Abstract
Patch clamp undersøgelser fra dorsalrodsganglier (DRG) neuroner har øget vores forståelse af det perifere nervesystem. I øjeblikket er de fleste optagelser foretaget på dissocierede DRG-neuroner, hvilket er en standard forberedelse til de fleste laboratorier. Neuronale egenskaber, men kan ændres ved axonal skade som følge af enzym fordøjelse bruges i at erhverve dissocierede neuroner. Endvidere kan dissocierede neuron præparater, der ikke fuldt ud repræsentere mikromiljø af DRG da tab af kontakt med satellit gliaceller, der omgiver de primære sensoriske neuroner er en uundgåelig konsekvens af denne metode. For at overvinde de begrænsninger i at bruge konventionelle dissocierede DRG-neuroner til patch clamp optagelser, i denne rapport beskriver vi en metode til at forberede intakte DRG og gennemføre patch clamp optagelser på individuelle primære sensoriske neuroner ex vivo. Denne fremgangsmåde tillader hurtig og enkel tilberedning af intakte DRG, efterligner ivivo betingelser ved at holde DRG-neuroner forbundet med deres omgivende satellit gliaceller og basalmembranen. Endvidere fremgangsmåden undgår axonal skade mod manipulation og enzym fordøjelse såsom når dissociering DRG. Denne ex vivo præparat kan yderligere anvendes til at studere interaktionen mellem primære sensoriske neuroner og satellit gliaceller.
Introduction
Sensation er afgørende for en organismes overlevelse og trivsel. Transmissionen af stimuli er afhængig af de sensoriske veje, der starter ved perifere endelser axoner fra primære sensoriske neuroner. Primære sensoriske neuroner, med undtagelse af mesencephale kerne af trigeminusnerven, er placeret i den trigeminale ganglier og dorsalrodsganglier (DRG). De tjener som dørvogtere af den sensoriske information 1. På perikarial membran, ligesom på centrale og perifere terminaler, DRG-neuroner udtrykker receptorer og ionkanaler, såsom glutamatreceptorer, TNF alfa-receptorer, forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1), natriumkanaler mv 2 -7. Patch clamp optagelser af perikarial membran tillader forstå funktionelle ændringer af mange af disse receptorer og kanaler i hele neuron.
Patch-clamp optagelse teknik er et stærkt værktøj til STUdøende aktiviteter kanaler eller receptorer og en lang række undersøgelser er blevet udført ved at anvende denne teknik på DRG-neuroner 8-10. I de fleste undersøgelser DRG fjernes ved at skære den dorsale rodspirerne og spinal nerve tæt på ganglion. Efter hakning, er ganglion derefter placeret i fordøjelsesenzymer, der resulterer i dissociation af DRG-neuroner, som derefter kan registreres straks eller dyrket i flere dage forud for optagelse. Desværre dissociation af DRG-neuroner involverer en nødvendig axotomi tæt på perikarya. Når dissocieret og axotomiserede, DRG-neuroner undergår fænotypiske ændringer samt ændringer i membran ophidselse 11,12. Tabet af kontakt mellem perikarya af individuelle neuroner og satellit gliaceller, der normalt omgiver dem kan bidrage til disse ændringer 13. Den krydstale mellem neuroner og satellit gliaceller er både afgørende fysiologiske forhold og i tilpasning til pathologiCal betingelser som dem, der fører til intraktabel smerte 14,15. Det ville være en udfordring at studere interaktionen mellem neuroner og satellit gliaceller bruger dissocieret DRG præparat.
Intakte DRG, på den anden side giver tættere på in vivo betingelser. I de sidste mange år, har vores laboratorium, samt nogle andre grupper, brugt intakte DRG fra voksne rotter til at undersøge ændringer af primære sensoriske neuroner i forskellige forhold, der er forbundet med kroniske smerter 3-5,11,15-17. Selvom de teknikker, der anvendes i disse undersøgelser noget er etableret, en trin-for-trin beskrivelse er endnu ikke blevet offentliggjort. I den foreliggende manuskript, beskriver vi en bekvem og hurtig måde at fremstille intakte DRG og deres anvendelse til patch clamp optagelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Alle procedurer for vedligeholdelse og brug af forsøgsdyrene var i overensstemmelse med reglerne i UCSF Udvalgene vedrørende Animal Research og blev udført i overensstemmelse med de retningslinjer for NIH regler om brug af dyr og pleje (publikation 85-23, Revideret 1996 ). Den UCSF Institutional Animal Care og brug Udvalg godkendte protokoller, der bruges i denne undersøgelse.
1. Udarbejdelse af Instrumenter, løsninger og fade
- Forbered Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF).
- Forbered 500 ml 10x lav kation opløsning, og 500 ml 10x bicarbonatopløsning (se tabel 1 og 2 for opløsning forberedelse). Opbevares ved 4 ° C og brug inden for en måned.
- Forbered 600 ml frisk aCSF ved blanding 60 ml 10x lav kation opløsning med 60 ml bicarbonatopløsning og derefter tilføje 480 ml deioniseret vand for at opnå en endelig volumen på 600 ml. Bubble i aCSF med carbogen(5% O2 og 95% CO2) i mindst 10 min før brug.
- Træk Patch Pipette fra Kapillær Glass.
- Placer tyndvægget kapillær glas i en pipette puller at forberede optagelse pipetter.
Bemærk: I vores laboratorium, er de følgende indstillingsparametre for aftrækker anvendes til at opnå den ideelle pipette form: varme (510), hastighed (32). Den ideelle pipette form for intakt DRG optagelse bør have en gradvis slank tilspidsning med en lav kegle vinkel, og dette kan bedst opnås ved at prøve sig frem. - Sørg for, at modstanden af pipetten er 3-5 MQ når fyldt med interne løsninger (se tabel 3 for løsning forberedelse). Der henvises til Axon Guide for detaljeret metode til måling pipette modstand 18.
- Placer tyndvægget kapillær glas i en pipette puller at forberede optagelse pipetter.
- Tilsæt 1 mg collagenase til 400 pi aCSF, hvilket gav en slutkoncentration på 13 enheder / ml. Derefter udfylde hvert glas pipette med omkring 20 ul collagenase løsning. butikde fyldte pipetter i en -20 ° C fryser og bruge dem inden for tre uger.
- Forbered 200 ml koldt aCSF (ca. 4 ° C). For at afkøle aCSF hurtigt placere den i et bæger, forsegle med plastfolie og sted i en -20 ° C fryser i ca. 20 min, indtil det begynder at fryse. Anbring bægerglasset i et isbad og boble med carbogen i 10 min. Bubble de resterende 400 ml aCSF med carbogen ved stuetemperatur.
- Mens aCSF køler, skære enden af en plast engangs overførselspipetten at forstørre åbningen til en diameter på 5 mm (dette vil blive anvendt til at overføre DRG). Saml følgende kirurgiske instrumenter: skalpel (# 15), lige og buede Mayo saks, fine 2 mm spids rongeur, Adson (tandede) pincet, iris saks, forår saks og to fine pincet. Hæld den oxygenerede kolde aCSF i 3 glaspetriskåle (Ydre diameter: 10 cm).
2. DRG Dissektion
- Bedøver en rotte (200-220 g) med natrium pentobarbital (100 mg / kg, ip) og bekræfte, at niveauet af anæstesi er tilstrækkelig ved at teste pedal refleks og øjne blinke refleks.
- Efter at have kontrolleret, at rotten er bedøvet, barbere lænden området og incise hud og subkutane væv langs midterlinjen. Frigør de paraspinale muskler fra torntappene på L1-S2-niveau ved hjælp af en fin periosteal elevator.
- Brug krum saks til at klippe torntappene fra L1 til S2. Brug lige Mayo saks til at gøre tværgående nedskæringer i den udsatte rygsøjlen ved ca. L1 og S1 og fjern dette segment af rygsøjlen en bloc og hurtigt nedsænkes den i koldt aCSF (udarbejdet i trin 1.5) i 2-3 min. Efter fjernelse af lændehvirvelsøjlen DRG, er eutanasi udført ved bilateral torakotomi mens rotten er stadig under dyb bedøvelse.
- Skyl off blodet fra den fjernede rygsøjlen og fastgjort væv og overførsel til en petriskål med koldt aCSF. USE en fin rongeur at fjerne lagene. Skær dura mater langs midterlinien med microscissors at blotlægge rygmarven. Løft forsigtigt rygmarven, og skær nerve rødder på deres indgang i rygmarven ved hjælp iris saks, derefter fjerne rygmarven.
- Overfør den resterende ryghvirvel med DRG til den anden petriskål fyldt med kold aCSF. Identificer L4 og L5 DRG baseret på deres relative position til tværgående processer og iskiasnerven.
Bemærk: Vedligeholdelse af iskiasnerven intakt vil bidrage til at identificere L4 og L5 DRG (iskiasnerven stammer fra L4-6 spinal nerver). - Brug Dumont pincet og de Noyes saks til at befri DRG fra de omgivende bindevæv. Hold nerve rod og spinal nerve knyttet til DRG.
- Brug overførselspipetten at flytte DRG ind i det tredje petriskål til yderligere dissektion.
- Under dissektion mikroskop, forsigtigt fjerne så meget som muligt af den epineurium omgivende the DRG.
- Brug Noyes foråret saks til at klippe en åbning, hvor dorsale og ventrale rødder deltage i DRG og adskille ventrale rod fra DRG. Brug Dumont # 5 pincet med stumpe tips til at holde epineurium, og bruge en anden fin pincet til at rulle DRG fra epineurium.
- Fortsæt med at fjerne så meget som muligt af epineurium knyttet til DRG bruger de fine pincet.
Bemærk: En godt dissekeret DRG er vigtigt at opnå en god fordøjelse i det næste trin.
3. DRG Fordøjelse
- Overfør DRG til optagelsen kammeret. Sørg for, at siden af DRG hvor nerve rødder stammer ansigter ned.
Bemærk: I denne måde, de fleste neuroner er tilgængelige. - Brug et anker for at stabilisere DRG. Perfundere DRG med iltet aCSF med en hastighed på 0,5 ml / min gennem plastrør forbundet med en peristaltisk pumpe, der er placeret på et bord ved siden af optagelsen riggen.
- Vent i 30 minutter for at tillade cellerne at inddrive. Vurdere kvaliteten af DRG under infrarødt differential-interface kontrast (IR-DIC) optik på 40X objektiv forstørrelse gennem et CCD-kamera.
Bemærk: Gode DRG indeholder normalt mange runde, godt kontrast, neuroner omgivet af satellit gliaceller på overfladen. - Fordøje et lille område af overfladen af DRG.
Bemærk: De glas patch pipetter anbringes i pipetteholdere, som er små koblinger, der tillader slangen at blive fastgjort til den glaspipette med en lufttæt forsegling.- Individuelt forbinde to 1 ml sprøjter til pipetteholdere gennem to stykker af små gummi diameter slange. Put en glas pipette fyldt med collagenase i en af pipetteholdere og en tom glas pipette ind i den anden.
- Brug mikromanipulator at placere pipetterne lige over DRG. Derefter under mikroskop forstørrelse, kolliderer tips af to pipetter mod hinanden forsigtigt at forstørre åbningerne i pipettespidser (Ideelt set en diameter på 5-10 um).
- Flyt pipette fyldt med enzym tæt på overfladen af DRG og kortvarigt anvende positivt tryk til pipetten indeholdende collagenase gennem røret, der forbinder holderen og sprøjten ved at forskyde stemplet omkring 0,5 ml.
Bemærk: Under pres, vil strømmen af enzymet fra pipetten mindre udvidelse rummet mellem DRG-neuroner, som kan tjene som tegn for enzym ansøgning. - Efter 10 til 15 minutter, når resterne af den resterende epineurium observeres, forsigtigt negativt tryk på tomme pipette til at suge væk resterne.
Bemærk: På denne måde vil de neuroner og omgivende satellit gliaceller tydeligt eksponeret og klar til patch optagelse. - Kassér de to pipetter ind i affaldsbeholder.
4. Patch Clamp Recordings
- Placeres elektroden opløsning (se tabel 3) på is for at forhindre nedbrydning. Fyld glasset patch pipette medfiltreres intracellulær løsning (sprøjte filter, porestørrelse: 0,2 um) og placere pipetten i holderen hovedtrin pipette. Anvende en blid positivt tryk til pipetten gennem en 5 ml sprøjte ved at forskyde stemplet omkring 1 ml før sænkning af pipetten i badopløsningen.
Bemærk: Dette forhindrer pipetten i at blive blokeret. - Vælg "V-clamp" mode ved at dreje funktion knappen på forstærkeren, og åbn "Membrane test" grænseflade i softwaren. Flyt pipetten tæt på målet neuron under mikroskop inspektion.
Bemærk: I den intakte DRG forberedelse, et tyndt lag af satellit gliaceller indkapsler hver neuron. - Brug positivt tryk fra pipetten til at krydse satellit gliacelle lag indtil en pludselig udvidelse af rummet mellem neuron og omgivende lag af satellitbaserede gliaceller observeres. Hold dig i bevægelse pipetten mod neuron, indtil en "smilehul" observeres på neuron.
Bemærk: I forhold tiloptagelser fra adskilles neuroner, det positive tryk skal være en lidt større, hvilket vil bidrage til at trænge ind i satellit gliacelle lag og øge chancerne for en vellykket patching. - Reducer positivt tryk. Dernæst opnå en giga ohm tætning med blide sug.
Bemærk: Med denne metode succesraten for optagelse er mindst 70%. - Opnå helcelle-optagelse konfiguration som tidligere 19 beskrevet.
- Kort beskrevet gennemtrænge neuron cellemembranen via en kort, men kraftig sugning. Alternativt kan du bruge "zappe" funktionen på forstærkeren, mens sugning.
- Når en hel celle-tilstand er etableret, kompensere helcelle kapacitans og seriemodstand (Rs) ved at dreje kapacitans og modstand kompensation drejeknapper på forstærkeren.
Bemærk: Rs er normalt 5-20 MQ. - Forlad cellen hvis Rs er indledningsvis større end 30 MQ; eller Rs ændres med mere end 20% i løbet af optagelsen. Ogsåmåle potentialet hvilende membran; opgive en celle, hvis den potentielle hvilende membran er mere end -50 mV.
- Luk "Membrane test" vinduet. Vælg "Jeg-clamp normal" tilstand ved at dreje på tilstanden knappen på forstærkeren.
- Klik på "åben protokol" i softwaren, skal du vælge og indlæse protokol til måling rheobase. Klik på "record" for at starte optagelsen. Mål input modstand og rheobase at undersøge neuronexcitabilitet ved at indsprøjte en gradueret serie af depolariserende strømninger i trin på 100 pA.
- Klik på "åben protokol" igen og vælg den protokol til måling tærskel membran. En 500 ms depolariserende rampe strøm (2.000 pA / s) vil blive injiceret til neuron.
- Brug dataindsamlings- og analysesoftware (f.eks Clampfit) at analysere de optagne spor ifølge producentens instruktioner. Brug softwaren til at beregne input modstand (Rin) på grundlag af steady-state IV vedrøledsagelse under hyperpolarisering strømme leverede. Flyt cursoren til at måle værdien for rheobase og membran tærskel.
Bemærk: Amplituden af strøm kræves for at inducere AP defineres som rheobase, og den laveste spænding til induktion AP defineres som tærskel membran.
- Optag liganden inducerede strømme.
- Fyld en pipette med de specifikke agonister.
Bemærk: I den aktuelle rapport, vi brugte 100 pM glutamat og 100 uM AITC at fremkalde de strømninger medieret af glutamatreceptorer og TRPA1 receptorer hhv. - Tjek pipetten for at sikre, at der ikke er luftbobler inde. Placer pipetten i holderen pipetten. Tilslut holderen pipetten med et rør forbundet til et lægemiddel dispenseringssystem.
- Brug manipulator til at flytte pipetten inden for 50 um af neuronen. Indstil lægemidlet dispenseringssystemet tryk til 1 psi, og varigheden til 1 sek. Skift optagefunktionen til spænding klemme, og klemme ved -70 mV. Kort fortalt anvender tryk via lægemidlet dispenseringssystemet at optage en lægemiddel-induceret strøm.
- Fyld en pipette med de specifikke agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser processen med at forberede intakt DRG for patch optagelse. Figur 1A viser eksponeringen og placering af ganglier efter laminektomi. Figure1B viser L3, L4 og L5 DRG med nerve rødder knyttet efter fjernelse af rygmarven. Derefter L4 og 5 DRG er omhyggeligt dissekeret og befriet fra ryghvirvlerne. Dernæst epineurium, en transparent membran omkring DRG, fjernes (gul pil, figur 1D). Den bedste placering for at separere epineurium er gennem det sted, hvor den dorsale og ventrale rødder deltage i DRG, som angivet ved den sorte pil i figur 1D. Efter skrælning fra epineurium, den ventrale rod fjernes og kasseres, forlader dorsale rodspirerne , spinal nerve og DRG, som vist i figur 1E. Spaltning med collagenase fjerner tilbageværende epineurium, udsætter neuronerne og satellitceller t dehat omgiver dem (figur 1F).
Efter endt DRG forberedelse, er ophidselse af små DRG diameter neuron undersøgt ved at måle tærsklen rheobase og membran. Som vist i figur 2A rheobase er 260 pA. Figur 2B viser den tærskel membran målt med denne metode. Med den stigende strøm er membranen kontinuerligt depolariseret indtil en AP fremkaldes. I dette eksempel tærskel membranen (potentialet ved hvor AP er fremkaldt) er -11,9 mV. Derfor, ved at opretholde forholdet mellem neuroner og satellit gliaceller, vores forberedelse er tættere på in vivo situationen. Baseret på vores resultater, at rheobase optaget fra små DRG-neuroner er omkring 300 pA, og input modstand er 451,3 ± 27,3 MQ. Begge er højere sammenlignet med dem målt fra dissocierede neuroner (ca. 150 pA og 635 MQ), hvilket tyderat dissociation øget ophidselse af DRG-neuroner 11.
Med dette præparat, vi målte også de indadgående strømme induceret af glutamat og allylisothiocyanat (AITC), som er agonister til glutamatreceptorer og forbigående receptor potentielle kation kanal medlem A1 (TRPA1) hhv. Amplituden af indadgående strømme induceret af disse ligander vil afspejle antallet af receptorerne distribueres i neuronerne. Figur 3A viser en indadgående strøm i en lille DRG diameter neuron induceret af en 1 sek pust anvendelsen af glutamat (1 mM). Glutamat inducerede en indadgående strøm (198 Pa), hvilket i vid udstrækning kan blokeres ved co-applikation af NMDA-receptorantagonist APV og AMPA / kainat-receptorantagonist CNQX (data ikke vist), hvilket bekræfter den nuværende medieres af glutamatreceptorer på DRG neuroner. Disse data fastslået, at der er funktionelle glutamatreceptorer på DRG-neuroner. Den neuron illustreret i figur 3B viste indadgående strømme (260 Pa) fremkaldt af 1 sek pust anvendelse af allylisothiocyanat (AITC, 100 uM), en selektiv TRPA1 agonist. Den indadgående strøm blev blokeret af den selektive TRPA1 antagonist 10 pM HC 030.031 (data ikke vist), hvilket bekræfter de strømninger blev formidlet af TRPA1 receptorer og etablerer tilstedeværelsen af TRPA1 receptorer på DRG-neuroner.
Figur 1: Fremstilling af intakte DRG (A) Eksponering af rygmarven efter laminektomi og opdelingen af DRG.. Pile fra højre til venstre angiver L3-5 DRG hhv. Scale bar = 1 cm. (B) Eksponering af L3, L4 og L5 DRG og de tilknyttede nerve rødder efter fjernelse af rygmarv. Pile angiver L3, L4, L5 og DRG fra højre til venstre. Scale bar = 1 cm. (C) Intact DRG med nerverødder fastgjort efter at være blevet dissekeret fra rygmarven. Pile angiver L4 og L5 DRG fra højre til venstre. Scale bar = 1 cm. (D) Intakt DRG med epineurium vedlagt. I dette billede, det epineurium er intakt, og den gule pil viser den halvgennemsigtige epineurium indehaves af en Dumont pincet. Den sorte pil viser krydset dannet af dorsale og ventrale rod, der tjener som et godt udgangspunkt for at skrælle epineurium. Scale bar = 1 mm. (E) Samme DRG med den dorsale rod fastgjort efter epineurium og ventrale rod er blevet fjernet. Scale bar = 1 mm. (F) Infrarød mikroskop billeder af DRG følgende fordøjelse med collagenase. Små og mellemstore neuroner er synlige. En satellit gliacelle (gul pil) er synlig omgiver en neuron (stjerne). Den røde pil peger på pipetten. Scale bar = 10 um. (G) Kontrolapparatet konfiguration. De sorte pile angiver the pipetteholdere. Den til venstre holder stoffet fyldt pipette, og optagelse pipette er til højre. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2:. Måling af neuronexcitabilitet i Current Clamp tilstand (A) Rheobase blev målt ved at injicere en række strømme ind i DRG neuron (øvre panel). Den laveste strømstyrke, som kan inducere et aktionspotentiale, er defineret som rheobase, som indikeret med pilen i nederste panel. Den rheobase for denne neuron er 300 pA. (B). tærskel membranen blev målt ved at injicere en rampe strøm. Potentialet, når et aktionspotentiale fremkaldes, er defineret som tærskel membran, som er mærket ved den stiplede linie i det øverste panel.Tærsklen for membran til denne neuron er -11,9 mV. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Ligand induktionsstrøm i Small DRG-neuroner strømme induceret af sug anvendelse af glutamat (1 mM) eller allylisothiocyanat (TRPA1 agonist, AITC, 100 uM) i 1 sek.. Både agonister inducerede indadgående strømme, hvilket antyder tilstedeværelsen af glutamatreceptorer og TRPA1 receptorer på små DRG-neuroner. Glutamat ansøgning inducerede en indadgående strøm på 198 pA (A), og AITC inducerede en indadgående strøm på 260 pA (B). Neuroner er fastspændt ved -70 mV. Klik her for at se en større version af dette tal. </ P>
| 2 liter 10x lavt kationisk lager | |||
| Slutkoncentration (mM) | Komponent | MW | Vægt (g) |
| 3 | KCI | 74,6 | |
| 11 | Glucose | 180,2 | |
| 123 | NaCl | 58,4 | |
| 1.25 | NaH 2 PO4 * H2O | 138 | |
| 1 | MgCl2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| 2 | CaCl2 * 2H 2 O | 147 | |
tabel 1
| 1 liter 10x bicarbonat bestand | |||
| Slutkoncentration (mM) | Komponent | MW | Vægt (g) |
| 26 | NaHCO3 | 84,01 | 21.84 |
tabel 2
| 100 ml intracellulær opløsning | |||
| Koncentration (mM) | Komponent | MW | g |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | KCI | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| Bemærkninger: Indstil pH til 7,4 med KOH, og osmolaritet til 260 - 280 mOsm med saccharose og destilleret vand. Tilsæt 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP og filter før umiddelbar brug. | |||
tabel 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterer en metode til at forberede hele DRG til patch clamp studier. Der er flere vigtige elementer for at forberede en ideel eksemplar. For det første er det vigtigt at dissekere DRG med dorsale rødder fastgjort. Efter dette, epineurium skal fjernes omhyggeligt og samtidig undgå beskadigelse af neuroner. Endelig, for at blotlægge de neuroner og de omgivende satellit gliaceller, er det nødvendigt at fordøje det resterende bindevæv. Intakte DRG fra voksne rotter tilberedt med den her beskrevne metode vil opretholde en god levedygtighed for 6 til 8 timer og kan stabilt opgjort i perioden. De kan bruges til mange forskellige undersøgelser af DRG herunder patch clamp optagelser på neuroner eller satellit gliaceller, eller fremkaldte reaktioner af DRG-neuroner.
Under dissektion procedure, er det vigtigt hurtigt at dissekere DRG og opbevares ved en lav temperatur (4 ° C) for at bremse neuronal stofskiftet og derfor fastholder sin levedygtighed. under than dissektion af DRG, bør man undgå at strække ryg eller spinal nerver indtaste DRG. Et andet vigtigt skridt i dette præparat er fjernelse af den epineurium omkring DRG. Da epineurium er svært at trænge igennem, vil enhver epineurium tilbage på DRG forhindre patch pipetter fra at nå neuroner. Anvendelse af collagenase er et vigtigt skridt for succesfulde præparater. Collagenase vil fordøje den resterende epineurium og rengøre overfladen af celler på samme tid, som begge er kritiske for vellykket patching. For at undgå overdreven nedbrydning af vævet, skal overvejes tre faktorer. Første, collagenase kommer i flere forskellige former; se Tabel over Materialer til vores anbefaling, at man i øjeblikket anvendes, er potent, men blid, og dermed undgå over-fordøjelse. For det andet bør enzymet kan afleveres i en let tryk for at undgå spredning af enzymet ud over optageområdet. Vi har fundet den, der frembringes anvendelsen 0,5 ml af enir ud af en 1 ml sprøjte med tilstrækkelig. For det tredje, det bedste koncentrationsområde for de collagenase er fra 10-13 enheder / ml. Højere koncentrationer kan føre til over-fordøjelse og hurtigere nedbrydning af vævet, mens lavere koncentrationer indebærer en unødvendig lang fordøjelse tid. Det er vores erfaring, en koncentration på 13 enheder / ml og en fordøjelse gang omkring 15 min giver de bedste resultater. Efter påføring af enzymet resterende epineurium omkring DRG bør blive løs, og kan ryddes væk med forsigtig sugning. Collagenase er følsom til at gentage frysning-optøning-cykler, derfor endnu en fortyndet enzymopløsningen bør opdeles i portioner og anvendt inden for 3 uger.
Zhang og kolleger var den første til at beskrive en fremgangsmåde til patch clamp optagelse fra intakte DRG. Rotterne de brugte, var imidlertid meget unge (10-15 dage postnatal) 20, som har den fordel, at DRG er nemmere at forberede, da de har en tyndere epineurium og de har en forøget levedygtighed. DRG fra neonatale rotter, men har den ulempe, at ekspressionen af proteiner og ionkanaler som TRPV1 og NaV1.8 afviger fra voksne rotter 21,22. Desuden er adfærdsmæssige og farmakologiske undersøgelser udføres sædvanligvis i voksne rotter. metoden til optagelse detaljeret her tillader dermed gøre en sammenhæng mellem elektrofysiologi og adfærd i voksne dyr. Brugen af intakt dorsalrodsganglier som en forberedelse til at gennemføre patch clamp optagelser ex vivo har for nylig øget 15-17,23,24, og nogle undersøgelser har anvendt in vivo optagelser 25. De fleste af ex vivo optagelser udsætte DRG-neuroner ved at inkubere hele DRG i enzymcocktail for omkring 30-60 min. Mens denne metode giver flere neuroner, har det en risiko for over-fordøjelse af neuronerne i de overfladiske lag. Vores metode minimerer muligheden for over-fordøjelse ved hjælp af visuel inspektion for at overvåge abtelt af fordøjelsen, en fremgangsmåde anvendes også af Ma et al for in vivo optagelser 25.
Sammenlignet med dissocierede DRG-neuroner, en af fordelene ved den intakte DRG præparatet kommer fra bevarelse af både neuroner og satellit gliaceller (figur 1). Dette er ikke tilfældet i konventionelle præparater, der bruger dissocierede DRG-neuroner. Satellit glialceller danner en barriere omkring individuelle DRG-neuroner, og deres tilstedeværelse er afgørende for at opretholde det fysiologiske miljø af disse neuroner 13. Som bemærket i resultaterne de elektrofysiologiske egenskaber af neuroner fremstillet på denne måde adskiller sig fra dem, der opnås ved undersøgelser under anvendelse dissocierede celler.
En af de mest interessante fremtidige retninger for dette præparat er at undersøge krydstale mellem DRG-neuroner og satellit gliaceller. Efter nervebeskadigelse, fx satellit gliaceller er blevet vist to undergår plast ændringer, som er tæt relateret til den smerte adfærd, som indledes 13-15,26. Bevarelsen af satellit gliaceller i de intakte DRG, vil gøre det muligt for os at vurdere, om senderen receptorer, såsom glutamat-receptoren, eller ATP-receptorer er til stede på satellit gliaceller, og hvordan de reagerer på ændringer i neuronal aktivitet. Ved at lappe satellit gliaceller og stimulere neuron samtidigt, kan de satellit gliaceller fungere som en biologisk sensor og vise, om der er transmitter frigivelse fra de nærliggende neuroner. Endvidere intakt DRG forberedelse holder både afferente og efferente nerverødder. Dette i høj grad udvider den eksperimentelle anvendelsesområde ved at tilføje muligheden for at stimulere axonerne komme ind eller ud neuronerne ved sugning elektrode, hvilket ville være en bedre efterligning af in vivo-situationen.
Der er nogle begrænsninger for den aktuelle præparat. Eksistensen af barrieren dannet af satellit glial celler, gør det vanskeligere at patch neuroner og man skal være opmærksom på at det kan begrænse koncentrationen af lægemidler nå neuronerne. Derfor, for at få adgang til neuron i vores forberedelse er det vigtigt at opretholde pipetten under positivt tryk til støtte gennemtrængende satellit gliaceller lag. En anden begrænsning er, at de dorsale rødder og spinal nerver skal skæres for at dissekere ud DRG. Derfor er det umuligt at forlade Axon fuldstændig intakt. Imidlertid bør overvejes tilstedeværelsen af resterende axon, som de perifere eller centrale axoner ikke kan fastspændes til samme spænding som soma, som kunne forårsage potentiel optagelse fejl eller forstyrrelser, når spænding clamp udføres. Også for at få god eksponering af neuronerne, blid fordøjelse med collagenase er nødvendig og selv om dette kan kontrolleres med erfaring, er det umuligt helt at beskytte neuroner fra eksponering for fordøje enzym. Sammenlignet med konventionel dissociated DRG-neuroner, men hele DRG er hurtigere at fremstille (ca. 30 min), kan bruges i mange applikationer og nøje efterligner in vivo betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
