Summary
이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.
Abstract
다이렉트 이미징 혈전 색전증 경색의 근본 원인을 시각화한다. 이미지 혈전을 수있는 것은 직접 간접 측정에 의존보다 뇌졸중의 훨씬 더 조사를 허용하고, 강력하고 강력한 혈관 연구 도구가 될 것입니다. 우리는 분자 이미징 혈전 마커 혈전 라벨 광학 이미징 방법을 사용 - 공유 응고 성숙 과정에서 활성화 응고 인자의 XIIIa에 피브린 - 가교 효소 작용에 의해 혈전 섬유소 가닥에 연결된 Cy5.5 근적외선 형광 (NIRF) 프로브. 섬유소 : 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT) 기반의 접근 방식은 혈전의 주요 구성 요소를 대상으로 작용 혈전을 추구하는 금 나노 입자 (AuNPs)를 사용합니다. 본 논문은 생체 microCT 결합 및 색전 뇌졸중의 마우스 모델에서 thromboemboli의 생체 NIRF 이미징에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 생체 내에서 보여 </ EM>는 microCT 및 섬유소 타겟 글리콜 키토산 AuNPs은 (FIB는-GC-AuNPs)는 현장 혈전 및 색전 뇌 혈전에 모두 시각화에 사용할 수 있습니다. 또한 직렬 조직 플라스 미노 겐 활성제 매개 혈전 용해의 치료 효과를 모니터링하는 생체 microCT 기반 직접 혈전 영상의 사용을 설명한다. 마지막 이미징 세션 후, 우리는 생체 NIRF의 범위와 뇌의 잔류 thromboemboli의 분포를 영상화하여 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 양적 이미지가 microCT 및 NIRF 영상 데이터의 분석에 대해 설명합니다. 직접 혈전 영상의 결합 기술은 혈전 시각화의 두 개의 독립적 인 방법을 비교 할 수 있습니다 :에 혈전 관련 형광 신호의 영역 생체 NIRF 이미징 대 생체 내에서 한 고밀도의 microCT 혈전의 볼륨.
Introduction
육명에 하나는 자신의 일생에 어떤 시점에서 뇌졸중이있을 것이다. 허혈성 뇌졸중은 지금까지 가장 일반적인 뇌졸중의 종류에 따라, 그리고 모든 스트로크의 경우 약 80 %를 차지한다. thromboemboli이 허혈성 뇌졸중의 대부분의 원인이되기 때문에, 바로 촬상 혈전에 대한 관심이 높아지고있다.
그것은 약 2 백만 뇌 세포는 슬로건 "시간이 두뇌입니다"로 이어지는 중간 대뇌 동맥 폐쇄 1의 모든 분 동안 죽을 것으로 추정했다. 전산화 단층 촬영 (CT) 연구는 신속하게 수행하고 널리 사용할 수 있습니다 될 수있다; 이러한 이유로, CT는 초기 진단 및 초급 성 허혈성 뇌졸중의 치료를위한 선택의 영상 남아있다. 혈전 용해에 대한 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)을 관리 및 / 또는 혈관 내 혈전 검색 2 차적으로 분류 : CT는 중요한 초기 의사 결정을 알리는 데 특히 유용합니다. 현재 CT 기반 혈전 이미징, 그러나, 직렬 cerebra을 추적 할 수 없습니다생체 내에서 리터의 thromboemboli, 그것은 간접적 인 방법을 사용하기 때문에이 혈전을 설명합니다 : 요오드화 대비하여 혈액 풀의 혼탁 한 후, 혈전은 혈관의 결함을 충전으로 증명된다. 이와 같이 혈전 촬상 반복 곤란할 요오드화 콘트라스트의 반복 투여와 관련된 용량 한계 위험이있다.
따라서, 빠르고 더 나은 치료 결정 할 수 있도록 뇌졸중 환자에서 뇌 혈전에 대한 직접 촬상 방법에 대한 중대한 필요성이있다. 우리는 혈전 추구 nanoparticular 분자 이미징 제의 사용으로, CT, 뇌졸중 현재 사용되고있는 전선 영상 기법의 값을 향상시켜이를 위해 제안한다.
우리는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT), 신속한 데이터 취득 <있게 고해상도 생체 외 또는 생체 내 (작은 동물) CT 영상의 버전을 사용하는 이러한 약제의 사용을 증명SUP> 3,4. 에도 (인간 크기의 스캐너에서 사용할 수보다 훨씬 더) 작은 동물 microCT에 사용할 수있는 상대적으로 가난한 연부 조직 대조, 이미징 에이전트가 추구하고 CT, 분자에 의해 향상된 '고밀도 용기 기호'에 그들에게 한 고밀도을 만들어 혈전을 표시 할 수 있었다 영상.
CT 기술을 보완 우리 그룹은 뇌 혈전 부담 5 시각화 Cy5.5 근적외선 형광 (NIRF) 프로브를 이용한 광 혈전 다이렉트 이미징 기술을 개발 이전 하였다. 이것은 사후 뇌 부검에 생체 외 기법이지만, 매우 민감하며, 연구 설정 생체 데이터에서 확인하는 역할을한다.
CT와 NIRF 모두 혈전을 추구하는 이미징 기술을 기반 갖는 것은 우리가 비교하고 허혈성 뇌졸중 개발의 과정에서 혈전 및 혈전 이미징의 역할에 크게 정보 데이터를 달성하기 위해 이러한 기술을 대조 할 수 있습니다.
H감수, 우리는 생체 내 및 생체 외 microCT NIRF 영상의 결합 기술에 대한 상세한 프로토콜은 직접 색 전성 뇌졸중의 쥐 모델에서 thromboemboli 시각화 기술한다. 이 간단하고 강력한 방법을 제공 생체 데이터 다음에, 치료 중 생체 내에서 신속하고 정량적 인 방법으로 혈전 부담 / 유통 및 동적 혈전 진화의 특성의 생체 내 평가에서 정확한을 활성화하여 혈전 질환에 대한 우리의 이해를 발전하는데 유용하다 생체 영상 소견의 확인에 대한 제어 및 참조 표준으로.
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Protocol
이 프로토콜에서 설명 모든 동물 절차를 검토하고 동국대 학교 일산 병원 동물 관리 및 사용위원회의 승인과 관리 및 동물의 사용에 대한 NIH 가이드에 설명 된 원칙과 절차에 따라 진행되고있다.
형광 마커로 표기 외생 형성된 응고 1. 준비 (그림 1)
- 30 % 산소 (1.5 L / min로 100 % 산소)를 혼합 3 % 이소 플루 란을 이용하여 유도 챔버에 마우스를 마취. 근육을 관찰하고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
- 발생하기 쉬운 위치에 멸균 드레이프의 동물을 배치, 30 %의 산소와 혼합 흡입 마스크와 2 % 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유지. 무균 기술과 무균 가운 / 마스크 / 장갑 / 악기를 사용하여 다음 절차를 수행합니다. 청소 및 이전에 70 % 알코올로 실험 영역을 살균하여 무균 상태를 유지차의 절차 후.
- 심장 천자 6 후 약 300 ~ 1,000 μL 동맥 혈액을 수집합니다. 형광 응고를 표시하기 위해, 30 μL의 C15 프로브 (5) (20 μmol / L 농도), 활성화 인자 XIII (FXIIIa) 응고 효소의 섬유소 가교 활동에 민감한 Cy5.5 형광 프로브 70 μL 전체 혈액 믹스 (그림 1A ). 20 ㎝ 길이의 폴리에틸렌 관 (PE-50, 0.58 mm ID)에 3 ㎖ 주사기 (23 게이지 니들)를 사용하여 혼합 된 혈액을 주입한다. PE 튜브는 멸균 (또는 제조사에 의해 멸균 인증) 및 혈전는 조직 문화 후드에서 무균 적으로 준비해야해야합니다.
- 호흡과 심장 펄스의 부족을 관찰하여 동물의 죽음을 확인합니다.
- 이전에보고 된 7, 22 시간 동안 4 ℃에이어서, 실온에서 2 시간 동안 혈액로드 관을두고 다음 절차를 수행한다.
- 1.5 cm 길이의 조각으로 혈전 함유 튜브를 잘라. 인산 완충 식염수 (PBS)로 채워진 3 ㎖ 주사기를 사용하여 부드럽게 튜브의 각 부분에 PBS를 주입하여 PBS 함유하는 6- 웰 플레이트 상에 혈전 추방. PBS (그림 1B)와 혈전을 세 번 씻으십시오.
- 기포를 방지하면서주의 깊게 30 식염수로 채워진 1 mL를 주사기를 사용하여, 세정 혈전을 그려 1.5 cm 길이의 혈전으로 15 cm 길이의 PE-10 튜브 (ID 0.28 mm)의 선단부를로드 튜브의 근위 단부에 삽입 게이지 바늘.
- 중간 대뇌 동맥 (MCA)에 배치됩니다 테이퍼 엔드 (ID 200 μm의)가 수정 3 ㎝ 길이 PE-50 튜브 (ID 0.58 mm)로 혈전이 장착 된 PE-10 튜브를 연결 - 뇌 앞쪽 색 전성 뇌졸중의 쥐 모델 (도 1C)의 내 경동맥 (ICA)의 동맥 (ACA) 분기점 영역.
2. 혈전 색 전성 뇌졸중의 마우스 모델을 모델링 (그림 2)
- Anesthetiz이전에 30 % 산소 (/ 분 1.5 L)과 혼합하여 3 % 이소 플루 란을 이용하여 유도 챔버 내에 7 개 상이한보고 마우스 쓰다한다. 수술 후 통증을 완화하기 위해 (5 ㎎ / ㎏) 피하 멜 록시 캄을 주입한다. 근육을 관찰하고 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다.
- 마취 동안 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 수의학 연고 소량을 적용한다. 무균 기술과 무균 가운 / 마스크 / 장갑 / 악기를 사용하여 다음 수술 절차를 수행합니다. 동안, 청소 전에 70 %의 알코올을 수술 영역을 살균하여 무균 상태를 유지하고, 수술 후.
- 운영 테이블에 마우스를 이동합니다. 발생하기 쉬운 위치에 멸균 드레이프에 동물을 배치하고 흡입 마스크와 2 % 이소 플루 란을 이용하여 마취를 유지. 그리고, 직장 온도계로 피드백 항온 성 블랭킷 (homeothermic blanket)을 사용하여 36.5 ℃로 체온 클램프.
- surgi 후betadine 70 % 알코올 칼 준비는 왼쪽 귀와 눈 사이의 두피에 메스를 사용하여 1cm 수직 절개를합니다. 노출 좌측 측두골의 표면에 레이저 도플러 유량계의 광파이버의 선단을 접착제 (1mm 좌측 및 브레 그마로부터 아래 4mm). 그리고, 도플러 플로우 모니터링 (도 2A)를 시작한다.
- 동물을 내려 놓습니다. 핀에 부착 된 문자열 위 앞니에 당겨 목을 펴서 목 영역을 면도. 그런 다음, 열려 확산하는 3cm 수직 정중선 절개를하고, 요정 혈관 부드러운 조직을 해부하여 왼쪽 경동맥 전구 영역에 노출됩니다. 미주 신경을 손상하지 않도록주의하십시오.
- 멸균 6-0 블랙 실크 봉합사를 이용하여 인접한 좌측 총 경동맥 (CCA)을 결찰하고, 좌측 ICA 멸균 7-0 블랙 실크 봉합사를 이용하여 좌측 pterygopalatine 동맥 (PPA)을 결찰.
- 왼쪽 외부 경동맥 USI의 지점입니다 왼쪽 우수한 갑상선 동맥, 소작NG 단극 전기 소작, 그리고 왼쪽 근위 외부 경동맥 (ECA) 느슨하게 단단히 멸균 7-0 블랙 실크 봉합사를 사용하여 더 먼 사이트를 결찰.
- 마이크로 가위를 사용하여, ECA의 결찰 사이트 사이의 작은 구멍 (약 0.2 ~ 0.25 ㎛의 직경)을 만든다.
- 근위 ECA 결찰을 풀어 동안 ECA의 구멍에 혈전 함유 카테터를 삽입합니다. 장소에 카테터를 식은 죽 먹기 위해 CCA에 카테터를 진행 한 후 다시 근위 ECA 결찰를 조입니다.
- 말단 결찰 사이트에 말단 인 ECA 말단 부분을 잘라 소작하고 무료 근위 ECA는 CCA에서 카테터를 철수하면서 ICA의 방향으로 정렬 시계 방향으로 회전합니다. 즉시 ICA 결찰을 느슨하게 한 후 원심 ICA의 ACA의 분기 지역 - 그럼, 카테터에게 MCA에 약 9mm를 진행합니다. 그런 다음, ICA 결찰를 조입니다.
- 부드럽게하여 분기 지역에 혈전 배치주사기 1 mL로 누르면 혈전을 주입한다. 혈전 성공적 용기 (도 2B)를 폐색하는 경우, 기준과 비교하여 30 % 이하로 저하한다 도플러 뇌 혈류 (CBF)의 감소를 확인한다.
- 카테터를 제거하고 즉시 단단히 ECA 근위 사이트를 결찰. 또한, CCA와 PPA를 unligate.
- 6-0 실크 봉합사를 사용하여 절개 사이트를 닫습니다. (혈전 주입 후 30 분 동안, 여기에) 필요한 시간 범위에 걸쳐 도플러 모니터링을 계속 한 후 마취를 중지합니다. 빈 새장에 마우스를 반환하고, 가열 램프 따뜻한 유지. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 얻을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
뇌 혈전의 생체 MicroCT 이미징 3. (그림 3)
- 다시 마취 미리 지정된 시간 지점에서 단계 2.1에 기재된 바와 같이 개시하기 (여기에서 1 시간) 2 % 이소 플루 란 마우스색 전성 뇌졸중으로 인한 대뇌 동맥에 혈전의 위치에. 발가락 핀치 반사의 부재를 확인하여 마취의 적절한 깊이를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 수의학 연고 소량을 적용한다.
- 10 mM의 PBS에 10 mg의 금 / ㎖의 농도에서 피브린 타겟 금 나노 입자 (FIB-GC-AuNP 4)에 재현 탁하고, 나노 입자의 용해 및 분산을 보장하기 위해 30 분 동안 혈전 영상 화제 초음파 처리. 300 μL의 FIB-GC-AuNP (10 ㎎ / ㎖) 음경의 정맥에 주입한다.
- microCT 기계의 침대에 동물을 배치하고 모션 아티팩트를 줄이기 위해 핀에 부착 된 문자열 위 앞니를 잡아 당겨 목을 곧게.
- FIB-GC-AuNP의 주입 후 5 분에서, 뇌 microCT 이미지를 획득하기 시작한다. 여기에 설명 된 실험 내용은 다음 이미징 매개 변수 사용 : 65 KVP, 60 μA, 뷰의 26.7 X 26.7 X 27.9 mm 3 필드를 0.053 X 0.053 X 0.054mm 3 복셀 크기, 프레임 당 100 밀리 초, 일 평균 360보기, 512 X 512 재건 행렬, 600 조각, 64 초 스캔 시간.
- 빈 새장에 마우스를 반환하고, 가열 램프 따뜻한 유지. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 얻을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
- microCT 스캐너에 설치된 소프트웨어 패키지의 '재건'패널의 '시작'명령을 사용하여 의학 (DICOM) 형식으로 디지털 이미징 및 통신에 원시 이미지 데이터를 변환.
- (단계 6) 화상의 정량적 분석을 위해, 제조자의 지시에 따라 상용 소프트웨어 패키지를 이용하여 TIFF 포맷으로 DICOM 데이터 변환.
- 질적뿐만 아니라 양적가 간단하고 신속한 분석 방법으로 분석 내용의 새로운 세트를 생성 DICOM 형식 소프트웨어 패키지와 원본 0.054 mm 두께의 이미지를 사용다음과 같이 (여기서, 2mm) 1 또는 2mm 두께로 렌더링 축 관상 이미지.
- 의 '데이터 원본'나무의 DICOM 폴더를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 'MasterDB'또는 'PrivateDB'에 폴더를 가져옵니다.
- '데이터 원본'트리에서 'MasterDB'또는 'PrivateDB'를 클릭하고 가져온 폴더를 선택합니다. '로드 옵션'창이 팝업 때 왼쪽 패널에서 '3D'탭을 클릭 한 후, 키를 눌러 'OK'는 스택과 같은 폴더에 이미지 시퀀스를 가져옵니다.
- 축 및 관상 이미지 창에서 단어 'MRP'를 클릭하고 팝업 메뉴에서 'MIP'를 선택하여 최대 강도 투사 (MIP) 형식으로 이미지 표현을 변경합니다. 같은 창에서 : 다음, '0 [mm] TH'를 클릭 한 후 2mm로 이미지 두께를 변경합니다.
- 수 NA 2mm 폭 3D 사용이미지 스택을 탐색하고 적절한 각도와 위치에서 슬라이스를 허용 vigator 바, 혈전을 항구 윌리스 (COW)의 원의 전체 범위로 2 mm 두께의 축 단면 이미지를 준비합니다. '출력'패널의 캡쳐 버튼 (카메라 아이콘)을 클릭합니다. TIFF 형식으로 이미지를 저장합니다.
- 그런 다음, 오 2mm 소뇌에 전두엽에서 연속적으로 커버 두께의 관상 단면 이미지를 준비합니다.
- ACA의 혈전 - 첫째, 관상 이미지가 가장 MCA를 시각화 할 수 있도록주의 깊게 축 이미지 네비게이터 줄을 맞추어 두 번째 슬라이스를 준비합니다.
- 다음으로, 연속적인 방법으로 다른 네 개의 조각을 준비합니다. '출력'패널의 캡쳐 버튼 (카메라 아이콘)을 클릭합니다. TIFF 형식으로 이미지를 저장합니다.
4. 혈전 및 뇌 혈전의 생체 MicroCT 영상에서 (그림 3)
- 준비 100 ㎝ 길이 PE-1일단에 30 게이지 바늘과 타단에 1 mL의 주사기로 0 튜브. 식염수 (600 μL) 또는 tPA를 (여기에, 24 ㎎ / ㎏, 600 μL) 공기 방울을 피하면서 하나와 튜브를 입력합니다.
- 단계 2.1에 기재된 바와 같이, 마우스를 다시 마취. 동물의 음경 정맥 내 바늘 끝을 삽입합니다. microCT 기계의 침대에 조심스럽게 동물을 놓습니다. 그리고, 고정 및 침대에 테이핑하여 도관 시스템의 정맥 내 주사 부분 안정화.
- 전처리 기준으로 후속 영상 세션을 수행합니다. 이어서, 도관 시스템 내로 주사기 플런저를 누름으로써 60 μL의 생리 식염수 나 주사 tPA의 하나. 루스 주입 후 시간 (여기서는 30 분)에 걸쳐 남은 용액 (540 μL)를 주입하기 시작한다.
- 사전에 지정된 시간 지점에서 단계 3.4에서와 같은 매개 변수를 사용 microCT 이미지를 얻 여기서, 일시 주사 후 3 시간에서 24. 다음과 같은 생체 NIRF throm을 수행하려면뇌의 버스 이미징, 자궁 전위에 의해 마취하에 동물을 안락사.
5. 예 생체 내 NIRF 혈전 이미징 및 뇌 조직의 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 염색 (그림 4)
- 잘린 후, 두피를 제거하고 최대 시상 봉합쪽으로 난원 매그넘에서 가위로 머리를 잘랐다. 주의 기본 뇌에 부상을 피하면서 가위를 사용하여 절개 두개골의 가장자리를 상승, 따라서 반구 베어 누워하여 두개골 볼트를 제거합니다.
- 그들은 NIRF 이미징에 가시화되어야한다 윌리스 동맥의 원과 중첩 수 있기 때문에, 뇌 표면에 최대한 가까이 뇌 기반의 광학 신경을 잘라. 그리고, 명확 NIRF 혈전 이미징을위한 Y 자 형상 "MCA / ACA는 / 원위 ICA '를 시각화하기 위해 부드럽게 일을 노출 소뇌 기본 압축 후까지 뇌 표면에 가능한 원위 ICAS 잘라즉 절삭 점 (도 4A).
- NIRF 영상 (여기 / 방출, 690분의 675 nm의 1 초 노출) 수행의 기본이 COW의 동맥에 형광 표지 thromboemboli을 시각화 (그림 4B, C)를 가리키는으로 제거 된 뇌 조직의 (그림 4D) . 그런 다음, 대뇌 피질의 thromboemboli을 시각화 가리키는 뇌의 정점에 추가 이미징을 수행합니다. 조직에 생리 식염수를 몇 방울을 넣어 뇌의 건조를하지 마십시오.
- 빨리 coronally 2mm 두께의 뇌 조각 준비, 제조업체의 지침에 따라 뇌 매트릭스 장치를 사용하여 2 mm의 6 개 두꺼운 조각 (2.3, 0.3, -1.7, -3.7, 브레 그마에서 -5.7 mm). 식염수 방울을 사용하여 뇌 조각의 건조를 방지하고, 앞 부분의이면 모두 NIRF 이미징을 수행합니다.
- 노출을 피하는 것은 조명 관리하면서, 20 분 동안 2 % 트리 페닐 테트라 졸륨 클로라이드 (TTC) 용액에 뇌 조각을 넣고티. 빛에 노출을 피하면서 그런 다음, 4 ° C에서 4 % 포름 알데히드 용액에 조각을 이동합니다.
MicroCT 이미지와 ImageJ에 (1.49d) 소프트웨어를 사용하여 6. 정량 혈전 지역 (그림 5)
- 열기 이미지 (그림 5A).
- 열기 이미지 시퀀스 파일을 '파일> 가져 오기> 이미지 시퀀스'또는 '파일> 열기'를 선택하여 스택 파일을 만들 수 있습니다. '이미지> 유형> 8 비트'를 사용하여 8 비트 그레이 스케일로 이미지를 변환합니다.
- 밀리미터 (그림 5A)에 인치의 단위를 변환합니다.
- CT 이미지 파일의 하나의 화소는 0.053 mm에 해당하는 경우, 사용 입력하는 '> 설정 척도를 분석하여'1 ','0.053 '및'픽셀의 거리 '에 대한'mm ','알려진 거리 '길이의'단위 '각각.
- 때 (만) 규모 막대를 사용할 수있는,'직선'도구를 사용하여 스케일 바의 동일한 길이와 선을 그립니다. 그런 다음, 밀리미터의 스케일 바의 길이를 입력하는 '> 설정 규모 분석'사용합니다.
- 배경 빼기 (그림 5B)
- 혈전이나 뼈 관련 한 고밀도 영역없이 뇌 실질의 영역에 관심 (ROI)의 원형 또는 사각형 영역을 '지정> 편집> 선택'을 사용하는 곳으로. 지정된 ROI는 스택의 모든 조각에 적용하기 때문에, 각 조각의 한 고밀도 영역과 중복되지 않은 경우 반드시 확인하십시오.
- '플러그인> 투자 수익 (ROI)> 투자 수익 (ROI)에서 BG 빼기'를 선택하고 '평균에서 표준 편차의 수'2.0를 입력합니다.
- Thromboemboli 관련 한 고밀도 병변의 분할 (그림 5C)
- '> 임계 값 이미지> 조정'을 선택하고, 소호 '의 값을 입력WER 역치 '및'는 각각 22, 255, 등의 상위 임계 레벨 '. 녹색 상위 임계 값 위의 그레이 스케일 블루, 역치 픽셀의 낮은 임계 값 아래 픽셀과 픽셀을 표시하기 '에서 오버 /'를 선택합니다.
- 뼈 영역을 포함하지 않고 thromboemboli 관련 한 고밀도 병변을 둘러싸고 로아을 그립니다 '자유형 선택 도구'를 사용합니다. 도면 중, 추가 또는 각각의 영역을 제거하는 [이동] 또는 [고도]를 누르고 있습니다.
참고 한 고밀도 혈전 병변 대신 '자유형 선택 도구'로, 뼈 구조로부터 멀리 떨어져있는 경우, "벽 도구 '안전하게 그'공차 '레벨을 변경하지 않고 사용할 수있다.
- 분할 된 병변의 정량 (그림 5D)
- 선택할 수있는 '지역' '> 설정 측정 분석'사용 '평균 회색 값'및 '통합 밀도 (면적 X 평균)9 ;. '임계 값으로 제한'과 '표시 라벨'다음 옵션을 선택합니다. 정량화 된 데이터를 얻기 위해 '측정> 분석'사용합니다. 다음, ".XLS"파일로 결과를 저장합니다.
- TIFF 형식으로 스택 파일을 저장합니다. 또한, 로아 저장 '>> 투자 수익 (ROI) 관리자 도구를 분석하여'사용합니다.
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Representative Results
원위부 내 경동맥의 ACA의 분기 지역 (그림 6 - 기준 microCT 이미지, FIB-GC가-AuNP 색 전성 뇌졸중 후 1 시간에서 (10 ㎎ / ㎖, 300 μL), 명확하게 MCA에서 뇌 혈전을 시각화 투여 후 생체 내에서 얻어진 ). 후속 microCT 이미징은 식염수 처리와 COW 혈전에 변화가 없었다. 그러나, tPA의 치료는 COW 혈전의 점진적 용해 (그림 6에 파란색 화살촉)를 보여 주었다. 이 발견은 microCT 혈전 영상이 혈전의 치료 모니터링을 허용 할 수 있음을 보여줍니다. 24 시간에서 잔류 thromboemboli에 대한 생체 CT 밀도와 생체 NIRF 사이의 우수한 대응이 있습니다. 때문에 내인성 혈전 자국 멋지게 인해 NIRF 신호 분야와 공동으로 로컬 라이즈 된 섬유소 타겟팅 AuNPs에 의해 해당 한 고밀도의 microCT 영역을 참고 외생 혈전 자국, EMBO 전에 수행 된응고 인자 XIIIa에 매개 피브린 가교 미리 형성된 혈전의 성숙 과정에서 활성 (도 6)에 민감한 Cy5.5 형광 프로브를 이용하여 LIC 스트로크. TTC 염색에 의해 측정 된 TPA를 매개 혈전 용해 효과를 입증하는 직접 혈전 영상의 결합 기술은 조직 학적 스트로크의 결과를 반영한다. TTC 염색의 TPA 혈전 수신 동물에 대한 허혈성 뇌 손상의 양 명확한 감소 (도 6의 백탁 부분)을 보였다.
그림 1 :. 공유 섬유소하여 혈전의 섬유소 가닥에 연결되어 형광 표지 된 혈전의 준비의 개요 (A) Cy5.5 근적외선 형광 신선한 전체 혈액의 혼합 (NIRF) 프로브 (C15) 활성화 coagu의 -crosslinking 효소 작용응고 성숙 과정에서 LATION 인자 XIIIa에. 혼합 된 혈액은 폴리에틸렌 (PE) -50 튜브 내로 주입 혈전 형성 및 성숙을 허용하도록 24 시간 동안 방치한다. (B) NIRF 이미징은 C15 프로브 혈전의 광학 라벨을 확인합니다. 체육 관에서 제거 된 혈전을 세척 후 지속 형광을합니다. 쥐의 경동맥의 전방 대뇌 동맥 분기 지역 - 테이퍼 끝 중간 대뇌 동맥 혈전 색전증에 대한 (200 μm의 직경)를 가지고 변성 PE-50 튜브 (C) 혈전이 장착 된 PE-10 튜브. 스케일 바 :. 2mm 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 죽의 마우스 모델을 모델링의 개요mboembolic 뇌경색. (A) 좌측 측두골 표면에 접착 레이저 도플러 유량계 광섬유의 원위 단부와 전후 중간 대뇌 동맥 (MCA)의 폐색 후 뇌 혈류 (CBF) 레이저 도플러 모니터링 (1mm 왼쪽과 브레 그마에서 아래 4mm). 베이스 라인에 비해 30 % 이하로 감소한다 도플러 CBF의 후 폐쇄 감소를합니다. (B) 혈전 함유 카테터의 삽입 (즉,도 1c의 말단 테이퍼 폴리에틸렌-50 관) 외부 경동맥 (ECA)의 구멍으로는 MCA에 카테터에 대한 9mm를 진행하여 (결국) 다음 - 원위부 내 경동맥 (ICA)의 전방 대뇌 동맥 (ACA) 분기 지역입니다. CCA, 경동맥; PPA, pterygopalatine 동맥. 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전.
그림 3 : 개요 생체 MicroCT 기반 뇌성 Thromboemboli을 시각화하고 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)이 혈전 효과 - 중재 모니터링하는 섬유소 타겟 금 나노 입자를 사용하여 직접 혈전 이미징 (A) 섬유소 타겟 글리콜 키토산 금 나노 입자의 정맥 주입. 혈전 색 전성 뇌졸중와 마우스에서 (FIB-GC-AuNPs). (B) 마우스는 microCT 이미 저의 침대에 배치됩니다. FIB-GC-AuNPs의 주입 후 5 분에서 microCT 이미지를 획득 (C). (D) 화상 재구성은 microCT 스캐너에 설치되어있는 소프트웨어 패키지를 사용하여 약 (DICOM) 형식의 디지털 이미징 및 통신으로 원시 이미지 데이터를 변환한다. (E) 이미지 분석 및 축 / C의 준비oronal 이미지 최대 강도 투사 모드를 사용하여 2mm의 두께로 표현. microCT 기반의 직접 혈전 이미징 방법을 사용하여 모니터링 및 분석 할 수 있습니다 (F) 정맥 TPA에 매개 혈전 용해. (C - E)를 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 :. 예 생체 근 적외선 형광 (NIRF) 뇌성 Thromboemboli의 이미징 (A와 B) 혈전 색 전성 뇌졸중와 마우스에서 제거 대표적인 뇌 조직의 개요. 중간 대뇌 동맥에 thromboemboli (빨간색 화살표)을 잃지 않도록 (MCA)을 예방 조치를 취 - 전방 대뇌 동맥 (ACA) 분기의 원위부 내 경동맥의 영역 (ICA를,파란색 화살표) 뇌를 제거하는 단계를 포함한다. (C와 D) 전 생체 내 NIRF 혈전 영상. 뇌 조직은 혈전 (D에서 빨간색 화살표)을 MCA의 전성 폐색 전 Cy5.5 형광 마커 C15 사전 표지의 시각화를위한 NIRF 이미 저 (C)의 빛 밀폐 실 내부에 배치 - ACA의 분기점을 지역. 중부 표준시 모양 그림 5를 비교한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 : MicroCT의 이미지를 사용하여 정량화 혈전 볼륨 개요 ImageJ에 (1.49d) (A), 새로운 스택 파일로 이미지를 가져 8 비트 그레이 스케일로 파일 포맷을 변환하고 단위를 변경.mm. (B) 배경 빼기. 뼈 구조를 제외하면서 한 고밀도 영역 주위의 관심 (ROI)의 영역을 그리기에 의해 혈전 병변 (C) 분할. '> 분석 측정을'메뉴를 사용하여 투자 수익 (ROI)에 대한 정량적 데이터를 취득 (D). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 :. 대표 직접 뇌 혈전 영상 데이터를 획득하기 전에 조직 플라스 미노 겐 활성제의 치료 모니터링을 할 수 있도록 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA) (A) microCT (MCT) 혈전 영상 대 식염수로 쓰다 마우스 치료 후 (TPA) - 매개 혈전 . (B 및
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Discussion
피브린은 생체 microCT 기반 이미징 금 나노 입자 (FIB-GC-AuNP)을 타겟팅하고 FXIIIa는 전 광학 이미징 프로브를 대상으로 우리는 색 전성 뇌졸중의 실험 모델에서 직접 혈전 촬상 두 상보 분자 이미징 기술의 사용을 보여 형광 이미징 생체 내.
FIB-GC-AuNPs의 정맥 내 투여 후 혈전 농도 그라데이션 - 후 (입자 표면에서) 피브린 타겟팅 펩타이드의 작용에 의해 혈전에 포획가되는 입자에 의한 고밀도의 구조로 CT에 표시되었는지 다공성 구조, 즉, 혈전에 따라 확산. 이 프로세스는 한 방향으로 만 발생하는 것으로 나타나고, 급속 응고에 농축되고 혈액에서 나노 입자의 상대적으로 낮은 농도로 인해, 검출 가능하도록 충분히 그 CT 밀도 변경. 24 시간에서 최종 생체 microCT 이미징잘 형광 대뇌 동맥에 배치되기 전에 FXIIIa의 섬유소 가교 활동을 인식하는 광학 탐침으로 표시되었던 초기 혈전의 포스트 단자 위치 보장 residua을 보여주는 생체 뇌의 사후 NIRF 이미징 상관 관계. 이러한 방식으로, 작업 및 다른 이미징을 각 보고서의 다른 메커니즘하여 두 분자 이미징 프로브, 기타의 결과를 크로스 검증.
혈전의 진화는 동일한 방법을 사용 하였다 수; 즉, tPA의 혈전으로 혈전 용해 요법의 성공을 빠르게 적시 리드가 CT에 의해 수행 될 수 있도록 생체 따라야 할 수있다. 이는 임상 혈전 심오한 의미를 가지며, 새로운 항 혈전 성 또는 혈전 용해 요법의 개발을위한 연구 응용을 갖는다.
이전에, 우리 그룹은 뇌졸중 치료에 흔한 합병증을 감지 할 수 있었다의 연구전자 혈전증 3는 종종 이후의 재 폐쇄 및 악화의 결과로, 부분적으로 처리 응고 주위에 발생. 다시 혈전증은 같은 동물에서 다른 시간에 4 개의 다른 위치 (왼쪽 말단 CCA, 왼쪽 인접 CCA 오른쪽 말단 CCA 한 다음 바로 인접 CCA)에 1mm 50ml을 -soaked 여과지 (학년 42)를 순차적으로 적용하여 만들어졌다 . 모든 경우에, FIB-GC-AuNP이 혈전 축적 입증되었다 순환 및 CT와 이미징이 볼 수 렌더링. 이 효과의이 기간은 현재 알 수있는 FIB-GC-AuNP의 생물학적 반감기에 한정되는 것, 그리고 fib-의 초기 주입 후 장시간 (최대 3 주 정도)에 대한 관찰되었다 GC-AuNP. 나노 입자 제제의 단일 투여 량은 임상 적 성공과 치료법의 실패를 모두 관찰 효과적 일 수 있기 때문에 임상 적 관심이다. 또한 연구 약동학 및 biodistri를 평가하는 데 필요한FIB-GC-AuNP의 bution.
FIB-GC-AuNPs의 화학적 합성은 이전에 상세히 4에서 설명되었다. EP-2104R 자기 공명 촬상에 사용 간단히 피브린 타겟팅 펩타이드 (티로신 D 글루타민 시스테인 히드 록시 프롤린-L-3-chlorotyrosine 글리신 류신 시스테인 티로신 - 이소류신 - 글루타민) (MRI) 제 8 인 표준 고상 펩티드 FMOC 화학 합성, 및 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카 보디이 미드 및 N- 히드 록시 숙신이 미드를 이용하여 GC-AuNPs 코팅의 표면에 접합. FIB-GC-AuNPs 정제하여 최종 생성물을 원심 분리에 의해 수집된다.
미리 형성된 혈전의 광학 표시 용 C15 NIRF 프로브 FXIIIa 인식 Cy5.5 및 형광 염료 9,10- 리신 잔기의 ε 아미노기에 표시된 15 개 아미노산 펩티드이다. 광학 이미징 제는 공유하는 단계의 효소 작용에 의해 혈전 섬유소 가닥에 연결된이 응고 11,12 성숙 과정에서 섬유소 가닥 가교 때 응고 인자 ivated. C15 NIRF 혈전 마커의 화학적 합성은 이전에 상세히 4에서 설명되었다. 간단히, FXIIIa 친 화성 펩타이드 (글리신 아스파라긴 알라닌 글루타메이트 - 글루타민 - 발린 세린 프롤린 류신 트레오닌 류신 류신 라이신 트립토판) alph -2- 항 플라스의 N 말단에 기초하여 고체로 합성 Cy5.5 표지 후 α 상 펩티드 합성 및 시스테인 측쇄를 통해 형광 색소. 고성능 액체 크로마토 그래피를 사용하여 생성물을 정제하고 최종 화합물을 회수한다.
NIRF 및 금 나노 입자 에이전트 모두의 성공으로 인해 이러한 에이전트의 강한 생물학적 디자인 기능을 가능성이있다. FXIIIa (11)는 근본적으로 중요한 트롬빈 - 활성화 된 트랜스 글 루타 미나 사량, 섬유소 저항을 매개 응고 효소이다. 이러한 활동효소는 새로 형성된 혈전의 특징으로 간주된다. 모두 우리의 에이전트는이 기본적인 혈액 응고합니다 (FXIIIa 감지 C15 광 대리인) 효소 또는 (섬유소 타겟팅 FIB-GC-AuNP CT 에이전트)의 기판과 강하게 상호 작용합니다.
공동 현지화 연구는 생체 형광 (외래 혈전 마커) 및 예상되는 섬유소 결합 나노 입자와 이미징 뇌 혈전에 대한 생체 내에서 microCT 밀도 (내인성 혈전 마커) 사이의 우수한 대응 때문에 서로의 존재였다 모두 에이전트와 관련된 생물학적 함정 수사기구.
이중 모달 직접 혈전 이미징 기술을 사용할 때 고려해야 할 몇 가지가 있습니다. 먼저 응집 FIB-GC-AuNPs을 방지 할 수 있고, 생체 적합성을 달성하기 위해, 글리콜 키토산 표면 코팅 (13)에 사용된다. 그러나, 정맥 내 주사 전에, 혈전 촬상 에이전트 resuspen되어야PBS에서 DED 및 나노 입자의 용해 및 분산을 위해 초음파. 또한, 나노 입자의 안정성은 약 519 nm에서되어야 둘 FIB-GC-AuNPs 신선한 대 이전 주식, 표면 플라즈몬 공명 피크를 비교하는 자외선 - 가시 광선 (UV-비스) 흡수 분광법을 사용하여 평가할 수있다.
이러한 그러나 완료하는 데 필요한 시간이 증가하는, 600 내지 1,200 슬라이스에서 '스캔 번호'를 증가 또는 1 ~ 3에서 평균 '증가 같이 둘째 microCT 혈전 이미지의 해상도는 스캐닝 파라미터를 변화시킴으로써 향상 될 수있다 스캔.
이 연구에서 혈전 형광 라벨링 3-5 : 제, 혈액 C15 NIRF 촬상 제 7의 비율로 혼합 하였다. 비교적 높은 혈액량은 혈전의 검출 감도를 낮출 수있는 반면, 우리의 경험에 의하면, 비교적 낮은 혈액량은 혈전의 형성을 방해 할 수있다인해 혈전로부터 방출 생체 형광 신호의 감쇠이다. 또한, 여러 가지 방법이 혈전 (14)의 다양한 구성 요소의 형광 가시화를 위해 사용될 수 있음을 주목할 만하다.
넷째, 대상 동맥 부분적 폐색 인 - 매개의 FeCl3 시츄 혈전증 모델에 비해 완전히 대뇌 혈관 폐색 thromboemboli의 microCT 시각화 FIB-GC-AuNPs (4)의 상대적으로 높은 투여 량을 필요로한다. 금 콜로이드는 생체 적합성 및 FIB-GC-AuNPs는 이전의 연구 (4)에 띄는 신경 행동 / 전신 독성을 보이지 않았다 간주되지만 따라서, 독성의 우려가있을 수 있습니다.
다섯째, 임상 시험은 혈소판이 타겟 또는 섬유소 타겟 가돌리늄 (하나님) 기반 MRI 에이전트가 심장 챔버, 경동맥에 혈전의 hyperintensity을 높일 수 있고, 대동맥 궁 것으로 나타났다 T1 강조 영상 15. MRI 우수한 연조직 콘트라스트 및 높은 공간 해상도를 갖지만, MRI는 시간이 많이 소요되는 시험이다. CT는 상대적으로 빈약 한 연부 조직의 명암을 앓고 그러나 CT 스캔은 신속하게 수행 할 수 있습니다. 따라서, CT는 스트로크 (16)의 급성 관리에서 가장 널리 사용되는 자기 공명 영상 법 남아있다. 또한, 작은 동물 이미징 microCT 시스템 아키텍처 차광이 설치되어 있어야하고, 고해상도의 화상을 제공하지는 않는다. 따라서, microCT는 생체 반사 형광 이미징 또는 생체 형광 단층 촬영 (17) 결합은 작은 동물 연구에 매우 유용합니다. 또한, AU-철을 사용하여 MRI / CT 듀얼 모달 이미징은 18 ~ 20도 동물과 인간 모두에서 혈전 이미징을위한 강력한 플랫폼이 될 수있다 나노 입자; MRI 및 CT는 상호 보완 수 있고, 광학 영상와는 달리, 이들은 낮은 조직 침투 문제를 겪지 않는다.
직접 혈전 시각화를위한 결론, 결합 CT와 형광 영상의 내용은 "> 혈전의 검출, 치료의 모니터링 및 치료를 복잡하게 다시 혈전증의 검출을 개선하기 위해 약속, 허혈성 뇌졸중의 조사를위한 강력한 연구 도구입니다. 또한, 이들 기술의 임상 적 응용에 대한 상당한 잠재력이있다.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A 및 KK는 섬유소 타겟 금 나노 입자의 특허 보유자이다 (10-1474063-0000, 특허청). 나머지 저자는 공개 아무것도 없어.
Acknowledgments
이 작품은 한국 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (HI12C1847, HI12C0066)에 의해 지원되었다, 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램 (2010-0019862) 및 글로벌 연구실 (GRL) 프로그램의 (NRF-2015K1A1A2028228) 한국 정부에 의해 자금 국립 연구 재단.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
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