en av de 3 olika sammansatta aminosyralösningar, 4,80 pl av vektor-DNA-lösning (150 nM), och 27.20 l sterilt DDH 2 O.

figur 2
Kompletterande material 2. Ett brev aminosyrasekvensen av modellprotein deGFP. Denna modell protein innehåller sex Arg och 18 Lys positioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Kompletterande materialet 3. Fullängds och omodifierade gelbanorna som motsvarar de gel bilder presenteras Figur 1 och 2. De gelbanorna presenteras i varje enskilt s ubfigure extraheras från samma SDS-polyakrylamidgel. I figur 1 och 2 dessa körfält var förenade med varandra för presentationsändamål. Molekylvikterna hos proteinstandard banden indikeras bredvid figurerna. (A.1) uncropped gelbanorna i figur 1A. Från vänster till höger: Protein standard, referenscellfritt reaktion, negativ kontroll och cellfritt reaktion ger kan istället för Arg. (A.2) uncropped gelbanorna i figur 1B. Från vänster till höger: Protein standard, renat deGFP från referensreaktionen, renat deGFP från Can innehåller reaktionen. (B.1) uncropped gelbanorna av figur 2A. Från vänster till höger: Negativ kontroll cellfritt reaktion, cellfritt reaktion innehållande Hyl och proteinstandard. (B.2) uncropped gelbanorna i figur 2B. Från vänster till höger: Renat deGFP från Hyl innehåller reaktionen och proteinstandard.d / 54273 / 54273supfig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

An-lätt att använda cellfria expressionssystem som en hållbar strategi för att rester specifikt införliva NCAAsen till proteiner, presenteras. För detta ändamål är det råa extraktet kompletterat med vektor-DNA som kodar för proteinet av intresse, energibuffert och motsvarande aminosyror. Observera att råextraktet alikvotens volym beror på råextraktet proteinkoncentrationen 34. Det cellfria expressionseffektiviteten är optimerad beroende på vektor-DNA-konstruktion koncentration. Volymerna av de energibuffertkomponenter variera som funktion av optimerad Mg- och K-glutamat koncentrationer för att möjliggöra höga utbyten av den cellfria uttryckt modellprotein.

En preliminär utvärdering av inkorporeringen experiment kan erhållas genom att utföra SDS-PAGE av den orenade cellfria reaktionsmediet. För en mer detaljerad analys, är HPLC-ESI masspektroskopi föreslagits som ett sätt att kontrollera för fullständig, rester specifika INCORporering av NCAA. Som en förberedelse för det senare, är spinnkolonn system som används för att göra det möjligt för His-tag rening och buffertutbyte med små volymer som vi använder i detta protokoll.

Inklusive HPLC-ESI masspektroskopi, kan hela protokollet genomföras inom 2 dagar. Det innehåller inte några särskilt viktiga steg. Men koncentrations optimeringar av Mg- och K-glutamat samt av vektor-DNA är avgörande för att uttrycka höga utbyten av modellprotein. Användningen av den högeffektiva expressionsvek pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-gene_of_model_protein-T500 rekommenderas starkt. Eluering av His-märkta proteiner är oftast på grund av hög koncentration av imidazol (> 150 mm) och andra salter såsom NaH 2 PO 4 (> 300 mm) eller NaCl (> 50 mM) som genererar höga bakgrundsljud i massanalys spektroskopiska 49 . Utbyte av sådana elueringsbuffertar med en lämplig proteinminnesbuffert stabiliserar modell protei och drastiskt minskar bakgrundsljud under massanalys spektroskopiska.

Som ett resultat kan ersätter Arg i alla sex positioner inom modellprotein. I expressionssystemet kan inga Arg-rester detekteras. Detta förenklar återstoden specifika inkorporering av Arg analoger jämfört med andra expressionssystem som kräver ytterligare utarmning strategier 29,30. De presenterade cellfria tillvägagångssätt kringgår de inneboende begränsningar i vivo tillvägagångssätt som beror på Can toxicitet, eller den starka beroendet av mRNA-sekvensen i en enda proteinproduktionsstrategier 24,31. I motsats till de anställda in vitro-system, in vivo klyvning av Can homoserinlakton och hydroxyguanidine inträffar 31.

Emellertid bibehåller det cellfria systemet en tillräcklig mängd av Lys att konkurrera med analoger såsom Hyl. HPLC-ESI mass-spektroskopisk analys visar att modellen proteinet innehåller både, den canonical liksom den noncanonical analog i olika proportioner. Återstoden specifika införlivande av Lys är möjligt i allmänhet, men för fullständig substitution, ytterligare utarmning strategier, eller specialkonstruerade Aars och tRNA optimerad för erkännande av NCAAsen måste utvecklas.

Vi uppnådde utmärkta utbyten av cellfria uttryckta, modifierade modellproteiner genom tillsats NCAAEN vid samma koncentration som de kanoniska sådana. Införlivandet effektivitet beror på naturen av NCAA som skall införlivas. Även högre utbyten kan fortfarande vara realiserbara genom optimering av koncentrationen av NCAA.

De presenterade resultaten visar tillämpligheten av sysselsatta system för återstoden specifika införlivande av NCAAsen så länge de accepteras av den kanoniska endogena translationella systemet. För återstoden specifika inkorporering av specifika NCAAsen, till en ytterligare behov kontrollera om de rester av den analoga CAA disturb expressionssystemet.

Cellfria system transkriptionstranslations kan konstrueras från olika organismer att svara på olika krav 54. All E. coli transkription-translations maskinerier av den här presenterade cellfritt system möjliggöra användningen av bakteriofag och E. coli promotorer, och de kan agera parallellt eller efter varandra i kaskader 55. Den allmänna tillämplighet och användbarhet gör metoden ett kraftfullt verktyg för vidare forskning inom aminosyra toxicitet och terapeutisk användning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Protective eyewear Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z758841
Nitrile gloves (size S) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z768960 Catalog numbers other sizes: Z768979 for M, Z768987 for L and Z768995 for XL
Eppendorf Safe-Lock Tube 1.5 ml (PCR clean) Eppendorf, Hamburg, Germany 30123.328
Microbalance Discovery DV114CM Ohaus, Greifensee, Switzerland 80104140
Microspatula (L 6 5/8 in., stainless steel, rod diam. 0.09 in.) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z243213
L-Canavanine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C9758 Acute toxicity: wear eyeshields, dust mask, protective gloves
Hydroxylysine (racemic mixture) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H0377
Cryo-gloves (size S, water resistent) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z183490 Catalog numbers other sizes: Z183512 for M, Z183520 for L and Z183539 for XL
RTS Amino Acid Sampler Biotechrabbit, Hennigsdorf, Germany BR1401801 For homemade preparation of amino acid stock solutions, follow this protocol35 and use the solid amino acid kit LAA21-1KT, L-proline (81709-25G), L-cysteine (30089-25G), L-histidine (53319-25G) and L-lysine (L5501-5G)  (all from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H6147
ATP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A8937
CTP Affymetrix, Santa Clara, USA 14121
GTP Affymetrix, Santa Clara, USA 16800
UTP Affymetrix, Santa Clara, USA 23160
tRNA (from E. coli, pack size 100 mg) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 10109541001 Catalog number for pack size of 500 mg is 10109550001
CoA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C4282
NAD (from yeast ) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA N6522
cAMP Sigma-Aldrich, St. Louis, USA A9501 
Folinic acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA F7878
3-PGA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8877
Mg-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 49605
K-glutamate Sigma-Aldrich, St. Louis, USA G1149
pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 Addgene, Cambridge, USA Plasmid #40019
4-20% precast Tris-Glycine Gels (10 cm x 10 cm x 1 mm, 10 courses) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 81610
SDS running buffer (10 x concentrate, 5,000 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 50001
SDS loading buffer (2 x concentrate, 50 ml) Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany TG 05002
Unstained protein marker, broad range (2-212 kDa) New England Biolabs, Ipswich, USA P7702S
Methanol Merck, Darmstadt, Germany 1060091011 Toxic by inhalation, in contact with skin and if swallowed: wear protective gloves and work under fume hood
Acetic acid (99.8%) VWR International, Darmstadt, Germany 20104.447
Coomassie Blue G-250 (10 g) Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany 902120
His-Spin Protein Miniprep kit Zymo Research Europe, Freiburg, Germany P2002 Product also distributed by Zymo Research Corporation, Irvine, USA 
Trizma Base Sigma-Aldrich, St. Louis, USA T1503
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich, St. Louis, USA H1758
Glycerol, 99% VWR International, Darmstadt, Germany 24397.296DB
CentriPure Z25 mini spin columns Genaxxon bioscience, Ulm, Germany CP-0205-Z100
Sodium chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, USA S9888
Concentrator 5301 Eppendorf, Hamburg, Germany 5301 000.210
2xYT MP biomedicals, Santa Ana, USA 113012032
Bacto-Agar BD Diagnostics, Franklin Lakes, USA 214010
Bead-beating tubes (polypropylene microvials) Biospec, Bartlesville, USA 522S
Beads, 0.1 mm dia. Biospec, Bartlesville, USA 11079101
BL21 Rosetta 2 E. coli strain Merck, Darmstadt, Germany 71402
Bradford BSA protein assay Kit Bio-Rad, München, Germany 500-0201
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA C1919
Cuvettes, 1.5 ml Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 14-955-127
DTT Sigma-Aldrich, St. Louis, USA D0632
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Bio-Rad, München, Germany 732-6204
Nunc 384-well optical bottom plates Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 142761
Nunc sealing tape Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 232701
PEG-8000 Promega, Madison, USA V3011
Potassium phosphate dibasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8584
Potassium phosphate monobasic solution Sigma-Aldrich, St. Louis, USA P8709
Slide-A-Lyzer dialysis cassettes, 10k MWCO (Kit) Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 66382
Spermidine Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 85558
1 L centrifuge bottle Beckman-Coulter, Brea, USA A98813
4 L Erlenmeyer flask Kimble Chase, Vineland (NJ), USA 26500-4000
Avanti J-26XP centrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 393127 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 1 L bottles.
Forma 480 orbital shaker Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA 480 Or equivalent shaker able to shake chest-size 6 x 4 L .
JLA-8.1000 rotor Beckman-Coulter, Brea, USA 363688 Or equivalent 5,000 x g rotor for the centrifuge above, able to centrifuge 1 L bottles.
Mini-Beadbeater-1 Biospec, Bartlesville, USA 3110BX
Microfuge 22R refrigerated microcentrifuge Beckman-Coulter, Brea, USA 368831 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
Heating block HLC HBT 130 Labexchange, Burladingen, Germany 24465 Or equivalent heating block able to heat samples in reaction tubes up to 100 °C.
Eppendorf MiniSpin centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany 5452000018 Or equivalent centrifuge able to centrifuge 2 ml reaction tubes.
IKA Vortex 3 (4 mm orbital shaker diameter, 0 - 2,500 rpm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z654760 Or equivalent vortex.
Scotsman AF103 ice flaker machine Kälte-Berlin, Berlin, Germany AF103 Or equivalent ice flaker machine.
MyTemp mini digital incubator Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z763314 Or equivalent incubator able to heat samples at 29 °C.
EcoCell electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12005 Or equivalent electrophoresis chamber able to perform vertical gel electrophoresis with the above precast gels or other gels used.
Power-phor power supply for electrophoresis cell / chamber Anamed Elektrophorese, Groß-Bieberau / Rodau, Germany AN12001 Or equivalent power supply able to supply above used electrophoresis cell / chamber with power
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 1 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5278 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
VWR Signature Ergonomic High Performance Single-Channel Variable Volume Pipettors Starter Kit 2 VWR International, Darmstadt, Germany 613-5279 Or equivalent micropipettes enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D10ST (0.1 - 10 µl) Gilson, Middleton, USA F171101 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D200ST (2 - 200 µl) Gilson, Middleton, USA F171301 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
Pipetman Tips Diamond D1000ST (100 - 1,000 µl) Gilson, Middleton, USA F171501 Or equivalent low-binding pipette tips enabling to pipette similar volumes with the same precision
50 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 50-0156
15 ml centrifuge tubes with screw caps (sterile) VWR International, Darmstadt, Germany 525-0150
14 ml polypropylene tubes (round bottom, two-position vent stopper, sterile) Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germany 187262
Discovery BIO Wide Pore C5 HPLC Column (3 µm particle size, L x I.D. 10 cm x 2.1 mm) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 567227-U
Agilent 1260 HPLC machine Agilent Technologies, Santa Clara, USA G1312B
6500 Series Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS Agilent Technologies, Santa Clara, USA G6530BA
Acetonitrile  Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 270717
FLUOstar Omega microplate reader BMG Labtech, Ortenberg, Germany 415-101 Or equivalent microplate reader able to measure the fluorescence of the expressed model protein
Hanna Checker pH meter Sigma-Aldrich, St. Louis, USA Z351091 
Formic acid eluent additive for LC-MS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA 56302

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Böck, A., et al. Selenocysteine: the 21st amino acid. Mol. Microbiol. 5 (3), 515-520 (1991).
  2. Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. Pyrrolysine Encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding Specialized tRNA. Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).
  3. Budisa, N. Prolegomena to Future Experimental Efforts on Genetic Code Engineering by Expanding Its Amino Acid Repertoire. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 43, 6426-6463 (2004).
  4. Wang, L., Xie, J., Schultz, P. G. Expanding the Genetic Code. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 35, 225-249 (2006).
  5. Chin, J. W. Expanding and Reprogramming the Genetic Code of Cells and Animals. Annu. Rev. Biochem. 83, 379-408 (2014).
  6. Neumann, H. Rewiring translation - Genetic code expansion and its applications. FEBS Lett. 586 (15), 2057-2064 (2012).
  7. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding New Chemistries to the Genetic Code. Annu. Rev. Biochem. 79, 413-444 (2010).
  8. Goerke, A. R., Swartz, J. R. High-Level Cell-Free Synthesis Yields of Proteins Containing Site-Specific Non-Natural Amino Acids. Biotechnol. Bioeng. 102 (2), 400-416 (2009).
  9. Albayrak, C., Swartz, J. R. Cell-free co-production of an orthogonal transfer RNA activates efficient site-specific non-natural amino acid incorporation. Nucleic Acids Res. 41 (11), 5949-5963 (2013).
  10. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr. Opin. Chem. Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  11. Xiu, X., Puskar, N. L., Shanata, J. A. P., Lester, H. A., Dougherty, D. A. Nicotine binding to brain receptors requires a strong cation-pi interaction. Nature. 458 (7237), 534-537 (2009).
  12. Grünewald, J., et al. Mechanistic studies of the immunochemical termination of self-tolerance with unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (11), 4337-4342 (2009).
  13. Nikić, I., Lemke, E. A. Genetic code expansion enabled site-specific dual-color protein labeling: superresolution microscopy and beyond. Curr. Opin. Chem. Bio. 28, 164-173 (2015).
  14. Munier, R., Cohen, G. N. Incorporation d'analogues structuraux d'aminoacides dans les protéines bactériennes. Biochim. Biophys. Acta. 21 (3), 592-593 (1956).
  15. Lepthien, S., Merkel, L., Budisa, N. In Vivo Double and Triple Labeling of Proteins Using Synthetic Amino Acids. Angew. Chem. Int. Ed. 49 (32), 5446-5450 (2010).
  16. Dieterich, D. C., Link, A. J., Graumann, J., Tirrell, D. A., Schuman, E. M. Selective identification of newly synthesized proteins in mammalian cells using bioorthogonal noncanonical amino acid tagging (BONCAT). Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (25), 9482-9487 (2006).
  17. Dieterich, D. C., et al. In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons. Nat. Neurosci. 13 (7), 897-905 (2011).
  18. Hendrickson, W. A., Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): a vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  19. Hoesl, M. G., et al. Lipase Congeners Designed by Genetic Code Engineering. ChemCatChem. 3 (1), 213-221 (2011).
  20. Bae, J. H., et al. Expansion of the Genetic Code Enables Design of a Novel "Gold" Class of Green Fluorescent Proteins. J. Mol. Biol. 328 (5), 1071-1081 (2003).
  21. Schachtele, C. F., Rogers, P. Canavanine death in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 14 (2), 474-489 (1965).
  22. Rosenthal, G. A. The biological effects and mode of action of L-canavanine, a structural analogue of L-arginine. Q. Rev. Biol. 52 (2), 155-178 (1977).
  23. Rosenthal, G. A., Dahlman, D. L. Incorporation of L-Canavanine into Proteins and the Expression of Its Antimetabolic Effects. J. Agric. Food Chem. 39 (5), 987-990 (1991).
  24. Ishida, Y., Park, J. H., Mao, L., Yamaguchi, Y., Inouye, M. Replacement of All Arginine Residues with Canavanine in MazF-bs mRNA Interferase Changes Its Specificity. J. Biol. Chem. 288 (11), 7564-7571 (2013).
  25. Thomas, D. A., Rosenthal, G. A., Gold, D. V., Dickey, K. Growth Inhibition of a Rat Colon Tumor by L-Canavanine. Cancer Res. 46 (6), 2898-2903 (1986).
  26. Bence, A. K., Worthen, D. R., Adams, V. R., Crooks, P. A. The antiproliferative and immunotoxic effects of L-canavanine and L-canaline. Anticancer Drugs. 13 (3), 313-320 (2002).
  27. Bence, A. K., Crooks, P. A. The Mechanism of L-Canavanine Cytotoxicity: Arginyl tRNA Synthetase as a Novel Target for Anticancer Drug Discovery. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 18 (5), 383-394 (2003).
  28. Akaogi, J., et al. Role of non-protein amino acid L-canavanine in autoimmunity. Autoimmun. Rev. 5 (6), 429-435 (2006).
  29. Singh-Blom, A., Hughes, R. A., Ellington, A. D. An amino acid depleted cell-free protein synthesis system for the incorporation of non-canonical amino acid analogs into proteins. J. Biotechnol. 178, 12-22 (2014).
  30. Oh, S. -J., Lee, K. -H., Kim, H. -C., Catherine, C., Yun, H., Kim, D. -M. Translational Incorporation of Multiple Unnatural Amino Acids in a Cell-free Protein Synthesis System. Bioprocess. Eng. 19 (3), 426-432 (2014).
  31. Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Cell-free expression with the toxic amino acid canavanine. Bioorg. Med. Chem. Lett. 25 (17), 3658-3660 (2015).
  32. Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70. J. Biol. Eng. 4 (8), (2010).
  33. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol. Bioeng. 112 (8), 1663-1672 (2015).
  34. Sun, Z. Z., Hayes, C. A., Shin, J., Caschera, F., Murray, R. M., Noireaux, V. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. J. Vis. Exp. (79), e50762 (2013).
  35. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
  36. JoVE Science Education Database. Molecular Cloning. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5074/molecular-cloning (2015).
  37. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2012).
  38. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli Using the Heat Shock Method. J. Vis. Exp. (6), e253 (2007).
  39. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying Plasmid DNA from Bacterial Colonies Using the Qiagen Miniprep Kit. J. Vis. Exp. (6), e247 (2007).
  40. Moreno, L. A., Cox, K. L. Quantification of dsDNA using the Hitachi F-7000 Fluorescence Spectrophotometer and PicoGreen Dye. J. Vis. Exp. (45), e2465 (2010).
  41. Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids. J. Vis. Exp. (45), e2699 (2010).
  42. Sukumaran, S. Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer. J. Vis. Exp. (48), e2699 (2011).
  43. Laemmli, U. K. Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  44. JoVE Science Education Database. Separating Protein with SDS-PAGE. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2015).
  45. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nature Biotechnology. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  46. Schägger, H., Aquila, H., Von Jagow, G. Coomassie blue-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for direct visualization of polypeptides during electrophoresis. Anal. Biochem. 173 (1), 201-205 (1988).
  47. Bradford, M. M. A Rapid Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  48. Ernst, O., Zor, T. Linearization of the Bradford Protein Assay. J. Vis. Exp. (38), e1918 (2010).
  49. Hurst, R., Kobs, G., Johnson, T. Mass Spectrometric Analysis of MagneHis Purified Proteins. Promega Corporation Web site. , http://www.promega.de/resources/pubhub/enotes/mass-spectrometric-analysis-of-magnehis-purified-proteins/ (2003).
  50. Banerjee, S., Mazumdar, S. Electrospray Ionization Mass Spectrometry: A Technique to Access the Information beyond the Molecular Weight of the Analyte. Int. J. Anal. Chem. 2012, 1-40 (2012).
  51. Fujiwara, K., Nomura, S. M. Condensation of an additive-free cell extract to mimic the conditions of live cells. PLoS One. 8 (1), e54155 (2013).
  52. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  53. Li, X., Zhang, G., Ngo, N., Zhao, X., Kain, S. R., Huang, C. C. Deletions of the Aequorea victoria Green Fluorescent Protein Define the Minimal Domain Required for Fluorescence. J. Biol. Chem. 272 (45), 28545-28549 (1997).
  54. Gagoski, D., Polinkovsky, M. E., Mureev, S., Kunert, A., Johnston, W., Gambin, Y., Alexandrov, K. Performance benchmarking of four cell-free protein expression systems. Biotechnol. Bioeng. 113 (2), 292-300 (2016).
  55. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells. ACS Synth. Biol. 1 (1), 29-41 (2012).

Tags

Molecular Biology Cell-Free Expression Noncanonical aminosyraanalog Rest-Specific Incorporation L-arginin analog L-kanavanin bioteknik Syntetisk biologi, Onaturliga aminosyra
Återstod specifika Införande av Noncanonical aminosyror i modellproteiner Använda en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Cellfritt Transkription-översättning System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Worst, E. G., Exner, M. P., DeMore

Worst, E. G., Exner, M. P., De Simone, A., Schenkelberger, M., Noireaux, V., Budisa, N., Ott, A. Residue-specific Incorporation of Noncanonical Amino Acids into Model Proteins Using an Escherichia coli Cell-free Transcription-translation System. J. Vis. Exp. (114), e54273, doi:10.3791/54273 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter