Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits

doi: 10.3791/54286 Published: September 20, 2016
* These authors contributed equally

Protocol

1. kromogentest med CPH substrater i en 96-brønds pladeformat

  1. Aktivering af assayet kit plade
    1. Aktiver 96 brønde filter (indeholdende blå CPH-xylan) assaykit plade (liste over materialer) ved at tilsætte 200 pi aktivering opløsning (opnået med kittet) i hver brønd, efterfulgt af 10 minutters inkubering ved stuetemperatur uden omrøring.
    2. Påfør vakuum under anvendelse af en vakuum manifold (med afstandsblokken inde og enhver standard, transparent plade med 96 brønde som en samling plade) til fjernelse eksisterede aktivering opløsning. Det er også muligt at anvende en centrifuge ved 2.700 xg i 10 minutter til dette trin i stedet for vakuum manifold.
    3. Vask CPH substrater ved tilsætning af 100 pi sterilt vand og anvende vakuum (eller centrifugalkraft) for at fjerne stabilisatoren. Gentag dette trin to gange mere, og pladerne er nu klar til brug.
  2. enzymreaktion
    BEMÆRK: omfatter altid bufferalene som en negativ kontrol og om muligt tidligere karakteriserede enzymer som positive kontroller. Brug en statistisk passende antal gentagelser. De CPH substrater er stabil mellem pH 3,0 til 10,0, og den samlede mængde af buffer ende enzym løsning i hver brønd bør ikke overstige 180 pi. Planteekstrakt eller dyrkningsvæsken kan også anvendes i stedet for renset enzymopløsning.
    1. Tilsæt 150 pi 100 mM natriumacetatpuffer, pH 4,5 og 5 pi endo -cellulase opløsning (til en slutkoncentration på 1 U / ml) til hver brønd i assay-kit plade.
    2. Sætte produktet plade (en klar-brønds plade forenelig med mikrotiter-plade-læser) under assay kit plade til at indsamle enhver potentiel lækage fra reaktionen pladen under omrystning.
    3. Inkubér analysekit pladen ved 25 ° C i 30 minutter i en horisontal ryster ved 150 rpm.
      BEMÆRK: Blanding af reaktionen i assaykittet plade under inkubationen er afgørende for at opnå en konsistent og reproducible resultat. CPH substrater er stabile op til 90 ° C. Inkubationstiden bør øges op til 24 timer ved test kultur bouillon indeholder ukendte enzymkoncentrationer med CPH substrater. Bemærk, at passende inkubationstider afhænge af aktiviteten af ​​enzymet (er), men i øvrigt, hvis der ikke er nogen påviselig aktivitet i 24 timer, er det sandsynligt, at enzymet ikke vil forringe det testede substrat. Et aktivt enzym er nedbrydende de uopløselige chromogene polysaccharider af CPH substrat til opløselige kromogene oligosaccharider, som er synlige som farvet supernatant.
    4. Placer ren produkt plade inde i vakuum manifold med afstandsstykket blokken indeni.
    5. Placer analysekit plade på toppen og anvende vakuum (undertryk på max -60 kPa). Det er også muligt at anvende en centrifuge ved 2.700 xg i 10 min.
      BEMÆRK: Filtratet indeholder de farvede oligosaccharider som reaktionsprodukt er nu i produktet plade til yderligere analyse 8
  3. Detektion og kvantificering
    1. Kontroller at det væskevolumen i hver brønd af produktet pladen er omtrent den samme ved visuel inspektion.
    2. Læs absorbans af samlingen pladen ved 595 nm for blåt CPH-xylan under anvendelse af en pladelæser.
    3. Når man gør dataanalyse, trække de buffer-kun negative kontrolværdier fra værdierne fra brøndene, hvor et enzym blev tilsat. Beregn middelværdien og standard fejl af midler (SEM) fra replikatbrønde 8.

2. kromogentest med ICB substrater i en 96-brønds format

  1. enzymreaktion
    1. Tilsæt 150 pi 100 mM natriumacetatbuffer, pH 4,5 og 5 pi 31 U / ml endo -xylanase opløsning til hver brønd i assay-kit plade indeholdende røde ICB-hvedehalm (endelig enzymkoncentration i brønden: 1 U / ml) .
      BEMÆRK: assay kit plader (96 brønde filter plAtes indeholder ICB substrater) fremstilles som beskrevet i litteraturen (se liste over materialer). ICB substrater er stabile i buffere med en pH-området mellem pH 3,0 til 10,0. Altid omfatter buffer alene som en negativ kontrol, kommercielle enzymer som en positiv kontrol og bruge en statistisk passende antal reproduktioner.
      1. Må ikke aktivere ICB substrater som CPH substrat plade, men fjerne stabilisator ved at vaske tre gange med 100 pi vand efterfulgt af vakuum filtrering eller centrifugering.
    2. Læg produktet plade under underlaget pladen til at indsamle enhver potentiel udsivning fra underlaget pladen under omrystning.
    3. Inkubér reaktionen ved 25 ° C under omrystning ved 150 rpm i 2 timer.
      BEMÆRK: En aktiv enzym er nedværdigende de uopløselige kromogene polysaccharider i ICB substrat til opløselige oligosaccharider, som er synlige som farvet supernatant. ICB substrater er stabile op til 90 ° C. Inkubationen time bør øges op til 24 timer, hvis der anvendes ikke-oprensede enzymer såsom kultur bouillon.
    4. Anbring produktet plade inde i vakuum manifold med afstandsstykket blokken indeni.
    5. Placer analysekit plade på toppen og anvende vakuum (undertryk på max -60 kPa) eller bruge en centrifuge for at filtrere produktet fra assaykittet plade i brønden af ​​produktet plade.
      BEMÆRK: Filtratet indeholder de farvede oligosaccharider som reaktionsprodukt er nu i samlingen plade til yderligere analyse 8.
  2. Detektion og kvantificering
    1. Kontroller at det væskevolumen i hver brønd på opsamlingspladen er omtrent den samme ved visuel inspektion.
    2. Læs absorbans af samlingen pladen ved 517 nm for rød ICB-hvedehalm anvendelse af en pladelæser.
    3. Når man gør dataanalyse - trække buffer - kun negative kontrolværdier fra værdierne fra brøndene, hvor et enzymblev tilsat. Beregn middelværdien og standard fejl af midler (SEM) fra replikatbrønde 8.
      BEMÆRK: I tilfælde af screening ukendte enzymer, foreslår vi at lave en fortyndingsrække for at få mere detaljerede data om det dynamiske område enzym aktivitet.

Representative Results

Den high-throughput og multiplexing kapacitet af denne assay er baseret på uopløselig kromogent polymer (eller protein) hydrogel (CPH) substrater anbragt i 96-brønds filterplader. Enzymer samt negative kontroller sættes til assay kit plade (figur 1A) og enzymerne nedbryder den tilsvarende substrat producerer en farvet supernatant (figur 1B). Efter at reaktionen er færdig, supernatanten overføres til en klar-brønd produkt plade og absorbansen kan måles direkte ved anvendelse af et spektrofotometer er egnet til plader med 96 brønde (figur 1C).

Et eksempel på en dosis respons af CPH-arabinoxylan til xylanase ved forskellige koncentrationer af enzymet (0.00 - 0,75 U / ml) er vist i figur 1 D, hvor den faldende koncentration enzym kan observeres visuelt. En mere detaljeret spektrofotometrisk Quantification kan anvendes til at plotte absorbans versus enzymkoncentration (figur 1E). Signalintensiteten svarer til enzymaktiviteten. Reproducerbarheden af ​​assayet er vist med fejlsøjlerne (standardfejl på middelværdi, SEM, af tre replikaer). Mere detaljerede eksperimenter på reproducerbarheden af denne assay er publiceret andetsteds 8.

figur 1
Figur 1. Xylanase behandling af CPH-arabinoxylan. A) En ordning af assayet kit plade med CPH substrat (f.eks CPH-arabinoxylan) fyldt i 96-brønds filterplade brønde lige før tilsætningen af enzymer 1 og 2 og bufferen -Kun kontrol (enzym 1 havde endo -xylanase aktivitet), B) Nedbrydning af CPH-arabinoxylan ved enzym 1 fremstillet en farvet supernatant; C) ved vakuum-assisteret Filtration af supernatanterne i til produktet plade, måles absorbansen spektrofotometrisk; D) produkt plade indeholdende reaktionsprodukterne efter behandling af CPH-arabinoxylan i 4 forskellige farver med forskellige koncentrationer af endo -β-1,4-xylanase i 100 mM natriumacetatpuffer, pH 4,5 i 60 minutter ved stuetemperatur,. E) Kvantificering af reaktionsprodukter fra D hjælp spektrofotometri klik her for at se en større version af dette tal.

Der er forskellige muligheder for at bruge denne analyse i enzym screening. En mulighed er at bruge en plade med 96 brønde indeholdende forskellige polysaccharider til screening, f.eks et lille antal (renset) endo -enzymes med ukendt aktivitet. I dette tilfælde vil resultatet vise, hvilke polysaccharider er nedbrydelighedstand af målenzymet. For at vise dette princip, blev en endo -cellulase testet mod forskellige CPH substrater ved 25 ° C. Tre forskellige enzymkoncentrationer (0,5 U / ml, 1,0 U / ml og 5 U / ml) blev inkuberet i 30 min. Resultatet er klart synlig i produktet plade (figur 2A). Produktet ark til denne endo -cellulase leveres af leverandøren angiver side-aktivitet for xyloglucan (tamarind), byg β-glucan, glucomannan Birchwood xylan og lave side-aktivitet for galactomannan. I overensstemmelse med dette, aktivitet ud over cellulase blev fundet mod CPH-β-glucan (byg), CPH-xyloglucan (tamarind), CPH-xylan (bøgetræ) og lav aktivitet mod CPH-galactomannan (figur 2B). Glucomannan blev ikke testet. De samme CPH substrater blev fordøjet med kommercielle tilgængelige enzymer (tre forskellige enzymkoncentrationer: 0,1 U / ml, 0,5 U / ml og 1,0 U / ml), der anvendes som positive kontroller på samme vilkår end den tidligereeksperiment. Alle substrater blev nedbrudt af den positive kontrol enzym og signalintensiteten øget svarende til højere enzymkoncentration (figur 2C).

Figur 2
Figur 2. Otte forskellige CPH substrater blev inkuberet under omrøring ved 25 ° C i 30 minutter. A) Produktet plade af forskellige CPH substrater fordøjet med en endo -cellulase, ved forskellige koncentrationer. B) Kvantificering af aktiviteten og forskellige side aktivitet af endo -cellulase. De fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien af tre replikaer C) Aktivitet af forskellige kommercielle enzymer til den tilsvarende CPH substrat (endo-cellulase og 2-HE-cellulose. E-LAMSE og CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH- β-glucan (byg); E-XYAN4 og CPH-xylan, E-XEGP og CPH-xyloglucan, E-Blaam og CPH-amylose, E-BMACJ og CPH-galactomannan; alle enzymer fra Megazyme). De fejl søjler repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien af to reproduktioner. Klik her for at se en større version af dette tal.

De uopløselige kromogent biomasse (ICB) substrater er en nyttig tilføjelse til det kromogene substrat repertoire fordi de bevarer delvis naturlige arrangement af polysaccharider i plantecellevægge, der er hovedbestanddelen af ​​biomasse. CPH og ICB substrater anvendes i vores eksempel at analysere de udskilte enzymer af Phanerochaete chrysosporium ved dyrkning i flydende medium. Pladen opsætning af assayet kit plade er vist i figur 3A, med 19 CPH substrater og 5 ICB substrater (4 brønde til hvert substrat, figur 3B). P. Chrysosporium var cultivated i tre dage og derefter kultursupernatanten analyseret. Derfor blev 125 pi 200 mM puffer overført til hver brønd og 25 pi kultursupernatant tilsat. Tre forskellige pH-betingelser er blevet testet ved anvendelse natriumacetatbuffer pH 4,0, natriumphosphatpuffer pH 6,0 eller pH 8,0 (figur 3C). Pladen blev inkuberet rystning (150 rpm) ved 25 ° C i 2 timer.

Reaktionsprodukterne blev overført til produktet pladen (figur 3D) og analyseret. P. Chrysosporium producerede enzymer til nedbrydning af forskellige glucaner, stivelse og xylaner (figur 3e). kunne påvises lavere signaler for hemicellulose arabinan (sukkerroer) og pectinstoffer galactan samt for RGI (sojabønne). De enzymer, der produceres var mere aktive i sure betingelser (pH 4,0) end i neutrale eller svagt basiske betingelser (pH 8,0). Lavere aktivitet i retning af ICB substrater (figur 3F)viser, at når polysacchariderne er i en mere naturlig sammenhæng effektiviteten af ​​enzymet er ikke det samme som med et rent polysaccharid og derfor ICB substrater udviser en mere realistisk syn på enzym effektivitet, hvis den blev anvendt på rå eller præ- behandlet plantemateriale.

Figur 3
Figur 3. Screening af en kultur supernatant fra en 3-dages gammel flydende kultur af Phanerochaete chrysosporium ved hjælp af en multi substrat plade indeholdende 19 CPH og 5 ICB substrater. A) En ordning af pladen setup med 4 brønde for hver enkelt substrat (grå baggrund = CPH substrater, orange baggrund = ICB substrater). B) Billede af analysen plade indeholdende underlaget. C) Scheme viser pufferbetingelser anvendes i dette forsøg (200 mM natriumacetat pH 4,0, natriumphosphat pH 6,0 og natriumphosphat, pH 8,0). D) billede af produktet plade efter 2 timer ved 25 ° C. E) Absorbanser blev påvist ved 517 nm og afbildet for hver enkelt CPH substrat og F ) ICB substrat resultater for de respektive enzymer. klik her for at se en større version af dette tal.

De chromogene substrater kan også anvendes til at studere synergistiske virkninger ved anvendelse af en blanding af forskellige farvede CPH substrater i en brønd og analysere reaktionsblandingen supernatanten efter behandling med enkelt enzymer eller enzym cocktails.

I det følgende er vist i figur 4 eksempel blev rød CPH-cellulose og gule CPH-xylan substrater blandes sammen ved en omtrent udsal-forhold i 96-brønds filterplade brønde. Figur 4A viser de farvede reaktionsprodukter Efter 1 time behandling ved stuetemperatur med intet enzym (kontrol), cellulose cel (2 U / ml), xylanase Xyl (1 U / ml) og en blanding af begge enzymer (3 replikater for hver tilgang) i 100 mM natriumacetat-buffer pH 4,5. Til analyse blev reaktionsproduktet kvantificeres spektrofotometrisk ved at scanne absorbansen spektret fra 350 nm til 700 nm (figur 4B). Ofte visuel inspektion alene kan give en indikation af, om enzymet virker på en eller flere substrater, men indspillet absorbansspektre stammer fra forskellige farvestoffer kan også løses ved hjælp af simpel lineær regression 8 for at give en mere præcis indikation af omfanget af nedbrydning af hver substrat fra blandingen.

Brug af CPH substrater som blandinger væsentlige tilføjer til gennemløb af assayet, således screening mod op til 4 forskellige substrater i et eksperiment (én brønd). I det viste eksempel er fire forskellige anvendte substrater: blå CPH-β-glucan (byg), gul CPH-xylan (bøgetræ), grøn CPH-amylose og røde CPH-pectinstoffer galactan (lupin). Layoutet af underlagspladen er vist i figur 4C og et billede af assaypladen i figur 4D. Reaktionen blev udført i 100 mM natriumacetat pH 4,5 i 30 minutter ved 25 ° C og 150 rpm. Første single enzymer med stigende enzymkoncentration blev testet med den tilsvarende CPH substrat (figur 4E) og den farvede supernatant blev modtaget som forventet i produktet plade (figur 4F, række 1A - 12D). Række E indeholdt to forskellige CPH substrater gul CPH-xylan og blå CPH-β-glucan, som blev nedbrudt med forskellige forhold af de tilsvarende enzymer endo -xylanase og endo-glucanase. Efter reaktionen er resultatet visible i produktet plade: farven af reaktionsproduktet var mørkere grøn-blå, når mere endo-glucanase var til stede (figur 4F, 4E-6E) og forvandlet til en lysere gul-grøn, når endo -xylanase koncentration forøget ( Figur 4F, 10-12E). Det samme ses i række F, hvor de to substrater røde CPH-pectinstoffer galactan og gul CPH-xylan blev nedbrudt med endo -galactanase og endo -xylanase. Alle fire forskellige farvede CPH substrat var til stede (figur 4F, 1G-12F) og enlige enzymer nedbrydes det passende CPH substrat og ved at tilsætte yderligere enzymer en kombination af de farvede reaktionsprodukter blev modtaget.

Figur 4
Figur 4. En kombination af to forskellige CPH substrater, rød CPH-cellulose og gul CPH-xylan, behandlet med forskellige enzymer. EN) Reaction supernatanter efter behandling af to substrater med endo -cellulase (cel) eller endo -xylanase (Xyl) eller begge enzymer. B) absorbansspektre af reaktions- supernatanterne. En kombination af fire forskellige CPH substrater behandlet med forskellige enzymer C) Ordning af substratet plade indeholdende de CPH substrater:. Blå CPH-β-glucan (byg), gul CPH-xylan (bøgetræ), grøn CPH-amylose og rød CPH- pectinstoffer galactan (lupin) D) Billede af assaypladen indeholder de forskellige CPH substrater E) Ordning af produktet plade, der viser forholdet mellem de tilsatte enzymer (nominelle koncentrationer (NC):.. glu = 1 U / ml endo-glucanase, Xyl = 1 U / ml endo -xylanase, amy = 5 U / ml endo-amylase og gal = 0,5 U / ml endo -galactanase). F) Billede af produktet plade efter 30 minutters inkubation ved 25 ° C. Klik her for at se en større version af dette tal.

substrat Kilde
CPH-2-hydroxyethylcellulose N / A
(CPH-2-HE-cellulose)
CPH-amylopectin kartoffel
CPH-amylose kartoffel
CPH-arabinan sukkerroer
CPH-arabinoxylan hvede
CPH-kasein bovin mælk
CPH-chitosan animalske
CPH-curdlan Alcaligenes faecalis
CPH-dextran Leuconostoc spp.
CPH-galactomannan johannesbrød
CPH-laminarin Fingertang
CPH-lichenan islandsk mos
CPH-methylcellulose N / A
CPH-pachyman Poria cocos
CPH-pectinstoffer galactan kartoffel
CPH-pullulan Aureobasidium pullulans
CPH-rhamnogalacturonan I (RG I) kartoffel
CPH-rhamnogalacturonan I (Gal) * kartoffel
CPH-rhamnogalacturonan sojabønne
CPH-xylan bøgetræ
CPH-xyloglucan tamarind
CPH-β-glucan fra byg byg
CPH-β-glucan fra havre havre
CPH-β-glucan fra gær gær
ICB-Arabidopsis Rosette blade fra Arabidopsis thaliana Col-0 (voksen plante)
ICB-Arabidopsis frø Arabidopsis thaliana
ICB-bagasse Saccharum officinarum (tørret voksen plante, stængel og blade)
ICB-krystallinsk cellulose (filterpapir) kommerciel Whatman 3MM Chr Kromatografi papir
ICB-bukkehorn frø Trigonella spp. Frø
ICB-hamp Cannabis spp. (Tørrede voksen plante, stængel og blade)
ICB-lupin frø Lupinus angustifolius frø
ICB-pollen P. pratense Phleum pratense pollen
ICB-gran Picea spp. (Mifyldes træstamme)
ICB-tobak blade fra Nicotiana benthamiana (unge plante)
halm ICB-hvede Triticum spp. (Tørrede voksen plante, stængel og blade)
ICB-pil Salix spp. (Tørrede voksen plante, fræset træstamme)
ICB-Sorghum Sorghum spp. (Blade fra voksen plante)
* (β-1,4-D-galactan sidekæder fjernes med endo -β-1,4-D-galactanase)

Tabel 1. Liste over tilgængelige Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) og Uopløselig Chromogenic Biomasse (ICB) substrater.

Discussion

Vi bruger en ny generation af multi-farvede CPH og ICB substrater, som er baseret på chlortriazin farvestoffer (komplet liste over substrater i tabel 1) arrangeret i et specialdesignet kommercielt assay kit. Enzymfordøjelse af substraterne giver små, opløselige, farvet produkter, som kan påvises i assayet opløsning og kan kvantificeres under anvendelse af en pladelæser 9. Dette assay er designet til evaluering af endo- virkende enzymer og følsomheden af assayet er tilsvarende den ene med azurin tværbundet (AZCL) substrater 10, mens andre metoder er tilgængelige for exo-virkende enzymer 11,12. Begrænsningen af dette assay kit ligger i påvisningen af endo -enzyme aktivitet, som CPH samt ICB substrater ikke nedbrydelige ved exo -enzymes sandsynligvis på grund af sterisk hindring som følge af farvestoffet og tværbindingsmolekyler 8.

Assayet udføres i en 96-well format og individuelle reaktioner finder sted i brøndene. Reaktionen skal omrøres i pladen til at modtage reproducerbare data. De resulterende supernatanter filtreres i et produkt plade, hvor absorbansen af ​​hver brønd kan kvantificeres ved hjælp af absorbans spektrometri. De grundlæggende principper og layoutet af assay er vist i figur 1. Assayet består af en analyseplade (en 96-brønds filterplade) med substraterne, og efter inkubering med enzymer, supernatanten filtreres gennem i en klar plade med og absorbanserne aflæses tilvejebringelse af en semi-kvantitativ måling af enzym specificitet og aktivitet. Det er blevet vist, at denne screeningsassay hjælp CPH substrater kan også anvendes i en agarplade format, hvor de opløselige reaktionsprodukter skabe en farvet halo efter inkubation natten over. 8

Analyseelementerne kits kan anvendes til at screene oprensede enzymer og deres potentielle bivirkninger aktiviteter som påvist iFigur 2. Bi-aktiviteter kan opstå fra et enkelt enzym og dets promiskuøse specificitet, men også fra et faktum, at den analyserede prøve er en blanding af forskellige enzymer og deres synergistisk virkning skal undersøges. Derudover, som det er blevet påvist i tidligere undersøgelser, at enzym cocktails, gut mikrobiota 13 og dyrkningssupper fra svampe 8 såvel som endogen plante enzym og bakterier (upublicerede data) kan anvendes som en enzymkilde.

ICB substrater fat komplekse blandinger af cellevægskomponenter ofte støder på i industrielle processer opdeling biomasse. Disse substrater er designet til at evaluere polysaccharid tilgængelighed og give oplysninger om, hvordan man effektivt optimerer nedbrydning cocktails for en mere effektiv nedbrydning output. Som illustreret i figur 3 CPH og ICB substrater kan anvendes i enzym screening side om side - afslører et væld af information om enzymspecificitet end aktivitet i både forbindelse med det foretrukne substrat (CPH) og en mere naturlig kompleks indeholdende andre komponenter udover den foretrukne substrat nærmere efterligne en makromolekylær samling findes i naturen (ICB). Anvendelsen af ​​flere farver giver mulighed for samtidig påvisning af forskellige enzymaktiviteter mod flere substrater, som øger den high-throughput og multiplexity af assayet. Spektre af forskellige farvestoffer kan løses ved simpel lineær regression og i de fleste tilfælde multisubstratenzym aktivitet kan observeres ved visuel inspektion alene. Et simuleret eksempel på et sådant forsøg, og resultaterne er afbildet i figur 4.

Dette assay værktøjskassen og alsidigheden af ​​dens anvendelse er meget velegnede til første-niveau screening af enzymer og dyrkningssupper med ukendte aktiviteter. De vigtigste aspekter af dette assay er dens high-throughput natur, customizability, brugervenlighed og fleksibilitet. Med det i tankerne, we mener, at denne roman sæt værktøjer i høj grad vil forbedre og fremskynde enzym screening processer i industrielle såvel som akademiske programmer.

Disclosures

Der er to patentansøgninger indleveret involverer 96-brønds plade CPH substratassay og 96 brønde ICB substratassay (WO2015036000 og Danmark PA 2015 70.311).

Acknowledgments

Vi vil gerne takke professor J. Paul Knox (University of Leeds, UK), der har givet adgang til sine laboratorier til at filme, og Susan E. Marcus for fremragende teknisk bistand. JS anerkender WallTraC projektet (Europa-Kommissionen syvende rammeprogram (tilskudsaftale nr.: 263.916) og projektet Biomasse til det 21. århundrede (Innovation fundament Danmark, sag nr .: 103.408) SKK er takke SET4Future projektet (Dansk Strategiske Forskningsråd), Bio-Value Strategisk grundlagt af den danske strategiske Forskningsråd, dansk Råd for Teknologi og Innovation (Grant sag nr .: 0603-00522B), og A Biologi tilgang til Forståelse enzymatisk nedbrydning af Complex Polysakkarid Systems (Grant J.nr. .:. 107.279) til finansiering Dette papir afspejler forfatternes synspunkter kun den Europæiske Union er ikke ansvarlig for nogen brug, der måtte blive gjort af oplysningerne indeholder heri..

Materials

Name Company Catalog Number Comments
assay kit plates Glycospot customized assay kit plates
activation solution Glycospot for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold Pall Corporation 5015 spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile Millipore MSHVN4510 assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene Greiner Bio-One 651201 collection plate after washing the substrates
Nunc MicroWell 96-Well Microplates Thermo Scientific 269620 product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT Vacuubrand 732000 vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron Infors HT 4950132 (Buch & Holm) horizontal shaker
SpectraMax M5 Molecular Devices 10067-750 (VWR) 96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold Pall Corporation 5017 vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum) Megazyme E-CELTR cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus Megazyme E-BMACJ mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.) Megazyme E-LAMSE β-glucanase [glu]
endo-β-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger Megazyme E-EGALN galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger Megazyme E-XYAN4 xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp. Megazyme E-XEGP xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis Megazyme E-BLAAM amylase [amy]

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lombard, V., Ramulu, H. G., Drula, E., Coutinho, P. M., Henrissat, B. The carbohydrate-active enzymes database (CAZy) in 2013. Nucleic Acids Res. 42, (Database issue), D490-D495 (2014).
  2. Cantarel, B. L., et al. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nucleic Acids Res. 37, D233-D238 (2009).
  3. Agblevor, F. A., Murden, A., Hames, B. R. Improved method of analysis of biomass sugars using high-performance liquid chromatography. Biotechnol. Lett. 26, (15), 1207-1211 (2004).
  4. Black, G. E., Fox, A. Recent progress in the analysis of sugar monomers from complex matrices using chromatography in conjunction with mass spectrometry or stand-alone tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 720, (1-2), 51-60 (1996).
  5. Miller, G. L. Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar. Anal. Chem. 31, 426-428 (1959).
  6. Somogyi, M. Notes on Sugar Determination. J. Biol. Chem. 195, (1), 19-23 (1952).
  7. Zantinge, J. L., Huang, H. C., Cheng, K. J. Microplate diffusion assay for screening of beta-glucanase-producing microorganisms. Biotechniques. 33, (4), 798 (2002).
  8. Kračun, S. K., et al. A new generation of versatile chromogenic substrates for high-throughput analysis of biomass-degrading enzymes. Biotechnol Biofuels. 8, (2015).
  9. Leemhuis, H., Kragh, K. M., Dijkstra, B. W., Dijkhuizen, L. Engineering cyclodextrin glycosyltransferase into a starch hydrolase with a high exo-specificity. J. Biotechnol. 103, (3), 203-212 (2003).
  10. Nyyssonen, M., et al. Coupled high-throughput functional screening and next generation sequencing for identification of plant polymer decomposing enzymes in metagenomic libraries. Front Microbiol. 4, 282 (2013).
  11. Sweeney, M. D., Xu, F. Biomass Converting Enzymes as Industrial Biocatalysts for Fuels and Chemicals: Recent Developments. Catalysts. 2, (2), 244-263 (2012).
  12. Biely, P., et al. Action of xylan deacetylating enzymes on monoacetyl derivatives of 4-nitrophenyl glycosides of beta-D-xylopyranose and alpha-L-arabinofuranose. J. Biotechnol. 151, (1), 137-142 (2011).
  13. Mackenzie, A. K., et al. A polysaccharide utilization locus from an uncultured bacteroidetes phylotype suggests ecological adaptation and substrate versatility. Appl Environ Microbiol. 81, (1), 187-195 (2015).
High-throughput screening af Carbohydrate-nedbrydende enzymer ved hjælp Novel Uopløseligt kromogene substrat Assay Kits
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).More

Schückel, J., Kračun, S. K., Willats, W. G. T. High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits. J. Vis. Exp. (115), e54286, doi:10.3791/54286 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter