Summary
Dit protocol beschrijft de toepassing van gecombineerde nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) beeldvorming en micro-computertomografie (microCT) voor het visualiseren van cerebrale thromboemboli. Deze techniek maakt de kwantificering van trombus last en evolutie. De NIRF beeldvormende techniek visualiseert fluorescent gelabelde trombus in weggesneden hersenen, terwijl de microCT techniek visualiseert trombus in levende dieren met behulp van goud-nanodeeltjes.
Abstract
Direct trombus beeldvorming visualiseert de oorzaak van trombo-embolische infarct. In staat zijn om het trombus direct kunt veel beter onderzoek naar beroerte dan te vertrouwen op indirecte metingen, en zal een krachtige en robuuste vasculaire research tool zijn. We maken gebruik van een optische imaging aanpak die trombi met een moleculaire beeldvorming thrombus marker labels - Cy5.5 een nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) probe die covalent is gekoppeld aan het fibrine strengen van de trombus door fibrine verknopen enzymatische werking van geactiveerde stollingsfactor XIIIa tijdens het proces van rijping stolsel. Een micro-computertomografie (microCT) gebaseerde benadering gebruikt trombus die goud nanodeeltjes (AuNPs) gefunctionaliseerd het hoofdbestanddeel van het stolsel targeten: fibrine. Dit document beschrijft een gedetailleerd protocol voor de gecombineerde in vivo microCT en ex vivo NIRF beeldvorming van thromboemboli in een muismodel van embolische beroerte. We tonen aan dat in vivo </ em> microCT en fibrine gerichte glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) kan worden gebruikt voor het visualiseren van zowel in situ trombi en cerebrale embolie trombi. We beschrijven ook het gebruik van in vivo-microCT gebaseerde directe trombus beeldvorming serieel volgen de therapeutische effecten van weefsel plasminogeen-activator-gemedieerde trombolyse. Na de laatste opnamesessie tonen we de ex vivo NIRF beeldvorming van de omvang en van de resterende thromboemboli in de hersenen. Tot slot beschrijven we kwantitatief beeld analyses van microCT en NIRF beeldgegevens. De gecombineerde techniek van directe trombus beeldvorming kunnen twee onafhankelijke methoden trombus visualisatie te vergelijken: het gebied van trombus gerelateerde fluorescentiesignaal op ex vivo beeldvorming NIRF versus de hoeveelheid hyperdense microCT thrombi in vivo.
Introduction
Een op de 6 mensen een beroerte op een bepaald punt in hun leven hebben. Herseninfarct veruit de meest voorkomende soort beroerte, en goed voor ongeveer 80 procent van alle beroertes. Omdat thromboemboli veroorzaken de meeste van deze ischemische beroerte, is er een toenemende belangstelling voor directe trombus beeldvorming.
Er werd geschat dat ongeveer 2 miljoen hersencellen sterven tijdens elke minuut van de middelste cerebrale slagader occlusie 1, wat leidt tot de slogan "Time is Brain". Computertomografie (CT) studies kunnen snel worden gedaan, en zijn overal verkrijgbaar; Daarom CT blijft de beeldvorming van de keuze voor de eerste diagnose en behandeling van hyperacute ischemische beroerte. CT is bijzonder waardevol voor het informeren van de kritieke eerste beslissingen: toedienen tissue plasminogen activator (tPA) voor trombolyse en / of triaging endovasculaire stolsel retrieval-2. Huidige CT-gebaseerde trombus beeldvorming, echter niet serieel volgen cerebral thromboemboli in vivo, omdat het gebruik maakt van indirecte methoden om trombi te tonen: na vertroebeling van het bloed zwembad bij jodiumhoudend contrastmiddel, worden de trombi aangetoond dat het vullen van defecten in de vaten. Er zijn dosislimieten en de risico's verbonden aan de herhaalde toediening van jodiumhoudend contrastmiddel, dat weg staan herhaalde beeldvorming van trombi op deze manier.
Er is derhalve een kritische behoefte aan een directe beeldvorming methode voor cerebrale trombi in patiënten met een beroerte, zodat snellere en betere behandeling beslissingen worden genomen. Wij stellen dit bereiken door verhogen van de waarde van CT, de momenteel gebruikte front beeldvormende modaliteit voor een beroerte, met behulp van een trombus die nanodeeltjes molecular imaging agens.
We hebben het gebruik van deze agent aangetoond met behulp van micro-computertomografie (microCT), een hoge-resolutie ex vivo of in vivo (kleine dieren) beeldvorming versie van CT die snelle data-acquisitie <toestaatsup> 3,4. Zelfs met de relatief slechte wekedelencontrast beschikbaar voor kleine dieren microCT (veel slechter dan die beschikbaar zijn vanaf menselijk formaat scanners), de imaging-agent was in staat om te zoeken en te markeren trombi door ze hyperdense op CT, een 'dichte vat sign' verbeterd door moleculaire beeldvorming.
Als aanvulling op de CT-techniek, heeft onze fractie eerder een optisch directe trombus beeldvormende techniek met behulp van Cy5.5 nabij-infrarood fluorescerende (NIRF) sonde naar cerebrale trombus last 5 visualiseren ontwikkeld. Dit is een ex vivo techniek op de post mortem hersenen, maar is zeer gevoelig, en dient te bevestigen in vivo data in het onderzoek setting.
Met zowel CT en NIRF gebaseerde trombus die beeldvormingstechnieken kunnen wij vergelijken en deze technieken zeer informatieve gegevens over de rol van trombus en trombus beeldvorming in het proces van ischemische beroerte ontwikkeling.
Here beschrijven we een gedetailleerd protocol van een gecombineerde techniek van in vivo microCT en ex vivo NIRF imaging direct thromboemboli visualiseren in een muismodel van embolische beroerte. Deze eenvoudige en robuuste werkwijzen bruikbaar voor ons begrip van trombotische ziekten bevorderen doordat de juiste in vivo bepaling van thrombus belasting / distributie en karakterisatie van dynamische trombus evolutie op een snelle en kwantitatieve wijze in vivo tijdens de behandeling, gevolgd door ex vivo gegevens die dient als een controle en referentiestandaard voor de bevestiging van in vivo beeldvorming bevindingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures aangetoond in dit protocol zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Dongguk Universiteit Ilsan Ziekenhuis Animal Care en gebruik Comite goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met de beginselen en procedures in de NIH Guide geschetst voor de zorg en het gebruik van dieren.
1. Bereiding van exogeen Gevormd Clot Label met Fluorescentie Marker (figuur 1)
- Verdoven een muis in een inductie kamer middels 3% isofluraan gemengd met 30% zuurstof (1,5 l / min 100% zuurstof). Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie door het observeren van de spiertonus en bevestiging van de afwezigheid van de teen knijpen reflex.
- Leg het dier op een steriel laken in buikligging, en houdt het onder verdoving met behulp van een inhalatie masker en 2% isofluraan gemengd met 30% zuurstof. Voer de volgende procedures met behulp van aseptische technieken en steriele jassen / maskers / handschoenen / instrumenten. Handhaaf steriele omstandigheden door het reinigen en ontsmetten van de experimentele ruimte met 70% alcohol voor eennd na de procedures.
- Verzamel ongeveer 300 ~ 1.000 III arterieel bloed na cardiale punctie 6. Mix 70 pi volbloed met 30 pi C15 probe 5 (20 micromol / l concentratie), een Cy5.5 fluorescente probe gevoelig voor de fibrine verknopen activiteit van geactiveerde factor XIII (FXIIIa) coagulatie enzym, om fluorescent markeren het stolsel (Figuur 1A ). Injecteer de gemengd bloed met behulp van een 3 ml injectiespuit (23 gauge naald) in een 20 cm lang polyethyleen buis (PE-50, ID 0,58 mm). PE buis moet worden gesteriliseerd (of gecertificeerd steriel door de fabrikant) en stolsels moet aseptisch worden bereid in een weefselkweek kap.
- Controleer de dood van het dier door naar het ontbreken van ademhaling en hart hartslag.
- Laat het bloed beladen buis bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en vervolgens bij 4 ° C gedurende 22 uur en de volgende procedures uit, zoals eerder gemeld 7.
- Snijd de trombus bevattende buis in 1,5 cm lange stukken. Met een 3 ml injectiespuit gevuld met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), verdrijven trombus op een PBS-bevattende 6-well plaat door voorzichtig injecteren PBS in elk stuk buis. Was de trombi driemaal met PBS (Figuur 1B).
- Laad het distale eindgedeelte van een 15 cm lange PE-10 buis (ID 0,28 mm) met een 1,5 cm lange trombus door het gewassen thrombus voorzichtig tekening, met vermijding van luchtbellen, met een zoutoplossing gevulde 1 ml spuit met een 30 gauge naald die in het proximale uiteinde van de buis wordt ingebracht.
- Sluit de trombus geplaatst PE-10 buis met een 3 cm lange PE-50 buis (ID 0,58 mm) aangepast om een taps uiteinde (ID 200 micrometer) hebben, waarbij de middelste cerebrale slagader (MCA) worden geplaatst - anterior cerebrale slagader (ACA) splitsing gebied van de interne halsslagader (ICA) in een muismodel van embolische beroerte (figuur 1C).
2. Modelleren van een muis-model van trombo-embolische beroerte (figuur 2)
- Anesthetizea verschillende muis strelen zoals eerder gemeld 7 per inductie kamer middels 3% isofluraan gemengd met 30% zuurstof (1,5 l / min). Injecteren meloxicam (5 mg / kg) subcutaan voor het verlichten van postoperatieve pijn. Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie door het observeren van de spiertonus en bevestiging van de afwezigheid van de teen knijpen reflex.
- Breng een kleine hoeveelheid van de veterinaire zalf aan elk oog tot droog te voorkomen tijdens de anesthesie. Voer de volgende chirurgische procedures met behulp van aseptische technieken en steriele jassen / maskers / handschoenen / instrumenten. Handhaaf steriele omstandigheden door het reinigen en ontsmetten van de chirurgische alcohol met 70% voor, tijdens en na de operatie.
- Beweeg de muis om een operatietafel. Leg het dier op een steriel laken in buikligging, en houdt het onder verdoving met behulp van een inhalatie masker en 2% isofluraan. Vervolgens klem de lichaamstemperatuur bij 36,5 ° C met een homeothermische deken met feedback van een rectale thermometer.
- na Surgical prep met betadine en 70% alcohol, maak een 1 cm verticale insnijding door een scalpel op de hoofdhuid tussen het linkeroor en oog. Lijm het distale uiteinde van de optische vezel van een laser Doppler flowmeter op het blootliggende oppervlak linker slaapbeen (1 mm links en 4 mm onder de bregma). Start vervolgens Doppler flow controle (Figuur 2A).
- Leg het dier. Strek de nek door te trekken op de bovenste voortand met een koord bevestigd aan een pin en scheren de nek. Maak dan een 3 cm verticale middellijn incisie, verdeel het open en bloot de linker halsslagader bollenstreek door het ontleden van peri-vasculaire zachte weefsels. Wees voorzichtig met de nervus vagus niet te verwonden.
- Afbinden de linker proximale gemeenschappelijke halsslagader (CCA) met behulp van een steriele 6-0 zwarte zijden hechtdraad en ligeren de linker ICA en de linker pterygopalatine slagader (PPA) met behulp van steriele 7-0 zwarte zijden hechtingen.
- Cauterize de linker superieure schildklier slagader, een tak van de linker externe carotis using een monopolaire elektrische cautery, en ligeren de linker proximale externe halsslagader (ECA) losjes en de meer distale plaats stevig vast met behulp van steriele 7-0 zwarte zijden hechtingen.
- Met behulp van een micro-schaar, maak een klein gaatje (ongeveer 0,2 ~ 0,25 micrometer diameter) tussen de geligeerde sites van de Europese Rekenkamer.
- Plaats de trombus-bevattende katheter in het gat in de ECA los terwijl het proximale ECA ligatie. Draai de proximale ECA ligatie opnieuw na voortbewegen van de katheter in de CCA om de katheter cinchen plaats.
- Cauterize aan de Rekenkamer distale deel, dat is distaal van de distale ligatieplaats gesneden, en draai het vrije proximale Rekenkamer met de klok mee aan te passen aan de richting van de ICA tijdens het terugtrekken van de katheter uit de CCA. Dan, vooraf de katheter ongeveer 9 mm in het MCA - ACA splitsing gebied van de distale ICA direct na het losdraaien van de ICA ligatie. Draai dan de ICA ligatie.
- Plaats de trombus in de splitsing gebied door voorzichtigop de spuit 1 ml aan de trombus te injecteren. Controleer de afname van Doppler cerebrale bloedstroming (CBF), die moeten worden verlaagd met 30% of lager ten opzichte van basislijn, of de trombus succes afgesloten het vat (figuur 2B).
- Verwijder de katheter, en onmiddellijk en strak afbinden van de Rekenkamer proximale website. Daarnaast unligate de CCA en de PPA.
- Sluit de incisie site met behulp van 6-0 zijden hechtingen. Stop narcose na de voortzetting van de Doppler controle over een vereiste tijdspanne (hier, gedurende 30 minuten na trombus injectie). Zet de muis in een lege kooi, en houd het warm met een warmtelamp. Laat de muis onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn heeft verworven om borstligging handhaven.
3. In vivo MicroCT beeldvorming en cerebrale trombus (figuur 3)
- Opnieuw verdoven de muis met 2% isofluraan zoals beschreven in stap 2.1 op een vooraf bepaalde tijd-punt (hier 1 uur) na het beginvan embolische beroerte als gevolg van de plaatsing van trombus in de cerebrale slagader. Zorg voor voldoende diepte van de anesthesie door de bevestiging van de afwezigheid van de teen knijpen reflex. Breng een kleine hoeveelheid van de veterinaire zalf aan elk oog tot droog te voorkomen tijdens de anesthesie.
- Resuspendeer fibrine gerichte gouden nanodeeltjes (fib-GC-AuNP 4) bij een concentratie van 10 mg Au / ml in 10 mM PBS, en de ultrasone trillingen trombus afbeeldingsmiddel voor 30 minuten om het oplossen en dispergeren van de nanodeeltjes te waarborgen. Injecteer 300 ui fib-GC-AuNP (10 mg / ml) in de ader van de penis.
- Plaats het dier op het bed van een microCT machine en strek de hals door aan de bovenste voortand met een touwtje aan een puntig bewegingsartefacten te verminderen.
- Op 5 minuten na de injectie van fib-GC-AuNP, beginnen microCT beelden van de hersenen te verkrijgen. Voor de hier beschreven experimenten, gebruikt u de volgende imaging parameters: 65 kVp, 60 uA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 gezichtsveld, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 voxel grootte, 100 milliseconden per frame, 1 middeling, uitzicht van 360, 512 x 512 reconstructie matrix, 600 plakken, 64 sec scantijd.
- Zet de muis in een lege kooi, en houd het warm met een warmtelamp. Laat de muis onbeheerd totdat het voldoende bewustzijn heeft verworven om borstligging handhaven.
- Transformeer de ruwe beeldgegevens in Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) formaat met de opdracht van het paneel 'Wederopbouw' in een softwarepakket op de microCT scanner geïnstalleerd 'Start'.
- Voor kwantitatieve analyse van de beelden (stap 6), transformeren de DICOM gegevens in TIFF-formaat door een los verkrijgbare software pakket volgens de instructies van de fabrikant.
- Kwalitatieve analyses evenals kwantitatieve analyses in een eenvoudigere en snellere manier, gebruik van de software-pakket en de originele 0.054 mm dik beelden in DICOM formaat voor het genereren van een nieuwe setaxiale en coronale beelden rendered hebben 1 of 2 mm (hier 2 mm) dik, als volgt.
- Selecteer de map DICOM op het 'Data Source' boom, klikt u op de rechter muisknop, en importeer de map 'MasterDB' of 'PrivateDB'.
- Klik op de 'MasterDB' of 'PrivateDB' in het 'Data Source' boom, en selecteer de geïmporteerde map. Na het klikken op het tabblad '3D' op de meest linker paneel, wanneer het venster 'Laden Options' verschijnt, drukt u op 'OK' om een reeks foto's te importeren in de map als een stack.
- Wijzig de beeldweergave aan maximale intensiteit projectie (MIP) formaat door te klikken op het woord 'MRP' in de axiale en coronale beeld ramen en te kiezen voor 'MIP' in het pop-up menu. Dan verandert het beeld dikte tot 2 mm na het klikken op 'TH: 0 [mm]' in dezelfde ramen.
- Met behulp van de 2 mm breedte 3D navigator bar die het mogelijk maakt voor het verkennen van een beeld stack en het snijden van het op een geschikte hoek en de locatie, voor te bereiden beeld 2 mm dik axiale doorsnede met een volledige dekking van de cirkel van Willis (COW), die thrombi herbergt. Klik op de opnameknop (camerapictogram) op de 'Output' panel. Sla de afbeelding in TIFF-formaat.
- Vervolgens bereiden vijf 2 mm dik coronale sectie beelden die aansluitend dekken van de frontale kwab van de kleine hersenen.
- Ten eerste, de voorbereiding van de tweede slice door voorzichtig uitlijnen van de navigator bar op het axiale beeld, zodat de coronale afbeelding kan best visualiseren van de MCA - ACA trombi.
- Next, de voorbereiding van de andere vier plakjes in een aaneengesloten manier. Klik op de opnameknop (camerapictogram) op de 'Output' panel. Sla de afbeeldingen in TIFF-formaat.
4. trombolyse in vivo MicroCT beeldvorming en cerebrale trombus (figuur 3)
- Bereid een 100 cm lange PE-10 buis met een 30 gauge naald op een uiteinde en een 1 ml spuit op het andere uiteinde. De buis wordt met zoutoplossing (600 ul) of tPA (hier, 24 mg / kg, 600 ui) met vermijding van luchtbellen.
- Opnieuw verdoven de muis zoals beschreven in stap 2.1. Steek de naald in de ader penis van het dier. Plaats het dier voorzichtig op het bed van de machine microCT. Vervolgens immobiliseren en te stabiliseren intraveneus geïnjecteerd gedeelte van het kathetersysteem van taping het bed.
- Voer een follow-up imaging sessie als voorbehandeling baseline. Vervolgens Injecteer 60 pi hetzij fysiologische zoutoplossing of tPA door het indrukken van de zuiger in het kathetersysteem. Na de bolusinjectie, gaan de overblijvende oplossing (540 ul) gedurende een tijdsperiode (hier 30 minuten) trekken.
- Verkrijgen microCT beelden met dezelfde parameters als in stap 3.4 op vooraf vastgestelde tijdstippen: hier op 3 en 24 uur na de bolusinjectie. Om de volgende ex vivo NIRF Throm voerenbus beeldvorming van de hersenen, inslapen het dier onder verdoving door cervicale dislocatie.
5. Ex Vivo NIRF trombus Visualisatie trifenyltetrazoliumchloride (TTC) Kleuring van het hersenweefsel (figuur 4)
- Na onthoofding, verwijder de hoofdhuid en dwars door de schedel met een schaar van het foramen magnum omhoog naar de pijlnaad. Verwijder het schedeldak door voorzichtig verhogen van de randen van de ingesneden schedel met een schaar met vermijding van schade aan de onderliggende hersenen, waardoor bloot te leggen hemisferen.
- Knip de optische zenuwen in de hersenen voet zo dicht mogelijk bij de hersenen oppervlak vormen, omdat ze overlappen met de cirkel van Willis slagaders die worden gevisualiseerd op NIRF beeldvorming. Vervolgens, om duidelijk zichtbaar de Y-vorm 'MCA / ACA / distale ICA de NIRF trombus beeldvorming knip het distale ICA's zo ver mogelijk naar de hersenen oppervlak nadat zachtjes samenpersen van de cerebellaire base th bloote snijpunten (Figuur 4A).
- Voer NIRF beeldvorming (excitatie / emissie, 675/690 nm; 1 sec belichting) van de verwijderde hersenweefsel met zijn basis omhoog gericht (Figuur 4B, C), waarin de fluorescerend gelabelde thromboemboli visualiseert in de slagaders van de COW (figuur 4D) . Voer vervolgens aanvullende beeldvorming met de top van de hersenen die omhoog wijst, die corticale thromboemboli visualiseert. Vermijd drogen van de hersenen door een paar druppels zoutoplossing op het weefsel.
- Met behulp van een hersenen matrix volgens instructies van de fabrikant snel voorbereiden 2 mm dikke hersencoupes coronaalwaarts: 6 stukken van 2 mm dikke plakken (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm van bregma). Vermijd drogen van de hersenen plakjes met zoutoplossing druppels en uitvoeren NIRF beeldvorming van de voor- en achteroppervlak van de secties.
- Zet de hersenen plakjes in 2% trifenyltetrazoliumchloride (TTC) oplossing voor 20 min, terwijl voorkomen doordat licht. Beweeg dan de plakjes in 4% formaldehyde oplossing bij 4 ° C, terwijl het vermijden van blootstelling aan licht.
6. Kwantificering van Trombus omgeving Met behulp van MicroCT Beelden en ImageJ (1.49d) Software (Figuur 5)
- Open Beelden (figuur 5A).
- Open afbeelding reeks bestanden naar een stapel bestand aan te maken door te kiezen voor 'Bestand> Importeren> Afbeelding Sequence' of 'Bestand> Openen'. Omzetten van de beelden naar 8-bit grijstinten met behulp van 'Beeld> Type> 8-bit'.
- Omzetten van de Eenheid van Inch naar Millimeter (figuur 5A).
- Wanneer een pixel van CT beeldbestanden komt overeen met 0,053 mm, gebruiken 'Analyze> Stel Scale' te gaan '1', '0,053', en 'mm' voor 'Afstand in pixels', 'bekende afstand' en 'Eenheid van lengte ', respectievelijk.
- Wanneer () a schaalbalk beschikbaar is,met behulp van de 'Straight Line' gereedschap trek een lijn met een lengte die gelijk is aan die van de schaal bar. Gebruik vervolgens 'Analyze> Stel Scale' om de lengte van de schaal bar in millimeter in te voeren.
- Aftrekken achtergrond (figuur 5B)
- Door het gebruik van 'Edit> Selection> Geef' plaats een ronde of rechthoekige regio van belang (ROI) op een gebied van de hersenen parenchym zonder trombus of bot-gerelateerde hyperdense regio's. Omdat de gespecificeerde ROI geldt voor elk segment van de stapel, controleer of als het niet overlapt met hyperdense regio in elk segment.
- Kies 'Plugin> ROI> BG aftrekken van ROI' en vul 2.0 voor de 'Aantal stdev van de gemiddelde'.
- Segmentatie van Thromboemboli-gerelateerde hyperdense letsels (figuur 5C)
- Kies 'Beeld> Aanpassen> Threshold' en voer de waarden van de 'Lower Threshold Level 'en' Upper Threshold Level 'als 22 en 255, respectievelijk. Kies 'Over / Under' om pixels onder de onderste drempelwaarde in het blauw, thresholded pixels in grijstinten, en pixels boven de bovenste drempelwaarde in het groen weer te geven.
- Gebruik de 'Freehand Selection Tool' to ROI dat-thromboemboli gerelateerde hyperdense laesies omringen zonder inclusief benige gebieden trekken. Tijdens de tekening, houdt u op [Shift] of [alt] toe te voegen of verwijderen van een regio, respectievelijk.
Let op: Als hyperdense trombo-embolische laesies ver van botstructuren, in plaats van de 'Freehand Selection Tool', kan 'Wand Tool' veilig worden gebruikt zonder dat het veranderen van de 'tolerantie' niveau.
- Kwantificering van de gesegmenteerde laesies (figuur 5D)
- Gebruik 'Analyze> Set Metingen' te kiezen 'Area', 'Mean Gray Value' en 'Geïntegreerd Density (Ruimte X Mean)9 ;. Controleer de volgende opties: 'Beperk tot Threshold' en 'Display Label'. Gebruik 'Analyze> Meet' dat de kwantitatieve gegevens op te halen. Sla het resultaat als een ".xls" bestand.
- Sla het stack-bestand in TIFF-formaat. Daarnaast gebruiken 'Analyze> Extra> ROI manager' om de ROI te slaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseline microCT beelden, verkregen in vivo na toediening fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 ul) en 1 uur na embolische beroerte, duidelijk gevisualiseerd cerebrale trombus in de MCA - ACA bifurcatie deel van het distale inwendige halsslagader (figuur 6 ). Follow-up microCT imaging toonde geen verandering in de COW trombus met zoutoplossing behandeld. Echter, behandeling met tPA vertoonden een geleidelijke dissolutie van de trombus COW (blauwe pijlen in figuur 6). Deze bevinding toont aan dat microCT trombus beeldvorming therapeutische monitoring van trombolyse kan toestaan. Er is een uitstekende overeenstemming tussen in vivo CT dichtheid en ex vivo NIRF overblijvend thromboemboli bij 24 uur. Merk op dat hyperdense microCT gebieden als gevolg van endogene trombus-markering door de fibrine-targeting AuNPs mooi co-gelokaliseerd met NIRF signaal gebieden als gevolg van exogene thrombus-markering, die werd uitgevoerd voordat EMBOlic beroerte met gebruikmaking van een fluorescente probe Cy5.5 gevoelig voor de coagulatiefactor-XIIIa-gemedieerde fibrine verknopen activiteit in het proces van rijping van de voorgevormde stolsel (figuur 6). De gecombineerde techniek van directe trombus beeldvorming om de tPA-gemedieerde trombolytische effect aan te tonen weerspiegelt histologische beroerte uitkomst zoals gemeten door TTC kleuring. TTC kleuring toonde een duidelijke vermindering van de hoeveelheid ischemische hersenbeschadiging (witachtige gebieden in figuur 6) de dieren ontvangen tPA trombolyse.
Figuur 1:. Overzicht van de bereiding van fluorescent gelabelde bloedstolsel (A) Het mengen van vers volbloed met Cy5.5 nabije infrarood fluorescerende (NIRF) probe (C15) die covalent gekoppeld is aan de fibrine strengen van de trombus door fibrine -crosslinking enzymatische werking van geactiveerde Coaguning factor XIIIa tijdens het proces van rijping stolsel. De gemengde bloed wordt geïnjecteerd in een polyethyleen (PE) -50 buis en gedurende 24 uur tot stolselvorming en rijping mogelijk. (B) NIRF beeldvorming om de optische kenmerken van de trombus met C15 probe bevestigen. Let op de aanhoudende fluorescentie na elke wasbeurt trombus die de PE buis werd verwijderd. (C)-trombus geladen PE-10 buis met een PE-50 buis gemodificeerd om een taps uiteinde (200 pm diameter) van trombo-embolie in de middelste cerebrale arterie hebben - anterior cerebrale slagader bifurcatie gebied van de interne halsslagader bij muizen. Schaal bars. 2 mm Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Overzicht van het modelleren een muismodel van Thromboembolic herseninfarct. (A) Laser Doppler controle van cerebrale bloedstroming (CBF) voor en na occlusie van de middelste cerebrale slagader (MCA), waarbij het distale uiteinde van de optische vezel van de laser Doppler flowmeter vastgelijmd aan de linkerkant temporale botoppervlak (1 mm links en 4 mm onder de bregma). Let op de post-occlusie afname van Doppler CBF, die moet worden verlaagd met 30% of lager ten opzichte van baseline. (B) Insertie van de trombus bevattende katheter (dat wil zeggen, de distaal taps polyethyleen-50 buis in figuur 1C) in het gat van de externe halsslagader (ECA), gevolgd (eventueel) door het voortbewegen van de katheter ongeveer 9 mm in de MCA - cerebralis anterior (ACA) splitsing gebied van het distale interne halsslagader (ICA). CCA, gemeenschappelijke halsslagader; PPA, pterygopalatine slagader. Klik hier om te bekijkeneen grotere versie van deze figuur.
Figuur 3: Overzicht van in vivo-MicroCT gebaseerde Direct trombus Imaging behulp fibrine-gerichte gouden nanodeeltjes te visualiseren Cerebrale Thromboemboli monitor en weefselplasminogeenactivator (tPA) gemedieerde trombolytische effecten (A) Intraveneuze injectie van fibrine gerichte glycol chitosan goud nanodeeltjes. (FIB-GC-AuNPs) in een muis met trombo-embolische beroerte. (B) De muis wordt geplaatst op het bed van een microCT imager. (C) verwerven microCT afbeeldingen op 5 min na de injectie van fib-GC-AuNPs. (D) Beeldreconstructie om de ruwe beeldgegevens in Digital Imaging and Communications in Medicine transformeren (DICOM) formaat met behulp van een softwarepakket op de microCT scanner geïnstalleerd. (E) Beeldanalyse en voorbereiding axiale / coronal afbeeldingen gerenderd tot 2 mm dikte met behulp van de maximale intensiteit projectie-modus. (F) Intraveneus tPA-gemedieerde trombolyse, die kan worden gevolgd en geanalyseerd met behulp van de-microCT gebaseerde directe trombus beeldvorming methode. (C - E) Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Overzicht van Ex Vivo Near-Infrared Fluorescent (NIRF) beeldvorming en cerebrale Thromboemboli (A en B) als vertegenwoordiger hersenweefsel uit een muis met trombo-embolische beroerte.. Neem voorzorgsmaatregelen niet thromboemboli (rode pijl) te verliezen in het midden cerebrale slagader (MCA) - cerebralis anterior (ACA) splitsing gebied van het distale interne halsslagader (ICA,blauwe pijlen) bij het verwijderen van de hersenen. (C en D) Ex vivo NIRF trombus beeldvorming. Het hersenweefsel is geplaatst in het lichtdichte kamer van een NIRF imager (C) voor de visualisatie van de trombus (rode pijl in D) gelabelde met de Cy5,5 fluorescente merker C15 voor embolische occlusie van de MCA - ACA bifurcatie gebied. Vergelijk figuur 5 voor de CT uitstraling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Overzicht van kwantificeren Trombus Volume behulp MicroCT Beelden en ImageJ (1.49d) (A) Afbeeldingen importeren in een nieuwe stapel bestand, het omzetten van het bestandsformaat in de 8-bits grijstinten, en het veranderen van het toestel.mm. (B) Achtergrond aftrekken. (C) Verdeling de trombo-embolische lesies door trekken het gebied van belang (ROI) rond de hyperdense gebieden met uitsluiting van botstructuren. (D) verwerven van de kwantitatieve gegevens van de ROI via het menu 'Analyseren> Measure'. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6:. Representatieve Direct cerebrale trombus Imaging gegevens verkregen voor en na behandelen Gestreken Muizen met zoutoplossing versus weefselplasminogeenactivator (tPA) (A) microCT (MCT) trombus beeldvorming met therapeutische observatie van weefselplasminogeenactivator toestaan (tPA) gemedieerde trombolyse . (B en
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wij toonden de toepassing van twee complementaire moleculaire beeldvorming technieken voor directe trombus beeldvorming in experimentele modellen van embolische beroerte: een fibrine gerichte gouden nanodeeltjes (fib-GC-AuNP) in vivo-microCT gebaseerde beeldvorming, en een FXIIIa gerichte optische afbeeldingssonde ex vivo fluorescentie beeldvorming.
Na intraveneuze toediening van fib-GC-AuNPs werd trombi zichtbaar CT als dichte structuren, veroorzaakt door de deeltjes ingevangen raken in de trombi door de werking van de fibrine-gerichte peptiden (op het oppervlak van de deeltjes) na concentratie-gradient- afhankelijke diffusie in de poreuze structuur, dat wil zeggen, trombi. Dit proces bleek bij een bepaald richting en snel de oorzaak van de relatief lage concentraties van nanodeeltjes in het bloed worden geconcentreerd in de klonter en veranderen van de CT dichtheid voldoende om detectie mogelijk te maken. De finale in vivo microCT beeldvorming bij 24 hrmooi gecorreleerd met post-mortem NIRF beeldvorming van de ex vivo hersenen, waarbij post-tPA residuen van de eerste trombi die fluorescent waren gemerkt met de optische sonde herkennen van de fibrine verknopen activiteit van FXIIIa eerder in de cerebrale slagader wordt geplaatst. Op deze manier twee moleculaire beeldvorming sondes met verschillende werkingsmechanismen en verschillende beeldvormende modaliteiten, elk rapport en cross-controleren of de bevindingen van de andere.
De evolutie van trombi kan worden gevolgd met gebruik van dezelfde methode; Daarbij zouden trombolyse met tPA worden gevolgd in vivo, waardoor een snelle en tijdige uitlezing van het succes van trombolyse te voeren door CT. Dit heeft grote gevolgen voor klinische trombolyse en ook onderzoekstoepassingen voor de ontwikkeling van nieuwe anti-trombotische en trombolytische therapie.
Voorheen onze fractie kon een veel voorkomende complicatie bij beroerte therapie detecteren, de re-trombose 3 vaak voorkomende rond een gedeeltelijk behandeld stolsel, gevolgd door re-occlusie en verslechterende resultaten. Re-trombose werd gemodelleerd door het aanbrengen van 1 mm FeCl3 -soaked filter papers (graad 42) achtereenvolgens op 4 verschillende locaties (links distale CCA, links proximale CCA, rechts distale CCA, en vervolgens rechtsaf proximale CCA) op verschillende tijdstippen in dezelfde dieren . In alle gevallen circulerend fib-GC-AuNP aangetoond ophopen in de trombi en waardoor deze zichtbaar voor beeldvorming met CT. Deze duur van het effect lijkt te worden beperkt om de biologische halfwaardetijd van de fib-GC-AuNP, die momenteel bekend en waargenomen gedurende langere tijd (tot 3 weken) na de eerste injectie van fib- GC-AuNP. Dit is van groot belang klinisch, omdat een enkele dosis van nanodeeltjes middel dat effectief is voor het waarnemen van zowel het succes en falen van klinische behandelingen kunnen blijken. Verdere studies zijn nodig om de farmacokinetiek en biodistri beoordelendrage van FIB-GC-AuNP.
De chemische synthese van fib-GC-AuNPs is eerder beschreven 4. Kort samengevat, fibrine richtende peptiden (tyrosine-D-glutamine-cysteïne-hydroxyproline-L-3-chlorotyrosine-glycine-leucine-cysteïne-tyrosine-isoleucine-glutamine) die in de EP-2104R magnetic resonance imaging (MRI) middel 8 zijn gesynthetiseerd door standaard vaste fase Fmoc peptidechemie en geconjugeerd aan het oppervlak van GC-beklede AuNPs via 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide en N-hydroxysuccinimide. De eindproducten, gezuiverd fib-GC-AuNPs verzameld door centrifugeren.
De C15 NIRF probe voor de optische kenmerken van voorgevormde trombus is een 15-aminozuur peptide herkend door FXIIIa en gelabeld op de ε aminogroepen van lysineresiduen 9,10 met Cy5.5 fluorescerende kleurstof. De optische beeldvormende middel covalent gebonden aan het fibrine strengen van de trombus door de enzymatische werking van de handelingivated stollingsfactor, wanneer verknoopt fibrine strengen tijdens het proces van rijping stolsel 11,12. De chemische synthese van de C15 NIRF trombus marker is ook eerder beschreven 4. Kort samengevat, FXIIIa affiniteit peptiden (glycine-asparagine-alanine-glutamaat-glutamine-valine-serine-proline-leucine-threonine-leucine-leucine-lysine-tryptofaan) op basis van de N-terminus van alph-2-antiplasmine wordt gesynthetiseerd door vaste -fase peptidesynthese en vervolgens gelabeld met fluorochromen Cy5,5 via de cysteïne zijketen. Met behulp van high-performance vloeistofchromatografie, zuivert en de eindverbinding wordt verzameld.
Het succes van zowel de NIRF goud nanodeeltjes middelen waarschijnlijk vanwege de sterke biologische ontwerpkenmerken van deze middelen. FXIIIa 11 is een fundamenteel belang trombine geactiveerde tetramere transglutaminase, de coagulatie fibrinolytische enzym dat resistentie medieert. De activiteit van dezeenzym wordt beschouwd als een kenmerk van nieuw gevormde trombi. Zowel onze agenten interageren sterk met deze fundamentele bloedstolling enzym (door de FXIIIa-sensing C15 optische agent) of zijn substraat (door de fibrine-targeting fib-GC-AuNP CT agent).
Co-localisatie studies toonden aan dat er een goede overeenkomst tussen ex vivo fluorescentie (exogene trombus marker) en in vivo microCT dichtheid (endogene trombus marker) voor cerebrale trombi afgebeeld met de fibrine-bindende nanodeeltjes, die naar verwachting vanwege de onderling gerelateerde biologische beknelling mechanismen voor zowel de agenten.
Er zijn verschillende dingen te overwegen bij het gebruik van de dual-modale directe trombus beeldvormende techniek. Ten eerste, om te voorkomen fib-GC-AuNPs van aggregatie en biocompatibiliteit bereiken wordt glycol chitosan voor oppervlaktebekleding 13. Voordat intraveneuze injectie moet echter de trombus afbeeldingsmiddel worden resuspenDED in PBS en gesoniceerd om oplossing en dispersie van de nanodeeltjes te waarborgen. Bovendien kunnen nanodeeltjes stabiliteit worden bepaald door ultraviolet-zichtbaar (UV-Vis) absorptiespectroscopie met oppervlakte plasmon resonantie pieken verse vs. oude voorraden fib-GC-AuNPs, die beide moeten worden op ongeveer 519 nm te vergelijken.
Ten tweede kan de resolutie van microCT trombus beelden worden verbeterd door de scanparameters: zoals het verhogen van de "Scan Number 'van 600 tot 1200 schijfjes of verhogen van de" gemiddelde "van 1 tot 3, die echter toeneemt de benodigde tijd in beslag de scan.
Ten derde, bloed en C15 NIRF beeldvormend middel werden gemengd in de verhouding van 7: 3 5 voor de fluorescente labeling van trombus in deze studie. Volgens onze ervaring, kan een relatief lage bloedvolume trombusvorming belemmeren, terwijl een relatief hoge bloedvolume van de aantoonbaarheid van trombus kunnen verminderengevolg van de verzwakking van ex vivo fluorescerend signaal uitzenden van de trombus. Verder valt op dat een aantal verschillende benaderingen kunnen worden gebruikt voor fluorescentie visualisatie van verschillende componenten van een trombus 14.
Ten vierde, vergeleken met FeCl3 gemedieerde in situ trombose model waarbij het doel slagader slechts gedeeltelijk afgesloten, microCT visualisatie van cerebrale thromboemboli dat het vaartuig volledig te occluderen vereist relatief hoge doses fib-GC-AuNPs 4. Aldus kunnen er toxiciteit betreft, hoewel goudcolloïden worden geacht biocompatibel te zijn en fib-GC-AuNPs heeft merkbare systemische / neurologische toxiciteit vertonen in een eerdere studie 4.
Ten vijfde, klinische studies toonden aan dat bloedplaatjes-gerichte of fibrine gerichte gadolinium (Gd) -gebaseerde MRI-middelen zou de hyperintensiteit van de trombi in de hartkamers, halsslagaders te verhogen, en aortaboog T1-gewogen beelden 15. Hoewel MRI heeft een uitstekend zacht weefsel contrast en een hoge ruimtelijke resolutie MRI is een tijdrovende testen. CT lijdt relatief slechte weke delen contrast echter CT-scans kunnen snel worden uitgevoerd. Dienovereenkomstig CT blijft de meest gebruikte beeldvormingstechniek in de acute zorg voor beroerte 16. Bovendien hoeven microCT systemen voor de beeldvorming van kleine proefdieren vereisen geen architectonische bescherming tegen straling te worden geïnstalleerd, en bieden een hoge-resolutie beelden. Zo microCT gecombineerd met ex vivo reflectie fluorescentie beeldvorming of in vivo fluorescentie tomografie 17 is erg handig voor kleine dieren onderzoek. Alternatief MRI / CT dual-modale beeldvorming met behulp Au-nanodeeltjes Fe 18-20 kan ook een krachtig platform voor trombus beeldvorming in zowel dieren als mensen zijn; MRI en CT kunnen elkaar aanvullen en, in tegenstelling tot de optische beeldvorming, hebben ze geen last van de lage penetratie probleem.
content "> Tot slot, in combinatie CT en fluorescerende beeldvorming voor directe trombus visualisatie is een krachtige research tool voor het onderzoeken van ischemische beroerte, de belofte om de detectie van trombus, de controle van de behandeling, en de detectie van re-trombose complicerende therapie te verbeteren. Bovendien is er een significant potentieel voor klinische toepassingen van deze technieken.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, ch.A en KK zijn de octrooihouders van de fibrine-gerichte gouden nanodeeltjes (10-1474063-0000, Koreaanse Intellectual Property Office). De overige auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Korea Healthcare Technology R & D Project, ministerie van Volksgezondheid en Welzijn (HI12C1847, HI12C0066), de Bio & Medical Technology Development Program (2010-0019862) en het programma Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) van de National Research Foundation, gefinancierd door de Koreaanse regering.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
