Summary
Ce protocole décrit l'application de la tomographie combinée fluorescent proche infrarouge (NIRF) imagerie et micro-ordinateur (microCT) pour la visualisation de thromboembolie cérébrale. Cette technique permet la quantification de la charge de thrombus et d'évolution. La technique d'imagerie marqué par fluorescence NIRF visualise un thrombus dans le cerveau excisé, alors que la technique de thrombus à l'intérieur de la microCT visualise les animaux vivants en utilisant des nanoparticules d'or.
Abstract
imagerie de thrombus direct visualise la cause de l'infarctus thromboembolique. Être en mesure de l'image thrombus permet directement beaucoup mieux enquête d'accident vasculaire cérébral que de compter sur des mesures indirectes, et sera un outil de recherche vasculaire puissant et robuste. Nous utilisons une approche d'imagerie optique qui marque thrombus avec un marqueur d'imagerie de thrombus moléculaire - un Cy5.5 fluorescent dans le proche infrarouge (NIRF) sonde qui est liée de manière covalente aux brins de fibrine du thrombus par l'action enzymatique de réticulation de la fibrine activée Xllla du facteur de coagulation pendant le processus de maturation du caillot. Un micro-tomographie par ordinateur (microCT) approche à base utilise des nanoparticules d'or thrombus recherche (AuNPs) fonctionnalisés pour cibler le composant principal du caillot: fibrine. Ce document décrit un protocole détaillé pour la combinaison in vivo et ex vivo microCT NIRF imagerie de thromboembolie dans un modèle de souris d'AVC embolique. Nous montrons que in vivo </ em> microCT et AuNPs de fibrine ciblées glycol-chitosane (fib-GC-AuNPs) peut être utilisé pour la visualisation des thrombus in situ et cérébral embolique thrombus aussi bien dans. Nous décrivons également l'utilisation d' un thrombus in vivo directe imagerie basée microCT pour surveiller en série les effets thérapeutiques de l' activateur tissulaire du plasminogène médiée par thrombolyse. Après la dernière session d'imagerie, nous démontrons par ex vivo NIRF imagerie de la mesure et de la distribution des thrombo - embolies résiduelle dans le cerveau. Enfin, nous décrivons l'image quantitative analyse des données d'imagerie microCT et NIRF. La technique combinée de l' imagerie de thrombus directe permet deux méthodes indépendantes de thrombus visualisation pour être comparés: la zone du signal fluorescent lié thrombus ex vivo sur NIRF imagerie par rapport au volume de hyperdense microCT thrombus in vivo.
Introduction
Une personne sur 6 aura un coup à un moment donné dans leur vie. L'AVC ischémique est de loin le type d'AVC le plus commun, et représente environ 80 pour cent de tous les cas d'AVC. Parce que thromboemboli causent la majorité de ces accidents vasculaires cérébraux ischémiques, il y a un intérêt croissant pour l'imagerie de thrombus direct.
Il a été estimé que près de 2 millions de cellules du cerveau meurent pendant chaque minute de l' occlusion de l' artère cérébrale moyenne 1, ce qui conduit au slogan «Time is Brain". La tomodensitométrie (TDM) des études peut être fait rapidement, et sont largement disponibles; pour cette raison, CT reste l'imagerie de choix pour le diagnostic et le traitement de l'AVC ischémique suraigu initial. CT est particulièrement utile pour informer les premières décisions critiques: l' administration de l' activateur tissulaire du plasminogène (tPA) pour thrombolyse et / ou triage à endovasculaire caillot recherche 2. thrombus actuelle imagerie à base de CT, cependant, ne peut pas suivre en série cerebral thromboembolies in vivo, car il utilise des méthodes indirectes pour démontrer thrombus: après opacification du pool sanguin par contraste iodés, les thrombus ont démontré que des défauts de remplissage dans les récipients. Il y a des limites dose et les risques associés à l'administration répétée de contraste iodés, qui ne permettent pas répétées imagerie de thrombus de cette manière.
Ainsi, il y a un besoin critique d'une méthode d'imagerie directe pour thrombus cérébrale chez les patients victimes d'AVC, afin de permettre plus rapidement et de meilleures décisions de traitement à effectuer. Nous vous proposons d'accomplir ceci en augmentant la valeur de CT, la modalité d'imagerie de première ligne actuellement utilisée pour la course, avec l'utilisation d'un agent d'imagerie moléculaire nanoparticulaire thrombus-recherche.
Nous avons démontré que l'utilisation de cet agent à l' aide de micro-tomographie par ordinateur (microCT), une haute résolution ex vivo ou in vivo (petit animal) version d'imagerie CT qui permet l' acquisition rapide de données <sup> 3,4. Même avec la relativement faible contraste des tissus mous disponibles pour les petites microCT des animaux (bien pire que disponible à partir de scanners de taille humaine), l'agent d'imagerie a été en mesure de rechercher et de marquer des thrombus en les rendant hyperdense sur CT, un «signe de vaisseau dense» renforcée par moléculaire imagerie.
En complément de la technique CT, notre groupe a déjà mis au point une technique d'imagerie de thrombus directe optique utilisant Cy5.5 fluorescent proche infrarouge (NIRF) sonde pour visualiser la charge de thrombus cérébrale 5. Ceci est une technique ex vivo sur des cerveaux post mortem, mais est très sensible, et sert à confirmer des données in vivo dans le cadre de la recherche.
Ayant à la fois CT et NIRF basés techniques d'imagerie thrombus recherche nous permet de comparer et de ces techniques pour obtenir des données très instructives sur le rôle de thrombus et d'imagerie de thrombus dans le processus de développement d'accident vasculaire cérébral ischémique.
Havant, nous décrivons un protocole détaillé d'une technique combinée de microCT in vivo et ex vivo NIRF imagerie pour visualiser directement thromboembolies dans un modèle de souris d'AVC embolique. Ces méthodes simples et robustes sont utiles pour faire progresser notre compréhension des maladies thrombotiques , en permettant l'exactitude de l'évaluation in vivo des thrombus charge / distribution et la caractérisation de l' évolution de thrombus dynamique d'une manière rapide et quantitative in vivo au cours du traitement, suivi par ex vivo des données qui sert comme le contrôle et la norme de référence pour la confirmation des résultats d'imagerie in vivo.
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Protocol
Toutes les procédures animales démontrées dans ce protocole ont été examinés et approuvés par le Comité soin et l'utilisation Animal Hospital Ilsan Université Dongguk et conduite conformément aux principes et aux procédures décrites dans le Guide du NIH pour le soin et l'utilisation des animaux.
1. Préparation du Clot exogène Formé Marquées avec Fluorescence Marker (Figure 1)
- Anesthésier une souris dans une chambre d'induction en utilisant 3% d'isoflurane mélangé avec 30% d'oxygène (1,5 L / min à 100% d'oxygène). Veiller à une bonne profondeur de l'anesthésie en observant le tonus musculaire et confirmant l'absence du réflexe orteil de pincement.
- Placez l'animal sur un champ stérile en position couchée, et le maintenir sous anesthésie à l'aide d'un masque d'inhalation et 2% d'isoflurane mélangé avec 30% d'oxygène. Effectuez les procédures suivantes en utilisant des techniques aseptiques et robes / masques / gants / instruments stériles. Maintenir des conditions stériles par le nettoyage et la désinfection de la zone expérimentale avec 70% d'alcool avant unnd après les procédures.
- Prélever le sang environ 300 ~ 1000 pi artérielle après ponction cardiaque 6. Mélanger 70 ul de sang entier avec 30 ul C15 sonde 5 (20 pmol / de la concentration en L), une sonde Cy5.5 fluorescente sensible à l'activité de fibrine-réticulation du facteur XIII activé (FXIIIa) la coagulation enzymatique pour marquer par fluorescence du caillot (figure 1A ). Injecter le sang mélangé à l'aide d'une seringue de 3 ml (23 aiguille de calibre) dans un tube de polyethylene de 20 cm de long (PE-50, N ° 0,58 mm). PE tube doit être stérilisé (ou certifié stérile par le fabricant) ainsi que les caillots doit être préparé de manière aseptique dans une hotte de culture tissulaire.
- Vérifiez la mort de l'animal en observant l'absence de respiration et le pouls cardiaque.
- Laisser le tube de sang chargé à la température ambiante pendant 2 h, puis à 4 ° C pendant 22 heures, et exécuter les procédures suivantes, comme indiqué précédemment 7.
- Couper le tube contenant thrombus dans 1,5 cm de long morceaux. En utilisant une seringue de 3 ml remplie de sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), d'expulser thrombus sur une plaque à 6 puits contenant du PBS en injectant doucement PBS dans chaque morceau de tube. Laver les thrombus trois fois avec du PBS (figure 1B).
- Charger la partie d'extrémité distale d'un cm de long PE-10 tube 15 (DI 0,28 mm) avec 1,5 cm de long thrombus en tirant avec précaution thrombus lavés, tout en évitant les bulles d'air, en utilisant une seringue de 1 ml de sérum physiologique rempli d'un 30 une aiguille de calibre qui est inséré dans l'extrémité proximale du tube.
- Connecter le PE-10 tube de thrombus chargé d'une longueur de 3 cm PE-50 tube (ID 0,58 mm) modifié pour avoir une extrémité conique (ID 200 pm), qui sera placée sur l'artère cérébrale moyenne (MCA) - cérébrale antérieure zone artère (ACA) de la bifurcation de l'artère carotide interne (ACI) dans un modèle de souris d'AVC embolique (figure 1C).
2. La modélisation d'un modèle murin de l'AVC thromboembolique (Figure 2)
- Anesthetizea autre souris à caressa comme indiqué précédemment 7 dans une chambre d'induction en utilisant 3% d' isoflurane mélangé avec 30% d' oxygène (1,5 L / min). Injecter meloxicam (5 mg / kg) sous-cutanée pour soulager la douleur post-chirurgicale. Veiller à une bonne profondeur de l'anesthésie en observant le tonus musculaire et confirmant l'absence du réflexe orteil de pincement.
- Appliquez une petite quantité de pommade vétérinaire à chaque oeil pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie. Effectuez les procédures chirurgicales suivantes en utilisant des techniques aseptiques et robes / masques / gants / instruments stériles. Maintenir des conditions stériles de nettoyage et la désinfection de la zone chirurgicale avec 70% d'alcool avant, pendant et après la chirurgie.
- Déplacez la souris sur une table d'opération. Placez l'animal sur un champ stérile en position couchée, et le maintenir sous anesthésie à l'aide d'un masque d'inhalation et 2% d'isoflurane. Ensuite, fixer la température du corps à 36,5 ° C en utilisant une couverture homéothermique avec rétroaction d'un thermomètre rectal.
- Après Surgical préparation avec de la bétadine et de 70% d'alcool, faire une incision verticale de 1 cm en utilisant un scalpel sur le cuir chevelu entre l'oreille gauche et l'œil. Coller l'extrémité distale de la fibre optique d'un débitmètre à laser Doppler sur la surface exposée de l'os temporal gauche (1 mm à gauche et à 4 mm au-dessous du bregma). Ensuite, démarrez la surveillance du débit Doppler (Figure 2A).
- Couchez l'animal. Redresser le cou en tirant sur la dent avant supérieure avec une corde attachée à une broche et se raser la région du cou. Ensuite, faire une incision médiane verticale de 3 cm, l'étaler ouverte, et exposer la zone carotide gauche de l'ampoule en disséquant les tissus mous péri-vasculaires. Faites attention de ne pas blesser le nerf vague.
- Ligaturer proximale artère carotide commune gauche (CCA) en utilisant un stérile 6-0 noir suture de soie, et ligaturer l'ICA gauche et l'artère ptérygo gauche (PPA) en utilisant stériles 7-0 sutures de soie noire.
- Cauterize l'artère thyroïdienne supérieure gauche, qui est une branche de l'usi externe gauche de l'artère carotideng un cautère électrique monopolaire et ligaturer l'artère proximale gauche externe de la carotide (ECA) de façon lâche et le site plus distale en utilisant bien stériles 7-0 sutures de soie noire.
- L'utilisation d'un micro-ciseaux, faire un petit trou (environ 0,2 ~ 0,25 um de diamètre) entre les sites ligaturées de la CEA.
- Insérez le cathéter contenant thrombus dans le trou de la CEA tout en desserrant la ligature ECA proximale. Resserrer la ligature ECA proximale après l'avancement du cathéter dans le CCA afin de sangler le cathéter en place.
- Cautériser pour couper la partie distale de la CEA, qui est distale par rapport au site de ligature distale et proximale tourner le CEA libre dans le sens horaire pour l'aligner à la direction de l'ACI tout en retirant le cathéter de la CCA. Ensuite, faire avancer le cathéter d'environ 9 mm dans la MCA - zone de bifurcation ACA de l'ACI distale immédiatement après avoir desserré la ligature ICA. Ensuite, serrer la ligature ICA.
- Placer le thrombus dans la zone de bifurcation en douceuren appuyant sur la seringue de 1 ml pour injecter le thrombus. Vérifiez la diminution du Doppler débit sanguin cérébral (CBF), qui devrait être abaissée de 30% ou moins par rapport à la ligne de base, si le thrombus occlus avec succès le navire (figure 2B).
- Retirer le cathéter, et ligaturer le site proximal ECA immédiatement et fermement. En outre, unligate le CCA et la PPA.
- Fermez le site d'incision en utilisant 6-0 sutures de soie. Arrêtez l'anesthésie après la poursuite de la surveillance de Doppler sur un laps de temps requis (ici, pendant 30 minutes après l'injection de thrombus). Retour de la souris dans une cage vide, et le garder au chaud avec une lampe chauffante. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait acquis une conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale.
3. In Vivo microCT Imaging de Cerebral thrombus (Figure 3)
- Re-anesthésier la souris avec 2% d'isoflurane comme décrit dans l'étape 2.1 à un point de temps prédéfini (ici, 1 h) après le débutd'accident vasculaire cérébral embolique en raison de la mise en place de thrombus dans l'artère cérébrale. Veiller à une bonne profondeur de l'anesthésie en confirmant l'absence du réflexe orteil de pincement. Appliquez une petite quantité de pommade vétérinaire à chaque oeil pour prévenir la sécheresse pendant l'anesthésie.
- La remise en suspension des nanoparticules d'or fibrine ciblée (FIB-GC-4 AUNP) à une concentration de 10 mg Au / ml dans du PBS 10 mM, et soniquer l'agent d'imagerie de thrombus pendant 30 mn pour assurer la dissolution et la dispersion des nanoparticules. Injecter 300 ul fib-GC-AUNP (10 mg / ml) dans la veine du pénis.
- Placer l'animal sur le lit d'une machine à microCT et redresser le col en tirant sur la dent frontale supérieure avec une ficelle attachée à une broche pour réduire les artéfacts de mouvement.
- A 5 min après l'injection de fib-GC-AUNP, commencer à obtenir des images microCT du cerveau. Pour les expériences décrites ici, utilisez les paramètres d'imagerie suivants: 65 kVp, 60 uA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 champ de vision, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 taille de voxel, 100 millisecondes par image, 1 moyenne, vue à 360, 512 x 512 matrice de reconstruction, 600 tranches, 64 sec temps de balayage.
- Retour de la souris dans une cage vide, et le garder au chaud avec une lampe chauffante. Ne laissez pas la souris sans surveillance jusqu'à ce qu'il ait acquis une conscience suffisante pour maintenir décubitus sternale.
- Transformer les données d'image brutes en imagerie numérique et des communications en médecine (DICOM) format en utilisant la commande 'Start' du panneau 'Reconstruction' dans un paquet de logiciel installé sur le scanner microCT.
- Pour les analyses quantitatives des images (à l'étape 6), transformer les données DICOM en format TIFF en utilisant un logiciel disponible dans le commerce selon les instructions du fabricant.
- Pour les analyses qualitatives ainsi que des analyses quantitatives d'une manière plus simple et plus rapide, utiliser le logiciel et les originaux de 0.054 mm d'épaisseur des images au format DICOM pour générer un nouvel ensemble deles images axiales et coronales ont rendus à 1 ou 2 mm (ici 2 mm) d'épaisseur, comme suit.
- Sélectionnez le dossier de DICOM sur l' arbre 'Data Source', cliquez sur le bouton droit de la souris, et importer le dossier 'MasterDB' ou 'PrivateDB'.
- Cliquez sur le 'MasterDB' ou 'PrivateDB' dans l' arbre «Data Source», et sélectionnez le dossier importé. Après avoir cliqué sur l' onglet «3D» sur le panneau de gauche, lorsque la fenêtre "Options de chargement de apparaît, appuyez sur« OK »pour importer une séquence d'images dans le dossier comme une pile.
- Changer la représentation d'image à la projection d'intensité maximale (MIP) en cliquant sur le mot «MRP» dans le sens axial et les fenêtres d'image coronale et en choisissant 'MIP' dans le menu pop-up. Ensuite, modifier l'épaisseur d'image à 2 mm après avoir cliqué sur 'TH: 0 [mm]' dans les mêmes fenêtres.
- Utilisation de la 2 mm Largeur 3D nabar vigator qui permet d'explorer une pile d'images et de couper à un angle approprié et l'emplacement, préparer une image de section de 2 mm d'épaisseur axiale avec une couverture complète du cercle de Willis (GC), qui abrite des thrombus. Cliquez sur le bouton de capture (caméra icône) sur le panneau 'Sortie'. Enregistrez l'image au format TIFF.
- Ensuite, préparer cinq 2 mm d'épaisseur images de section coronale qui couvrent contigue du lobe frontal du cervelet.
- Tout d'abord, préparer la deuxième tranche en alignant soigneusement la barre de navigation sur l'image axiale, de sorte que l'image coronale peut mieux visualiser le MCA - thrombus ACA.
- Ensuite, préparer les quatre autres tranches d'une manière contiguë. Cliquez sur le bouton de capture (caméra icône) sur le panneau 'Sortie'. Enregistrez les images au format TIFF.
4. thrombolyse et In Vivo microCT Imaging de Cerebral thrombus (Figure 3)
- Préparer un 100 cm de long PE-10 tube avec une aiguille de calibre 30 sur une extrémité et une seringue de 1 ml à l'autre extrémité. Remplir le tube avec soit une solution saline (600 ul), ou de tPA (ici, 24 mg / kg, 600 ul) tout en évitant les bulles d'air.
- Re-anesthésier la souris comme décrit à l'étape 2.1. Insérez la pointe de l'aiguille dans la veine du pénis de l'animal. Placez soigneusement l'animal sur le lit de la machine microCT. Ensuite, immobiliser et de stabiliser la partie injectée par voie intraveineuse du système de cathéter en collant à la chambre.
- Effectuer une séance d'imagerie suivi comme pré-traitement de base. Ensuite, 60 ul d'injecter soit une solution saline normale ou de tPA en appuyant sur le piston de la seringue dans le système de cathéter. Après l'injection d'un bol, commencent à infuser la solution restante (540 ul) sur une période de temps (ici, 30 min).
- Obtenir des images microCT en utilisant les mêmes paramètres que dans l'étape 3.4 à points de temps prédéfinis: ici, à 3 et 24 heures après l'injection d'un bolus. Pour effectuer les opérations suivantes ex vivo NIRF Thromimagerie de bus du cerveau, euthanasier l'animal sous anesthésie par dislocation cervicale.
5. Ex Vivo NIRF thrombus Imaging et Chlorure de triphényl tétrazolium (TTC) Coloration du tissu cérébral (Figure 4)
- Après la décapitation, enlever le cuir chevelu et couper à travers le crâne avec des ciseaux du foramen magnum vers le haut vers la suture sagittale. Retirer la voûte crânienne en élevant soigneusement les bords du crâne incisée avec des ciseaux, tout en évitant des blessures au cerveau sous-jacente, ce qui met à nu les hémisphères.
- Découpez les nerfs optiques dans la base du cerveau aussi près que possible de la surface du cerveau, car ils pourraient se chevaucher avec le cercle des artères Willis qui doit être visualisé sur l'imagerie NIRF. Puis, afin de visualiser clairement la forme de Y 'MCA / ACA / ICA distal »pour l'imagerie NIRF de thrombus, découper la IMN distale aussi loin que possible de la surface du cerveau après la compression doucement la base du cervelet pour exposer thpoints de coupe e (figure 4A).
- Effectuer l' imagerie NIRF (excitation / émission 675/690 nm; 1 exposition à sec) du tissu cérébral enlevé avec sa base vers le haut (figure 4B, C), qui visualise l'thromboemboli marqué par fluorescence dans les artères de la GC (Figure 4D) . Puis, effectuer une imagerie supplémentaire au sommet du cerveau pointant vers le haut, ce qui permet de visualiser thromboembolies corticaux. Éviter le séchage du cerveau en plaçant quelques gouttes d'une solution saline sur le tissu.
- À l'aide d'un dispositif de matrice du cerveau, selon les instructions du fabricant, de préparer rapidement 2 mm d'épaisseur des tranches de cerveau coronale: 6 morceaux de 2 mm d'épaisseur des tranches (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm du bregma). Évitez de faire sécher des tranches de cerveau en utilisant des gouttes de solution saline, et effectuer des NIRF imagerie à la fois la surface avant et arrière des sections.
- Placer les tranches de cerveau dans du chlorure de triphényltétrazolium (TTC), solution à 2% pendant 20 min, tout en évitant l'exposition à light. Ensuite, déplacer les tranches dans une solution de formaldéhyde 4% à 4 ° C, tout en évitant l'exposition à la lumière.
6. Quantification des thrombus Area Utilisation microCT Images et ImageJ (1.49d) Software (Figure 5)
- Images Open (Figure 5A).
- Ouvrez les fichiers de séquence d'images pour créer un fichier de pile en choisissant «Fichier> Importer> Image séquentielle» ou «Fichier> Ouvrir '. Convertir les images à 8 bits en niveaux de gris en utilisant 'image> Type> 8-bit'.
- Convertir l'unité de pouce à Millimeter (figure 5A).
- Quand un pixel de fichiers d'image CT correspond à 0,053 mm, utiliser 'Analyse> Echelle Set' pour entrer '1', '0,053', et 'mm' pour 'Distance en pixels »,« distance connue »et« Unité de longueur ', respectivement.
- Lorsque (seulement) une barre d'échelle est disponible,en utilisant l'outil «ligne droite» tracer une ligne avec sa longueur égale à celle de la barre d'échelle. Ensuite, utilisez 'Analyse> Echelle Set' pour entrer dans la longueur de la barre d'échelle en millimètres.
- Soustraction du fond (figure 5B)
- En utilisant 'Edition> Sélection> Spécifiez «lieu d' une région circulaire ou rectangulaire d'intérêt (ROI) sur une zone du parenchyme cérébral sans thrombus ou régions hyperdense osseuses. Parce que le retour sur investissement spécifié applique à chaque tranche de la pile, vérifiez que si elle ne se chevauchent avec les régions hyperdense dans chaque tranche.
- Choisissez 'Plugin> ROI> BG soustraction ROI' et entrez 2.0 pour le 'Nombre de stdev de moyenne.
- Segmentation des lésions hyperdense thromboembolies liées (Figure 5C)
- Choisissez "Image> Réglages> Seuil ', et entrez les valeurs de' Lower Threshold Level »et« Threshold Level 'Upper comme 22 et 255, respectivement. Sélectionnez 'Over / Under »pour afficher les pixels en dessous de la valeur de seuil inférieure en bleu, pixels seuillées en niveaux de gris et pixels au- dessus de la valeur seuil supérieure en vert.
- Utilisez le 'Freehand outil de sélection »pour dessiner ROIs qui entourent les lésions hyperdense liées thromboembolies, sans y compris les zones osseuses. Pendant le dessin, continuez à appuyer sur [shift] ou [alt] pour ajouter ou supprimer une région, respectivement.
Remarque: Si des lésions thromboemboliques hyperdense sont éloignés des structures osseuses, au lieu de la «Freehand outil de sélection ',' outil Baguette 'peut être utilisé sans danger, sans changer son niveau« Tolérance ».
- Quantification des lésions segmentés (Figure 5D)
- Utilisez 'Analyse> Mesures Set »pour choisir« Zone »,« Mean Gris Value »et« Densité intégrée (Zone X moyenne)9 ;. Vérifiez les options suivantes: «Limiter à seuil» et «étiquette d'affichage». Utilisez 'Analyse> Mesure »pour obtenir les données quantifiées. Ensuite, enregistrez les résultats sous forme de fichier «.xls».
- Enregistrez le fichier de la pile au format TIFF. En outre, utiliser 'Analyse> Outils> Gestionnaire de retour sur investissement »pour sauver les ROIs.
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Representative Results
Images de référence microCT, obtenues in vivo après administration de fib-GC-AUNP (10 mg / ml, 300 pi) à 1 h après un AVC embolique, clairement visualisé thrombus cérébral dans le MCA - ACA zone de bifurcation de l'distale artère carotide interne (Figure 6 ). Suivi microCT imagerie n'a montré aucun changement dans le thrombus GC avec un traitement salin. Cependant, le traitement avec le tPA a montré une dissolution progressive du thrombus GC (têtes de flèches bleues sur la figure 6). Cette constatation démontre que microCT thrombus imagerie peut permettre le suivi thérapeutique de la thrombolyse. Il y a une excellente correspondance entre vivo densité CT et ex vivo NIRF pour thromboemboli résiduelle à 24 h. Notez que les zones de hyperdense microCT due à endogène thrombus marquage par les AuNPs de fibrine ciblant bien co-localisés avec des zones de signal NIRF due à exogène thrombus-marquage, qui a été effectuée avant embolic course à l'aide d' une sonde fluorescente sensible à Cy5.5 le facteur de coagulation XIIIa à médiation par l' activité de réticulation de la fibrine dans le processus de maturation du caillot préformé (figure 6). La technique combinée de l'imagerie de thrombus directe pour démontrer l'effet thrombolytique tPA médiée reflète histologique résultat de la course telle que mesurée par coloration TTC. TTC coloration a montré une nette diminution de la quantité de lésions cérébrales ischémiques (zones blanchâtres dans la figure 6) pour l'animal recevant tPA thrombolyse.
Figure 1:. Vue d'ensemble de la préparation des marquées par fluorescence caillot sanguin (a) le mélange du sang entier frais avec Cy5.5 fluorescent dans le proche infrarouge (NIRF) sonde (C15) qui est lié de manière covalente aux brins de fibrine du thrombus par la fibrine action enzymatique -crosslinking de coagu activélation XIIIa facteur au cours du processus de maturation du caillot. Le sang mélangé est injecté dans un polyéthylène (PE) -50 tube et laissé pendant 24 heures pour permettre la formation de caillots et de la maturation. (B) imagerie NIRF pour confirmer l'étiquetage optique du thrombus avec la sonde C15. Notez la fluorescence persistante après le lavage du thrombus qui a été retiré du tube PE. (C) thrombus chargé PE-10 tube avec un tube de PE-50 modifié pour avoir une extrémité effilée (200 um de diamètre) pour une thromboembolie dans l'artère cérébrale moyenne - cérébrale antérieure zone de la bifurcation de l' artère de l'artère carotide interne chez la souris. Barres d'échelle:. 2 mm S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Vue d' ensemble de la modélisation d' un modèle de souris de Thromboembolic infarctus cérébral. (A) suivi laser Doppler du débit sanguin cérébral (CBF) avant et après l' occlusion de l'artère cérébrale moyenne (MCA), l'extrémité distale de la fibre optique du débitmètre à laser Doppler collé à la surface temporale gauche de l' os (1 mm de gauche et de 4 mm au-dessous du bregma). Notez la diminution post-occlusion de Doppler CBF, qui devrait être abaissée de 30% ou moins par rapport à la ligne de base. (B) d' insertion du cathéter contenant un thrombus ( par exemple, la direction distale conique polyéthylène 50 tube dans la figure 1C) dans le trou dans la carotide externe artère (CEA), suivie (éventuellement) en faisant avancer le cathéter d' environ 9 mm dans le MCA - zone artère cérébrale antérieure (ACA) de bifurcation de l'artère carotide interne distale (ICA). CCA, artère carotide commune; PPA, artère ptérygo. S'il vous plaît cliquer ici pour voirune version plus grande de cette figure.
Figure 3: Vue d'ensemble de In vivo Direct thrombus Imaging à l' aide de fibrine ciblées nanoparticules d' or pour visualiser les Cerebral thromboembolies et Monitor activateur tissulaire du plasminogène (tPA) médiée Effets thrombolytiques à base microCT (A) d'injection intraveineuse de nanoparticules d'or de glycol-chitosane fibrine ciblée. (fib-GC-AuNPs) chez une souris ayant subi un AVC thromboembolique. (B) La souris est placée sur le lit d'un appareil d'imagerie microCT. (C) Acquisition d' images microCT à 5 min après l'injection de fib-GC-AuNPs. (D) La reconstruction d'image pour transformer les données d'image brutes en imagerie numérique et des communications en médecine (DICOM) format à l' aide d' un logiciel installé sur le scanner microCT. (E) l' analyse et la préparation des axial / c imageORONAL images rendues pour avoir une épaisseur de 2 mm en utilisant le mode de projection maximale de l'intensité. Thrombolyse (F) intraveineux tPA médiation, qui peut être surveillée et analysée en utilisant la méthode d'imagerie thrombus directe basée microCT. (C - E) S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Vue d'ensemble des ex vivo proche infrarouge Fluorescent (NIRF) imagerie cérébrale des thromboembolies (A et B) Un tissu cérébral représentant retiré d'une souris avec AVC thromboembolique.. Prenez des précautions pour ne pas perdre thromboembolies (flèche rouge) dans l'artère cérébrale moyenne (MCA) - antérieure zone artère cérébrale (ACA) de bifurcation de l'distale artère carotide interne (ICA,flèches bleues) lors de la suppression du cerveau. (C et D) thrombus ex vivo NIRF imagerie. Le tissu cérébral est placé à l' intérieur de la chambre étanche à la lumière d'un imageur NIRF (C) pour la visualisation du thrombus (flèche rouge D) pré-étiquetés avec le Cy5.5 fluorescent marqueur C15 avant occlusion embolique du MCA - ACA bifurcation région. Comparer à la figure 5 pour l'aspect CT. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Vue d'ensemble de Quantification thrombus Volume en utilisant microCT Images et ImageJ (1.49d) (A) Importation d' images dans un nouveau fichier de la pile, la conversion du format de fichier dans l'échelle de gris de 8 bits, et en changeant l'unité à.mm. (B) Contexte soustraction. (C) Segmentation des lésions thromboemboliques en dessinant la région d'intérêt (ROI) autour des zones de hyperdense tout en excluant les structures osseuses. (D) L' acquisition des données quantitatives pour le retour sur investissement en utilisant le menu 'Analyse> Mesure'. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6:. Représentant Direct Cerebral thrombus Imaging données acquises avant et après traitement des souris Stroked avec Saline vs Tissue Plasminogen Activator (tPA) (A) microCT (MCT) thrombus imagerie pour permettre le suivi thérapeutique de l' activateur tissulaire du plasminogène (tPA) thrombolyse médiée . (B et
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Discussion
Nous avons démontré l'utilisation de deux techniques d'imagerie moléculaire complémentaires pour l' imagerie de thrombus directe dans des modèles expérimentaux d'AVC embolique: une fibrine or nanoparticule (fib-GC-AUNP) ciblées pour l' imagerie in vivo sur la base microCT, et un FXIIIa ciblé sonde d'imagerie optique pour ex vivo imagerie de fluorescence.
Après administration intraveineuse de FIB-GC-AuNPs thrombus est devenu visible au scanner en tant que structures denses, causée par les particules deviennent piégées dans le thrombus par l'action des peptides de fibrine ciblage (sur la surface des particules) après concentration du gradient pour la diffusion dépendante dans la structure poreuse, c. -à- thrombus. Ce processus a semblé se produire dans une seule direction, et rapidement causé relativement faibles concentrations de nanoparticules dans le sang pour se concentrer dans le caillot, et en changeant la densité de CT suffisante pour permettre la détection. Le vivo microCT imagerie finale à 24 hbien corrélé avec post-mortem NIRF imagerie du cerveau ex vivo, montrant l' après-tPA residua du thrombus initial qui avait été marqué par fluorescence avec la sonde optique reconnaissant l'activité de fibrine réticulation de FXIIIa avant d' être placé dans l'artère cérébrale. De cette manière, deux sondes d'imagerie moléculaire, en utilisant différents mécanismes d'action et les différentes modalités d'imagerie, chaque rapport et contre-vérifier les résultats de l'autre.
L'évolution de thrombus peut être suivie en utilisant la même méthode; spécifiquement, la thérapie thrombolytique avec tPA pourrait être suivie in vivo, ce qui permet une lecture rapide et en temps opportun de la réussite de la thrombolyse à effectuer par CT. Cela a des implications profondes pour la thrombolyse clinique, et a également des applications de recherche pour le développement de nouvelles thérapies anti-thrombotiques ou thrombolytiques.
Auparavant, notre groupe a été en mesure de détecter une complication fréquente de la thérapie de la course, le re-thrombose 3 survenant souvent autour d' un caillot partiellement traitées, avec la suite ré-occlusion et les résultats d' aggravation. Re-thrombose a été modélisée en appliquant 1 mm FeCl 3 -soaked papiers filtres (grade 42) séquentiellement sur 4 endroits différents (distal CCA, gauche proximale gauche CCA, droite CCA distale, puis proximale droite CCA) à différents moments dans les mêmes animaux . Dans tous les cas, circulation fib-GC-AUNP ont démontré l'accumulation dans le thrombus, et de rendre ceux-ci visible à l'imagerie par CT. Cette durée de cet effet semble être limitée seulement à la demi-vie biologique de la FIB-GC-AUNP, qui est actuellement inconnue, et il a été observé pendant une période prolongée (jusqu'à 3 semaines) après l'injection initiale de fib- GC-AUNP. Ceci est d'un grand intérêt sur le plan clinique, car une seule dose d'agent de nanoparticules pourrait se révéler efficace pour observer à la fois le succès et les échecs des schémas thérapeutiques cliniques. D'autres études sont nécessaires pour évaluer la pharmacocinétique et la biodistribution de fib-GC-AUNP.
La synthèse chimique de fib-GC-AuNPs a été décrit précédemment en détail 4. En bref, les peptides de fibrine ciblage (tyrosine-D-glutamine-cystéine-hydroxyproline-L-3-chlorotyrosine-glycine-leucine-cystéine-tyrosine-isoleucine-glutamine) utilisé dans l'imagerie par résonance magnétique EP-2104R (IRM) , l' agent 8 sont Fmoc synthétisé par la chimie des peptides en phase solide standard, et conjugué à la surface de AuNPs GC revêtu à l'aide de 1-éthyl-3- (3-diméthylaminopropyl) carbodiimide et N-hydroxy-succinimide. Les produits finaux, purifiés fib-GC-AuNPs sont recueillies par centrifugation.
La sonde C15 NIRF pour le marquage optique d' un thrombus préformé est un peptide de 15 acides aminés reconnue par FXIIIa et marqué sur les groupes aminés de e résidus lysine 9,10 avec Cy5.5 colorant fluorescent. L'agent d'imagerie optique est liée de manière covalente aux brins de fibrine du thrombus par l'action enzymatique de la loiivated facteur de coagulation, quand il réticule les brins de fibrine au cours du processus de maturation 11,12 caillot. La synthèse chimique du marqueur de thrombus C15 NIRF a également été décrit en détail précédemment 4. En bref, les peptides FXIIIa d'affinité (glycine-asparagine-alanine-glutamate-glutamine-valine-sérine-proline-leucine-thréonine-leucine-leucine-lysine, tryptophane) sur la base de l'extrémité N-terminale de l'alph-2-antiplasmine sont synthétisés par des solides la synthèse peptidique -phase, puis marqué avec Cy5.5 fluorochromes par l'intermédiaire de la chaîne latérale de la cystéine. En utilisant la chromatographie liquide à haute performance, le produit est purifié et le composé final est recueilli.
Le succès des deux NIRF et agents de nanoparticules d'or est probable en raison des fortes caractéristiques de conception biologique de ces agents. 11 FXIIIa est fondamentalement important tétramère transglutaminase activée par la thrombine, l'enzyme de coagulation qui médie la résistance fibrinolytique. L'activité de cettel'enzyme est considérée comme une caractéristique de thrombus nouvellement formés. Nos deux agents interagissent fortement avec cette enzyme essentielle de la coagulation sanguine (par l'agent optique de détection FXIIIa C15) ou son substrat (par l'agent FIB-GC-AUNP CT fibrine ciblage).
Des études Co-localisation ont montré qu'il y avait une excellente correspondance entre ex vivo par fluorescence (marqueur de thrombus exogène) et in vivo microCT densité (marqueur de thrombus endogène) pour thrombus cérébral imagé avec la nanoparticule de liaison à la fibrine, qui est prévu, en raison de la mutuelle mécanismes de piégeage biologiques liés tant pour les agents.
Il y a plusieurs choses à prendre en compte lors de l'utilisation de la technique d'imagerie de thrombus dual-modal direct. Tout d' abord, pour empêcher fib-GC-AuNPs d'agrégation et d'atteindre biocompatibilité, le glycol chitosane est utilisé pour le revêtement de surface 13. Avant l'injection intraveineuse cependant, l'agent d'imagerie de thrombus doit être resuspended dans du PBS et soumis à une sonication pour assurer la dissolution et la dispersion des nanoparticules. En outre, la stabilité des nanoparticules peut être évaluée en utilisant la spectroscopie d'absorption ultraviolet-visible (UV-Vis) pour comparer les pics de vs frais vieux stocks de fib-GC-AuNPs, qui devraient tous deux être à environ 519 nm résonance plasmonique de surface.
D' autre part, la résolution de microCT images thrombus peut être améliorée en modifiant les paramètres de l' analyse: par exemple en augmentant le «numéro de balayage" de 600 à 1 200 tranches ou en augmentant la «moyenne» entre 1 et 3, ce qui cependant d' augmenter le temps nécessaire pour terminer le balayage.
En troisième lieu , le sang et C15 NIRF agent d'imagerie ont été mélangés dans un rapport de 7: 3 5 pour le marquage fluorescent d' un thrombus dans cette étude. Selon notre expérience, un volume sanguin relativement faible pourrait entraver la formation de thrombus, tandis qu'un volume relativement élevé de sang pourrait réduire la détectabilité de thrombusen raison de l'atténuation de l' ex vivo signal fluorescent émettant dans le thrombus. En outre, il faut noter que plusieurs approches différentes peuvent être utilisées pour la visualisation de fluorescence de différents composants d'un thrombus 14.
En quatrième lieu , par rapport au modèle de thrombose FeCl 3 médié in situ où l'artère cible est seulement partiellement obturée, microCT visualisation des thrombo - embolies cérébrales qui obture complètement le récipient exige relativement élevé de doses de FIB-GC-4 AuNPs. Ainsi, il pourrait y avoir des préoccupations toxicité, bien que colloïdes or sont considérés comme biocompatible et fib-GC-AuNPs n'a pas montré de toxicité systémique / neurocomportemental notable dans une étude précédente 4.
Cinquièmement, les essais cliniques ont montré que des plaquettes ciblées ou des agents d'IRM fibrine ciblée de gadolinium (Gd) à base pourrait augmenter le hyperintensité des thrombus dans les cavités cardiaques, les artères carotides, et l'arc aortique sur les images pondérées en T1 15. Bien que l'IRM a un excellent contraste des tissus mous et une haute résolution spatiale, l'IRM est un test de temps. CT souffre de relativement faible contraste des tissus mous, mais tomodensitogrammes peuvent être effectuées rapidement. En conséquence, CT reste la technique d'imagerie la plus largement utilisée dans la gestion aiguë de l' AVC 16. En outre, les systèmes de microCT pour imagerie du petit animal ne nécessitent pas de protection contre le rayonnement architectural doit être installé, et offrent des images haute résolution. Ainsi, microCT combiné avec ex vivo réflectance ou l' imagerie de fluorescence in vivo par fluorescence tomographie 17 est très utile pour la recherche des petits animaux. Alternativement, IRM / CT dual-modal imagerie utilisant Au-Fe nanoparticules 18-20 peut également être une plate - forme puissante pour l' imagerie de thrombus chez les animaux et les humains; IRM et CT pourraient se compléter mutuellement et, contrairement à l'imagerie optique, ils ne souffrent pas du problème de faible pénétration tissulaire.
content "> En conclusion, CT combiné et l'imagerie de fluorescence pour la visualisation de thrombus directe est un puissant outil de recherche pour l'étude de l'AVC ischémique, promettant d'améliorer la détection des thrombus, la surveillance de la thérapie, et la détection de re-thrombose compliquer la thérapie. en outre, il existe un risque important pour les applications cliniques de ces techniques.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A et KK sont les détenteurs de la nanoparticule d'or de fibrine ciblées brevets (10-1474063-0000, coréen de la propriété intellectuelle Office). Les auteurs restants ont rien à révéler.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la Corée Healthcare Technology R & D Project, Ministère de la Santé et des Affaires sociales (HI12C1847, HI12C0066), le Programme Bio & Medical Technology Development (2.010-0019862) et Laboratoire de recherche mondial (GRL) programme (NRF-2015K1A1A2028228) de la national Research Foundation, financée par le gouvernement coréen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
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