Abstract
Patch clamp studier från dorsalrotsganglier (DRG) nervceller har ökat vår förståelse av det perifera nervsystemet. För närvarande är majoriteten av inspelningar genomfördes på dissocierade DRG nervceller, vilket är en vanlig förberedelse för de flesta laboratorier. Neuronala egenskaper kan dock ändras genom axonal skada till följd av enzymsmältning som används för att förvärva dissocierade neuroner. Vidare kan dissocierade neuronpreparat är helt representativ för mikro DRG eftersom förlusten av kontakt med satellit gliaceller som omger de primära sensoriska neuroner är en oundviklig konsekvens av denna metod. För att övervinna begränsningarna i användning av konventionella dissocierade DRG nervceller för patch clamp inspelningar, i denna rapport beskriver vi en metod för att framställa intakta DRG och genomföra patch clamp inspelningar på enskilda primära sensoriska neuroner ex vivo. Detta tillvägagångssätt tillåter snabb och enkel framställning av intakta DRG, härma ivivo villkor genom att hålla DRG nervceller i samband med deras omgivande satellit gliaceller och basalmembranet. Dessutom undviker metoden axonal skada från manipulation och enzym matsmältningen som när dissociera DRG. Detta ex vivo preparat kan dessutom användas för att studera interaktionen mellan primära sensoriska neuroner och satellit gliaceller.
Introduction
Sensation är avgörande för en organisms överlevnad och välbefinnande. Överföringen av stimuli är beroende av de sensoriska vägar börjar på perifera ändelser av axoner från primära sensoriska neuroner. Primära sensoriska neuroner, med undantag av den mesencefal kärnan av trigeminal nerve, är belägna i den trigeminala ganglier och dorsala rotganglier (DRG). De fungerar som grindvakter för sensorisk information 1. Vid perikarial membranet, precis som på de centrala och perifera terminaler, DRG nervceller uttrycka receptorer och jonkanaler, såsom glutamatreceptorer, TNF-alfa-receptorer, Transient Receptor Potential ning kanal subfamily V medlem 1 (TRPV1), natriumkanaler, etc. 2 -7. Patch clamp inspelningar av perikarial membran tillåta förstå funktionella förändringar av många av dessa receptorer och kanaler i hela neuron.
Plåstret clamp inspelning tekniken är ett kraftfullt verktyg för studöende verksamhet kanaler eller receptorer och ett stort antal studier har gjorts genom att tillämpa denna teknik på DRG nervceller 8-10. I de flesta studier DRG avlägsnas genom att skära rygg rottrådar och spinal nerv nära ganglion. Efter malning, är ganglion placeras sedan i matsmältningsenzymer som resulterar i dissociation av DRG neuroner, som sedan kan spelas in omedelbart eller odlas i flera dagar före inspelningen. Tyvärr, dissociation av DRG nervceller innebär en nödvändig axotomy nära perikarya. När dissocieras och axotomiserade, DRG nervceller genomgår fenotypiska förändringar samt förändringar i membran retbarhet 11,12. Förlusten av kontakt mellan perikarya av enskilda nervceller och satellit gliaceller som normalt omger dem är sannolikt att bidra till dessa förändringar 13. Överhörningen mellan nervceller och satellit gliaceller är både nödvändigt i fysiologiska förhållanden och anpassning till pathological tillstånd såsom de som leder till svårbehandlad smärta 14,15. Det skulle vara svårt att studera interaktionen mellan nervceller och satellit gliaceller med hjälp av en dissocierad DRG preparat.
Intakta DRG, å andra sidan, ger närmare in vivo-betingelser. Under de senaste åren har vårt laboratorium, liksom vissa andra grupper, använt intakta DRG från vuxna råttor för att undersöka förändringar av primära sensoriska neuroner i olika tillstånd associerade med kronisk smärta 3-5,11,15-17. Även om de tekniker som används i dessa studier är något etablerat, en steg-för-steg-beskrivning har ännu inte publicerats. I föreliggande manuskript, beskriver vi ett bekvämt och snabbt sätt att förbereda intakta DRG och deras användning för patch clamp inspelningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Alla procedurer för underhåll och användning av försöksdjur överensstämde med bestämmelserna i UCSF utskott för djurförsök och genomfördes i enlighet med riktlinjerna för NIH regler för användning djur och omsorg (publikation 85-23, reviderad 1996 ). UCSF Institutional Animal Care and Use Committee godkände de protokoll som används i denna studie.
1. Framställning av instrument, lösningar och fat
- Förbered artificiell cerebrospinalvätska (aCSF).
- Bereda 500 ml av 10x låg katjon lösning och 500 ml av 10x bikarbonatlösning (se tabell 1 och 2 för lösningsberedning). Förvaras vid 4 ° C och användning inom en månad.
- Bered 600 ml av färsk aCSF genom att blanda 60 ml av 10x låg katjon lösning med 60 ml bikarbonatlösning, och sedan lägga till 480 ml avjoniserat vatten för att nå en slutlig volym av 600 ml. Bubbla aCSF med karbogen(5% O2 och 95% CO2) under minst 10 min före användning.
- Dra Patch pipett från kapillär glas.
- Placera tunnväggiga kapillär glas i en pipett avdragare för att förbereda inspelning pipetter.
Obs: I vårt labb är följande inställningsparametrarna för avdragare används för att uppnå den ideala pipetten form: värme (510), hastighet (32). Den idealiska pipett form för intakt DRG inspelning bör ha en gradvis smal avsmalning med en låg konvinkel, och detta kan bäst uppnås genom trial and error. - Se till att motståndet av pipetten är 3-5 Mohm när den är fylld med interna lösningar (se tabell 3 för lösningsberedning). Se Axon Guide för detaljerad metod för att mäta pipett motstånd 18.
- Placera tunnväggiga kapillär glas i en pipett avdragare för att förbereda inspelning pipetter.
- Lägg 1 mg av kollagenas till 400 | il aCSF, för att ge en slutlig koncentration av 13 enheter / ml. Fyll sedan varje glaspipett med cirka 20 pl kollagenas lösning. Lagrade fyllda pipetter i en -20 ° C frys och använda dem inom tre veckor.
- Förbereda 200 ml kallt aCSF (ca 4 ° C). Att kyla aCSF snabbt placera den i en bägare, täta med plastfolie och lägg i en -20 ° C frys under ca 20 min tills det börjar frysa. Placera bägaren i ett isbad och bubbla med karbogen under 10 minuter. Bubbla resterande 400 ml aCSF med karbogen vid RT.
- Medan aCSF svalnar, skär i slutet av en plast disponibel överföringspipett för att förstora öppningen till en diameter på 5 mm (detta kommer att användas för att överföra DRG). Samla följande kirurgiska instrument: skalpell (# 15), Mayo raka och krökta sax, fin 2 mm spets rongeur, Adson (tandade) tång, iris sax, fjäder sax och två fin pincett. Häll syre kall aCSF i tre glaspetriskålar (Ytterdiameter: 10 cm).
2. DRG Dissection
- Söva en råtta (200-220 g) med natrium pentobarbital (100 mg / kg, ip) och bekräfta att nivån av anestesi är tillräcklig genom att testa pedal reflex och ögonblinkreflex.
- Efter att ha kontrollerat att råttan sövd, raka ländregionen och incisionsfilm huden och subkutan vävnad längs mittlinjen. Lossa paraspinala musklerna från spinalutskotten på L1-S2 nivå med hjälp av en fin periosteal hiss.
- Använd böjd sax för att klippa ryggkotornas processer från L1 till S2. Använd raka Mayo sax för att göra tvärgående nedskärningar i den exponerade ryggraden vid ungefär L1 och S1 och ta bort denna del av ryggraden i klump och snabbt dränka den i kallt aCSF (framställd i steg 1,5) under 2-3 minuter. Efter avlägsnandet av ryggradens DRG, är eutanasi utförs genom bilaterala torakotomi medan råttan är fortfarande under djup pentobarbital anestesi.
- Spola bort blodet från den avlägsnade ryggraden och fäst vävnad och överför till en petriskål med kallt aCSF. Usyns en fin rongeur att ta bort lamellerna. Skär dura mater längs mittlinjen med microscissors att exponera ryggmärgen. Lyft försiktigt ryggmärgen och skär nervrötterna på deras ingångspunkt i ryggmärgen med hjälp av iris sax, sedan bort ryggmärgen.
- Överför återstående kotan med DRG till den andra petriskål fylld med kallt aCSF. Identifiera L4 och L5 DRG baserat på deras relativa position till tvär processer och ischiasnerven.
Notera: Att upprätthålla ischiasnerven intakt kommer att bidra till att identifiera L4 och L5 DRG (ischiasnerven härstammar från L4-6 spinal nerver). - Använd Dumont pincett och Noyes sax för att befria DRG från omgivande bindväv. Håll nervroten och spinal nerv bifogas DRG.
- Använd överföringspipetten att flytta DRG i den tredje petriskål för ytterligare dissektion.
- Enligt dissektion mikroskop, försiktigt bort så mycket som möjligt av epineurium omgivande the DRG.
- Använd Noyes våren sax för att klippa en öppning där dorsala och ventrala rötter ansluta DRG och separera den ventrala roten från DRG. Använd Dumont # 5 pincett med trubbiga tips för att hålla epineurium, och använda en annan fin pincett för att rulla DRG från epineurium.
- Fortsätt att ta bort så mycket som möjligt av epineurium fäst DRG med hjälp av fin pincett.
Notera: En väl dissekeras DRG är viktigt att erhålla en god matsmältning i nästa steg.
3. DRG Digestion
- Överför DRG till inspelningen kammaren. Se till att sidan av DRG där nervrötterna härrör ansikten ner.
Obs: På detta sätt, de flesta neuroner är åtkomliga. - Använd ett ankare för att stabilisera DRG. BEGJUTA DRG med syresatt aCSF med en hastighet av 0,5 ml / min genom plaströr i samband med en peristaltisk pump, som är placerad på ett bord bredvid inspelningen riggen.
- Vänta i 30 min för att tillåta cellerna att återhämta sig. Bedöma kvaliteten på DRG under infrarött differential gränssnitt kontrast (IR-DIC) optik vid 40X objektivförstoring genom en CCD-kamera.
Obs: Bra DRG innehåller vanligtvis många runda, väl kontrasterade, nervceller omgivna av satellit gliaceller på sin yta. - Smälta en liten area av ytan av DRG.
Notera: De glas patch pipetter är placerade i pipetthållare, som är små kopplingar som tillåter slangen att fästas glaspipett med en lufttät försegling.- Individuellt ansluta två 1 ml sprutor till pipetthållare genom två bitar av små gummi diameter rör. Sätt en glaspipett fylld med kollagenas i en av de pipetthållare och ett tomt glas pipett till den andra.
- Använd mikromanipulator att placera pipetterna precis ovanför DRG. Därefter, under förstoring mikroskop, kolliderar spetsarna på två pipetter mot varandra försiktigt för att förstora öppningarna av pipettspetsar (Helst en diameter av 5-10 | j, m).
- Flytta pipetten fylls med enzym nära ytan av DRG och kortfattat applicera positivt tryck på pipetten innehållande kollagenas genom röret som förbinder hållaren och injektionssprutan genom att förskjuta kolven ca 0,5 ml.
Notera: Under tryck, kommer flödet av enzymet från pipetten något förstora utrymmet mellan de DRG neuroner, som kan tjäna som tecken för enzym applikation. - Efter 10 till 15 min, när skräp av den återstående epineurium observeras, tillämpa mild undertryck till den tomma pipetten att suga bort skräpet.
Obs: På detta sätt kommer de neuroner och omgivande satellit gliaceller tydligt exponerad och redo för patch inspelning. - Kasta de två pipetter in i avfallsbehållare.
4. Patch Clamp Inspelningar
- Placera elektroden lösning (se tabell 3) på is för att förhindra nedbrytning. Fylla glaset fläckpipetten medfiltrerad intracellulära lösning (sprutfilter, porstorlek: 0,2 um) och placera pipetten i huvudsteg pipetten hållaren. Tillämpa en mild övertryck till pipetten genom en 5 ml spruta genom att förskjuta kolven ca 1 ml före sänkning av pipetten i badlösningen.
Obs: Detta förhindrar pipetten från att bli blockerad. - Välj "V-klämma" läge genom att vrida lägesratten på förstärkaren, öppna sedan "Membran test" gränssnitt i programvaran. Flytta pipetten nära målet neuron under mikroskop inspektion.
Obs! I den intakta DRG förberedelse, ett tunt lager av satellit gliaceller fattar varje neuron. - Använd positivt tryck från pipetten att korsa satellit gliaceller cellskiktet tills en plötslig utvidgning av utrymmet mellan neuron och omgivande skikt av satellit gliaceller observeras. Hålla flytta pipetten mot neuron tills en "grop" observeras på neuron.
Obs: Jämfört medinspelningar från disassocierade nervceller, behöver det positiva trycket att vara en något större, vilket kommer att bidra till att penetrera satellit gliaceller cellskiktet och öka chanserna för en lyckad lapp. - Reducera det positiva trycket. Därefter uppnå en giga ohm tätning med skonsam sugkraft.
Obs! Med den här metoden, är andelen framgångsrika inspelningen åtminstone 70%. - Skaffa helcells-inspelning konfiguration som beskrivits tidigare 19.
- Kortfattat, penetrera neuroncellmembranet via en kort men stark sugning. Alternativt kan du använda "zappa" -funktionen på förstärkaren medan sug appliceras.
- När väl en hel cell läge är etablerad, kompensera helcells-kapacitans och serieresistans (Rs) genom att vrida de kapacitans och motstånd kompensations rattar på förstärkaren.
Obs: Rs är normalt 5-20 Mohm. - Överge cellen om Rs är initialt högre än 30 MQ; eller RS ändras med mer än 20% under inspelningen. Ocksåmäta den vilande membranpotential; överge en cell om vilande membranpotentialen är mer än -50 mV.
- Stäng "Membrane test" fönstret. Välj "I-klämma normalt" läge genom att vrida lägesratten på förstärkaren.
- Klicka på "öppet protokoll" i programmet, välja och ladda protokoll för att mäta rheobase. Klicka på "record" för att starta inspelningen. Mät ingångsmotstånd och rheobase att undersöka neuronala retbarhet genom att injicera en graderad serie av depolariserande strömmar i steg om 100 pA.
- Klicka på "öppet protokoll" igen och välj protokoll för mätning av membran tröskel. En 500 ms depolariserande rampström (2000 Pa / s) kommer att injiceras till neuron.
- Använd datainsamling och analys (t.ex. Clampfit) för att analysera de inspelade spåren enligt tillverkarens anvisningar. Använda programvaran för att beräkna ingångsmotståndet (Rin) på grundval av steady-state IV relationship under hyperpolarisering strömmar levereras. Flytta markören för att mäta värdet för rheobase och membran tröskel.
Notera: Amplituden hos ström som krävs för att inducera AP definieras som rheobase, och den lägsta spänningen för att inducera AP definieras som membran tröskelvärde.
- Spela liganden inducerade strömmar.
- Fyll en pipett med de specifika agonister.
Obs! I den aktuella rapporten har vi använt 100 iM glutamat och 100 | iM AITC att inducera strömmar som förmedlas av glutamatreceptorer och TRPA1 receptorer respektive. - Kontrollera pipetten att se till att det inte finns några luftbubblor inuti. Placera pipetten i pipetten hållaren. Anslut pipetten hållaren med ett rör anslutet till en läkemedelsdispenseringssystem.
- Använda manipulatorn för att flytta pipetten inom 50 ^ m av neuron. Ställ läkemedelsdoseringssystemtrycket till en psi och varaktigheten till en sekund. Växla inspelningsläge till spänning klämma och klämma på -70 mV. tillämpas korthet trycket via läkemedelsdoseringssystem för att spela in en läkemedelsinducerad ström.
- Fyll en pipett med de specifika agonister.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar processen för framställning av intakt DRG för patch inspelning. Figur 1A visar exponeringen och placeringen av ganglierna efter laminektomi. Figure1B visar L3, L4 och L5 DRG med nervrötterna bifogade efter avlägsnande av ryggmärgen. Då L4 och 5 DRG noggrant dissekeras och befriade från kotorna. Därefter epineurium, ett transparent membran som omger DRG, avlägsnas (gul pil, figur 1D). Den bästa platsen för att separera den epineurium är genom den plats där den dorsala och ventrala rötter ansluta sig vid DRG, såsom indikeras av den svarta pilen i figur 1D. Efter avskalning av epineurium, den ventrala roten avlägsnas och kasseras, vilket lämnar de dorsala rottrådar , spinal nerv och DRG, såsom visas i figur 1E. Uppslutning med kollagenas avlägsnar rest epineurium, utsätta nervceller och satellitceller thatt omger dem (figur 1F).
Efter genomgången DRG beredning, retbarhet små DRG diameter neuron undersöktes genom att mäta rheobase och membran tröskel. Såsom visas i fig 2A, är den rheobase 260 pA. Figur 2B visar membranet tröskel uppmätt med denna metod. Med ökande ström membranet kontinuerligt depolariserade tills en AP framkallas. I detta exempel är membran tröskeln (potentialen vid vilken AP framkallas) är -11,9 mV. Därför genom att hålla förhållandet mellan nervceller och satellit gliaceller, är våra förberedelser närmare in vivo situation. Baserat på våra resultat är rheobase in från små DRG nervceller runt 300 Pa, och ingångsmotståndet är 451,3 ± 27,3 Mohm. Båda är högre jämfört med dem som uppmätts från dissocierade neuroner (cirka 150 Pa och 635 MQ), vilket tyder påatt dissociation ökade retbarhet av DRG nervceller 11.
Med detta preparat, mätte vi också aktiv strömmar inducerad av glutamat och allylisotiocyanat (AITC), som är agonister för glutamatreceptorer och Transient Receptor Potential ning kanalelementet A1 (TRPA1) respektive. Amplituden av aktiv strömmar som induceras av dessa ligander kommer att återspegla antalet receptorer fördelade i nervceller. Figur 3A visar en inåtgående ström i en liten DRG diameter neuron induceras av en 1 sek puff tillämpning av glutamat (1 mM). Glutamat inducerade en inåtgående ström (198 pA), som till stor del kan blockeras genom samtidig tillämpning av NMDA-receptorantagonisten APV och AMPA / kainat-receptorantagonisten CNQX (data ej visade), vilket bekräftar den aktuella förmedlas av glutamatreceptorer på DRG neuroner. Dessa data fastställt att det finns funktionella glutamatreceptorer på DRG-neuroner. NEuron visas i figur 3B visade aktiv strömmar (260 Pa) induceras av en sekund puff tillämpning av allylisotiocyanat (AITC, 100 M), en selektiv TRPA1 agonist. Den inåtgående ström blockerades genom selektiv TRPA1 antagonisten 10 iM HC 030.031 (data ej visade), vilket bekräftar strömmarna förmedlades genom TRPA1 receptorer och fastställer närvaron av TRPA1 receptorer på DRG-neuroner.
Figur 1: Framställning av intakta DRG (A) Exponering av ryggmärgen efter laminektomi och segmenteringen av DRG.. Pilar från höger till vänster visar L3-5 DRG respektive. Skalstreck = 1 cm. (B) Exponering av L3, L4 och L5 DRG och bifogade nervrötter efter avlägsnande av ryggmärgen. Pilar indikerar L3, L4 och L5 DRG från höger till vänster. Skalstreck = 1 cm. (C) Intact DRG med nervrötter kopplade efter att dissekeras från ryggmärgen. Pilar indikerar L4 och L5 DRG från höger till vänster. Skalstreck = 1 cm. (D) Intakt DRG med epineurium bifogas. På den här bilden är epineurium intakt, och den gula pilen visar den halvgenomskinliga epineurium innehas av en Dumont pincett. Den svarta pilen visar korsningen bildas av dorsala och ventrala roten, som fungerar som en bra utgångspunkt för att lossna epineurium. Skalstreck = 1 mm. (E) Samma DRG med dorsala fäst efter epineurium och ventrala roten, har avlägsnats. Skalstreck = 1 mm. (F) Infraröd mikroskopbilder av DRG följande digerering med kollagenas. Små och medelstora neuroner är synliga. En satellit gliacellsmarkörer (gul pil) syns kring en neuron (asterisk). Den röda pilen pekar på pipetten. Skalstreck = 10 | im. (G) konfiguration färdskrivaren. De svarta pilar indikerar the pipett hållare. Den vänstra håller läkemedlet fylld pipett och inspelning pipett är på höger sida. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Mätning av neuronala retbarhet i Tångläge (A) Rheobase mättes genom att injicera en serie strömmar in DRG neuron (övre panelen). Den lägsta strömintensitet, vilket kan inducera en verkningspotential, definieras som rheobase, såsom indikeras av pilen i nedre panelen. Den rheobase för denna neuron 300 pA. (B). Tröskelmembran mättes genom att injicera en rampström. Potentialen, när en aktionspotential framkallas, definieras som membran tröskel, som märkt med den streckade linjen i den övre panelen.Membrantröskelvärdet för denna neuron är -11,9 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Ligand inducerade strömmar i små DRG nervceller Strömmar som induceras av puff tillämpning av glutamat (1 mM) eller allylisotiocyanat (TRPA1 agonist, AITC, 100 ^ M) för en sekund.. Både agonister inducerad inåt strömmar, vilket antyder närvaron av glutamatreceptorer och TRPA1 receptorer på små DRG-neuroner. Glutamat ansökan inducerade en inre ström av 198 pA (A), och AITC inducerade en inre ström av 260 pA (B). Nervceller är fastklämda vid -70 mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ P>
| 2 liter 10x låg katjonisk lager | |||
| Slutlig koncentration (mM) | Komponent | MW | Vikt (g) |
| 3 | KCl | 74,6 | |
| 11 | Glukos | 180,2 | |
| 123 | NaCl | 58,4 | |
| 1,25 | NaH 2 PO 4 * H2O | 138 | |
| 1 | MgCl2 * 6 H2O | 203,3 | |
| 2 | CaCl2 * 2 H2O | 147 | |
bord 1
| 1 liter 10x bikarbonat lager | |||
| Slutlig koncentration (mM) | Komponent | MW | Vikt (g) |
| 26 | NaHCOs 3 | 84,01 | 21,84 |
tabell 2
| 100 ml av intracellulär lösning | |||
| Koncentration (mM) | Komponent | MW | g |
| 130 | KGluconate | 234,24 | |
| 10 | KCl | 74,55 | |
| 10 | HEPES | 238,3 | |
| 10 EGTA | |||
| 2 | MgCl2 * 6 H2O | 203,3 | |
| Anmärkningar: Justera pH till 7,4 med KOH, och osmolaritet till 260-280 mOsm med sackaros och destillerat vatten. Tillsätt 2 mM MgATP, 0,5 mM Na 2 GTP och filter innan omedelbar användning. | |||
tabell 3
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi rapporterar en metod för att förbereda hela DRG för patch clampundersökningar. Det finns flera viktiga faktorer för att förbereda en idealisk exemplar. För det första är det viktigt att dissekera de DRG med dorsala rötter kopplade. Efter det epineurium måste tas bort omsorgsfullt samtidigt som man undviker skada på nervceller. Slutligen, för att exponera de nervceller och deras omgivande satellit gliaceller, är det nödvändigt att smälta den återstående bindväv. Intakta DRG från vuxna råttor framställda med den metod som beskrivs här kommer att upprätthålla en god lönsamhet för 6-8 timmar och kan stabilt registreras under denna period. De kan användas för många olika studier av DRG inklusive patch clamp inspelningar på nervceller eller satellit gliaceller, eller evoked potential av DRG-neuroner.
Under dissektionen förfarande är det viktigt att snabbt dissekera DRG och hålla den vid en låg temperatur (4 ° C) för att bromsa den neuronala ämnesomsättningen och därmed bibehåller sin livsduglighet. under than dissektion av DRG, bör man undvika stretching rygg eller spinal nerver in DRG. En annan viktig steg i denna beredning är avlägsnandet av epineurium kring DRG. Eftersom epineurium är svårt att tränga igenom, kommer någon epineurium kvar på DRG förhindra patch pipetter från att nå nervceller. Tillämpning av kollagenas är ett viktigt steg för framgångsrika preparat. Kollagenas kommer smälta återstående epineurium och rengöra ytan på celler samtidigt, vilka båda är avgörande för en lyckad lapp. Att undvika överdigerering av vävnaden, behöver tre faktorer som skall beaktas. Först kommer kollagenas i flera olika former; se tabell av material för vår rekommendation, är den som för närvarande används potent men mild, för att undvika över matsmältningen. För det andra bör enzymet kan levereras i ett lätt tryck för att undvika dispergeringen av enzymet utöver inspelningsområdet. Vi har funnit det tryck som produceras från att tillämpa 0,5 ml av enir av en 1 ml spruta med är tillräcklig. För det tredje är det bästa koncentrationsintervallet för kollagenas från 10-13 enheter / ml. Högre koncentrationer kan leda till över-digestion och snabbare nedbrytning av vävnaden, medan lägre koncentrationer innebär en onödigt lång uppslutningstiden. I vår erfarenhet, en koncentration av 13 enheter / ml och en uppslutningstiden omkring 15 minuter ger de bästa resultaten. Efter applicering av enzymet återstående epineurium kring DRG bör lossna, och kan rensas bort med skonsam sugkraft. Kollagenas är känslig för upprepa frysning-upptiningscykler, därför, en gång utspädda enzymlösningen bör delas upp i alikvoter och användes inom 3 veckor.
Zhang och kollegor var först med att beskriva en metod för patch clamp inspelning från intakta DRG. Råttorna de använde, var dock mycket unga (10-15 dagar efter födseln) 20, som har den fördelen att de DRG är lättare att förbereda tanke på att de har en tunnare epineurium och de har en ökad viabilitet. DRG från neonatala råttor, men har nackdelen att uttrycket av proteiner och jonkanaler som TRPV1 och NaV1.8 skiljer sig från vuxna råttor 21,22. Dessutom är beteende- och farmakologiska studier vanligen i vuxna råttor. Således metoden för inspelning beskrivs här tillåter att en korrelation mellan elektrofysiologi och beteende hos vuxna djur. Användningen av intakta dorsalrotsganglier som en förberedelse för att genomföra patch clamp inspelningar ex vivo har ökat den senaste tiden 15-17,23,24, och vissa studier har använt in vivo inspelningar 25. De flesta av ex vivo inspelningar exponera DRG nervceller genom inkubation hela DRG i enzym cocktail för cirka 30-60 minuter. Även om denna metod producerar fler neuroner, har det en risk för överdigerering av neuronerna vid de ytliga skikten. Vår metod minimerar risken för över matsmältningen genom visuell inspektion för att övervaka extält matsmältningen, en metod som också används av Ma et al för in vivo inspelningar 25.
Jämfört med dissocierade DRG nervceller, kommer en av fördelarna med den intakta DRG beredning från bevarandet av både neuroner och satellit gliaceller (Figur 1). Detta är inte fallet i konventionella preparat som använder differentierade DRG nervceller. Satellite gliaceller bildar en barriär som omger individuella DRG nervceller och deras närvaro är nödvändig för att upprätthålla den fysiologiska miljön av dessa neuroner 13. Som nämnts i de resultat elektrofysiologiska egenskaperna hos neuroner som framställts på detta sätt skiljer sig från de som erhållits genom studier med dissocierade celler.
En av de mest intressanta framtida inriktningar för denna beredning är att undersöka överhörning mellan DRG nervceller och satellit gliaceller. Efter nervskada, till exempel, satellit gliaceller har visats to genomgå förändringar plast, som är nära relaterade till smärtbeteende som följer 13-15,26. Bevarandet av satellit gliaceller i intakta DRG, gör det möjligt för oss att avgöra om sändar receptorer såsom glutamatreceptorn, eller ATP-receptorer finns på satellit gliaceller och hur de reagerar på förändringar i nervaktivitet. Med lapp satellit gliaceller och stimulera neuron samtidigt, kan de satellit gliaceller fungera som en biologisk sensor och visar om det finns transmittorfrisättning från de närliggande neuroner. Dessutom intakt DRG förberedelse håller både afferenta och efferenta nervrötter. Detta utökar den experimentella räckvidd genom att lägga till möjligheten att stimulera axoner in eller ut nervceller med sug elektrod, vilket skulle vara en bättre härma in vivo situation.
Det finns vissa begränsningar för den aktuella preparatet. Förekomsten av barriären som bildas av satellit glial-celler, gör det svårare att patch neuroner och man bör vara medveten om att det kan begränsa koncentrationen av läkemedel som når nervceller. Därför, för att få tillträde till neuron i vår beredning är det viktigt att bibehålla pipetten under positivt tryck för att underlätta genomträngande satellit gliaceller skiktet. En annan begränsning är att de dorsala rötter och spinal nerver måste skäras för att dissekera ut DRG. Därför är det omöjligt att lämna axonet helt intakt. Dock bör förekomsten av den återstående axonet övervägas, eftersom de perifera eller centrala axoner inte kan spännas fast med samma spänning som soma, som kan orsaka potentiella inspelnings fel eller störningar när spänningsklämma genomförs. Också för att få bra exponering av nervceller, är skonsam matsmältning med kollagenas nödvändigt och även om detta kan styras med erfarenhet, är det omöjligt att helt skydda nervceller från exponering för smälta enzymet. Jämfört med konventionell dissociated DRG-neuroner, emellertid hela DRG är snabbare att framställa (omkring 30 min), kan användas i många tillämpningar och nära efterliknar in vivo-förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pentobarbital sodium | vortech Pharmaceuticals | ||
| syringe | BD | 309659 | 1 ml, 5 ml. |
| scalpel | BD | size: 15 | |
| Mayo straight scissor | Fine Science Tools | 14010-15 | |
| Mayo curved scissor | Fine Science Tools | 14011-15 | |
| Rongeur | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| Adson toothed forceps | Fine Science Tools | 11027-12 | |
| Iris Scissor | Fine Science Tools | 14084-08 | |
| Noyes spring scissor | Fine Science Tools | 15124-12 | |
| Bone scissors | Fine Science Tools | 16044-10 | Special for cutting the bones. |
| Forceps: Dumont, Dumoxel Biologie #5 | Fine Science Tools | 11252-30 | These have the fine tips that do not need sharpening when first purchased. |
| periosteal elevator | Sklar | 97-0530 | |
| Dissection microscope | WILD | ||
| Transfer pipette | Fisher brand | 13-711-5AM | |
| Petri dish (10 cm) | Pyrex | Glass petri dish can avoid damaging the tips of fine forceps | |
| Collagenase (Liberase TM) | Roche | 05-401-119-001 | dissolve at the concentration of 13 U/ml, aliquot into glass pipette. Avoid repeated freeze and thaw. |
| filter | Thermo scientific | 7232520 | Filter the internal solutions for patch clamp recording to avoid clog. |
| Glass pipette | Sutter | BF150-110-7.5 | |
| Anchor | Havard apparatus | 64-0250 | stabilize the DRG to avoid drift. |
| Peristaltic pump | WPI | ||
| Pipette puller | Sutter | P97 | |
| Amplifier | Molecular devices | Axopatch 200B | |
| Digitizer | Molecular devices | 1440D | |
| Microscope | NIKON | FN600 | |
| Micro-manipulator | Sutter | MPC200 | |
| microinjection dispense system | General Valve | Picrospitzer II | fast drug application system |
| Carbogen (95% O2, 5% CO2) | Local Medical Gas supplier |
References
- Basbaum, A. I., Bautista, D. M., Scherrer, G., Julius, D. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell. 139, 267-284 (2009).
- Caterina, M. J., et al. The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389, 816-824 (1997).
- Gong, K., Bhargava, A., Jasmin, L. GluN2B N-methyl-D-aspartate receptor and excitatory amino acid transporter 3 are upregulated in primary sensory neurons after 7 days of morphine administration in rats: implication for opiate-induced hyperalgesia. Pain. 157, 147-158 (2016).
- Gong, K., Kung, L. H., Magni, G., Bhargava, A., Jasmin, L. Increased response to glutamate in small diameter dorsal root ganglion neurons after sciatic nerve injury. PloS one. 9, 95491 (2014).
- Gong, K., Zou, X., Fuchs, P. N., Lin, Q. Minocycline inhibits neurogenic inflammation by blocking the effects of tumor necrosis factor-alpha. Clin Exp Pharmacol Physiol. , (2015).
- Ohtori, S., Takahashi, K., Moriya, H., Myers, R. R. TNF-alpha and TNF-alpha receptor type 1 upregulation in glia and neurons after peripheral nerve injury: studies in murine DRG and spinal cord. Spine. 29, 1082-1088 (2004).
- Waxman, S. G., Cummins, T. R., Dib-Hajj, S., Fjell, J., Black, J. A. Sodium channels, excitability of primary sensory neurons, and the molecular basis of pain. Muscle nerve. 22, 1177-1187 (1999).
- Zhang, J. M., Song, X. J., LaMotte, R. H. Enhanced excitability of sensory neurons in rats with cutaneous hyperalgesia produced by chronic compression of the dorsal root ganglion. J Neurophysiol. 82, 3359-3366 (1999).
- Dib-Hajj, S. D., et al. Plasticity of sodium channel expression in DRG neurons in the chronic constriction injury model of neuropathic pain. Pain. 83, 591-600 (1999).
- Cummins, T. R., et al. A novel persistent tetrodotoxin-resistant sodium current in SNS-null and wild-type small primary sensory neurons. J Neurosci. 19, RC43 (1999).
- Zheng, J. H., Walters, E. T., Song, X. J. Dissociation of dorsal root ganglion neurons induces hyperexcitability that is maintained by increased responsiveness to cAMP and cGMP. J Neurophysiol. 97, 15-25 (2007).
- Schoenen, J., Delree, P., Leprince, P., Moonen, G. Neurotransmitter phenotype plasticity in cultured dissociated adult rat dorsal root ganglia: an immunocytochemical study. J Neurosci Res. 22, 473-487 (1989).
- Hanani, M. Satellite glial cells: more than just 'rings around the neuron'. Neuron Glia Biol. 6, 1-2 (2010).
- Takeda, M., Nasu, M., Kanazawa, T., Shimazu, Y. Activation of GABA(B) receptors potentiates inward rectifying potassium currents in satellite glial cells from rat trigeminal ganglia: in vivo patch-clamp analysis. Neuroscience. 288, 51-58 (2015).
- Zhang, H., et al. Altered functional properties of satellite glial cells in compressed spinal ganglia. Glia. 57, 1588-1599 (2009).
- Fan, N., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Chronic compression of mouse dorsal root ganglion alters voltage-gated sodium and potassium currents in medium-sized dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 106, 3067-3072 (2011).
- Fan, N., Sikand, P., Donnelly, D. F., Ma, C., Lamotte, R. H. Increased Na+ and K+ currents in small mouse dorsal root ganglion neurons after ganglion compression. J Neurophysiol. 106, 211-218 (2011).
- The Axon Guide. Sherman-Gold, R. , Axon Instruments. Foster City, CA. (2008).
- Cummins, T. R., Rush, A. M., Estacion, M., Dib-Hajj, S. D., Waxman, S. G. Voltage-clamp and current-clamp recordings from mammalian DRG neurons. Nat Protoc. 4, 1103-1112 (2009).
- Zhang, J. M., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. Patch clamp recording from the intact dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 79, 97-103 (1998).
- Benn, S. C., Costigan, M., Tate, S., Fitzgerald, M., Woolf, C. J. Developmental expression of the TTX-resistant voltage-gated sodium channels Nav1.8 (SNS) and Nav1.9 (SNS2) in primary sensory neurons. J Neurosci. 21, 6077-6085 (2001).
- Funakoshi, K., et al. Differential development of TRPV1-expressing sensory nerves in peripheral organs. Cell Tissue Res. 323, 27-41 (2006).
- Hayar, A., Gu, C., Al-Chaer, E. D. An improved method for patch clamp recording and calcium imaging of neurons in the intact dorsal root ganglion in rats. J Neurosci Methods. 173, 74-82 (2008).
- Yagi, J., Sumino, R. Inhibition of a hyperpolarization-activated current by clonidine in rat dorsal root ganglion neurons. J Neurophysiol. 80, 1094-1104 (1998).
- Ma, C., Donnelly, D. F., LaMotte, R. H. In vivo visualization and functional characterization of primary somatic neurons. J Neurosci Methods. 191, 60-65 (2010).
- Vit, J. P., Jasmin, L., Bhargava, A., Ohara, P. T. Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2, 247-257 (2006).
