Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות

Published: September 29, 2016 doi: 10.3791/54287

Abstract

מחקרים הצמד תיקון מן הגרעינים השורש הגבי (DRGs) נוירונים הגדילו את הבנתנו את מערכת העצבים ההיקפית. נכון לעכשיו, רוב ההקלטות נערכים בימים נוירונים DRG ניתק, המהווה הכנה סטנדרטית ברוב המעבדות. נכסים עצביים, לעומת זאת, ניתן לשנות על ידי פגיעת אקסונלית נובעת עיכול אנזים המשמש ברכישת נוירונים ניתקו. יתר על כן, הכנות נוירון ניתקות אינן יכולות לייצג את המיקרו-הסביבה של DRG מלא מאז אובדן ההתקשרות עם ותאי גלייה בלווין המקיפים את עצב סנסורי העיקרי היא תוצאה בלתי נמנעת של שיטה זו. כדי להתגבר על המגבלות בשימוש נוירונים DRG ניתק קונבנציונאלי עבור הצמד תיקון הקלטות, בדוח זה אנו מתארים שיטה להכין DRGs שלם לנהל הקלטות מהדק תיקון על עצב סנסורי עיקרי הפרט vivo לשעבר. גישה זו מאפשרת ההכנה המהירה וישירה של DRGs ללא פגע, מחקה בvivo התנאים על ידי שמירה על נוירונים DRG הקשורים ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם ואת קרום המרתף. יתר על כן, השיטה תמנע פגיעה אקסונלית ממניפולצית אנזים עיכול כגון כאשר dissociating DRGs. לשעבר זו הכנה vivo גם יכול לשמש כדי לחקור את האינטראקציה בין עצב סנסורי עיקרי ותאי גלייה בלוויין.

Introduction

הסנסציה חיונית ההישרדות ורווחתם של האורגניזם. את הלך הגירויים תלויה מסלולים החושיים החל מ הסופים היקפיים של אקסונים מן עצב סנסורי עיקרי. עצב סנסורי עיקרי, למעט גרעין mesencephalic של העצב הטריגמינלי, ממוקם גרעיני שורש בגרעיני הגבי trigeminal (DRGs). הם משמשים שומרי סף של המידע החושי 1. על הממברנה perikarial, כשם במסוף המרכזי ואת הפריפריה, נוירונים DRG לבטא קולטנים תעלות יונים, כגון קולטני גלוטמט, קולטני אלפא TNF, V subfamily ערוץ קטיון פוטנציאל חולף הקולטן חבר 1 (TRPV1), תעלות נתרן, וכו '2 -7. הצמד תיקון הקלטות של קרום perikarial לאפשר הבנת שינויים תפקודיים של רבים של קולטנים ערוצים אלה ברחבי הנוירון.

טכניקת הקלטת תיקון מהדק הוא כלי רב עצמה עבור סטיוגוסס הפעילויות של ערוצים או קולטני ומספר רב של מחקרים שנערכו על ידי החלת בטכניקה זו על נוירונים DRG 8-10. ברוב המחקרים DRG מוסר על ידי חיתוך שורשונים הגבי וקרוב עצבי השדרה אל הגנגליון. לאחר מיותר, גנגליון ממוקם מכן אנזימי עיכול כי לגרום דיסוציאציה של נוירונים DRG, וזה יכול אז יירשמו מייד או בתרבית למשך כמה ימים לפני ההקלטה. למרבה הצער, דיסוציאציה של נוירונים DRG כרוך axotomy צורך קרוב perikarya. לאחר הפרידו axotomized, נוירונים DRG עוברים שינויים פנוטיפי וכן שינויים רגישות הממברנה 11,12. ההפסד של קשר בין perikarya של נוירונים בודדים ואת ותאי גלייה בלווין שבדרך כלל מקיף אותם עשוי לתרום לשינויים אלה 13. ערב הדיבור בין נוירונים ותאי גלייה בלוויין הוא גם חיוני בתנאים פיזיולוגיים מאמצי ההסתגלות שלהם pathologתנאי iCal כגון אלה הגורמים לכאב סורר 14,15. זה יהיה מאתגר לחקור את האינטראקציה בין נוירונים ותאי גלייה בלוויין באמצעות תכשיר DRG ניתק.

DRGs השלם, מצד השני, לספק יותר לתנאי in vivo. בשנים האחרונות, במעבדה שלנו, כמו גם כמה קבוצות אחרות, כבר משתמשות DRGs ללא פגע מן החולדות בוגרות לחקור שינויים של עצב סנסורי עיקרי בתנאים שונים הקשורים כאב כרוני 3-5,11,15-17. למרות הטכניקות המשמשות במחקרים אלה מוקמות מעט, תיאור צעד אחר צעד טרם פורסם. בכתב היד הנוכחי, אנו מתארים בצורה נוחה ומהירה להכין DRGs שלמים והשימוש בהם עבור הצמד תיקון הקלטות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משפט ואתיקה: כל הנהלים עבור התחזוקה והשימוש של חיות ניסוי תאם את התקנות של ועדת UCSF על מחקר בבעלי החיים בוצעו בהתאם להנחיות של תקנות NIH על שימוש וטיפול בבעלי חיים (פרסום 85 - 23, מתוקן 1996 ). הטיפול בבעלי החיים המוסדי UCSF ועדת השימוש אשרה את הפרוטוקולים המשמשים במחקר זה.

1. הכנת מכשירים, פתרונות ומנות

  1. הכן מלאכותי הנוזל השדרתי (aCSF).
    1. כן 500 מיליליטר של 10x פתרון קטיון נמוך, ו -500 מיליליטר של 10x פתרון ביקרבונט (ראה טבלה 1 ו -2 להכנת פתרון). חנות ב 4 מעלות צלסיוס ושימוש תוך חודש.
    2. הכן 600 מ"ל של aCSF טרי ידי ערבוב 60 מ"ל של 10x פתרון קטיון נמוכה עם 60 מ"ל של תמיסת ביקרבונט, ולאחר מכן להוסיף 480 מ"ל מים ללא יונים להגיע נפח סופי של 600 מ"ל. הבועה aCSF עם carbogen(5% O 2 ו -95% CO 2) עבור לפני השימוש 10 דקות לפחות.
  2. משוך פיפטה תיקון מ זכוכית נימים.
    1. מניח זכוכית נימי קירות דקה לתוך חולץ פיפטה להכין טפטפות הקלטה.
      הערה: במעבדה שלנו, את הפרמטרים הבאים בהגדרות של החולץ משמשים כדי להשיג את צורת פיפטה האידיאלית: חום (510), מהירות (32). צורת פיפטה האידיאלית להקלטה ללא פגע DRG צריכה להתחדד רזה הדרגתי עם זווית קונוס נמוכה, וזה יושג בצורה טובה ביותר על ידי ניסוי וטעייה.
    2. ודא כי ההתנגדות של פיפטה היא 3-5 MΩ כאשר התמלאו פתרונות פנימיים (ראה טבלה 3 להכנת פתרון). עיין אקסון המדריך לשיטה המפורטת של מדידת פיפטה התנגדות 18.
  3. הוסף 1 מ"ג של collagenase 400 μl של aCSF, לתת ריכוז סופי של 13 יחידות / מיליליטר. לאחר מכן ממלאים כל פיפטה זכוכית עם כ -20 μl של פתרון collagenase. חֲנוּתאת pipettes מולא במקפיא C -20 o ולהשתמש בהם תוך שלושה שבועות.
  4. כן 200 מיליליטר של קר aCSF (כ -4 מעלות צלסיוס). כדי לקרר את aCSF במהירות למקם אותו לתוך מבחנה, לאטום בניילון נצמד ומניחים במקפיא -20 o צלזיוס למשך כ 20 דקות עד שהוא מתחיל להקפיא. מניח את הכוס באמבט קרח בועה עם carbogen במשך 10 דקות. הבועה הנותרים 400 מ"ל של aCSF עם carbogen ב RT.
  5. בעוד aCSF מתקרר, לחתוך את הקצה של טפטפת העברת פלסטיק חד פעמית כדי להגדיל את פתח בקוטר של 5 מ"מ (זה ישמש להעביר את DRG). אסוף את מכשירי הניתוח הבאים: אזמל (# 15), מאיו ישר ומספריים מעוקלים, rongeur 2 מ"מ טיפ הנאה, Adson (שיניים) מלקחיים, מספרי איריס, מספרי האביב ושני מלקחיים בסדר. יוצקים את aCSF קר מחומצן לתוך בצלחות פטרי זכוכית 3 (קוטר חיצוני: 10 ס"מ).

2. DRG Dissection

  1. להרדים חולדה (200-220 גר ') עם PE נתרןntobarbital (100 מ"ג / ק"ג, IP) ולאשר כי רמת הרדמה היא נאותה על ידי בדיקת רפלקס הדוושה רפלקס מצמוץ עין.
  2. לאחר אימות כי החולדה הוא הרדים, לגלח את האזור המותני ו לחתוך את העור ורקמות תת עורית לאורך קו האמצע. לנתק את השרירים paraspinal מן התהליכים spinous ברמה L1-S2 באמצעות מעלית periosteal בסדר.
  3. השתמש במספריים מעוגלים לחתוך את תהליכי spinous מ L1 כדי S2. השתמש במספרי מאיו ישר לבצע קיצוצים רוחביים של עמוד השדרה החשוף בכ L1 ו- S1 ולהסיר במגזר זה של עמוד השדרה כמקשה אחת ובמהירות ותציף אותה לתוך קר aCSF (מוכן בשלב 1.5) במשך 2-3 דקות. בעקבות הסרת DRGs המותני, המתת חסד מתבצעת על ידי פתיחת בית החזה בין שתי המדינות תוך החולדה הוא עדיין מורדם פנטוברביטול עמוק.
  4. לשטוף את הדם מעמוד השדרה הוסר ורקמות המצורפת ולהעביר בצלחת פטרי עם aCSF קר. Use rongeur בסדר להסיר את הרבדים. חותכים את דורה מאטר לאורך קו האמצע עם microscissors לחשוף את חוט השדרה. הרם בעדינות את חוט השדרה, וחותכים את שורשי העצבים בשלב כניסתם בחוט השדרה באמצעות מספריים איריס, ולאחר מכן להסיר את חוט השדרה.
  5. מעבירים את החוליה הנותרים עם DRGs כדי בצלחת פטרי השני מלא aCSF קר. זהה את L4 ו- L5 DRGs מבוסס על המיקום היחסי שלהם לתהליכים רוחביים גיד הנשה.
    הערה: שמירה על עצב השת שלמים יעזור לזהות L4 ו- L5 DRG (עצב השת מקורו עצבי עמוד השדרה L4-6).
  6. שימוש במלקחיים דומון המספריים נויס לשחרר את DRGs מרקמות חיבור המקיפה. שמור על שורש עצב עצב עמוד שדרה מצורף DRGs.
  7. השתמש פיפטה העביר להעביר את DRGs לתוך צלחת פטרי השלישית לנתיחה נוספת.
  8. תחת המיקרוסקופ לנתיחה, להסיר בזהירות ככל האפשר של ה שמסביב epineuriumDRG דואר.
    1. השתמש במספריים באביב נויס כדי לחתוך פתח שבו הגבה ושורשי גחון להצטרף DRG ולהפריד את שורש הגחון מן DRG. השתמש דומון # 5 מלקחיים עם טיפים בוטים להחזיק את epineurium, ולהשתמש אחר מלקחיים בסדר לגלגל את DRG מן epineurium.
    2. המשך להסיר ככל האפשר של epineurium המצורפת DRGs באמצעות מלקחיים בסדר.
      הערה: DRG היטב גזור חשוב להשיג עיכול טוב בשלב הבא.

3. עיכול DRG

  1. מעביר את DRG לתא ההקלטה. ודא שהצד של DRG שבו שורשי העצבים מקורן פניהם למטה.
    הערה: בדרך זו, רוב הנוירונים נגישים.
  2. השתמש עוגן לייצב את DRG. Perfuse DRG עם aCSF מחומצן בשיעור של 0.5 מ"ל / דקה דרך צינורות פלסטיק מחובר עם משאבה peristaltic, אשר ממוקם על שולחן בסמוך לפלטפורמה הקלטה.
  3. חכה 30 דקות כדי לאפשר לתאים להתאושש. להעריך את האיכות של DRG תחת בניגוד ממשק ההפרש אינפרא אדום (IR-DIC) אופטיקה ב 40X ההגדלה המטרה באמצעות מצלמת CCD.
    הערה: DRGs טוב מכיל בדרך כלל עגול רבים, גם בניגוד, נוירונים מוקפים ותאי גלייה בלווין על פני השטח שלו.
  4. תקציר אזור קטן של פני השטח של DRG.
    הערה: טפטפות תיקון הזכוכית ממוקמות בעלי פיפטה, שהן זיווגים קטנים המאפשרים צינורות שיצורפו פיפטה הזכוכית עם חותם אטום.
    1. בנפרד לחבר שני 1 מ"ל מזרקים למחזיקי פיפטה באמצעות שתי חתיכות של צינורות גומי בקוטר קטן. שים פיפטה כוס אחת מלא collagenase לתוך אחד ממחזיקי פיפטה פיפטה הכוס הריקה לתוך אחד אחר.
    2. השתמש micromanipulator כדי למקם את טפטפות בדיוק מעל DRG. לאחר מכן, תחת ההגדלה במיקרוסקופ, מתנגשים קצות שתי טפטפות אחד נגד השני בעדינות על מנת להגדיל את הפתחים של טיפים פיפטה (אידיאלי בקוטר של 510 מיקרומטר).
    3. הזז את פיפטה מלא אנזים קרוב לפני השטח של DRG ולהפעיל לחץ חיובי בקצרה collagenase המכיל פיפטה דרך הצינור המחבר בין בעל לבין מזרק ידי לעקירתם הבוכנה על 0.5 מ"ל.
      הערה: תחת לחץ, זרימת האנזים מן פיפטה יהיה מעט להגדיל את החלל בין נוירונים DRG, אשר יכול לשמש סימן עבור יישום האנזים.
    4. לאחר 10 עד 15 דקות, כאשר פסולת של epineurium נותר הוא ציין, להפעיל לחץ שלילי עדין על פיפטה הריק למצוץ את השיירים.
      הערה: בדרך זו, נוירונים ותאי גלייה לווין הסביבה ייחשפו בבירור ומוכן הקלטת תיקון.
    5. בטל שתי טפטפות לתוך המכל החד.

4. הצמד תיקון הקלטות

  1. מניח את פתרון אלקטרודה (ראה טבלה 3) על קרח כדי למנוע שפלה. מלאו את פיפטה זכוכית תיקון עםפתרון תאי מסונן (מסנן מזרק, גודל נקבובי: 0.2 מיקרומטר) ומקום פיפטה מחזיק פיפטה headstage. החל לחץ חיובי עדין על פיפטה באמצעות מזרק 5 מ"ל על ידי תפיסת הבוכנה על 1 מ"ל לפני הורדת פיפטה לתוך הפתרון אמבטיה.
    הערה: פעולה זו מונעת פיפטה מלהפוך חסום.
  2. בחר מצב "V-מהדק" על ידי סיבוב הידית במצב על המגבר, ולאחר מכן פתח ממשק "מבחן ממברנה" בתוכנה. הזז את פיפטה הקרובה הנוירון היעד תחת פיקוח מיקרוסקופ.
    הערה: בעריכת DRG ללא פגע, שכבה דקה של תאי גליה לווין מתמצת כל נוירון.
  3. הפעל לחץ חיובי פיפטה לעבור את שכבת תאי גליה לווין עד גדלה פתאומית של רווח בין הנוירון השכבות סביב תאי גלייה בלווין הוא ציין. להמשיך לנוע פיפטה כלפי הנוירון עד "גומה" הוא ציין על הנוירון.
    הערה: בהשוואהרישומים של פעילות מוחית ומפורר, הלחץ החיובי צריכה להיות מעט גדול יותר, אשר יסייעו לחדור את שכבת תאי גליה בלווין להגדיל את סיכויי תיקון מוצלח.
  4. הפחתת הלחץ החיובי. לאחר מכן, להשיג חותם אוהם גיגה עם שאיבה עדינה.
    הערה: בשיטה זו, קצב הקלטת ההצלחה הוא לפחות 70%.
  5. קבל את תצורת הקלטה כל תא כפי שתואר לעיל 19.
    1. בקצרה, לחדור את קרום תא נוירון באמצעות יניקה קצרה אך חזקה. לחלופין, השתמש בפונקצית "zap" על המגבר תוך יניקה מוחלת.
    2. פעם מצב התא כולו הוא הקים, לפצות קיבול כל תא והתנגדות בסדרה (RS) על ידי סיבוב פיצוי קיבול והתנגדות ידיות על המגבר.
      הערה: Rs הוא בדרך כלל 5-20 MΩ.
    3. נוטשים את התא אם Rs הוא בתחילה יותר מ -30 MΩ; או RS שינויים על ידי יותר מ -20% במהלך ההקלטה. גַםלמדוד את פוטנציאל הממברנה מנוחה; לנטוש תא אם פוטנציאל הממברנה במנוחה הוא יותר מ -50 mV.
  6. סגור את החלון "ממברנה הבדיקה". בחר "אני מהדק נורמלי" מצב על ידי סיבוב הידית במצב על המגבר.
  7. לחץ על "פרוטוקול פתוח" בתוכנה, בחר לטעון פרוטוקול למדידת rheobase. לחץ על "שיא" כדי להתחיל בהקלטה. מדוד התנגדות קלט rheobase לבחון את הרגישות העצבית על ידי הזרקת סדרה מדורגת של depolarizing זרמים מדרגים 100 PA.
    1. לחץ על "פרוטוקול פתוח" שוב ובחר את הפרוטוקול למדידת סף הממברנה. של 500 ms depolarizing נוכחי רמפה (2,000 רשות / ים) יהיה מוזרק אל נוירון.
    2. השתמש רכישת נתונים וניתוח תוכנה (למשל Clampfit) לנתח את העקבות נרשמו לפי הוראות היצרן. השתמש בתוכנה כדי לחשב את התנגדות קלט (רין) על בסיס של relat IV היציבionship במהלך זרמי hyperpolarizing נמסרו. להזיז את הסמן כדי למדוד את הערך עבור סף rheobase הממברנה.
      הערה: משרעת הנוכחי הנדרש כדי להשרות את AP מוגדרת rheobase, ואת המתח הנמוך גרימת AP מוגדר סף הממברנה.
  8. רשום את Currents ליגנד מושרה.
    1. מלאו פיפטה עם אגוניסטים ספציפיים.
      הערה: בדו"ח הנוכחי, השתמשנו 100 מיקרומטר גלוטמט 100 מיקרומטר AITC לגרום הזרמים בתיווך קולטני גלוטמט קולטנים TRPA1 בהתאמה.
    2. בדוק את פיפטה לוודא שאין בועות אוויר בתוך. מניחים את פיפטה מחזיק פיפטה. חבר לבעל פיפטה עם צינור המחובר למערכת מחלק סמים.
    3. השתמש מניפולטור להעביר את פיפטה בתוך 50 מיקרומטר של הנוירון. הגדר את הלחץ במערכת מחלק הסמים עד 1 psi ואת משך הזמן עד 1 שניות. לעבור את מצב ההקלטה מהדק מתח, מהדק ב -70 mV. בקצרה להפעיל את הלחץ באמצעות המערכת מחלק הסמים להקליט זרם מושרה-סמים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מציג את תהליך הכנת DRG תילן הקלטת תיקון. איור 1 א מציג את החשיפה ואת המיקום של הגרעינים לאחר laminectomy. Figure1B תערוכות L3, L4 ו- L5 DRGs עם שורשי העצבים המצורפים לאחר הסרת חוט השדרה. ואז L4 ו -5 DRGs הם גזורים בקפידה ושוחררו מן החוליות. בשלב הבא, epineurium, קרום שקוף סביב DRG, מוסר (חץ צהוב, 1D איור). המיקום הטוב ביותר כדי להפריד את epineurium הוא באמצעות האתר שבו הגבה ושורשי גחון להצטרף בבית DRG, כפי שצוינו על ידי החץ השחור ב 1D האיור. לאחר קילוף epineurium, שורש הגחון מוסר וזנוח, עוזב את שורשונים הגבה , עצב השדרה DRG, כפי שמוצג באיור 1E. עיכול עם collagenase מסיר את epineurium שיורית, חשיפת נוירונים ואת t תאי הלווייןכובע המקיפים אותם (איור 1F).

לאחר השלמת הכנת DRG, רגישות של נוירון DRG בקוטר קטן נבחנת על ידי מדידת סף rheobase הממברנה. כפי שניתן לראות בתרשים 2A, rheobase הוא 260 PA. איור 2B מראה את הסף ממברנה נמדד בשיטה זו. עם הזרם הגובר, הממברנה depolarized ברציפות עד סוכנות הידיעות AP הוא עורר. בדוגמה זו לסף הממברנה (פוטנציאל שבה AP הוא עורר) הוא -11.9 mV. לכן, על ידי שמירה על הקשר בין נוירונים ותאי גלייה בלווין, ההכנה שלנו היא קרובה יותר אל המצב-vivo. בהתבסס על התוצאות שלנו, rheobase רשמה נוירונים DRG הקטנים היא בסביבות 300 PA, ואת התנגדות הקלט היא 451.3 ± 27.3 MΩ. שני מושווים גבוה עם לשיעורים שנמדדו מתא עצב ניתק (כ -150 הרשות 635 MΩ), דבר המצביע עלדיסוציאציה כי הגדילה את הרגישות של נוירונים DRG 11.

עם הכנה זו, אנו מדדו גם את הזרמים פנימה המושרה על ידי isothiocyanate גלוטמט allyl (AITC), שהן אגוניסטים לרצפטורים גלוטמט וחבר ערוץ קטיון פוטנציאל הקולטן חולף A1 (TRPA1) בהתאמה. משרעת של זרמים פנימה מושרה על ידי ליגנדים אלה ישקפו את מספר הקולטנים המופצים הנוירונים. איור 3A מראה זרם פנימה נוירון DRG בקוטר קטן המושרה על ידי יישום עלים 1 שניות של גלוטמט (1 מ"מ). גלוטמט המושרה זרם פנימה (198 PA), אשר ניתן לחסום במידה רבה על ידי שיתוף יישום של APV אנטגוניסט לרצפטור NMDA ואת אנטגוניסט AMPA / kainate קולטן CNQX (מידע לא מוצג), המאשר את הנוכחי מתווכת על ידי קולטני גלוטמט על DRG נוירונים. נתונים אלה נקבע כי יש קולטני גלוטמט תפקודית על נוירונים DRG. neuron באיור 3B הראה זרמים פנימה (260 PA) הנגרמת על ידי יישום עלים 1 שניות של isothiocyanate allyl (AITC, 100 מיקרומטר), אגוניסט TRPA1 סלקטיבית. הזרם פנימה נחסם על ידי HC מיקרומטר 10 אנטגוניסט TRPA1 סלקטיבית 030,031 (מידע לא מוצג), המאשר את הזרמים בתיווך קולטנים TRPA1 וקובע נוכחות של קולטני TRPA1 על נוירונים DRG.

איור 1
איור 1: הכנת שלמים DRGs (א) חשיפה של חוט השדרה לאחר laminectomy ואת פילוח DRGs.. חצים מימין לשמאל מצביעי L3-5 DRGs בהתאמה. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (ב) חשיפה של L3, L4, L5 ו DRGs ואת שורשי עצבים המצורפים לאחר הסרת חוט שדרה. החצים מצביעים L3, L4, ו DRGs L5 מימין לשמאל. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (C) IntaDRGs ct עם שורשי עצבים המצורפים לאחר הגזור מן חוט השדרה. החצים מצביעים DRGs L4 ו- L5 מימין לשמאל. סרגל קנה מידה = 1 ס"מ. (ד) Intact DRG עם epineurium המצורפת. בתמונה זו, epineurium הוא תם, ואת החץ הצהוב מראה את epineurium השקופה למחצה שבידי מלקחי דומון. החץ השחור מציין את צומת נוצר על ידי השורש הגבי ושורש הגחון, אשר משמש כנקודת התחלה טובה לקלף את epineurium. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (ה) באותו DRG עם השורש הגבה המצורף אחרי epineurium ושורש גחון הוסרה. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. (F) תמונות מיקרוסקופ אינפרא אדום של DRG הבאים העיכול עם collagenase. קטנים ובינוניים נוירונים גלויים. תא גלייה בלוויין (חץ צהוב) גלוי סביב נוירון (כוכבית). נקודות החץ האדומות אל פיפטה. בר סולם = 10 מיקרומטר. (G) תצורת ציוד הקלטה. החיצים השחורים מצביעי המחזיקי פיפטה דואר. אולי השמאלית מחזיקה את פיפטה מלא סמים, פיפטה הקלטה נמצא בצד ימין. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. מדידה עצבית רגישה בלקט קלאמפ מצב (א) Rheobase נמדד על ידי הזרקת סדרה של זרמים לתוך הנוירון DRG (פנל עליון). עוצמת הזרם הנמוכה ביותר, אשר יכול לגרום פוטנציאל פעולה, מוגדרת rheobase, כפי שצוינה על ידי חץ פנל תחתון. Rheobase עבור נוירון זה 300 PA. (B). סף הקרום נמדד על ידי הזרקה נוכחי רמפה. הפוטנציאל, כאשר פוטנציאל פעולה הוא עורר, מוגדר סף קרום, שזכה על פי הקו המקווקו בלוח העליון.סף הקרום עבור נוירון זה -11.9 mV. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: זרמים ליגנד קטנים DRG נוירונים זרמים המושרה על ידי יישום עלים של גלוטמט (1 מ"מ) או isothiocyanate allyl (אגוניסט TRPA1, AITC, 100 מיקרומטר) עבור 1 שניות.. אגוניסטים שני המושרה פנימה זרמים, דבר המצביע על נוכחות של קולטני גלוטמט קולטנים TRPA1 על נוירונים DRG קטן. גלוטמט יישום המושרה זרם פנימה של 198 Pa (א), וכן AITC המושרה זרם פנימה של 260 Pa (B). נוירונים הם הדקו ב -70 mV. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. < / P>

2 ליטר נמוך קטיוני 10x המניות
ריכוז סופי (מ"מ) רְכִיב MW משקל (גרם)
3 KCl 74.6
11 גלוקוז 180.2
123 NaCl 58.4
1.25 לאא 2 PO 4 * H 2 O 138
1 MgCl 2 * 6H 2 O 203.3
2 CaCl 2 * 2H 2 O 147

שולחן 1

לשמור-together.within-page = "1" FO: keep-עם-next.within-page = "תמיד">
1 ליטר של 10x מניות ביקרבונט
ריכוז סופי (מ"מ) רְכִיב MW משקל (גרם)
26 NaHCO 3 84.01 21.84

טבלה 2

100 מיליליטר של פתרון תאי
ריכוז (מ"מ) רְכִיב MW g
130 KGluconate 234.24
10 KCl 74.55
10 HEPES 238.3
10 EGTA
2 MgCl 2 * 6H 2 O 203.3
הערות: התאם ל- pH 7.4 עם KOH, ו osmolarity 260 - 280 mOsm עם סוכרוז ומים מזוקקים. להוסיף 2 מ"מ MgATP, 0.5 מ"מ Na 2 GTP ולסנן לפני השימוש המיידי.

טבלה 3

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

אנו מדווחים על שיטה להכין DRGs כולו ללימודי מהדק תיקון. ישנם מספר מרכיבים המרכזיים להכנת דגימה אידיאלית. ראשית, חשוב לנתח את DRGs עם שורשי גב מצורפים. לאחר מכן, epineurium צורך להסירו בזהירות תוך הימנעות נזק לתאי העצב. לבסוף, על מנת לחשוף את נוירונים ותאי גלייה בלוויין הסובבת אותם, יש צורך לעכל את רקמת החיבור שנותרו. DRGs ללא פגע מן חולדות בוגרות מוכנות עם השיטה המתוארת כאן ישמור כדאיות טובה 6 עד 8 שעות ו ניתן להקליט ביציבות במהלך אותה התקופה. הם יכולים לשמש למחקרים שונים של DRGs כוללים הקלטות מהדק תיקון על נוירונים או תאי גליה לווין, או תגובות עוררו של נוירונים DRG.

במהלך ההליך לנתיחה, חשוב לנתח את DRG במהירות ולשמור אותו בטמפרטורה נמוכה (4 o C) כדי להאט את חילוף החומרים העצביים ובכך שומר הכדאיות שלה. במהלך tהוא דיסקציה של DRGs, יש להימנע מתיחת הגבי או עצבי עמוד השדרה הזנת DRGs. עוד צעד מפתח בהכנה זו הוא סר של epineurium סביב DRG. מאז epineurium קשה לחדור, כל epineurium הנותרים על DRG תמנע טפטפות תיקון מלהגיע נוירונים. יישום של collagenase הוא צעד חשוב עבור הכנות מוצלחות. Collagenase יהיה לעכל את epineurium הנותר לנקות את השטח של תאים בו זמנית, אשר שניהם הם קריטיים עבור תיקון מוצלח. כדי למנוע יתר העיכול של הרקמה, שלושה גורמים שצריך לקחת בחשבון. ראשית, collagenase מגיע במספר צורות שונות; עיינו בטבלה של חומרי המלצתנו, המשמש כיום הוא חזק אבל עדין, וכך למנוע עיכול מעל. שנית, צריך להיות מועברת האנזים בלחץ אור כדי למנוע את הפיזור של האנזים מעבר לאזור ההקלטה. מצאנו את הלחץ המופק החלת 0.5 מ"ל שלir מתוך מזרק 1ml של די. שלישית, טווח הריכוז הטוב ביותר עבור collagenase הוא מ- 10-13 יחידות / מ"ל. ריכוזים גבוהים יותר עלולים להוביל יתר עיכול והשפלה מהירה של הרקמה, בעוד ריכוזים נמוכים כרוכים זמן עיכול ארוך שלא לצורך. מניסיוננו, בריכוז של 13 יחידות / מיליליטר ו זמן עיכול סביב 15 דקות מייצרים את התוצאות הטובות ביותר. לאחר החלת האנזים epineurium הנותר סביב DRG צריך להיות משוחרר, וניתן פינה עם שאיבה עדינה. Collagenase רגישה לחזור מחזורי פשרת הקפאה, ולכן, פעם מדוללת פתרון האנזים צריך להיות מחולק aliquots בשימוש בתוך 3 שבועות.

זאנג ועמיתיו היו הראשונים מתארים שיטת הקלטת מהדק תיקון מ שלמי DRGs. החולדות הם השתמשו, לעומת זאת, היו צעירים מאוד (לאחר הלידה 10-15 ימים) 20 אשר יש יתרון כי DRGs הם יותר קל להכין בהתחשב בעובדה שיש להם EPI רזהיש neurium ו להם כדאיות מוגברת. DRGs חולדות ילודות, לעומת זאת, יש חסרון, כי הביטוי של חלבוני תעלות יונים כמו TRPV1 ו NaV1.8 שונה מאלה של חולדות בוגרות 21,22. כמו כן, מחקרים התנהגותיים תרופתיים נערכים בדרך כלל חולדות מבוגרות. לכן שיטת הרישום המפורטת כאן מאפשרת ביצוע קורלציה בין אלקטרופיזיולוגיה והתנהגות בבעלי חיים בוגרים. שימוש גרעיני שורש הגבה שלמים כהכנה לנהל צמד תיקון הקלטות vivo לשעבר גדל לאחרונה 15-17,23,24, וכמה מחקרים השתמשו בהקלטות vivo 25. רוב הקלטות vivo לשעבר לחשוף את הנוירונים DRG ידי דוגרי DRG כולו לתוך קוקטייל אנזים במשך כ 30-60 דקות. אמנם שיטה זו מייצרת נוירונים יותר, יש לו סיכון של יתר העיכול של נוירונים ב בשכבות השטחיות. השיטה שלנו מפחיתה את האפשרות-עיכול על ידי שימוש בדיקה ויזואלית לפקח על לשעבראוהל של דרכי העיכול, שיטה גם בשימוש על ידי מא ואח עבור in vivo הקלטות 25.

בהשוואת נוירונים DRG ניתקו, אחד היתרונות של תכשיר DRG השלם מגיע מהשימור של שני נוירונים ותאי גלייה בלווין (איור 1). זהו לא המקרה בהכנות קונבנציונליות המשתמש נוירונים DRG ניתקו. בלווין גליה תאים מהווה מכשול סביב נוירונים DRG פרט, ונוכחותם חיונית לשמירה על איכות הסביבה הפיזיולוגית של נוירונים אלה 13. כפי שצוין תוצאות המאפיינים אלקטרו של נוירונים שהכין זה אומר להיות שונים מאלה שהושגו על ידי מחקרים באמצעות תאים ניתק.

אחד הכיוונים העתידיים המעניינים ביותר להכנה זו היא לחקור את crosstalk בין נוירונים DRG ותאי גלייה בלוויין. לאחר פגיעה עצבית, למשל, תאי גלייה בלוויין הוכחו to עובר שינויי פלסטיק, אשר קשורים זה לזה כדי התנהגות הכאב הזה מתפתח 13-15,26. שימור תאי גלייה לווין DRGs ללא פגע, יאפשר לנו לקבוע אם קולטנים משדר כגון קולטן הגלוטמט, או קולטנים ATP נוכחים על ותאי גלייה בלוויין איך הם מגיבים לשינויים בכלל הפעילות העצבית. על ידי תיקון ותאי גלייה בלווין מגרה הנוירון זמנית, בתאי הגלית לווין יכולים לפעול כחיישן ביולוגי ולהראות האם יש לשחרר משדר מן הנוירונים הסמוכים. יתר על כן, הכנת DRG שלמה שומרת שניהם מביאות ו שורשי עצבי efferent. זה מאוד מרחיב את היקף הניסוי על ידי הוספת האפשרות להמריץ את האקסונים להיכנס או לצאת הנוירונים עם אלקטרודה יניקה, אשר תהיה חקיין טוב יותר של מצב in vivo.

ישנן מספר מגבלות על ההכנה הנוכחית. קיומו של המכשול נוצר על ידי gli לוויןתאי אל, עושים את זה יותר קשה נוירונים תיקון ואחד צריך להיות מודע לכך שהוא עשוי להגביל את הריכוז של תרופות לכה הנוירונים. לכן, כדי לקבל גישה הנוירון בהכנה שלנו חשוב לשמור על פיפטה בלחץ חיובי כדי לסייע חודר שכבת תאי גלייה בלוויין. מגבלה נוספת היא כי שורש גב ואת עצבי עמוד שדרה צריכות להיחתך על מנת לנתח את DRG. לכן, אי אפשר לעזוב את האקסון לחלוטין ללא פגע. עם זאת, הנוכחות של האקסון הנותר צריכה להיחשב, כמו אקסונים פריפריאלי לא יכולים להיות מהודקים לאותו מתח כמו סומה, אשר יכולה לגרום שגיאת הקלטה פוטנציאלית או הפרעה כאשר מהדק מתח מתנהל. כמו כן על מנת לקבל חשיפה טובה של נוירונים, עיכול עדין עם collagenase הכרחי אם כי זה יכול להיות נשלט עם ניסיון, אי אפשר להגן על נוירונים לחלוטין מחשיפת האנזים לעכל. לעומת ד קונבנציונאלינוירונים issociated DRG, אולם DRGs כולו הם מהירים להכין (כ -30 דק '), ניתן להשתמש ביישומים רבים ומחקה מקרוב בתנאים vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Pentobarbital sodium vortech Pharmaceuticals
syringe BD 309659 1 ml, 5 ml.
scalpel BD size: 15
Mayo straight scissor Fine Science Tools 14010-15
Mayo curved scissor Fine Science Tools 14011-15
Rongeur Fine Science Tools 16021-14
Adson toothed forceps Fine Science Tools 11027-12
Iris Scissor Fine Science Tools 14084-08
Noyes spring scissor Fine Science Tools 15124-12
Bone scissors Fine Science Tools 16044-10 Special for cutting the bones. 
Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 Fine Science Tools 11252-30 These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased.
periosteal elevator Sklar 97-0530
Dissection microscope WILD
Transfer pipette Fisher brand 13-711-5AM
Petri dish (10 cm) Pyrex Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps
Collagenase (Liberase TM) Roche 05-401-119-001 dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw.
filter Thermo scientific 7232520 Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog.
Glass pipette Sutter BF150-110-7.5
Anchor Havard apparatus 64-0250 stabilize the DRG to avoid drift.
Peristaltic pump WPI
Pipette puller Sutter P97
Amplifier Molecular devices Axopatch 200B
Digitizer Molecular devices 1440D
Microscope NIKON FN600
Micro-manipulator Sutter MPC200
microinjection dispense system General Valve Picrospitzer II fast drug application system
Carbogen (95% O2, 5% CO2) Local Medical Gas supplier

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
  2. Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
  3. Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
  4. Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
  5. Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
  6. Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
  7. Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
  8. Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
  9. Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
  10. Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
  11. Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
  12. Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
  13. Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
  14. Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
  15. Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
  16. Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
  17. Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
  18. The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
  19. Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
  20. Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
  21. Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
  22. Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
  23. Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
  24. Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
  25. Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
  26. Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).

Tags

ביוכימיה גיליון 115 רגישות מהדק מתח מהדק נוכחי כאב קולטנים TRPA1 קולטני גלוטמט ותאי גלייה בלווין פריפריה עצב סנסורי גיד הנשה שיטה
הצמד תיקון הקלטות על Intact השורש הגבי הגרעינים מן חולדות בוגרות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L.More

Gong, K., Ohara, P. T., Jasmin, L. Patch Clamp Recordings on Intact Dorsal Root Ganglia from Adult Rats. J. Vis. Exp. (115), e54287, doi:10.3791/54287 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter