Abstract
studi patch clamp da gangli spinali (DRG) neuroni hanno aumentato la nostra comprensione del sistema nervoso periferico. Attualmente, la maggior parte delle registrazioni sono condotti sui neuroni DRG dissociate, che è una preparazione standard per la maggior parte dei laboratori. le proprietà neuronali, tuttavia, possono essere alterati da danno assonale derivante dalla digestione enzima utilizzato per l'acquisizione neuroni dissociati. Inoltre, i preparativi dei neuroni dissociate non può rappresentare pienamente il microambiente delle DRG da perdita di contatto con le cellule gliali satellite che circondano i neuroni sensoriali primarie è una conseguenza inevitabile di questo metodo. Per superare le limitazioni nell'uso convenzionali neuroni DRG dissociati per le registrazioni di patch clamp, in questo rapporto si descrive un metodo per preparare DRG intatte e condurre le registrazioni di patch clamp su singoli neuroni primari sensoriali ex vivo. Questo approccio permette la preparazione rapida e semplice DRG intatti, imitando inVivo condizioni mantenendo neuroni DRG associati ai loro cellule circostanti gliali satellitare e membrana basale. Inoltre, il metodo evita danno assonale dalla manipolazione e digestione enzimatica come quando dissociare DRG. Questa preparazione ex vivo può inoltre essere usato per studiare l'interazione tra i neuroni sensoriali primarie e cellule gliali satellitare.
Introduction
La sensazione è essenziale per la sopravvivenza e il benessere di un organismo. La trasmissione di stimoli dipende dalle vie sensoriali da terminazioni periferiche di assoni da neuroni sensoriali primarie. neuroni sensoriali primari, ad eccezione del nucleo mesencefalico del nervo trigemino, si trovano nella trigemino gangli e dei gangli spinali (DRG). Essi servono come custodi delle informazioni sensoriali 1. A livello della membrana perikarial, proprio come ai terminali centrali e periferici, neuroni DRG esprimono recettori e canali ionici, come i recettori del glutammato, recettori TNF alfa, Canale Trp cazione membro sottofamiglia V 1 (TRPV1), i canali del sodio, ecc 2 -7. registrazioni di patch clamp della membrana perikarial consentono comprensione cambiamenti funzionali di molti di questi recettori e canali in tutto il neurone.
La tecnica di registrazione patch clamp è un potente strumento per la stumorire le attività dei canali o recettori e un gran numero di studi sono stati condotti mediante l'applicazione di questa tecnica sui neuroni DRG 8-10. Nella maggior parte degli studi DRG viene rimosso tagliando le radichette dorsali e spinali del nervo vicino al ganglio. Dopo macinazione, il ganglio viene poi posto in enzimi digestivi che provocano dissociazione dei neuroni DRG, che possono poi essere registrate immediatamente o in coltura per diversi giorni prima della registrazione. Purtroppo, la dissociazione dei neuroni DRG comporta un assotomia necessario vicino al perikarya. Una volta dissociato e axotomized, neuroni DRG subiscono cambiamenti fenotipici così come i cambiamenti nella eccitabilità della membrana 11,12. La perdita di contatto tra la perikarya dei singoli neuroni e le cellule gliali satellite che normalmente li circonda può contribuire a questi cambiamenti 13. Il crosstalk tra i neuroni e cellule gliali satellitare è sia essenziale in condizioni fisiologiche e nell'adattamento di pathologcondizioni iCal come quelli che porta al dolore intrattabile 14,15. Sarebbe difficile per studiare l'interazione tra neuroni e cellule gliali satelliti usando una preparazione DRG dissociato.
DRG intatte, invece, forniscono avvicinarle alle condizioni in vivo. Negli ultimi anni, il nostro laboratorio, così come alcuni altri gruppi, ha utilizzato DRG intatte da ratti adulti di indagare i cambiamenti dei neuroni sensoriali primari in diverse condizioni associate a dolore cronico 3-5,11,15-17. Sebbene le tecniche utilizzate in questi studi sono alquanto stabiliti, una descrizione passo-passo non è ancora stata pubblicata. Nel presente manoscritto, si descrive un modo comodo e veloce da preparare DRG intatte e il loro utilizzo per le registrazioni di patch clamp.
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Protocol
Etica Dichiarazione: Tutte le procedure per la manutenzione e l'uso degli animali da esperimento conforme alle norme dei comitati UCSF per la ricerca di animali e sono stati effettuati in conformità con le linee guida della normativa NIH in uso e cura degli animali (Pubblicazione 85-23, Revised 1996 ). Il Comitato Istituzionale cura e l'uso di animali UCSF ha approvato i protocolli utilizzati in questo studio.
1. Preparazione di strumenti, soluzioni e Piatti
- Preparare artificiale liquido cerebrospinale (aCSF).
- Preparare 500 ml di soluzione 10x partire cationico, e 500 ml di soluzione di bicarbonato di 10x (vedi Tabella 1 e 2 per la preparazione della soluzione). Conservare a 4 ° C e l'uso entro un mese.
- Preparare 600 ml di aCSF fresca miscelando 60 ml di soluzione a basso 10x cazione con 60 ml di soluzione di bicarbonato, e quindi aggiungere 480 ml di acqua deionizzata per raggiungere un volume finale di 600 ml. Bubble ACSF con CarboGen(O 2 e 95% CO 5% 2) per almeno 10 minuti prima dell'uso.
- Tirare Patch pipetta dalla capillare di vetro.
- Posizionare sottile capillare di vetro con pareti in un estrattore pipetta per preparare pipette di registrazione.
Nota: Nel nostro laboratorio, i seguenti parametri di impostazione del estrattore sono utilizzati per ottenere la forma ideale pipetta: calore (510), velocità (32). La forma pipetta ideale per la registrazione DRG intatto dovrebbe avere una conicità slanciata graduale con un angolo basso del cono, e questo può essere realizzato al meglio per tentativi ed errori. - Assicurarsi che la resistenza della pipetta è 3-5 MW quando riempita con soluzioni interne (vedere Tabella 3 per la preparazione della soluzione). Si prega di fare riferimento alla Guida Axon per il metodo dettagliato di misura della resistenza pipetta 18.
- Posizionare sottile capillare di vetro con pareti in un estrattore pipetta per preparare pipette di registrazione.
- Aggiungere 1 mg di collagenasi per 400 ml di aCSF, per dare una concentrazione finale di 13 unità / ml. Poi riempire ogni pipetta di vetro con circa 20 ml di soluzione di collagenasi. Negoziole pipette inserite all'interno di un congelatore C -20 ° e utilizzarli entro tre settimane.
- Preparare 200 ml di aCSF freddo (circa 4 ° C). Per raffreddare il aCSF rapidamente metterlo in un bicchiere, sigillare con pellicola trasparente e mettere in un congelatore C -20 ° per circa 20 minuti fino a quando non inizia a congelare. Porre il becher in un bagno di ghiaccio e bolla con CarboGen per 10 min. Bubble restanti 400 ml di aCSF con CarboGen a RT.
- Mentre il aCSF si raffredda, tagliare l'estremità di una pipetta di trasferimento di plastica monouso per allargare l'apertura ad un diametro di 5 mm (questo sarà usato per trasferire il DRG). Raccogliere i seguenti strumenti chirurgici: bisturi (# 15), Mayo rette e curve forbici, multa 2 millimetri punta Rongeur, Adson (dentata) pinze, forbici iris, forbici a molla e due pinza sottile. Versare il aCSF freddo ossigenata in capsule di Petri 3 in vetro (diametro esterno: 10 cm).
2. DRG Dissection
- Anestetizzare un topo (200-220 g) con pe sodiontobarbital (100 mg / kg, ip) e verificare che il livello di anestesia è adeguato testando pedale reflex e reflex occhi lampeggiano.
- Dopo aver verificato che il ratto è anestetizzato, radere la zona lombare e incidere la cute e del tessuto sottocutaneo lungo la linea mediana. Staccare i muscoli paravertebrali dai processi spinosi a livello L1-S2 con una multa scollaperiostio.
- Usare le forbici per tagliare curve processi spinosi da L1 a S2. Usare le forbici diritte Mayo a fare tagli trasversali della colonna vertebrale, esposto a circa L1 e S1 e rimuovere questo segmento della colonna vertebrale, in blocco e rapidamente immergere nella fredda aCSF (preparata al punto 1.5) per 2-3 minuti. Dopo la rimozione di DRG lombari, eutanasia viene effettuata da toracotomia bilaterale mentre il ratto è ancora sotto anestesia profonda pentobarbital.
- Lavare via il sangue dalla colonna vertebrale, rimosso e il tessuto attaccato e trasferimento in una capsula di Petri con aCSF freddo. USE una multa rongeur per rimuovere le lamine. Tagliare la dura madre lungo la linea mediana con microscissors per esporre il midollo spinale. Sollevare delicatamente il midollo spinale, e tagliare le radici nervose al loro punto di ingresso nel midollo spinale utilizzando forbici iris, quindi rimuovere il midollo spinale.
- Trasferire la vertebra restante con DRG alla seconda capsula di Petri riempite con aCSF freddo. Identificare la L4 e L5 DRG in base alla loro posizione rispetto ai processi trasversali e nervo sciatico.
Nota: Mantenere intatto il nervo sciatico aiuterà ad identificare L4 e L5 DRG (il nervo sciatico proviene dai nervi spinali L4-6). - Utilizzare pinze Dumont e le forbici Noyes per liberare i DRG dai tessuti connettivi circostanti. Mantenere la radice del nervo e nervo spinale attaccato ai DRG.
- Utilizzare la pipetta di trasferimento per spostare i DRG nel terzo capsula di Petri per ulteriori dissezione.
- Al microscopio dissezione, rimuovere con attenzione il più possibile del epineurio th circostantee DRG.
- Utilizzare le forbici primavera Noyes per tagliare un'apertura in cui la dorsale e le radici ventrali si uniscono al DRG e separano la radice ventrale dal DRG. Utilizzare Dumont # 5 pinze con punte smussate per tenere il epinevrio, e utilizzare un altro pinza sottile a rotolare DRG dal epinevrio.
- Continuare a rimuovere il più possibile epineurio attaccato DRG utilizzando i pinza sottile.
Nota: Un DRG ben sezionato-è importante ottenere una buona digestione nel passaggio successivo.
3. DRG Digestione
- Trasferire il DRG alla camera di registrazione. Assicurarsi che il lato del DRG in cui le radici nervose provengono volti verso il basso.
Nota: In questo modo, la maggior parte dei neuroni sono accessibili. - Utilizzare un ancoraggio per stabilizzare il DRG. Perfuse DRG con ossigenato aCSF ad una velocità di 0,5 ml / min attraverso tubi di plastica collegati con una pompa peristaltica, che si trova su un tavolo accanto al rig registrazione.
- Attendere 30 minuti per permettere alle cellule di recuperare. Valutare la qualità del DRG in infrarossi contrasto interfaccia differenziale (IR-DIC) ottiche a 40X di ingrandimento obiettivo attraverso una telecamera CCD.
Nota: Le buone DRG di solito contiene molti rotondo, ben contrastato, i neuroni circondate da cellule gliali satelliti sulla sua superficie. - Digerire una piccola area della superficie del DRG.
Nota: Le pipette patch di vetro vengono inseriti nei supporti pipette, che sono piccoli accoppiamenti che permettono tubo per essere attaccato alla pipetta di vetro con una chiusura ermetica.- collegare individualmente due 1 ml siringhe ai titolari delle pipette attraverso due pezzi di piccolo tubo di gomma di diametro. Mettere una pipetta di vetro riempita con collagenasi in uno dei titolari pipetta e una pipetta di vetro vuoto in altro.
- Utilizzare il micromanipolatore per posizionare le pipette appena sopra il DRG. Poi, con un ingrandimento al microscopio, si scontrano le punte di due pipette uno contro l'altro con delicatezza per ingrandire le aperture di punte per pipette (idealmente un diametro di 5-10 micron).
- Spostare la pipetta riempito con l'enzima vicino alla superficie di DRG e brevemente applicare una pressione positiva alla pipetta contenente collagenasi attraverso il tubo di collegamento supporto e la siringa spostando lo stantuffo circa 0,5 ml.
Nota: Sotto pressione, il flusso dell'enzima dalla pipetta leggermente allargare lo spazio tra i neuroni DRG, che possono servire come segno per applicazione dell'enzima. - Dopo 10 a 15 minuti, quando si osserva detriti del epinevrio restante, applicare una leggera pressione negativa alla pipetta vuoto a succhiare via i detriti.
Nota: In questo modo, i neuroni e cellule gliali circostanti satelliti saranno chiaramente esposti e pronti per la registrazione patch. - Eliminare le due pipette nel contenitore diesis.
4. Bloccare Registrazioni patch
- Posizionare la soluzione elettrodo (vedere Tabella 3) su ghiaccio per evitare il degrado. Riempire la pipetta di patch di vetro consoluzione filtrata intracellulare (filtro siringa, dimensione dei pori: 0,2 micron) e posizionare la pipetta nel supporto headstage pipetta. Applicare una pressione positiva delicato sulla pipetta attraverso una siringa da 5 ml spostando lo stantuffo circa 1 ml prima di abbassare la pipetta in soluzione del bagno.
Nota: Questo impedisce la pipetta di diventare bloccato. - Scegliere la modalità "V-clamp" ruotando la manopola modalità dell'amplificatore, quindi aprire l'interfaccia "a membrana test" nel software. Spostare la pipetta vicino al neurone bersaglio sotto ispezione al microscopio.
Nota: Nella preparazione DRG intatto, un sottile strato di cellule gliali satellite incapsula ciascun neurone. - Utilizzare pressione positiva dalla pipetta per attraversare lo strato di cellule gliali satellite fino si osserva un allargamento improvviso di spazio tra il neurone e lo strato circostante di cellule gliali satelliti. Mantenere spostando la pipetta verso il neurone fino si osserva una "fossetta" sul neurone.
Nota: Rispettoregistrazioni da neuroni dissociati, la pressione positiva deve essere un po 'più grande, che contribuirà a penetrare lo strato di cellule gliali satellitare e aumentare le possibilità di patching di successo. - Ridurre la pressione positiva. Avanti, ottenere una tenuta giga Ohm con aspirazione delicata.
Nota: Con questo metodo, il tasso di successo della registrazione è almeno del 70%. - Ottenere configurazione di registrazione cellula intera come descritto in precedenza 19.
- Brevemente, penetrare la membrana cellulare del neurone tramite una breve ma forte aspirazione. In alternativa, utilizzare la funzione "zap" dell'amplificatore, mentre viene applicata aspirazione.
- Una volta che viene stabilita una modalità cellula intera, compensare capacità a cellula intera e la resistenza serie (Rs) ruotando le manopole di capacità e di compensazione resistenza dell'amplificatore.
Nota: Rs è normalmente 5-20 MW. - Abbandonare la cella se Rs è inizialmente superiore a 30 MW; o Rs modifiche da più del 20% durante la registrazione. Anchemisurare il potenziale di membrana a riposo; abbandonare una cella se il potenziale di membrana è più di -50 mV.
- Chiudere la finestra "test a membrana". Scegliere la modalità "I-clamp normale" ruotando la manopola modalità dell'amplificatore.
- Fai clic su "protocollo aperto" nel software, selezionare e caricare il protocollo per la misurazione reobase. Fai clic su "record" per avviare la registrazione. Misurare la resistenza di ingresso e reobase per esaminare l'eccitabilità neuronale iniettando una serie graduata di depolarizzante correnti a passi di 100 Pa.
- Fare clic di nuovo "protocollo aperto" e selezionare il protocollo per la misurazione della soglia di membrana. A 500 ms depolarizzanti attuale rampa (2.000 pA / s) saranno iniettati al neurone.
- Utilizzare l'acquisizione dei dati e software di analisi (ad es Clampfit) per analizzare le tracce registrate in base alle istruzioni del produttore. Utilizzare il software per calcolare la resistenza di ingresso (Rin) sulla base dello stato stazionario IV relationship durante le correnti iperpolarizzanti consegnati. Spostare il cursore per misurare il valore per reobase e la membrana soglia.
Nota: L'ampiezza della corrente necessaria per indurre l'AP è definita come la reobase, e la più bassa tensione per indurre AP è definito come soglia di membrana.
- Registrare il ligando correnti indotte.
- Riempire una pipetta con gli agonisti specifici.
Nota: Nella presente relazione, abbiamo utilizzato 100 micron glutammato e 100 micron AITC per indurre le correnti mediate dai recettori del glutammato e recettori TRPA1, rispettivamente. - Controllare la pipetta per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria all'interno. Posizionare la pipetta nel supporto pipetta. Collegare supporto pipetta con un tubo collegato ad un sistema di erogazione di droga.
- Utilizzare il manipolatore per spostare la pipetta a meno di 50 micron del neurone. Impostare la pressione del sistema di erogazione farmaco per 1 psi e la durata di 1 sec. Attivare la modalità di registrazione al morsetto di tensione, e fissare a -70 mV. Brevemente applicare la pressione attraverso il sistema di erogazione farmaco per registrare una corrente indotta da farmaci.
- Riempire una pipetta con gli agonisti specifici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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