Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Patch Clamp Recordings op intacte ganglia van volwassen ratten

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54287

Abstract

Patch clamp studies uit ganglia (DRG) neuronen hebben ons begrip van het perifere zenuwstelsel verhoogd. Momenteel zijn de meeste opnamen zijn uitgevoerd op gedissocieerd DRG neuronen, hetgeen een standaardpreparaat voor de meeste laboratoria. Neuronale eigenschappen kan echter worden veranderd door axonaal letsel door enzymdigestie gebruikt verwerven gedissocieerd neuronen. Verder kunnen gedissocieerd neuron preparaten niet geheel vertegenwoordigen de micromilieu van de DRG aangezien verlies van contact met satelliet gliacellen die de primaire sensorische neuronen omringen is een onvermijdelijk gevolg van deze methode. Om de beperkingen in het gebruik van conventionele los DRG neuronen voor patch clamp opnames, in dit verslag te overwinnen beschrijven we een methode om intacte DRG's voor te bereiden en uit te voeren patch clamp opnamen op de individuele primaire sensorische neuronen ex vivo. Deze aanpak maakt het mogelijk snel en eenvoudig de voorbereiding van intacte DRG's, het nabootsen invivo omstandigheden door het houden van DRG neuronen in verband met hun omgeving satelliet gliacellen en basaal membraan. Voorts vermijdt de werkwijze axonale verwonding door manipulatie en enzym digestie bijvoorbeeld wanneer dissociëren DRG. Dit ex vivo preparaat kan bovendien worden gebruikt om de interactie tussen primaire sensorische neuronen en gliacellen satelliet bestuderen.

Introduction

Sensation is essentieel om te overleven en het welzijn van een organisme. De transmissie van stimuli afhankelijk gevoelsbanen vanaf perifere uiteinden van axonen uit primaire sensorische neuronen. Primaire sensorische neuronen, met uitzondering van de mesencefale kern van de nervus vagus, bevinden zich in de nervus ganglia en dorsale wortel ganglia (DRG). Ze dienen als poortwachters van de sensorische informatie 1. Aan het perikarial membraan, net zoals bij de centrale en perifere terminals, DRG neuronen te uiten receptoren en ionkanalen, zoals glutamaat receptoren, TNF-alfa-receptoren, transient receptor potential kationenkanaal onderfamilie V lid 1 (TRPV1), natriumkanalen, etc. 2 -7. Patch clamp de perikarial membraan toestaan ​​begrip functionele veranderingen van veel van deze receptoren en kanalen door het neuron.

De patch clamp opname techniek is een krachtig hulpmiddel voor stusterven de activiteiten van kanalen of receptoren en een groot aantal studies uitgevoerd door toepassing van deze techniek op DRG neuronen 8-10. In de meeste studies de DRG wordt verwijderd door het snijden van de dorsale worteltjes en spinale zenuwen dicht bij het ganglion. Na het hakken, wordt de ganglion vervolgens in spijsverteringsenzymen die resulteren in dissociatie van de DRG neuronen, dat kan vervolgens direct of gekweekt gedurende enkele dagen voor de opname opgenomen. Helaas, dissociatie van DRG neuronen behelst een noodzakelijke axotomy dichtbij de perikarya. Eenmaal los en geaxotomiseerde, DRG neuronen ondergaan fenotypische veranderingen en veranderingen in de membraan prikkelbaarheid 11,12. Het verlies van contact tussen de perikarya van individuele neuronen en de satelliet gliacellen die hen normaal gesproken omringen zal waarschijnlijk bijdragen aan deze veranderingen 13. De overspraak tussen neuronen en gliacellen satelliet zowel essentieel fysiologische omstandigheden en aanpassing aan patholoogical voorwaarden zoals die leidt tot hardnekkige pijn 14,15. Het is moeilijk om de interactie tussen neuronen en gliacellen satelliet met een gedissocieerde DRG preparaat bestuderen.

Intacte DRG, anderzijds bieden dichter bij in vivo omstandigheden. In de afgelopen jaren, heeft ons laboratorium, en andere groepen, gebruikt intacte DRG van volwassen ratten veranderingen van primaire sensorische neuronen in verschillende aandoeningen geassocieerd met chronische pijn 3-5,11,15-17 onderzoeken. Hoewel de in deze onderzoeken gebruikte technieken enigszins vastgesteld, stap voor stap beschreven is nog niet gepubliceerd. In de huidige manuscript beschrijven we een handige en snelle manier om intact DRG's en het gebruik ervan voor patch clamp opnames voor te bereiden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ethiek Verklaring: Alle procedures voor het onderhoud en het gebruik van proefdieren in overeenstemming met de voorschriften van de UCSF commissies Animal Research en werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van het NIH regelgeving voor diergeneeskundig gebruik en onderhoud (Publicatie 85 uitgevoerd - 23 Revised 1996 ). De UCSF Institutional Animal Care en gebruik Comite ingestemd met de protocollen die worden gebruikt in deze studie.

1. Voorbereiding van de instrumenten, Solutions and Dishes

  1. Bereid kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF).
    1. Bereid 500 ml 10x lage kation oplossing en 500 ml van 10x bicarbonaatoplossing (zie tabel 1 en 2 voor oplossing preparaat). Bewaren bij 4 ° C en gebruik binnen een maand.
    2. Bereid 600 ml vers aCSF door mengen van 60 ml van 10x lage kationoplossing met 60 ml bicarbonaatoplossing, en voeg vervolgens 480 ml gedeïoniseerd water tot een eindvolume van 600 ml te bereiken. Bubble de aCSF met carbogen(5% O2 en 95% CO2) gedurende ten minste 10 minuten voor gebruik.
  2. Trek Patch pipet uit capillaire Glass.
    1. Plaats dunwandige capillair glas in een pipet trekker om de opname pipetten te bereiden.
      Opmerking: In ons laboratorium worden de volgende instelparameters van de trekker die de ideale vorm te pipet: warmte (510), snelheid (32). De ideale pipet vorm voor intact DRG opname moet een geleidelijke slanke conus met een lage kegel hoek, en dit kan het best worden bereikt door trial and error.
    2. Zorg ervoor dat de weerstand van de pipet is 3-5 MQ wanneer gevuld met interne oplossingen (zie tabel 3 voor oplossing voorbereiding). Raadpleeg Axon Gids voor de gedetailleerde methode voor het meten pipet weerstand 18.
  3. Voeg 1 mg collagenase tot 400 gl aCSF, tot een eindconcentratie van 13 eenheden / ml. Vul dan elk glas pipet met ongeveer 20 ui collagenase oplossing. Winkelde gevulde pipetten in een -20 ° C vriezer en gebruik ze binnen drie weken.
  4. Bereid 200 ml koude aCSF (ongeveer 4 ° C). Om de aCSF snel afkoelen plaats deze in een bekerglas, afdichting met plasticfolie en plaats in een -20 ° C vriezer voor ongeveer 20 minuten totdat het begint te vriezen. Plaats het bekerglas in een ijsbad en bel met carbogeen gedurende 10 min. Bel de resterende 400 ml aCSF met carbogeen bij kamertemperatuur.
  5. Terwijl de aCSF afkoelt, snijd het uiteinde van een plastic wegwerpbare transferpipet de opening tot een diameter van 5 mm (deze wordt gebruikt om de DRG dragen) te vergroten. Verzamel de volgende chirurgische instrumenten: scalpel (# 15), Mayo rechte en gebogen schaar, fijn 2 mm tip rongeur, Adson (getande) tang, iris schaar, de lente schaar en twee fijne tang. Giet de zuurstofrijke koude aCSF in 3 glazen petrischaaltjes (Outer diameter: 10 cm).

2. DRG Dissection

  1. Verdoven een rat (200-220 g) met natrium pentobarbital (100 mg / kg, ip) en bevestigen dat het niveau van de anesthesie voldoende door het testen pedaal reflex en ogen knipperen reflex.
  2. Na verificatie dat de rat wordt verdoofd, scheren de lumbale gebied en incise de huid en het onderhuidse weefsel over de middellijn. Maak de paraspinale spieren van de doornuitsteeksels van de L1-S2 niveau met behulp van een boete periostale lift.
  3. Gebruik de gebogen schaar om de doornuitsteeksels van L1 teruggebracht tot S2. Gebruik rechte Mayo schaar dwarse sneden in de belichte wervelkolom ongeveer L1 en S1 te maken en verwijderen dit segment van de wervelkolom geheel en snel onderdompelen in koud aCSF (bereid in stap 1,5) gedurende 2-3 min. Na het verwijderen van de lumbale DRG, wordt euthanasie uitgevoerd door bilaterale thoracotomie uitgevoerd terwijl de rat is nog steeds onder diepe pentobarbital anesthesie.
  4. Spoel uit het bloed uit de verwijderde wervelkolom en de bijgevoegde weefsel en over te dragen aan een petrischaal met koude aCSF. Use een boete rongeur aan de laminaten te verwijderen. Snijd de dura mater over de middellijn met microscissors het ruggenmerg bloot. Til het ruggenmerg, en snijd de zenuwwortels bij hun binnenkomst in het ruggenmerg met behulp van iris schaar, verwijder dan het ruggenmerg.
  5. Breng de resterende wervel met DRG's aan de tweede petrischaal gevuld met koud aCSF. Identificeer de L4 en L5 DRG basis van hun relatieve positie dwarsuitsteeksels en heupzenuw.
    Let op: Handhaving van de heupzenuw intact zal helpen om L4 en L5 DRG (de nervus vagus is afkomstig van de L4-6 spinale zenuwen) te identificeren.
  6. Gebruik Dumont tang en Noyes schaar om de DRG bevrijden van het omringende bindweefsel. Houd de zenuwwortel en spinale zenuwen aan de DRG.
  7. Gebruik de overdracht pipet om de DRG's te verplaatsen naar de derde petrischaal voor verdere dissectie.
  8. Onder de dissectie microscoop, verwijder voorzichtig zoveel mogelijk van de epineurium omliggende the DRG.
    1. Gebruik de Noyes voorjaar schaar om een ​​opening waar de dorsale en ventrale wortels toetreden tot de DRG en scheiden de ventrale wortel uit de DRG te snijden. Gebruik Dumont # 5 tang met stompe tips om de epineurium te houden, en een andere fijne tang om de DRG uit de epineurium rollen.
    2. Ga door met zoveel mogelijk van epineurium bevestigd verwijderen om DRG's met behulp van de fijne tang.
      Opmerking: Een goed ontleed DRG is belangrijk om een ​​goede vertering in de volgende stap te verkrijgen.

3. DRG Spijsvertering

  1. Breng de DRG aan de opname kamer. Zorg ervoor dat de kant van DRG waar de zenuwwortels afkomstig gezichten naar beneden.
    Opmerking: Zo meeste neuronen toegankelijk.
  2. Gebruik een anker voor de DRG te stabiliseren. Perfuseren DRG zuurstofrijk aCSF met een snelheid van 0,5 ml / min door plastic buizen verbonden met een peristaltische pomp, die vervolgens wordt geplaatst op een tafel om de opname rig.
  3. Wacht 30 minuten om de cellen te herstellen. Beoordeelt de kwaliteit van de DRG onder infrarood-interface differentieel contrast (IR-DIC) optiek 40x objectiefvergroting door een CCD-camera.
    Opmerking: Good DRG bevat meestal veel rond, scherp contrast, neuronen omgeven door satelliet gliacellen op het oppervlak.
  4. Digest een klein deel van het oppervlak van de DRG.
    Opmerking: Het glas patch pipetten in pipet houders, die kleine koppelingen waarmee slang aan met een luchtdichte afsluiting van de glazen pipet worden bevestigd zijn geplaatst.
    1. Individueel verbinden twee 1 ml injectiespuiten voor de pipethouders via twee stukken van kleine diameter rubber slang. Zet een glazen pipet gevuld met collagenase in een van de pipet houder en een lege glazen pipet naar de andere.
    2. Gebruik de micromanipulator om de pipetten te positioneren net boven de DRG. Vervolgens onder microscoop vergroting, botsen de uiteinden van twee pipetten tegen elkaar zachtjes vergroten de openingen van pipetpunten (idealiter een diameter van 5-10 pm).
    3. Beweeg de pipet gevuld met enzym nabij het oppervlak van DRG en oefen kort een positieve druk op de pipet met collagenase door de buis die de houder en de spuit door het verplaatsen van de zuiger ongeveer 0,5 ml.
      Opmerking: Onder druk, zal de stroom van het enzym uit de pipet enigszins uitgebreid de ruimte tussen de DRG neuronen, die als teken voor toepassing enzym kan dienen.
    4. Na 10 tot 15 minuten, bij puin van de resterende epineurium waargenomen, zachtjes negatieve druk op de lege pipet weg te zuigen vuil.
      Opmerking: Zo wordt de omringende neuronen en gliacellen satelliet duidelijk blootgesteld en klaar voor patch opnemen.
    5. Gooi de twee pipetten in de naaldencontainer.

4. Patch Clamp Recordings

  1. Elektrode oplossing (zie tabel 3) op ijs om afbraak te voorkomen. Vul het glas patch pipet metgefilterd intracellulaire oplossing (spuitfilter, poriegrootte: 0,2 urn) en plaats de pipet in de headstage pipet houder. Breng een zachte positieve druk om de pipet door een 5 ml spuit door het verplaatsen van de zuiger ongeveer 1 ml voor het verlagen van de pipet in badoplossing.
    Opmerking: Dit voorkomt dat de pipet verstopt raakt.
  2. Kies "V-clamp" mode door de mode knop op de versterker, dan open "Membrane test" interface in de software. Beweeg de pipet dicht bij het doel neuron onder de microscoop inspectie.
    Opmerking: In de intacte DRG preparaat, een dunne laag satelliet gliacellen kapselt elk neuron.
  3. Gebruik positieve druk van de pipet naar de satelliet gliale cellaag doorlopen tot een plotselinge vergroting van de ruimte tussen het neuron en omringende laag satelliet gliacellen waargenomen. Blijven bewegen de pipet naar het neuron tot een "kuiltje" waar op de neuron.
    Opmerking: In vergelijking metopnamen van gedissocieerd neuronen, de positieve druk moet een iets groter, die zal bijdragen tot de satelliet gliale cellaag binnendringen en vergroten de kans op succesvolle patch zijn.
  4. Verminder de positieve druk. Next, het bereiken van een giga ohm afdichting met zachte zuigkracht.
    Opmerking: Bij deze werkwijze het slagingspercentage van de opname ten minste 70%.
  5. Verkrijgen van whole-cell opname configuratie zoals eerder 19 beschreven.
    1. Kort samengevat, dringen de neuron celmembraan via een korte maar sterke zuigkracht. U kunt ook gebruik maken van de functie "zappen" op de versterker, terwijl zuiging wordt toegepast.
    2. Zodra een gehele cel modus is vastgesteld, te compenseren whole-cell capaciteit en serieweerstand (Rs) door het draaien van de capaciteit en de vergoeding weerstand knoppen op de versterker.
      Let op: Rs is normaal gesproken 5-20 MQ.
    3. Verlaat de cel als Rs aanvankelijk groter dan 30 MQ; of Rs verandert met meer dan 20% tijdens de opname. Ookhet meten van de rust membraanpotentiaal; een cel verlaat wanneer het rust membraanpotentiaal is dan -50 mV.
  6. Sluit het venster "Membrane test". Kies "I-clamp normale" modus door het draaien van de mode knop op de versterker.
  7. Klik op "open protocol" in de software, selecteert en laadt het protocol voor het meten van rheobase. Klik op "record" om de opname te starten. Meet ingangsweerstand en rheobase de neuronale exciteerbaarheid onderzocht door het injecteren van een gegradeerde reeks depolariserende stromen in stappen van 100 pA.
    1. Klik op "open protocol" opnieuw en selecteert u het protocol voor het meten van membraan drempel. Een 500 ms depolariserende helling stroom (2000 pA / s) worden geïnjecteerd in het neuron.
    2. Gebruik data acquisitie en analyse software (bijv Clampfit) om de opgenomen sporen analyse volgens instructies van de fabrikant. Gebruik de software om de ingangsweerstand (Rin) te berekenen op basis van de steady-state IV relationship tijdens de hyperpolarisering stromen opgeleverd. Beweeg de cursor naar de waarde van rheobase en het membraan drempel te meten.
      Opmerking: De amplitude van stroom vereist om de AP te induceren wordt gedefinieerd als rheobase en de laagste spanning voor het induceren AP wordt gedefinieerd als membraan drempelwaarde.
  8. Noteer het Ligand geïnduceerde stromen.
    1. Vul een pipet met de specifieke agonisten.
      Opmerking: In het huidige rapport, gebruikten we 100 uM glutamaat en 100 uM AITC de stromen gemedieerd door respectievelijk glutamaatreceptoren en TRPA1 receptoren induceren.
    2. Controleer de pipet om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen binnen. Plaats de pipet in de pipet houder. Sluit de pipet houder met een buis verbonden met een geneesmiddel afgiftesysteem.
    3. Gebruik de manipulator om de pipet binnen 50 urn van het neuron verplaatsen. Stel het geneesmiddel doseersysteem druk tot 1 psi en de duur tot 1 sec. Schakel de opnamestand op voltage clamp, en klem bij -70 mV. de druk in het kort toe te passen via de drug doseersysteem naar een geneesmiddel-geïnduceerde stroom op te nemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont de werkwijze voor het bereiden van intacte DRG patch opnemen. Figuur 1A toont de belichting en plaats van de ganglia na laminectomie. Figure1B toont L3, L4 en L5 DRG de zenuwwortels bevestigd na het verwijderen van het ruggenmerg. Vervolgens L4 en 5 DRG zorgvuldig ontleed en bevrijd van de wervels. Vervolgens wordt de epineurium, een transparante membraan rond de DRG verwijderd (gele pijl, figuur 1D). De beste locatie voor de epineurium scheiden is door de plaats waar de dorsale en ventrale wortels deelnemen aan de DRG, zoals aangegeven door de zwarte pijl in figuur 1D. Na afpellen van de epineurium, de ventrale wortel wordt verwijderd en weggegooid, waardoor de dorsale worteltjes , spinale zenuw en DRG, zie figuur 1E. Digestie met collagenase verwijdert de resterende epineurium, waardoor de neuronen en de satelliet cellehat omringen hen (Figuur 1F).

Na de DRG preparaat, wordt de prikkelbaarheid van kleine diameter DRG-neuron onderzocht door meting van de rheobase en membraan drempel. Zoals getoond in Figuur 2A, de rheobase is 260 pA. Figuur 2B toont het membraan drempel gemeten met deze methode. Met de toenemende stroom wordt het membraan continu gedepolariseerd tot een AP wordt opgeroepen. In dit voorbeeld is het membraan drempel (de potentiaal waarbij het AP wordt opgeroepen) is -11,9 mV. Daarom is door het handhaven van de relatie tussen de neuronen en gliacellen satelliet, onze voorbereiding dichter bij de in vivo situatie. Op basis van onze resultaten, de rheobase opgenomen van kleine DRG neuronen ligt op ongeveer 300 pA en de input weerstand is 451,3 ± 27,3 MQ. Beide zijn hoger in vergelijking met die gemeten van gedissocieerd neuronen (ongeveer 150 pA en 635 MQ), suggereertdat dissociatie verhoogde prikkelbaarheid van de DRG neuronen 11.

Met deze voorbereiding, we meten ook de innerlijke stromen geïnduceerd door glutamaat en allylisothiocyanaat (AITC), die agonisten voor glutamaat receptoren en transient receptor potential kationenkanaal lid A1 (TRPA1) respectievelijk. De amplitude van inkomende stromen geïnduceerd door deze liganden wordt het aantal receptoren verspreid in de neuronen geven. Figuur 3A toont een binnenwaartse stroom in een kleine diameter DRG neuronen geïnduceerd door 1 sec puff toepassing van glutamaat (1 mM). Glutamaat veroorzaakte een binnenwaartse stroom (198 pA), die grotendeels kan worden geblokkeerd door gezamenlijk aanbrengen van de NMDA receptor antagonist APV en de AMPA / kainate receptor antagonist CNQX (gegevens niet getoond), hetgeen de stroom wordt gemedieerd door glutamaat receptoren op de DRG neuronen. Deze gegevens vastgesteld dat er functioneel glutamaatreceptoren op DRG neuronen. de neUron geïllustreerd in figuur 3B toonde naar binnen stromen (260 Pa) geïnduceerd door 1 sec bladerdeeg toepassing van allylisothiocyanaat (AITC, 100 uM), een selectieve TRPA1 agonist. De binnenwaartse stroom werd geblokkeerd door de selectieve antagonist TRPA1 10 uM HC 030.031 (gegevens niet getoond), hetgeen de stroming werd gemedieerd door receptoren TRPA1 en bepaalt de aanwezigheid van TRPA1 receptoren op DRG neuronen.

Figuur 1
Figuur 1: Bereiding van intacte DRG (A) blootstelling van het ruggenmerg na laminectomie en segmentatie van DRG.. Pijlen van rechts naar links aan te geven L3-5 DRG respectievelijk. Schaal bar = 1 cm. (B) Blootstelling van L3, L4 en L5 DRG en de bijgevoegde zenuwwortels na het verwijderen van het ruggenmerg. Pijlen geven L3, L4 en L5 DRG van rechts naar links. Schaal bar = 1 cm. (C) Intact DRG met zenuwwortels bevestigd na wordt ontleed uit het ruggenmerg. Pijlen geven L4 en L5 DRG van rechts naar links. Schaal bar = 1 cm. (D) Intact DRG met epineurium bevestigd. Op deze foto, de epineurium intact is, en de gele pijl geeft de semi-transparante epineurium gehouden door een Dumont tang. De zwarte pijl geeft de kruising gevormd door dorsale wortel en ventrale wortel, die dient als een goed uitgangspunt te pellen de epineurium. Schaal bar = 1 mm. (E) Dezelfde DRG met de dorsale wortel bevestigd na de epineurium en ventrale wortel zijn verwijderd. Schaal bar = 1 mm. (F) Infrarood microscoopbeelden van DRG na digestie met collagenase. Kleine en middelgrote neuronen zichtbaar zijn. Een satelliet-gliacellen (gele pijl) zichtbaar is rondom een ​​neuron (asterisk). De rode pijl wijst naar de pipet. Schaal bar = 10 micrometer. (G) Het controleapparaat configuratie. De zwarte pijlen geven the pipet houders. De linker houdt de drug gevulde pipet, en de opname pipet ligt aan de rechterkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Bepaling van Neuronale Exciteerbaarheid in Current Clamp modus (A) Rheobase werd gemeten door het injecteren van een aantal stromen in de DRG neuronen (bovenste paneel). De laagste stroomsterkte die een actiepotentiaal kan induceren, wordt gedefinieerd als rheobase, zoals aangegeven door de pijl in onderpaneel. De rheobase hiervoor neuron is 300 pA. (B). Het membraan drempel werd gemeten door injectie van een helling stroom. Het potentieel wanneer een actiepotentiaal wordt opgewekt, wordt gedefinieerd als membraan drempel, zoals aangeduid door de stippellijn in het bovenste paneel.Het membraan drempel voor deze neuron is -11,9 mV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Ligand geïnduceerde stromen in Small DRG neuronen Currents geïnduceerd door trekje toepassing van glutamaat (1 mm) of allylisothiocyanaat (TRPA1 agonist, AITC, 100 uM) gedurende 1 sec.. Beide agonisten geïnduceerde naar binnen stromen, suggereren de aanwezigheid van glutamaatreceptoren en TRPA1 receptoren op kleine DRG neuronen. Glutamaat toepassing veroorzaakte een innerlijke stroom van 198 Pa (A), en AITC veroorzaakte een innerlijke stroom van 260 Pa (B). Neuronen worden geklemd bij -70 mV. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien. </ P>

2 liter 10x low-kationische voorraad
Uiteindelijke concentratie (mM) bestanddeel MW Gewicht (g)
3 KCl 74.6
11 Glucose 180,2
123 NaCl 58.4
1.25 NaH 2 PO 4 * H 2 O 138
1 MgCl 2 * 6H 2 O 203.3
2 CaCl2 * 2 H 2 O 147

tafel 1

1 liter 10x bicarbonaat voorraad
Uiteindelijke concentratie (mM) bestanddeel MW Gewicht (g)
26 NaHCO3 84.01 21.84

tabel 2

100 ml intracellulaire oplossing
Concentratie (mM) bestanddeel MW g
130 KGluconate 234,24
10 KCl 74.55
10 HEPES 238,3
10 EGTA
2 MgCl 2 * 6H 2 O 203.3
Notities: Stel de pH tot 7,4 met KOH, en osmolariteit tot 260-280 mOsm met sucrose en gedestilleerd water. Voeg 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP en filter voor onmiddellijk gebruik.

tabel 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij rapporteren een methode om hele DRG voor patch clamp studies voor te bereiden. Er zijn een aantal belangrijke elementen voor het bereiden van een ideaal exemplaar. Ten eerste is het belangrijk om de DRG ontleden met dorsale stukje wortel. Daarna moet de epineurium zorgvuldig worden verwijderd terwijl dat schade aan de neuronen. Ten slotte de neuronen en hun omgeving satelliet gliacellen blootgesteld, is het nodig om de resterende bindweefsel verteren. Intacte DRG van volwassen ratten bereid met de hier beschreven methode goede haalbaarheid ervan 6 tot 8 uur en stabiel kan worden opgenomen tijdens die periode. Ze kunnen worden gebruikt voor vele verschillende studies DRG waaronder patch clamp op neuronen of gliacellen satelliet of opgeroepen reacties van DRG neuronen.

Bij de dissectie procedure, is het belangrijk om de DRG snel ontleden en bewaren bij lage temperatuur (4 ° C) om de neuronale metabolisme vertragen en handhaaft dus de levensvatbaarheid. tijdens thij dissectie van DRG's, moet men voorkomen dat het uitrekken van de dorsale of spinale zenuwen het invoeren van de DRG. Een andere belangrijke stap in dit preparaat is het verwijderen van de omringende epineurium DRG. Aangezien de epineurium moeilijk doordringbaar, worden de resterende op de DRG epineurium voorkomen dat de pleister pipetten bereiken de neuronen. Toepassing van collagenase is een belangrijke stap voor een succesvolle preparaten. Collagenase de resterende epineurium verteren en het oppervlak van cellen reinigen tegelijkertijd, die beide cruciaal zijn voor succes patch. Over-digestie van het weefsel te vermijden, drie factoren moet worden beschouwd. Eerst, collagenase komt in verschillende vormen; Zie de tabel van materialen voor onze aanbeveling, de momenteel gebruikte krachtige maar zacht, dus over-de spijsvertering te vermijden. Ten tweede moet het enzym worden afgegeven met een lichte druk op het verspreiden van het enzym buiten het opnamegebied voorkomen. We hebben de druk geproduceerd uit de toepassing van 0,5 ml van een gevondenir uit een 1 ml spuit is voldoende. Ten derde, het beste concentratiebereik voor collagenase 10-13 eenheden / ml. Hogere concentraties kunnen leiden tot over-de spijsvertering en een snellere afbraak van het weefsel, terwijl lagere concentraties gaat om een ​​onnodig lange tijd de spijsvertering. In onze ervaring, een concentratie van 13 eenheden / ml en de spijsvertering tijd rond 15 min levert de beste resultaten. Na het aanbrengen van het enzym de resterende epineurium rond de DRG los zou moeten worden, en kan veranderen met zachte zuigkracht worden gewist. Collagenase is gevoelig voor bevriezen-ontdooien cycli herhalen zich derhalve na verdunde enzymoplossing worden in fracties verdeeld en binnen 3 weken.

Zhang en collega's waren de eersten die een methode voor patch clamp opname te beschrijven uit intacte DRG. De ratten vroeger waren echter zeer jonge (10-15 dagen postnatale) 20 heeft het voordeel dat de DRG gemakkelijker te bereiden omdat ze een dunnere epineurium en ze hebben een verhoogde levensvatbaarheid. DRG's van neonatale ratten, hebben echter het nadeel dat de expressie van eiwitten en ionenkanalen zoals TRPV1 en NaV1.8 verschillen van die van volwassen ratten 21,22. Ook gedragsmatige en farmacologische studies gewoonlijk uitgevoerd bij volwassen ratten. Waardoor de methode van opnemen hier beschreven maakt het maken van een correlatie tussen elektrofysiologie en gedrag bij volwassen dieren. Het gebruik van intacte ganglia als voorbereiding op patch clamp opnames uit te voeren ex vivo is onlangs 15-17,23,24 toegenomen, en sommige studies hebben gebruikt in vivo-opnamen 25. De meeste ex vivo opnamen bloot DRG neuronen door het incuberen van de gehele DRG in enzymcocktail ongeveer 30-60 min. Hoewel deze werkwijze meer neuronen vertonen, heeft het een risico op overmatige afbraak van de neuronen in de oppervlakkige lagen. De werkwijze minimaliseert de mogelijkheid om over-digestie door visuele inspectie om de ex bewakentent van de vertering, een methode ook gebruikt door Ma et al in vivo opnamen 25.

Vergeleken met gedissocieerde DRG neuronen, een van de voordelen van het intacte DRG preparaat van het behoud van zowel neuronen en gliacellen satelliet (figuur 1). Dit is niet het geval is in gebruikelijke preparaten die gedissocieerde DRG neuronen gebruikt. Satelliet gliacellen vormt een barrière rond individuele DRG neuronen en hun aanwezigheid is essentieel voor de fysiologische omgeving van deze neuronen 13. Zoals in de resultaten van de elektrofysiologische eigenschappen van neuronen bereid op deze wijze afwijken van die verkregen door onderzoeken met gedissocieerde cellen.

Een van de meest interessante toekomstige richtingen van dit preparaat zal de overspraak tussen DRG neuronen en gliacellen te onderzoeken satelliet. Na zenuwbeschadiging, bijvoorbeeld, satelliet gliacellen zijn t aangetoondo ondergaan plastische veranderingen, die nauw verwant zijn aan het pijngedrag die 13-15,26 volgt. Het behoud van een satelliet-gliacellen in de intacte DRG, zal ons in staat stellen om te bepalen of de zender receptoren zoals de glutamaat receptor, of ATP-receptoren aanwezig zijn op satelliet-gliacellen zijn en hoe ze reageren op veranderingen in de neuronale activiteit. Door het patchen van satelliet-gliacellen en de neuron tegelijkertijd stimuleren, kan de satelliet gliacellen fungeren als een biologische sensor en zien of er zender vrijlating uit de nabijgelegen neuronen. Bovendien intact DRG voorbereiding houdt zowel afferente en efferente zenuwwortels. Dit vergroot sterk de experimentele toepassingsgebied voorzien in de mogelijkheid van het stimuleren van de axonen betreden of verlaten van de neuronen afzuigen elektrode, die een betere nabootsing van de in vivo situatie zou zijn.

Er zijn een aantal beperkingen aan de huidige preparaat. Het bestaan ​​van de barrière gevormd door satelliet gliAl cellen bemoeilijkt patch neuronen en moet men beseffen dat het de concentratie van de geneesmiddelen verstrekkende neuronen kunnen beperken. Daarom, om toegang tot de neuron in ons preparaat krijgen is het belangrijk om de pipet onder positieve druk te handhaven op steun penetrerende satelliet gliacellen laag. Een andere beperking is dat de dorsale wortels en spinale zenuwen om ontleden de DRG te snijden. Daarom is het onmogelijk om de axon reactie volledig intact. Echter, de aanwezigheid van de resterende axon worden beschouwd, aangezien het perifere of centrale axonen niet kan worden vastgeklemd aan dezelfde spanning als de soma, die potentiële opnamefout of interferentie kan veroorzaken wanneer spanningsklem wordt uitgevoerd. Ook om goede belichting van de neuronen krijgen, zwakke digestie met collagenase noodzakelijk en hoewel dit kan worden gecontroleerd met ervaring, is het onmogelijk om volledig neuronen beschermen tegen blootstelling aan het enzym verteren. Vergeleken met conventionele dissociated DRG neuronen echter geheel DRG zijn sneller (ongeveer 30 min) te bereiden, kan worden gebruikt in vele toepassingen en nauw bootst in vivo omstandigheden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital sodium vortech Pharmaceuticals
syringe BD 309659 1 ml, 5 ml.
scalpel BD size: 15
Mayo straight scissor Fine Science Tools 14010-15
Mayo curved scissor Fine Science Tools 14011-15
Rongeur Fine Science Tools 16021-14
Adson toothed forceps Fine Science Tools 11027-12
Iris Scissor Fine Science Tools 14084-08
Noyes spring scissor Fine Science Tools 15124-12
Bone scissors Fine Science Tools 16044-10 Special for cutting the bones. 
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 Fine Science Tools 11252-30 These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.
periosteal elevator Sklar 97-0530
Dissection microscope WILD
Transfer pipette Fisher brand 13-711-5AM
Petri dish (10 cm) Pyrex Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps
Collagenase (Liberase TM) Roche 05-401-119-001 dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.
filter Thermo scientific 7232520 Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.
Glass pipette Sutter BF150-110-7.5
Anchor Havard apparatus 64-0250 stabilize the DRG to avoid drift.
Peristaltic pump WPI
Pipette puller Sutter P97
Amplifier Molecular devices Axopatch 200B
Digitizer Molecular devices 1440D
Microscope NIKON FN600
Micro-manipulator Sutter MPC200
microinjection dispense system General Valve Picrospitzer II fast drug application system
Carbogen (95% O2, 5% CO2) Local Medical Gas supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
  2. Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  3. Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
  4. Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
  5. Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
  6. Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
  7. Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
  8. Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
  9. Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
  10. Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
  11. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
  12. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
  13. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
  14. Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
  15. Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
  16. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
  17. Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
  18. The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
  19. Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
  20. Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
  21. Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
  22. Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
  23. Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
  24. Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
  25. Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
  26. Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).

Tags

Biochemie opgewondenheid spanning klem stroomtang pijn TRPA1 receptoren glutamaatreceptoren satelliet gliacellen periferie sensorische neuronen heupzenuw methode
Patch Clamp Recordings op intacte ganglia van volwassen ratten
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L.More

Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. J. Vis. Exp. (115), e54287, doi:10.3791/54287 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter