Summary
Este manuscrito descreve uma técnica suave baseado em litografia para engenharia matrizes uniformes de tridimensional (3D) de tecidos epiteliais geometria definida rodeados por matriz extracelular. Este método é favorável a uma ampla variedade de tipos de células e contextos experimentais e permite o rastreio de alto rendimento de réplicas idênticas.
Introduction
O desenvolvimento de tecidos epiteliais ramificada, conhecidos como ramificação morfogênese, é regulado por, e fatores ambientais físicas derivadas de células. Na glândula mamária, ramificação morfogênese é um processo iterativo pelo qual guiou a migração de células coletiva cria uma arquitetura de árvore. O primeiro passo é a formação de gemas primário dos canais de leite, seguido pela iniciação e alongamento ramo 1,2. Invasão de filiais no estroma circundante é induzida pela liberação sistêmica de hormônios esteróides na puberdade. Botões novos primários, em seguida, iniciar a partir das extremidades dos ramos existentes, e este processo continua a criar uma árvore epitelial 3. Embora muitos sinais bioquímicos importantes foram identificados, uma compreensão abrangente dos mecanismos celulares biológica que norteiam este processo de desenvolvimento complexo actualmente não existe. Além disso, estudos sobre os mecanismos sobre as influências das pistas específicas são difíceis de desconstruir a partir experimentos in vivo, perturbações e medições espaço-temporais como precisas muitas vezes não são possíveis.
Tridimensionais técnicas de cultura (3D), como a cultura inteira órgão, Organóides primários, e os modelos de cultura de células, são ferramentas úteis para investigar sistematicamente os mecanismos subjacentes morfogênese do tecido 4-6. Estes podem ser particularmente úteis para determinar as influências de factores específicos individualmente, tais como as forças mecânicas e sinais bioquímicos, em uma variedade de comportamentos de células, incluindo migração, proliferação e diferenciação. 6 modelos de cultura de células modificadas geneticamente, em particular, facilmente permitir a perturbação de células individuais e o seu microambiente.
Um tal modelo de cultura utiliza uma abordagem baseada em microfabricação para manipular tecidos epiteliais mamárias modelo 3D com estrutura controlada de modo consistente e reprodutível formam ramos que migram colectivamente quando induzida com o umfactores de crescimento ppropriate. A principal vantagem do modelo é a capacidade de manipular com precisão e medir os efeitos dos factores físicos e bioquímicos, tais como padrões de esforço mecânico, com alta confiança estatística. Esta técnica, em conjunto com a modelagem computacional, já foi usado para determinar as contribuições relativas de sinais físicos e bioquímicos na orientação do desenvolvimento normal dos tecidos epiteliais mamárias e outros epitélios ramificados 7-11. É apresentada aqui um protocolo detalhado para a construção destes tecidos modelo, que pode ser facilmente alargada a outros tipos de células e matriz extracelular (ECM) géis, e que serve como uma potencial ferramenta para o teste de agentes terapêuticos.
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Protocol
1. Preparação de Soluções
- Para preparar uma solução a 5 mg / ml de insulina, dilui-se a base de insulina em pó com ácido clorídrico a 5 mM (HCl) em dH 2 O (500 mg de insulina em 100 ml de solvente). Preparação de 100 ml de solvente por adição de 50 ul de HCl concentrado a 100 ml de água destilada (dH2O).
- Para fazer uma solução de PBS 1x, dilui-se a solução de reserva 10x de solução salina tamponada com fosfato (PBS) para 1x com dH2O sob condições estéreis.
- Prepara-se o (PDMS) elastómero solução de polidimetilsiloxano como segue: misturar a pré-polímero de PDMS, juntamente com o agente de cura numa proporção de 10:: 1 (w w).
- Prepara-se o meio de cultura celular como se segue: a 500 ml de estoque de Dulbecco Modified Eagle Médium: Mistura Nutriente F-12 (DMEM / F-12), adicionam-se 10 ml de soro fetal de bovino estéril (FBS), 500 ul de reagente de gentamicina, e 500 uL de 5 mg / ml de insulina.
- Para preparar a albumina de soro bovino 1% (BSA) em solução de PBS 1x, adicionar 1% (w: V) solução de pó de BSA para 1x PBS e misture bem.
- Para preparar uma solução de 4 mg / ml de bovino tipo neutralizada I colágeno, adicionar 50 ul de 10 x solução salina equilibrada de Hank (HBSS) de tampão, 30 ul de 0,1 N de hidróxido de sódio (NaOH), meio de cultura celular de 30 ul e 400 ul de colagénio estoque para um tubo de microcentrífuga de 1.5 ml fresco. Misture devagar pipetando cima e para baixo; evitar a introdução de bolhas. Para remover quaisquer bolhas, Centrifugar brevemente a mistura a 4 ° C.
- Prepara-se uma solução fixadora por diluição de 16% de paraformaldeído a 1: 4 (v: v) em PBS 1x.
- Prepara-se uma solução de etiquetagem núcleos por diluição da solução núcleos banco de rotulagem 1: 1000 (v: v) em PBS 1x.
- Prepara-se uma solução salina tamponada com fosfato 0,3% e solução de detergente (PBST) através da mistura de 1x PBS com 0,3% (v: v) de detergente.
- Preparar o tampão de bloqueio por diluição de soro de cabra a 01:10 (v: v) em 0,3% de PBST.
- Prepara-se uma solução de anticorpo primário para uma determinada proteína de interesse por diluição priMaria anticorpo (por exemplo, de coelho anti-quinase de adesão focal (FAK)) 1: 200 (v: v) em tampão de bloqueio.
- Prepara-se uma solução de anticorpo secundário diluindo um anticorpo conjugado sonda-fluorescente (por exemplo, anticorpo de cabra anti-coelho) 1: 1000 (v: v) em tampão de bloqueio.
2. Preparação de elastoméricos selos para micropatterning 3D
Nota: selos elastoméricos são feitos com PDMS.
- Adicione uma solução de PDMS na mesma proporção que a descrita no passo 1.3 e homogeneiza-se. Coloque a mistura em uma câmara de vácuo durante 15-30 min para remover quaisquer bolhas de ar que foram introduzidas durante o processo de mistura.
- Despeje a solução desgaseificado em um plástico pesam barco ou placa de Petri contendo um mestre de silício que é lithographically modelada com características de geometria desejada. Para melhores resultados, curar o PDMS solução a 60 ° C durante ~ 12 horas.
Nota: Os mestres de silício são altamente personalizável; este protocolo utiliza estruturas retangulares, com dimensões de 50um x 200 um x 50 um espaçadas 200 um aparte. Os mestres de silício pode ser feita usando técnicas de fotolitografia padrão. Resumidamente, um foto-resistente é à base de epoxi-girar revestida em cima de uma pastilha de silício. Uma máscara que detalha as características desejadas selo é colocado no topo da pastilha revestida-foto-resistente, que é então exposta à luz UV. As características desejadas não bloqueados pela máscara são expostos à luz e o fotorresistente nesses locais se torna reticulado, enquanto que o restante do revestimento foto-resistente é solúvel e pode ser lavado. - Depois de o PDMS tem curado em torno das características desejadas no mestre de silício, remover o PDMS e mestre a partir do recipiente plástico. Cuidadosamente separar o PDMS da bolacha de silício e remover o excesso de PDMS em torno das características impressas utilizando uma lâmina de barbear limpo.
- Agora corte os PDMS estampados com características impresso no interior selos retangulares individuais (~ 8 mm x 5 mm) com uma lâmina de barbear. Armazená-los longa-side-up em um cleum de 100 mm de diâmetro placa de Petri.
- Além disso, utilizar a solução PDMS descrito no passo 1.3 para fazer suportes para os carimbos rectangulares.
- Utilizando um revestidor de rotação, espalhar ~ 2-3 g da solução de PDMS uniformemente em um de 100 mm de diâmetro, uma placa de Petri e curar o PDMS durante ~ 12 h a 60 ° C como no passo 2.1. Em seguida, utilizando uma lâmina de barbear, cortar a fina camada de PDMS em rectângulos (aproximadamente 5 mm x 2 mm).
Nota: Dois suportes são necessários para cada selo PDMS feita no passo 2.3. Os suportes podem ser armazenados nos 100 mm de diâmetro numa caixa de Petri que contém os carimbos de PDMS. - Antes de os carimbos de PDMS e suportes podem ser usados para a cultura de células, esterilizar por imersão em etanol a 70% e seca utilizando um aspirador num armário de segurança biológica (cultura de células capa).
3. Preparação de tecidos epiteliais 3D
- Em uma cabine de segurança biológica, adicionar uma gota de cerca de 50 ul de BSA a 1% em PBS para o início de cada selo. Coloque a gota coberto carimbos, a 4 ° C durante um minimamã de 4 h para assegurar que a BSA é adsorvido à superfície do selo.
- Aspirar solução de BSA a partir de os carimbos de PDMS.
- Lavam-se as superfícies dos selos duas vezes com meio de cultura de células (50 uL por lavagem por selo deve ser suficiente), a aspiração após cada lavagem.
- Lidar com os selos e os suportes PDMS esterilizados utilizando pinças de aço inoxidável curvas. Em uma cabine de segurança biológica, colocar para fora um de 35 mm de diâmetro prato de cultura de tecidos para cada PDMS selo. Em cada prato, deitou-se dois PDMS suportes separados por uma distância ligeiramente menor que o comprimento dos selos PDMS.
- Usando as pinças, esterilizar como muitas lamelas de vidro circulares (15 mm de diâmetro, # 1) como existem PDMS selos usando 70% de etanol. Aspirar o líquido em excesso as lamelas, mantendo-os com a pinça. Armazenar as lamelas foram lavadas em uma de 100 mm de diâmetro Petri prato separado.
- Dispensar ~ 50 ul da mistura de colagénio para revestir uniformemente a superfície de cada carimbo de PDMS.
- Pegarcada PDMS revestidos com colagénio carimbar com a pinça e inverter cuidadosamente eles. Diminuir os selos invertidas no topo do PDMS suporta estabelecidas em cultura de tecidos de 35 mm de diâmetro abaulado de modo a que o colagénio é entre o selo e o fundo do prato de cultura de tecidos. Incubar os pratos a 37 ° C durante 30 min.
- Dispensar ~ 50 ul da mistura de colagénio restante em cada uma das lamelas circulares (mais tarde, estes irão ser colocados no topo dos tecidos modificados para encapsular completamente los em colagénio) e incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Obter uma placa de cultura de tecidos de 100 mm de diâmetro contendo células epiteliais (ex. EpH4 rato células epiteliais mamárias) em ~ 40% de confluência. Aspirar o meio de cultura de células e lava-se uma vez com 10 ml de PBS 1X. Adicionar 2 ml de tripsina às células e incuba-se a 37 ° C durante 5-10 min.
- Adicionar 8 mL de meio de cultura fresco para a placa de cultura de tecido contendo células tratadas com tripsina, separando as células aderentes remanescentes do prato. Misturar suavemente por pipetagem e mover-se a mistura de células para um tubo cónico de 15 ml e centrifugar a 100 x g durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante do tubo cónico e ressuspender o sedimento de células em meio de cultura celular. Usando um hemocitómetro, contagem de células para determinar a concentração da suspensão. Ajustar o volume de suspensão para se obter uma concentração final de 10 ~ 6 -10 7 culas / ml.
- Retirar as amostras de colagénio gelificadas da incubadora. Usando a pinça, levante suavemente os selos PDMS em linha reta para cima para destacá-las do colágeno moldado e descartá-las.
- Dispensar ~ 30 ul da suspensão de células concentrada sobre a superfície de cada gel de colagénio contendo cavidades moldadas, de geometria desejada. Observar as células em um microscópio de campo claro com uma objectiva 10X / 0,25 NA, enquanto agitando o lado pratos a lado para promover a célula de se estabelecer dentro das cavidades. As cavidades deve ser preenchido dentro de ~ 5 min.
- para retirar excesso de células a partir de em torno das cavidades, inclinar cada prato de cultura de tecido no seu lado e suavemente dispensar ~ 400 ul de meio de cultura de células sobre a superfície do gel de colagénio. Aspirar o líquido e repita a lavagem mais 1-2 vezes, verificando os géis de colágeno sob o microscópio entre cada lavagem.
- Após as células em excesso foram apuradas a partir de em torno das cavidades cheias de células no colagénio molde, colocar as placas de cultura de tecido para dentro de uma incubadora de cultura de células a 37 ° C durante 15 min. Em seguida, utilizando a pinça, inverter cuidadosamente as lamelas revestidas com colagénio de classe e colocá-las em cima dos moldes de colagénio cheias de células de modo a que o colagénio de as lamelas forma uma capa sobre as cavidades cheias de células. Incubar as amostras a 37 ° C durante 15 min.
- Uma vez que as tampas de colagénio aderiram ao molde de colagénio cheias de células, dispensar ~ 2-2,5 ml de meio de cultura de células lentamente através da lamela de vidro na parte superior dos géis. Cultura das amostras a 37 ° C durante 1-3 dias.
Nota:24 horas após a sementeira inicial, os tecidos epiteliais podem ser tratadas com factores de crescimento tais como o factor de crescimento epidérmico (EGF), ou factor de crescimento de hepatócitos (HGF) para induzir a ramificação.
4. Imunofluorescência e Análise de Imagem
- Aspirar o meio de cultura de células a partir das placas de cultura de tecidos e adicionar a solução fixadora suficiente para cobrir os géis contendo as células. Incubar os pratos à temperatura ambiente durante 15 min num agitador a 200 rpm.
- Aspirar o fixador, encher os pratos de cultura de tecidos com 1 x PBS, e incubar à temperatura ambiente durante 15 min num agitador a 200 rpm. Repita duas vezes para três lavagens totais.
- Para rotular núcleos: Aspirar o PBS da placa de cultura de tecidos e substitua com uma solução de Hoechst. Incubar à temperatura ambiente durante 15-20 min. Para manchar para FAK ou outro marcador que é detectável com os anticorpos, avance para o Passo 4.5.
- Aspirar a solução de marcação nuclear e lava-se a g contendo as célulasels três vezes com 1x PBS como no passo 4.2. amostras coradas pode ser armazenado em 1x PBS a 4 ° C até uso posterior.
- Para corar para uma proteína de interesse: Aspirar o PBS a partir das placas de cultura de tecidos, adicionar 300 uL de 0,3% de PBST, e incuba-se a amostra à temperatura ambiente durante 15 min.
- Aspirar o PBS, cobrir os géis com tampão de bloqueio, e incuba-se num agitador (200 rpm) à temperatura ambiente durante ~ 4 horas.
- Aspirar o tampão de bloqueio, cobrir os géis com solução de anticorpo primário, e incuba-se num agitador a 200 rpm durante a noite a 4 ° C.
- Aspirar a solução de anticorpo primário, adicionar solução de PBST 0,3%, e incuba-se num agitador a 200 rpm à temperatura ambiente durante 30 min. Aspirar o PBST e repetir a cada 30 minutos para 3-4 hr.
- Repita os passos 4.7 e 4.8, este tempo de incubação com a solução de anticorpo secundário. Enrole as placas de cultura de tecido com papel alumínio para evitar a fotodegradação do anticorpo secundário. Após a finaL lavagem, as amostras coradas pode ser armazenado em 1x PBS a 4 ° C até uso posterior.
- Para visualizar amostras, usar um 10X / 0,30 NA objectivo focado no plano médio dos tecidos epiteliais.
- Para visualizar núcleos celulares, amostras de imagem fixa marcadas com um marcador nuclear usando um 10x / 0,30 NA objetivo sob iluminação UV.
- Para visualizar amostras coradas para uma proteína de interesse, utilizando uma imagem de NA objectiva 10X / 0,30 em um microscópio de fluorescência invertido.
- Para criar mapas de coloração das proteínas de tecidos múltiplos (normalmente 50 ou mais) de geometria inicial idêntica frequência, primeira importação cada uma das imagens usando o software de análise de imagem padrão (veja Materiais) e convertê-los para 8 bits em tons de cinza.
- Para limiar essas imagens, convertê-los para binário (ie, reticulação / preto e branco) através da definição de um ponto de corte em tons de cinza; valores em escala de cinza abaixo do limiar de se tornar preto, e aqueles acima do limiar de se tornar branco. Em seguida, combinarcada uma das imagens binárias individuais numa pilha única imagem.
- Em seguida, registrar as imagens empilhados (ou seja, alinhar ou combiná-los) no software de análise. Muitos pacotes de software de análise de imagem vem com um plug-in de inscrição disponível gratuitamente.
- Usar cada imagem em uma pilha como um modelo para o alinhamento da imagem seguinte, de tal modo que as imagens em toda a pilha estão alinhadas por propagação. Finalmente, overlay (projeto) as imagens da pilha de imagens alinhadas com base na intensidade média para formar uma única imagem com um mapa frequência pixel. Essa imagem pode ser codificados por cores usando o software de edição de imagem de escolha 10,11.
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Representative Results
Esquemática geral de microfabricação tecido epitelial mamário
Um esquema geral do processo de microfabricação descrição do fluxo de trabalho experimental é mostrado na Figura 1. O resultado final é uma série de tecidos epiteliais de geometria e espaçamento idênticos que estão completamente encaixadas dentro de um gel de ECM. Uma experiência representativa utiliza rato EpH4 células epiteliais mamarias cultivadas num gel de colagénio de tipo I bovino a uma concentração de 4 mg / ml. Para garantir a mais alta qualidade de tecidos artificiais, as técnicas descritas no protocolo deve ser acompanhado de perto. Figuras 2A e 2B mostram vistas de baixa e alta ampliação de matrizes de poços retangulares que foram moldados em um colágeno tipo I gel antes da semeadura de células. A forma das cavidades é determinada pela forma das características do mestre de silício. É importante para levantar the PDMS molde recta a partir do colagénio de modo a não falsear a geometria da cavidade. A Figura 2C mostra cavidades rectangulares em um colagénio do tipo I de gel que foram enchidos com células epiteliais mamarias (excesso de células foram lavadas para fora da superfície do colagénio). Neste exemplo, cada 200 um x 50 um poço rectangular contém cerca de 80-100 células.
A adição de factores de crescimento induz a morfogénese
24 horas após a sementeira, os tecidos podem ser tratados com factores de crescimento tais como HGF ou EGF e cultivadas durante vários dias para modelar ramificação morfogénese. Tipicamente, ramos começam a formar tão cedo quanto 4 horas após a estimulação do factor de crescimento. A Figura 3A mostra resultados representativos de tecidos epiteliais mamárias rectangulares dentro de um gel de colagénio de tipo I de 24 horas após o procedimento de microfabricação, após o que CELLS aderiram ao colagénio e um ao outro. Sem ramos são observados antes da adição do factor de crescimento. A figura 3B mostra um tecido rectangular representativa que foi submetido a ramificação 24 horas após a adição de HGF a 10 ng / ml. Neste caso, ramos ocorrem nas extremidades dos tecidos (em oposição ao meio), em que as células sofrem o maior esforço mecânico 9. Múltiplos tecidos da geometria inicial idêntica no mesmo gel pode então ser trabalhada para determinar as médias populacionais de localização de agências e comprimento dos ramos, permitindo a análise de alto rendimento.
Imunofluorescência para visualizar localização de proteínas
Imunofluorescência das matrizes de tecido no modelo de cultura permite-nos determinar a localização de proteínas no interior de um tecido com alta confiança estatística. A Figura 4A mostra represenresultados sentativas de um tecido epitelial ramificação rectangular mamária coradas para quinase de adesão focal (FAK). A criação de mapas de tecidos de geometria idêntica de frequências pode ser utilizada para visualizar a localização espacial média de proteínas de interesse dentro dos tecidos, o que pode ser comparado com a localização de outras proteínas, bem como a actividade de ramificação. Figura 4B mostra um mapa frequência de coloração média FAK por 50 tecidos que apresentam FAK enriquecimento nas extremidades curtas de tecidos retangulares, onde ramificação ocorre normalmente.
Figura 1. Diagrama esquemático delineando o processo de microfabricação. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Imagens tomadas durante o processo de microfabricação. (A) e baixa (B) e ampliação imagens de alto-contraste de fase de cavidades retangulares em colágeno tipo I criado usando um molde elastomérica PDMS. (C) As cavidades a partir de (A) e (B) são cheios com células epiteliais mamarias. Barras de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. microfabricated tecidos sofrem ramificação morfogênese. (A) imagem de contraste de fase de um representante rectangular de tecidos de 24 horas após a microfabricação. Imagem de contraste de fase de uma re (B)tecido rectangular presentativa que começou a ser submetido a ramificação 24 h depois da adição de HGF a 10 ng / ml. setas brancas indicam ramos recém-formados. Barras de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Imunofluorescência coloração dos tecidos microfabricated. (A) imunofluorescência para FAK num tecido epitelial mamária após o início do ramo. (B) Um mapa frequência de coloração média FAK em 50 tecidos. Barras de escala, 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Acknowledgments
Este trabalho foi financiado em parte por doações do NIH (HL118532, HL120142, CA187692), o Packard Fundação David & Lucile, a Camille & Dreyfus Fundação Henry, eo Burroughs Bem-vindo Fundo. ASP foi apoiado em parte por um Charlotte Elizabeth Procter honorífico Fellowship.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
| Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
| Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
| 100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
| Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
| Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
| 1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
| 10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| 10x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
| Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
| Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
| 35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
| 15 ml conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
| 1.5 ml Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
| 0.05% 1x Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
| HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/ml |
| Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
| Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
| FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |
References
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