Abstract
estudos de patch-clamp de gânglios da raiz dorsal (DRGs) neurônios têm aumentado nossa compreensão do sistema nervoso periférico. Actualmente, a maioria das gravações são realizadas sobre os neurónios DRG dissociados, que é uma preparação padrão para a maioria dos laboratórios. propriedades neuronais, no entanto, pode ser alterada por lesão axonal resultante da digestão com enzimas utilizadas na aquisição de neurónios dissociados. Além disso, as preparações neuronais dissociadas não pode representar plenamente o microambiente do DRG desde perda de contacto com células gliais por satélite que rodeiam os neurônios sensoriais primários é uma conseqüência inevitável desse método. Para superar as limitações no uso de neurônios DRG dissociados convencionais para gravações de patch clamp, neste relatório nós descrevemos um método para preparar DRGs intactas e realizar gravações patch clamp em neurônios sensoriais primários individuais ex vivo. Esta abordagem permite a preparação rápida e simples das DRGs intactos, imitando emvivo condições de manter os neurônios DRG relacionadas com as suas células gliais por satélite em volta e membrana basal. Além disso, o método evita a lesão axonal de manipulação e de digestão enzimática, tais como quando se dissociar DRGs. Esta preparação ex vivo pode, adicionalmente, ser utilizado para estudar a interacção entre os neurónios sensoriais primários e células gliais por satélite.
Introduction
Sensation é essencial para a sobrevivência e bem-estar de um organismo. A transmissão de estímulos é dependente das vias sensoriais a partir de terminações periféricas dos axónios de neurónios sensoriais primários. neurónios sensoriais primários, com a excepção de o núcleo mesencefálico do nervo trigeminal, situam-se nos gânglios da raiz dorsal e gânglios trigeminais (DRG). Eles servem como guardiões da informação sensorial 1. Na membrana perikarial, assim como nos terminais centrais e periféricos, os neurônios DRG expressam receptores e canais iônicos, tais como receptores de glutamato, os receptores alfa de TNF, receptor de potencial transitório canal cátion membro da subfamília V 1 (TRPV1), canais de sódio, etc. 2 -7. gravações de patch clamp da membrana perikarial permitir compreender alterações funcionais de muitos destes receptores e canais ao longo do neurónio.
A técnica de gravação de patch-clamp é uma ferramenta poderosa para stumorrendo as actividades dos canais ou receptores e um grande número de estudos foram realizados por aplicação da presente técnica em neurónios DRG 8-10. Na maioria dos estudos, o DRG é removido através do corte das radículas dorsais e nervo perto da coluna vertebral para o gânglio. Após a trituração, o gânglio é, então, colocado em enzimas digestivas que resultam na dissociação dos neurónios DRG, que podem então ser gravados imediatamente ou cultivadas durante vários dias antes da gravação. Infelizmente, a dissociação dos neurônios DRG envolve uma axotomia necessário perto do pericários. Uma vez dissociados e axotomia, os neurônios DRG sofrer alterações fenotípicas, bem como alterações na excitabilidade da membrana 11,12. A perda de contato entre o pericários de neurônios individuais e as células gliais por satélite que normalmente cercam deles é susceptível de contribuir para estas mudanças 13. O crosstalk entre os neurônios e células gliais por satélite é tanto essencial em condições fisiológicas e na adaptação às pathologcondições políticas, tais como as que podem causar dor intratável 14,15. Seria um desafio para estudar a interação entre os neurônios e células gliais por satélite usando uma preparação DRG dissociada.
DRGs intacto, por outro lado, fornecer aproximar das condições in vivo. Nos últimos anos, nosso laboratório, bem como alguns outros grupos, tem vindo a utilizar DRGs intactas de ratos adultos para investigar mudanças de neurônios sensoriais primários em diferentes condições associadas com dor crônica 3-5,11,15-17. Embora as técnicas utilizadas nestes estudos são relativamente estabelecido, uma descrição passo-a-passo não foi ainda publicada. No presente artigo, são apresentadas uma maneira conveniente e rápido para preparar DRGs intactas e sua utilização para gravações patch clamp.
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Protocol
Declaração de Ética: Todos os procedimentos para a manutenção e utilização dos animais experimentais conformados com os regulamentos das comissões UCSF em Pesquisa Animal e foram realizadas em conformidade com as diretrizes dos regulamentos do NIH sobre o uso e cuidados (Publicação 85 animais - 23, revista em 1996 ). O Comité Cuidados e Uso de Animais aprovou os Institucional UCSF protocolos utilizados neste estudo.
1. Preparação de Instrumentos, Soluções e pratos
- Prepare fluido cerebrospinal artificial (aCSF).
- Preparar 500 ml de 10x solução de baixo catião, e 500 ml de solução de bicarbonato de 10x (ver Tabela 1 e 2 para a preparação da solução). Armazenar a 4 ° C e utilizado dentro de um mês.
- Preparar 600 ml de aCSF fresco por mistura de 60 ml de 10x solução de baixo catiónica com 60 ml de solução de bicarbonato, e, em seguida adicionar 480 ml de água de s ionizada para alcançar um volume final de 600 ml. Bolha do aCSF com carbogênio(5% de O2 e 95% de CO 2) durante pelo menos 10 min antes da utilização.
- Puxe remendo pipeta capilar de vidro.
- Coloque vidro fino capilar murado em um extrator pipeta para preparar pipetas de gravação.
Nota: Em nosso laboratório, os seguintes parâmetros de configuração do extrator são usados para atingir a forma ideal pipeta: calor (510), velocidade (32). A forma pipeta ideal para gravação DRG intacto deve ter um afunilamento delgado gradual com um ângulo de cone baixo, e isso pode ser melhor alcançado por tentativa e erro. - Assegure-se que a resistência da pipeta é de 3-5 MQ quando preenchidos com a solução internos (ver Tabela 3 para a preparação da solução). Por favor, consulte o Guia Axon para o método detalhado para medir a resistência da pipeta 18.
- Coloque vidro fino capilar murado em um extrator pipeta para preparar pipetas de gravação.
- Adicionar 1 mg de colagenase para 400 ul de aCSF, para dar uma concentração final de 13 unidades / ml. Em seguida, preencha cada pipeta de vidro com cerca de 20 ml de solução de colagenase. Lojaas pipetas cheias em um congelador C -20 ° e usá-los dentro de três semanas.
- Prepare 200 ml de aCSF fria (cerca de 4 ° C). Para esfriar o aCSF rapidamente colocá-lo num copo, selar com filme plástico e coloque em um C congelador -20 ° por cerca de 20 minutos até que ele começa a congelar. Colocar o copo num banho de gelo e fazer borbulhar com carbogénio durante 10 min. Bolha a 400 ml de aCSF com carbogénio restante à TA.
- Enquanto o aCSF é arrefecimento, cortar a extremidade de uma pipeta de transferência de plástico descartável para ampliar a abertura de um diâmetro de 5 mm (isto irá ser utilizado para transferir o DRG). Coletar os seguintes instrumentos cirúrgicos: bisturi (# 15), Mayo retas e curvas tesouras, bem dois milímetros ponta Rongeur, Adson (dentada) forceps, íris tesouras, tesouras de primavera e duas pinças finas. Despeje a aCSF frio oxigenado em placas de Petri 3 de vidro (diâmetro exterior: 10 cm).
2. DRG Dissection
- Anestesiar um rato (200-220 g) com pe de sódiontobarbital (100 mg / kg, ip) e confirmar que o nível de anestesia é adequada por meio de testes de reflexo pedal e olho reflexo de piscar.
- Depois de verificar que o rato é anestesiado, raspar a área lombar e inciso da pele e do tecido subcutâneo ao longo da linha média. Separar os músculos paravertebrais dos processos espinhosos no nível L1-S2 usando um elevador periosteal bem.
- Use tesoura curva para cortar os processos espinhosos de L1 a S2. Use a tesoura Mayo retas para fazer cortes transversais na coluna vertebral exposta a cerca de L1 e S1 e remover este segmento da coluna vertebral em bloco e rapidamente mergulhe-o em aCSF frio (preparado no passo 1.5) por 2-3 min. Após a remoção do DRGs lombares, eutanásia é realizada por toracotomia bilateral enquanto o rato é ainda sob anestesia com pentobarbital de profundidade.
- Lave fora do sangue a partir da coluna vertebral, removido e o tecido ligado e transferir para uma placa de Petri com aCSF frio. vocêse, uma rongeur fino para remover as lâminas. Cortar a dura-máter ao longo da linha média com microtesouras para expor a medula espinhal. Levante cuidadosamente a medula espinhal e cortar as raízes nervosas em seu ponto de entrada na medula espinhal usando íris tesouras, em seguida, remover a medula espinhal.
- Transferir a vértebra restante com DRGs para a segunda placa de petri preenchida com aCSF frio. Identificar a L4 e L5 DRGs com base na sua posição relativa a processos transversais e do nervo ciático.
Nota: Manter o nervo ciático intacta ajudará a identificar L4 e L5 DRG (o nervo ciático tem origem nos nervos espinhais L4-6). - Use uma pinça Dumont e as tesouras Noyes para libertar os DRGs dos tecidos conjuntivos circundantes. Mantenha a raiz do nervo e nervo espinhal associadas a DRGs.
- Utilizar a pipeta de transferência para mover as DRGs para a terceira placa de Petri para posterior dissecação.
- Sob o microscópio de dissecação, cuidadosamente remover tanto quanto possível do th circundante epinervoe DRG.
- Use a mola tesoura Noyes para cortar uma abertura onde dorsal e ventral raízes se juntar ao DRG e separar a raiz ventral do DRG. Use Dumont # 5 pinça com pontas sem corte para manter o epineuro, e usar outra pinça fina para rolar a DRG do epineuro.
- Continuar para remover o máximo possível de epineuro ligado a DRGs usando o fórceps finos.
Nota: Uma DRG bem dissecado é importante para se obter uma boa digestão no passo seguinte.
3. DRG Digestão
- Transferir o DRG para a câmara de registo. Verifique se o lado de DRG, onde as raízes nervosas originam rostos para baixo.
Nota: Neste modo, a maioria dos neurónios são acessíveis. - Use uma âncora para estabilizar o DRG. Perfundir DRG com aCSF oxigenado a uma taxa de 0,5 ml / min através de tubos de plástico que está ligado com uma bomba peristáltica, que é colocado sobre uma mesa ao lado do equipamento de gravação.
- Esperar durante 30 min para permitir que as células para recuperar. Avaliar a qualidade do DRG sob contraste de interface diferencial de infravermelhos (IR-DIC) na óptica de ampliação 40X objectivo através de uma câmara CCD.
Nota: Os bons DRGs geralmente contém muitos redondo, bem contrastada, neurônios cercadas por células gliais satélite em sua superfície. - Digerir uma pequena área da superfície do DRG.
Nota: As pipetas de patch vidro são colocadas em suportes de pipetas, que são pequenas acoplamentos que permitem que os tubos a serem ligados para a pipeta de vidro com uma vedação hermética.- Individualmente conectar duas seringas de 1 ml para os suportes de pipetas através de dois pedaços de tubos de borracha pequeno diâmetro. Coloque uma pipeta de vidro preenchidos com colagenase em um dos suportes de pipetas e uma pipeta de vidro vazio para o outro.
- Use o micromanipulador para posicionar as pipetas logo acima do DRG. Então, sob a ampliação do microscópio, colidem as pontas das duas pipetas contra o outro suavemente para ampliar as aberturas das pontas de pipeta (Idealmente um diâmetro de 5-10 uM).
- Mover a pipeta cheia com enzima perto da superfície de DRG e brevemente aplicar pressão positiva para a pipeta contendo colagenase através do tubo de ligação e o suporte da seringa deslocando-se o êmbolo cerca de 0,5 ml.
Nota: Sob pressão, o fluxo da enzima a partir da pipeta irá aumentar ligeiramente o espaço entre os neurónios DRG, que podem servir como sinal para a aplicação da enzima. - Depois de 10 a 15 min, quando se observa os restos do epineuro restante, aplique pressão negativa suave para a pipeta vazio para sugar os detritos.
Nota: Neste modo, os neurónios e células gliais circundantes satélite serão claramente expostos e prontos para a gravação de remendo. - Descartar as duas pipetas para o recipiente apropriado.
4. Recordings Grampo patch
- Coloque a solução de eléctrodo (ver Tabela 3) em gelo para evitar a degradação. Encha a pipeta patch de vidro comintracelular solução filtrada (filtro de seringa, tamanho de poro: 0,2 um) e colocar a pipeta no suporte da pipeta headstage. Aplicar uma pressão positiva suave para a pipeta através de uma seringa de 5 ml, deslocando o êmbolo cerca de 1 ml antes de abaixar a pipeta na solução do banho.
Nota: Isto impede a pipeta de se tornar bloqueado. - Escolha o modo "V-clamp" girando o botão de modo no amplificador, em seguida, abra "Membrane teste" interface no software. Mover a pipeta perto do neurônio alvo sob inspeção microscópio.
Nota: Na preparação DRG intactos, uma fina camada de células da glia por satélite encapsula cada neurónio. - Use pressão positiva da pipeta para atravessar a camada de células da glia de satélite até que um alargamento súbita do espaço entre o neurónio e a camada circundante de células gliais de satélite é observado. Mantenha-se movendo a pipeta para o neurônio até que uma "covinha" é observado no neurônio.
Nota: Em comparação comgravações de neurônios dissociados, a pressão positiva precisa ser um pouco maior, o que ajudará a penetrar a camada de células glial por satélite e aumentar as chances de patching bem sucedido. - Reduzir a pressão positiva. Em seguida, conseguir um selo giga ohm com sucção suave.
Nota: Com este método, a taxa de sucesso de gravação é de pelo menos 70%. - Obter a configuração de gravação de célula completa, tal como descrito anteriormente 19.
- Resumidamente, penetrar a membrana celular dos neurônios através de um pequeno, mas forte sucção. Alternativamente, use a função "zap" no amplificador enquanto a sucção é aplicada.
- Uma vez que um modo de célula inteira é estabelecida, compensar a capacitância de células inteiras e resistência série (RS) rodando os botões capacitivos e compensação de resistência no amplificador.
Nota: Rs é normalmente 5-20 mohms. - Abandonar a célula se Rs é inicialmente superior a 30 mohms; ou RS alterações por mais de 20% durante a gravação. tbmedir o potencial de repouso; abandonar uma célula se o potencial de repouso é mais do que -50 mV.
- Feche a janela de "teste de membrana". Escolha o modo "Eu-clamp normal" girando o botão de modo no amplificador.
- Clique em "protocolo aberto" no software, selecionar e carregar o protocolo para medir reobase. Clique em "Record" para iniciar a gravação. Medir a resistência de entrada e reobase para examinar a excitabilidade neuronal, por injecção de uma série graduada de correntes despolarizantes em passos de 100 Pa.
- Clique em "protocolo aberto" novamente e selecione o protocolo para medir limiar membrana. A 500 ms despolarizantes atual rampa (2.000 pA / s) será injetado para o neurônio.
- Use de aquisição de dados e software de análise (por exemplo Clampfit) para analisar os vestígios gravados de acordo com as instruções do fabricante. Usar o software para calcular a resistência de entrada (Rin) sobre a base do Relat estado estacionário IVionship durante as correntes hiperpolarizantes entregues. Mover o cursor para medir o valor para o limiar reobase e membrana.
Nota: A amplitude de corrente necessária para induzir o AP é definida como a reobase, e a tensão mais baixa para induzir AP é definido como limiar de membrana.
- Grave as correntes ligando induzido.
- Encha uma pipeta com os agonistas específicos.
Nota: No relatório atual, nós usamos 100 M glutamato e 100 M AITC para induzir as correntes mediadas pelos receptores de glutamato e receptores TRPA1, respectivamente. - Verifique a pipeta para se certificar de que não há bolhas de ar no interior. Coloque a pipeta no suporte da pipeta. Ligue o suporte da pipeta com um tubo ligado a um sistema de distribuição de drogas.
- Use o manipulador para mover a pipeta dentro de 50 uM do neurónio. Defina a pressão do sistema de distribuição de drogas a 1 psi e a duração de 1 segundo. Mudar o modo de gravação a braçadeira de tensão, e prenda a -70 mV. Resumidamente aplicar a pressão através do sistema de distribuição de drogas para gravar uma corrente induzida por drogas.
- Encha uma pipeta com os agonistas específicos.
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Representative Results
A Figura 1 mostra o processo de preparação de DRG intactos para gravação de remendo. A Figura 1A mostra a orientação e localização dos gânglios após laminectomia. Figura 1B mostra DRGs L3, L4 e L5, com as raízes nervosas associadas após a remoção da medula espinhal. Em seguida, L4 e 5 DRGs são cuidadosamente dissecado e libertado a partir das vértebras. Em seguida, o perineuro, uma membrana transparente em torno do DRG, é removido (seta amarela, a Figura 1D). A melhor posição para separar o perineuro é através do local onde o dorsal e raízes ventrais juntar-se no DRG, como indicado pela seta preta na Figura 1D. Depois de peeling da perineuro, a raiz ventral é removida e descartada, deixando as radículas dorsais , nervo espinal e DRG, como mostrado na Figura 1E. A digestão com colagenase remove o epineuro residual, expondo os neurônios e as células satélites tchapéu de cercá-los (Figura 1F).
Depois de completar a preparação de DRG, a excitabilidade de neurónio pequeno diâmetro DRG é examinado através da medição do limiar de reobase e membrana. Como mostrado na Figura 2A, o reobase é de 260 pA. A Figura 2B mostra o limiar de membrana medido com este método. Com o aumento da corrente, a membrana é continuamente despolarizada até um AP é evocado. Neste exemplo, o limite da membrana (o potencial a que o AP é evocado) é -11,9 mV. Por conseguinte, mediante a manutenção da relação entre os neurónios e células gliais de satélite, a nossa preparação é a mais perto a situação in vivo. Com base em nossos resultados, a reobase gravado a partir de pequenos neurônios do GRD é de cerca de 300 Pa, ea resistência de entrada é 451,3 ± 27,3 mohms. Ambos são mais elevados em comparação com aqueles medidos a partir neurônios dissociados (cerca de 150 Pa e 635 mohms), sugerindoque a dissociação aumento da excitabilidade dos neurônios DRG 11.
Com esta preparação, também mediram as correntes de entrada induzidas pelo glutamato e isotiocianato de alilo (AITC), que são agonistas de receptores de glutamato e do receptor transiente potencial canal membro catião A1 (TRPA1), respectivamente. A amplitude das correntes de entrada induzidas por estes ligandos vai reflectir o número de receptores distribuídos nos neurónios. A Figura 3A mostra uma corrente para dentro num pequeno diâmetro neurónio DRG induzida por uma aplicação de sopro 1 seg de glutamato (1 mM). O glutamato induzida uma corrente interna (198 Pa), que pode ser em grande parte bloqueada pela co-aplicação do APV antagonista do receptor de NMDA e o antagonista do receptor de AMPA / cainato CNQX (dados não apresentados), confirmando a corrente é mediada por receptores de glutamato no DRG neurônios. Estes dados estabelecido que existem receptores de glutamato funcionais nos neurônios DRG. a neuron ilustrada na Figura 3B mostrou correntes de entrada (260 Pa) induzidas por 1 seg aplicação sopro de isotiocianato de alilo (AITC, 100? M), um agonista TRPA1 seletiva. A corrente de influxo foi bloqueado pelo antagonista selectivo de TRPA1 10 uM 030031 HC (dados não mostrados), confirmando as correntes foi mediada por receptores de TRPA1 e estabelece a presença de receptores de TRPA1 em neurónios DRG.
Figura 1: Preparação de DRG intactos (A) Exposição da medula espinal após laminectomia e a segmentação de DRGs.. Setas da direita para a esquerda indicam L3-5 DRGs respectivamente. Barra de escala = 1 cm. (B) exposição de L3, L4, L5 e DRGs e as raízes dos nervos ligados após remoção da espinal medula. As setas indicam DRGs L3, L4, L5 e da direita para a esquerda. Barra de escala = 1 cm. (C) IntaDRGs ct com raízes nervosas anexadas depois de ser dissecado da medula espinhal. As setas indicam DRGs L4 e L5 da direita para a esquerda. Barra de escala = 1 cm. (D) DRG Intact com epineuro anexado. Neste quadro, o epineuro está intacta, e a seta amarela mostra o epineuro semi-transparente realizada por uma pinça Dumont. A seta preta indica a junção formada pela raiz dorsal e ventral da raiz, que serve como um bom ponto de partida para descolar do epineuro. Escala da barra = 1 mm. (E) O mesmo DRG com a raiz dorsal ligado após o perineuro e raiz ventral foram removidos. Escala da barra = 1 mm. Imagens de microscópio (F) infravermelhos de DRG seguintes digestão com colagenase. neurônios de pequeno e médio porte são visíveis. Uma célula glial satélite (seta amarela) é visível em torno de um neurônio (asterisco). A seta vermelha aponta para a pipeta. Barra de escala = 10 mm. (G) a configuração do equipamento de gravação. As setas pretas indicam thsuportes de pipetas e. A da esquerda contém a pipeta de drogas preenchido, e gravação de pipeta é à direita. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Medição da excitabilidade neuronal na actual braçadeira Modo (A) reobase foi medida por injecção de uma série de correntes para o neurónio de DRG (painel superior). A menor intensidade de corrente, o que pode induzir um potencial de acção, é definido como reobase, como indicado pela seta no painel inferior. O reobase para este neurónio é 300 Pa. (B). O limiar da membrana foi medida por injecção de uma corrente de rampa. O potencial, quando um potencial de acção é evocado, é definido como limiar de membrana, como marcado pela linha tracejada no painel superior.O limiar de membrana para este neurônio é -11,9 mV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: As correntes induzidas em ligando pequeno DRG Os neurónios correntes induzidas por aplicação de sopro de glutamato (1 mM) ou isotiocianato de alilo (agonista TRPA1, AITC, 100 uM) durante 1 seg.. Ambos os agonistas induzida para dentro correntes, sugerindo a presença dos receptores de glutamato e receptores TRPA1 em pequenos neurônios do GRD. Aplicação glutamato induziu uma corrente interna de 198 pA (A), e AITC induzida uma corrente interna de 260 pA (B). Os neurônios são presas a -70 mV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. </ P>
| 2 litros de 10x estoque baixo catiônica | |||
| Concentração final (mM) | Componente | MW | Peso (g) |
| 3 | KCl | 74,6 | |
| 11 | Glicose | 180,2 | |
| 123 | NaCl | 58,4 | |
| 1,25 | NaH 2 PO 4 * H2O | 138 | |
| 1 | MgCl2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| 2 | CaCl2 * 2H 2 O | 147 | |
tabela 1
| 1 litro de 10x estoque de bicarbonato | |||
| Concentração final (mM) | Componente | MW | Peso (g) |
| 26 | NaHCO3 | 84.01 | 21.84 |
mesa 2
| 100 ml de solução intracelular | |||
| Concentração (mM) | Componente | MW | g |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | KCl | 74.55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl2 * 6H 2 O | 203,3 | |
| Notas: Ajustar o pH para 7,4 com KOH e a osmolaridade de 260-280 mOsm com sacarose e água destilada. Adicionar MgATP 2 mM, Na 2 GTP 0,5 e filtro antes de uso imediato. | |||
tabela 3
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Discussion
Nós relatamos um método para preparar DRGs inteiros para estudos patch clamp. Há vários elementos-chave para a preparação de um espécime ideais. Em primeiro lugar, é importante para dissecar os DRGs com raízes dorsais anexados. Depois disso, o perineuro necessitam de ser cuidadosamente removidas, evitando danos para os neurónios. Finalmente, para expor os neurónios e as suas células gliais circundantes por satélite, que é necessário para digerir o tecido conjuntivo restante. DRGs intactas a partir de ratos adultos, preparados com o método aqui descrito vai manter uma boa viabilidade durante 6 a 8 horas e pode ser gravado de forma estável durante esse período. Eles podem ser usados para muitos estudos diferentes de DRGs incluindo gravações patch clamp em neurónios ou células gliais, por satélite ou respostas evocadas de neurónios de DRG.
Durante o procedimento de dissecção, é importante para dissecar rapidamente o DRG e mantê-lo a uma baixa temperatura (4 ° C) para retardar o metabolismo neuronal e, consequentemente, mantém a sua viabilidade. durante tele dissecação de DRGs, deve-se evitar o alongamento dorsal ou nervos espinhais inserindo os DRGs. Outro passo chave nesta preparação é a remoção do perineuro torno do DRG. Uma vez que o perineuro é difícil de penetrar, qualquer epinervo restante no DRG vai impedir que as pipetas remendo de alcançar os neurónios. Aplicação de colagenase é um passo importante para as preparações de sucesso. A colagenase digere o restante perineuro e limpar a superfície das células, ao mesmo tempo, ambos os quais são críticos para remendar bem sucedida. Para evitar a sobre-digestão do tecido, três factores precisa ser considerado. Em primeiro lugar, colagenase vem em várias formas diferentes; ver a Tabela de Materiais para a nossa recomendação, o atualmente utilizado é potente, mas suave, evitando assim o excesso de digestão. Em segundo lugar, a enzima deve ser entregue a uma pressão leve para evitar a dispersão da enzima além da área de gravação. Encontramos a pressão produzida a partir de aplicar 0,5 ml de umair fora de uma seringa de 1ml de é suficiente. Em terceiro lugar, o melhor intervalo de concentração para a colagenase é de 10-13 unidades / ml. Concentrações mais elevadas podem conduzir a sobre-digestão e degradação mais rápida do tecido, enquanto que as concentrações mais baixas envolve um tempo de digestão desnecessariamente longa. Na nossa experiência, numa concentração de 13 unidades / ml e um tempo de digestão de cerca de 15 min produz os melhores resultados. Depois de aplicar a enzima epineuro restante em torno do DRG deve tornar-se solta, e podem ser eliminadas com sucção suave. A colagenase é sensível para repetir ciclos de congelamento-descongelamento, por conseguinte, uma vez diluída a solução de enzima deverão ser divididas em alíquotas e usados dentro de 3 semanas.
Zhang e seus colegas foram os primeiros a descrever um método para a gravação de patch-clamp de DRGs intactas. Os ratos que eles usaram, no entanto, eram muito jovens (10-15 dias pós-parto) 20, que tem a vantagem de que os DRGs são mais fáceis de preparar, uma vez que eles têm um epi mais finoneurium e eles têm uma maior viabilidade. DRG de ratos recém-nascidos, no entanto, tem a desvantagem de que a expressão de proteínas e os canais de iões como o TRPV1 e NaV1.8 diferem dos de ratos adultos 21,22. Além disso, estudos farmacológicos e comportamentais são geralmente realizados em ratos adultos. Assim, o método de gravação descrito aqui permite fazer uma correlação entre electrofisiologia e comportamento em animais adultos. O uso de intacta gânglio da raiz dorsal como uma preparação para realizar gravações de patch clamp ex vivo aumentou recentemente 15-17,23,24, e alguns estudos têm utilizado em gravações in vivo 25. A maior parte gravações ex vivo expor os neurónios DRG por incubação de toda a DRG em cocktail de enzima para cerca de 30-60 min. Enquanto este método produz mais neurónios, que tem um risco de sobre-digestão dos neurónios nas camadas superficiais. O nosso método minimiza a possibilidade de sobre-digestão utilizando inspecção visual para controlar o extenda da digestão, um método também usado por Ma et ai para in vivo gravações 25.
Em comparação com os neurónios de DRG dissociados, uma das vantagens da preparação DRG intactos vem da preservação de ambos os neurónios e células gliais por satélite (Figura 1). Este não é o caso em preparações convencionais que utiliza neurónios DRG dissociados. Satélite células gliais forma uma barreira em torno neurónios DRG individuais, e a sua presença é essencial para a manutenção do ambiente fisiológico destes neurónios 13. Como observado nos resultados das propriedades eletrofisiológicas de neurônios preparados por este meio são diferentes dos obtidos por estudos utilizando células dissociadas.
Uma das mais interessantes direções futuras para esta preparação é investigar a interação entre neurônios do GRD e células gliais por satélite. Após a lesão do nervo, por exemplo, células gliais satélite foram mostrados to sofrer alterações de plástico, que estão estreitamente relacionadas com o comportamento de dor que se segue 13-15,26. A preservação de células gliais por satélite nos DRGs intactas, que nos permitirá determinar se os receptores do transmissor como o receptor de glutamato, ou receptores de ATP estão presentes em células gliais de satélite e como eles respondem às mudanças na atividade neuronal. Ao aplicar o patch células gliais por satélite e estimulando o neurónio simultaneamente, as células gliais satélite pode actuar como um sensor biológico e mostrar se há libertação do transmissor a partir dos neurónios nas proximidades. Além disso, a preparação DRG intacta mantém ambas as raízes nervosas eferentes e aferentes. Isto expande grandemente o âmbito experimental adicionando a possibilidade de estimulação dos axónios entrando ou saindo os neurónios com eléctrodo de sucção, o que seria uma melhor imitador de situação in vivo.
Existem algumas limitações para a preparação atual. A existência da barreira formada por Gli satélitecélulas al, torna mais difícil para os neurônios de patch e um deve estar ciente de que pode limitar a concentração de drogas que chegam aos neurônios. Portanto, para obter acesso ao neurónio na nossa preparação é importante para manter a pipeta sob pressão positiva para auxiliar a penetração satélite camada de células da glia. Outra limitação é que as raízes dorsais e nervos espinhais tem que ser cortada de modo a dissecar o DRG. Portanto, não é possível deixar o axónio totalmente intacta. No entanto, a presença do axónio restantes devem ser considerados, como os axónios periféricos ou centrais não podem fixar-se a mesma tensão que a soma, que pode causar erros de gravação ou potencial interferência quando fixador de tensão é conduzida. Além disso, a fim de obter uma boa exposição dos neurónios, a digestão com colagenase suave é necessário e embora isso possa ser controlada com experiência, é impossível para proteger completamente os neurónios contra a exposição à enzima de digestão. Comparado com d convencionalneurónios DRG issociated, no entanto, DRGs inteiras são mais rápidos de preparar (cerca de 30 min), pode ser usado em muitas aplicações e imita as condições in vivo.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
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