Summary
Denne protokollen beskriver bruk av kombinerte nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) bildebehandling og mikro-computertomografi (microCT) for å visualisere cerebral tromboemboli. Denne teknikken tillater kvantifisering av trombe byrde og evolusjon. Den NIRF avbildningsteknikk visualiserer fluorescensmerkede trombe i utskåret hjernen, mens microCT teknikken visualiserer trombe inne levende dyr med gullnanopartikler.
Abstract
Direkte trombusavbilding visualiserer rotårsak av tromboembolisk infarkt. Å være i stand til å bilde tromben tillater direkte langt bedre undersøkelse av slag enn å stole på indirekte målinger, og vil være en potent og robust vaskulær forskningsverktøy. Vi bruker en optisk avbildning tilnærming som etiketter tromber med en molekylær avbildning trombe markør - en Cy5.5 nær-infrarødt, fluorescent (NIRF) probe som er kovalent bundet til fibrin-tråder av tromben av fibrin-tverrbindings enzymatisk virkning av aktivert koagulasjonsfaktor XHIa under prosessen av blodpropp modning. En mikro-computertomografi (microCT) -basert tilnærmingen bruker trombe økende gullnanopartikler (AuNPs) funksjon å målrette den viktigste komponenten av blodpropp: fibrin. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for den kombinerte in vivo microCT og ex vivo avbildning av NIRF tromboemboli i en musemodell av emboliske slag. Vi viser at in vivo </ em> microCT og fibrin-målrettet glykol-kitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) kan brukes til å visualisere både in situ tromber og cerebral embolic tromber. Vi beskriver også bruken av in vivo microCT baserte direkte trombusavbilding til serielt overvåke den terapeutiske effekten av vevsplasminogenaktivator-mediert trombolyse. Etter siste bildebehandling økten, vi demonstrere ved ex vivo NIRF bildebehandling omfang og fordeling av rest tromboemboli i hjernen. Til slutt beskriver vi kvantitativ bildeanalyse av microCT og NIRF bildedata. Den kombinerte teknikk for direkte trombusavbilding tillater to uavhengige metoder for visualisering tromben som skal sammenlignes: arealet av trombe-relaterte fluorescerende signal på ex vivo avbildning NIRF lignet med volumet av hyperdense microCT tromber in vivo.
Introduction
Én av 6 personer vil ha et slag på et tidspunkt i livet. Hjerneinfarkt er langt den vanligste slag type, og står for om lag 80 prosent av alle slagtilfeller. Fordi tromboemboli forårsake de fleste av disse iskemisk slag, er det en økende interesse i direkte trombusavbilding.
Det ble anslått at om lag 2 millioner hjerneceller dør i løpet av hvert minutt av midt cerebral arterie okklusjon 1, som fører til slagordet "Tid er Brain". Computertomografi (CT) undersøkelser kan gjøres raskt, og er allment tilgjengelig; på grunn av dette, CT forblir avbildning av valget for den innledende diagnose og behandling av hyperakutt hjerneinfarkt. CT er spesielt verdifull for å informere de kritiske tidlige beslutninger: administrere vevsplasminogenaktivator (tPA) for trombolyse og / eller triaging til endovaskulær blodpropp-henting 2. Nåværende CT-baserte trombusavbilding, kan imidlertid ikke serielt spore cerebral tromboemboli in vivo, fordi den bruker indirekte metoder for å demonstrere tromber: etter opasifikasjon av blodet pool av joderte kontrast, er tromber demonstrert som fylling av feil i skipene. Det er dosegrenser og risiko forbundet med gjentatt administrasjon av joderte kontrast, som utelukker gjentatte avbildning av tromber på denne måten.
Det er derfor et kritisk behov for en direkte avbildning metodikk for cerebral blodpropper hos slagpasienter, for å tillate raskere og bedre behandling beslutninger for å bli gjort. Vi foreslår å oppnå dette ved å øke verdien av CT, den tiden brukes frontlinjen avbildningsfunksjonalitet for slag, med bruk av en trombe søkende nanoparticular molekylær avbildning agent.
Vi har vist at bruk av denne agenten ved hjelp av mikro-computertomografi (microCT), en høy oppløsning ex vivo eller in vivo (små dyr) avbildning versjon av CT som tillater rask datainnsamling <sup> 3,4. Selv med relativt dårlig bløtvev kontrast tilgjengelig for små dyr microCT (mye verre enn tilgjengelig fra menneskelig størrelse skannere), bilde agent var i stand til å søke og markere tromber ved å gjøre dem hyperdense på CT, en "tett fartøy skilt 'forsterket av molekylære bildebehandling.
Utfyller CT teknikken, har vår gruppe tidligere utviklet en optisk direkte trombusavbilding teknikk med Cy5.5 nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) probe for å visualisere cerebral blodpropp byrde 5. Dette er en ex vivo teknikk på post mortem hjerner, men er svært følsom, og tjener til å bekrefte in vivo data i forsknings setting.
Å ha både CT og NIRF basert trombe søkende imaging teknikker tillater oss å sammenligne og kontrast disse teknikkene for å oppnå svært informative data om rollen til tromben og trombusavbilding i ferd med iskemisk hjerneslag utvikling.
Here, beskriver vi en detaljert protokoll av en kombinert teknikk for in vivo microCT og ex vivo avbildning NIRF til direkte å visualisere tromboemboli i en musemodell av emboliske slag. Disse enkle og robuste metoder er anvendelige for å fremme forståelsen av trombotiske sykdommer ved å muliggjøre den nøyaktige in vivo vurdering av tromben byrde / fordelings og karakterisering av dynamisk trombe utvikling i en rask og kvantitativ måte in vivo i løpet av terapi, etterfulgt av ex vivo data som tjener som en kontroll og referansestandard for bekreftelse av in vivo avbildning funn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer demonstrert i denne protokollen er gjennomgått og godkjent av Dongguk universitetet Ilsan Hospital Animal Care og bruk komité og utført i samsvar med prinsippene og prosedyrene som er beskrevet i Guide NIH for omsorg og bruk av dyr.
1. Utarbeidelse av eksogent Dannet Clot Merket med Fluorescence Marker (figur 1)
- Bedøve en mus i en induksjonskammeret ved anvendelse av 3% isofluran blandet med 30% oksygen (1,5 l / min 100% oksygen). Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å observere muskel tone og bekrefter fraværet av tå klype refleks.
- Plasser dyret på en steril drapere i liggende stilling, og holde den under anestesi ved hjelp av en inhalasjon maske og 2% isofluran blandet med 30% oksygen. Utfør følgende prosedyrer ved hjelp av aseptiske teknikker og sterile kjoler / masker / hansker / instrumenter. Oppretthold sterile betingelser ved rengjøring og desinfiserende forsøksområdet med 70% alkohol før ennd etter prosedyrene.
- Samle ca 300 ~ 1000 mL arteriell blod etter hjerte punktering 6. Bland 70 ul fullblod med 30 pl C15 probe 5 (20 umol / L konsentrasjon), en Cy5.5 fluorescerende probe følsom overfor fibrin-tverrbindingsaktiviteten av aktivert faktor XIII (FXIIIa) koagulering enzymet, for å fluorescensmerket markere koagel (figur 1A ). Injisere blandet blod ved bruk av en 3 ml sprøyte (23 gauge nål) inn i en 20 cm lang polyetylenrør (PE-50, ID 0,58 mm). PE rør må steriliseres (eller sertifisert steril av produsenten) og propper må være forberedt på aseptisk i en vev kultur hette.
- Kontroller dyrets død ved å observere mangelen på åndedrett og hjertepulsen.
- La blodet belastede rør ved romtemperatur i 2 timer, deretter ved 4 ° C i 22 timer, og utføre følgende prosedyrer, som tidligere rapportert syv.
- Skjær trombe-inneholdende rør i 1,5 cm lange stykker. Ved hjelp av en 3 ml sprøyte fylt med fosfatbufret saltløsning (PBS), utvise trombe på en PBS-inneholdende 6-brønns plate ved forsiktig injeksjon av PBS til hver del av røret. Vask tromboser tre ganger med PBS (figur 1B).
- Legg den distale endeparti av en 15 cm lang PE-10 rør (ID 0,28 mm) med en 1,5 cm lang trombus ved forsiktig å trekke den vaskede tromben, og samtidig unngå luftbobler, anvendelse av en salt-fylt 1 ml sprøyte med en 30 gauge nål som settes inn i den proksimale ende av røret.
- Koble tromben belastede PE-10 rør med en 3 cm lang PE-50 rør (ID 0,58 mm) modifisert til å ha en avsmalnende ende (ID 200 um), som vil bli plassert på den midtre cerebrale arterie (MCA) - fremre cerebral arterie (ACA) bifurkasjon område av arteria carotis interna (ICA) i en musemodell for embolisk slag (figur 1C).
2. Modellering en musemodell for tromboembolisk slag (figur 2)
- Anesthetizea annen mus for å bli klappet som tidligere rapportert 7 i en induksjonskammeret ved anvendelse av 3% isofluran blandet med 30% oksygen (1,5 l / min). Injisere meloksikam (5 mg / kg) subkutant å avlaste postoperative smerter. Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi ved å observere muskel tone og bekrefter fraværet av tå klype refleks.
- Påfør en liten mengde av veterinær salve til hvert øye for å hindre tørrhet under anestesi. Utfør følgende kirurgiske prosedyrer ved hjelp av aseptiske teknikker og sterile kjoler / masker / hansker / instrumenter. Opprettholde sterile betingelser ved rengjøring og desinfisering av kirurgiske området med 70% alkohol før, under og etter operasjonen.
- Flytt musen til et operasjonsbord. Plasser dyret på en steril drapere i liggende stilling, og holde den under anestesi ved hjelp av en inhalasjon maske og 2% isofluran. Deretter klemme kroppstemperatur ved 36,5 ° C under anvendelse av en homeothermic teppe med tilbakemelding fra en rektal termometer.
- etter Surgical prep med Betadine og 70% alkohol, lage en 1 cm vertikalt snitt ved hjelp av en skalpell i hodebunnen mellom venstre øre og øye. Lim den distale ende av den optiske fiber fra en laser Doppler strømningsmåler på den eksponerte venstre tinningbenet flaten (1 mm til venstre og 4 mm nedenfor fra bregma). Deretter starter Doppler flow overvåking (figur 2A).
- Legg ned dyret. Rett halsen ved å trekke i øvre fortann med en streng festet til en pinne og barbere nakken. Deretter gjør en 3 cm vertikal midtlinjesnitt, spre det åpent, og utsetter den venstre hals pære området ved å dissekere peri-vaskulære bløtvev. Vær forsiktig så du ikke skader vagus nerve.
- Ligate venstre proksimale arteria carotis communis (CCA) ved hjelp av en steril 6-0 sort silke sutur, og ligate venstre ICA og venstre pterygopalatine arterie (PPA) ved hjelp av sterile 7-0 sorte silke sting.
- Cauterize den venstre overlegen thyroid arterie, som er en gren av den venstre eksterne karotidarterie using en monopolar elektrokirurgi, og ligate venstre proksimale eksterne arteria carotis (ECA) løst og mer distal området tett ved hjelp av sterile 7-0 sorte silke sting.
- Ved hjelp av en mikro-saks, lage et lite hull (ca 0,2 ~ 0,25 mikrometer diameter) mellom ligert områder av ECA.
- Sett trombe inneholdende kateter inn i hullet i den ECA mens løsne den proksimale ECA ligering. Stram proksimale ECA rings igjen etter fremføring av kateteret inn i det CCA for å cinch kateteret på plass.
- Cauterize å kutte ECA distale delen, som er distal til den distale ligation området, og roter gratis proksimale ECA klokken for å justere den til retningen av ICA mens uttak kateteret fra CCA. Deretter avansere kateteret ca 9 mm inn i MCA - ACA delinger område av distal ICA umiddelbart etter løsne ICA ligering. Deretter stramme ICA ligering.
- Plasser trombe i forgreningen området ved forsiktigå trykke på sprøyten 1 ml for å injisere tromben. Sjekk reduksjon av Doppler cerebral blodstrøm (CBF), som skal bli senket med 30% eller lavere i forhold til grunnlinjen, hvis tromben hell okkluderte fartøyet (figur 2B).
- Fjern kateteret, og ligate ECA proksimale stedet umiddelbart og tett. I tillegg unligate CCA og PPA.
- Lukk snittet området ved hjelp av 6-0 silke sting. Stopp anestesi etter fortsetter Doppler overvåking over et ønsket tidsrom (her, for 30 min etter trombe injeksjon). Returner musen i en tom bur, og holde den varm med en varmelampe. Ikke la musen uten tilsyn før den har fått tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
3. I Vivo MicroCT Imaging av Cerebral blodpropp (figur 3)
- Re-bedøve mus med 2% isofluran som beskrevet i trinn 2.1 til en forhåndsdefinert tids-punkt (her, 1 time) etter utbruddetav embolic hjerneslag på grunn av plasseringen av blodpropp i cerebral arterie. Sikre tilstrekkelig anestesidybden ved å bekrefte fraværet av tåen klype refleks. Påfør en liten mengde av veterinær salve til hvert øye for å hindre tørrhet under anestesi.
- Resuspender fibrin-målrettede gull nanopartikler (fib-GC-AuNP 4) ved en konsentrasjon på 10 mg Au / ml i 10 mM PBS, og sonikere trombusavbilding midlet i 30 minutter for å sikre oppløsning og dispersjon av nanopartikler. Injiser 300 mL fib-GC-AuNP (10 mg / ml) i penile blodåre.
- Plasser dyret på sengen av en microCT maskin, og rette nakken ved å trekke den øvre fortann med en streng festet til en pinne for å redusere bevegelsesartefakter.
- Ved 5 min etter injeksjon av fib-GC-AuNP, begynne å oppnå microCT bilder av hjernen. For forsøkene beskrevet her, kan du bruke følgende bildeparametere: 65 KVP, 60 uA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm 3 synsfelt, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm 3 voxel størrelse, 100 millisekunder per ramme, en gjennomsnittsberegning, 360 visninger, 512 x 512 rekonstruksjon matrise, 600 stykker, 64 sek skanning tid.
- Returner musen i en tom bur, og holde den varm med en varmelampe. Ikke la musen uten tilsyn før den har fått tilstrekkelig bevissthet for å opprettholde sternal recumbency.
- Transform rå bildedata i Digital Imaging og kommunikasjon i medisin (DICOM) format ved hjelp av "Start" kommando av "Reconstruction 'panel i en programvarepakke installert på microCT skanneren.
- For kvantitative analyser av bildene (i trinn 6), transformere DICOM data i TIFF-format ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig programvarepakke i henhold til produsentens instruksjoner.
- For kvalitative analyser, samt kvantitative analyser på en enklere og raskere måte, bruke programvarepakken og de opprinnelige 0,054 mm tykke bilder i DICOM-format for å generere et nytt sett medaksiale og koronale bilder gjengis å ha en eller to mm (her, 2 mm) tykkelse, som følger.
- Velg DICOM-mappen på "Data Source" treet, klikk på høyre museknapp, og importere mappen til "MasterDB 'eller' PrivateDB '.
- Klikk "MasterDB 'eller' PrivateDB" i "Data Source" treet, og velg den importerte mappen. Etter å ha klikket kategorien "3D" på lengst til venstre, når de "Legge i Alternativer-vinduet dukker opp, trykk OK for å importere en sekvens av bilder i mappen som en stabel.
- Endre bildet representasjon til maksimal intensitet projeksjon (MIP) format ved å klikke på ordet "MRP 'i den aksiale og koronale bildevinduer og velge" MIP "på hurtigmenyen. Deretter endre bildet tykkelse 2 mm etter å ha klikket 'TH: 0 [mm]' i de samme vinduene.
- Bruke 2 mm bredde 3D navigator bar som gir mulighet for å utforske en bildestakk og ha klippet det på et passende vinkel og plassering, utarbeide en 2 mm tykk aksialt snitt bilde med full dekning av sirkelen av Willis (COW), som havner tromber. Klikk på opptaksknappen (kameraikon) på "Output 'panel. Lagre bildet i TIFF-format.
- Deretter forberede fem 2 mm tykke koronale delen bilder som dekker contiguously fra frontallappen til lillehjernen.
- Først forberede andre skive ved forsiktig samkjøre navigatøren bar på den aksiale bildet slik at den koronale bilde beste kan visualisere MCA - ACA tromber.
- Deretter klargjør de andre fire skiver i en sammenhengende måte. Klikk på opptaksknappen (kameraikon) på "Output 'panel. Lagre bildene i TIFF-format.
4. Trombolyse og in vivo MicroCT Imaging av Cerebral blodpropp (figur 3)
- Forbered en 100 cm lang PE-en0-rør med en 30 gauge nål på den ene enden og en 1 ml sprøyte på den andre enden. Fylle røret med enten saltvann (600 ul) eller tPA (her, 24 mg / kg, 600 ul) og samtidig unngå luftbobler.
- Re-bedøve mus som beskrevet i trinn 2.1. Sett sprøytespissen i den penile blodåre til dyret. Plasser dyret forsiktig på sengen av microCT maskinen. Deretter immobilisere og stabilisere intravenøst injiserte del av katetersystemet ved taping den til sengen.
- Utfør en oppfølging bildebehandling session som forbehandling baseline. Deretter injiseres enten 60 mL fysiologisk saltvann eller tPA ved å trykke inn sprøytestempelet inn i katetersystem. Etter bolusinjeksjon, begynne å tilføre den gjenværende oppløsning (540 ul) i løpet av en tidsperiode (her, 30 min).
- Skaff microCT bilder med de samme parametrene som i trinnet 3,4 på forhåndsdefinerte tidspunkter: her, på 3 og 24 timer etter bolusinjeksjon. For å utføre følgende ex vivo NIRF thrombuss avbilding av hjernen, avlive dyret under bedøvelse ved cervikal dislokasjon.
5. Ex Vivo NIRF trombusavbilding og Triphenyl tetrazoliumklorid (TTC) Farging av hjernevevet (figur 4)
- Etter halshogging, fjerne hodebunnen og skjære gjennom skallen med saks fra foramen magnum opp mot sagittal sutur. Ta av kraniale hvelvet ved forsiktig heve kantene av radert skallen med saks samtidig unngå skade på underliggende hjernen, og dermed legger nakne halvkuler.
- Skjær ut de optiske nerver i hjernen basen så nær som mulig til hjernen overflaten, fordi de kan overlappe med kretsen av Willis arterier som skal visualiseres på NIRF avbildning. Deretter, for klart å visualisere Y-form 'MCA / ACA / distal ICA' for NIRF trombusavbilding, skjære ut den distale ICAs så langt som mulig til hjernens overflate etter forsiktig sammenpressing av cerebellar basen for å eksponere the skjærepunkter (figur 4A).
- Utfør NIRF imaging (eksitasjon / emisjon, 675/690 nm, 1 sek eksponering) av fjernet hjernevev med sin base peker opp (figur 4B, C), som visualiserer fluorescensmerkede tromboemboli i arteriene i COW (figur 4D) . Deretter foreta ytterligere bildebehandling med toppunktet av hjernen som peker opp, som visualiserer kortikale tromboemboli. Unngå tørking av hjernen ved å sette noen få dråper av saltvann på vevet.
- Ved hjelp av en hjerne matrix anordning i henhold til produsentens instruksjoner, raskt å fremstille 2 mm tykke hjerneskiver coronally: 6 stykker på 2 mm tykke skiver (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 mm fra bregma). Unngå tørking av hjernesnitt ved hjelp av saltholdige dråper, og utføre NIRF avbildning av både den fremre og bakre overflate av seksjonene.
- Sett hjerneskiver i 2% trifenyl tetrazoliumklorid (TTC) løsning i 20 min, og samtidig unngå eksponering for Light. Deretter flytter skivene i 4% formaldehyd-løsning ved 4 ° C, og samtidig unngå eksponering for lys.
6. Kvantifisering av blodpropp området ved hjelp MicroCT bilder og ImageJ (1.49d) Programvare (figur 5)
- Åpne Bilder (figur 5A).
- Åpne bildesekvens filer for å lage en stabel fil ved å velge "Fil> Importer> Bildesekvens" eller "File> Open '. Konverter bildene til 8-biters gråtoner ved å bruke "bilde> Type> 8-bit".
- Konverter Unit fra Inch til Millimeter (figur 5A).
- Når en piksel av CT-bildefiler tilsvarer 0,053 mm, bruke "Analyze> Sett Scale" for å angi '1', '0,053', og 'mm' for 'Avstand i piksler', 'kjent distanse "og" Enhet for lengde ', henholdsvis.
- Når (bare) en skala bar,ved hjelp av "Rett Linje" verktøy tegne en linje med sin lengde lik som i den målestokken. Deretter bruker 'Analyser> Sett Scale "for å angi lengden av skalaen bar i millimeter.
- Bakgrunn subtraksjon (figur 5B)
- Ved å bruke "Edit> Utvalg> Angi 'sted en sirkulær eller rektangulær region av interesse (ROI) på et område av hjernen parenchyma uten trombe eller bein-relaterte hyperdense regioner. Fordi den angitte ROI gjelder for hver bit av stabelen, sjekk for å være sikker på om det ikke er overlappet med hyperdense regioner i hver skive.
- Velg 'Plugin> ROI> BG subtraksjon fra ROI og skriv 2.0 for' Antall stdav fra gjennomsnittet '.
- Segmentering av tromboemboli-relaterte Hyperdense lesjoner (figur 5C)
- Velg "Bilde> Juster> Threshold", og skriv inn verdiene for 'Lower Threshold Nivå "og" Upper Threshold nivå "som 22 og 255, henholdsvis. Velg "Over / Under" for å vise piksler under nedre grenseverdi i blå, terskel piksler i gråtoner, og piksler over den øvre grenseverdien i grønt.
- Bruk "Freehand Selection Tool" for å trekke Rois som omgir tromboemboli relaterte hyperdense lesjoner uten å inkludere benete områder. Under tegningen, holde trykke enten [shift] eller [alt] for å legge til eller fjerne en region, henholdsvis.
Merk: Hvis hyperdense tromboemboliske lesjoner er fjernt fra beinstrukturer, i stedet for den "Freehand Selection Tool", kan "Wand Tool" trygt brukes uten å endre sin "toleranse" nivå.
- Kvantifisering av den segmenterte lesjoner (figur 5D)
- Bruk "Analyser> Sett Målinger 'å velge" området "," Mean Gray Value', og 'Integrert Tetthet (Area X Mean)9 ;. Sjekk følgende alternativer: "Begrens søket til Threshold" og "Visning etikett". Bruk "Analyser> Mål" for å få tallfestede data. Deretter lagrer resultatene som en "XLS" fil.
- Lagre stabelen fil i TIFF-format. I tillegg bruker "Analyze> Verktøy> ROI manager" for å lagre Rois.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Baseline microCT bilder, oppnås in vivo etter administrering av fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 ul) ved 1 time etter embolisk slag, tydelig visualisert cerebral trombose i MCA - ACA bifurkasjon område av den distale arteria carotis interna (Figur 6 ). Oppfølging microCT bildebehandling viste ingen endring i COW trombe med saltvann behandling. Men behandling med tPA viste en gradvis avvikling av COW tromben (blå pilspisser i Figur 6). Dette funnet viser at microCT trombusavbilding kan tillate terapeutisk overvåkning av trombolyse. Det er en utmerket overensstemmelse mellom in vivo CT tetthet og ex vivo NIRF for rest tromboemboli i 24 timer. Merk at hyperdense microCT områder på grunn av endogen blodpropp-merking av fibrin målretting AuNPs pent samlokalisert med NIRF signal områder på grunn av eksogene trombe-merking, som ble utført før embolic slag ved hjelp av en Cy5.5 fluorescerende probe følsom for koagulasjonsfaktor XHIa-mediert fibrin-tverrbinding aktivitet i prosessen med modningen av det forhåndslagede koagel (figur 6). Den kombinerte teknikk for direkte trombusavbilding for å demonstrere den tPA-mediert trombolytiske effekt skyldes histologisk slag resultat som målt ved TTC farging. TTC farging viste en klar reduksjon i mengden av iskemisk hjerneskade (hvitaktige områder i figur 6) for dyret å motta tPA trombolyse.
Fig. 1: Oversikt over Fremstilling av fluorescensmerkede tromboemboli (A) Blanding av ferskt fullblod med Cy5.5 nær infrarødt fluorescerende (NIRF) probe (C15) som er kovalent bundet til fibrin-tråder av tromben av fibrin -crosslinking enzymatisk handling av aktivert coaguningen faktor XHIa under prosessen av blodpropp modning. Den blandede blod blir injisert inn i en polyetylen (PE) -50 rør og satt hen i 24 timer for å tillate dannelse av blodpropper og modning. (B) NIRF avbildning for å bekrefte den optiske merking av tromben med C15 sonde. Legg merke til den vedvarende fluorescens etter vasking av tromben som ble fjernet fra den PE-rør. (C) blodpropp belastede PE-10 rør med en PE-50 rør modifisert til å ha en avsmalnende ende (200 um diameter) for tromboemboli i midtre cerebralarterie - fremre cerebral arterie bifurkasjon område av den indre halsarterie i mus. Skala barer. 2 mm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Oversikt over Modellering en musemodell for Thromboembolic hjerneinfarkt. (A) Laser Doppler overvåking av cerebral blodstrøm (CBF) før og etter okklusjon av den midtre cerebrale arterie (MCA), med den distale ende av den optiske fiber av laser Doppler strømningsmåler limt til venstre tinningbenet flate (1 mm til venstre og 4 mm nedenfor fra bregma). Legg merke til den post-okklusjon nedgang på Doppler CBF, som bør senkes med 30% eller lavere i forhold til baseline. (B) Innsetting av trombe inneholdende kateter (dvs. den distalt skrådd polyetylen-50 røret i figur 1C) inn i hullet i den ytre halsarterie (ECA), etterfulgt (eventuelt) ved fremføring av kateteret omtrent 9 mm inn i MCA - anterior cerebral arterie (ACA) bifurcation område av distal arteria carotis interna (ICA). CCA, felles halspulsåren; PPA, pterygopalatine arterie. Klikk her for å seen større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oversikt over In vivo MicroCT-basert direkte trombusavbilding hjelp fibrin-målrettet gull nanopartikler for å visualisere Cerebral tromboemboli og Monitor vevsplasminogenaktivator (tPA) -mediert Trombolytiske Effects (A) Intravenøs injeksjon av fibrin-målrettet glykol-kitosan gull nanopartikler. (FIB-GC-AuNPs) i en mus med tromboembolisk slag. (B) Den mus blir plassert på bunnen av en microCT imager. (C) Anskaffelse microCT bilder på 5 min etter injeksjon av løgn-GC-AuNPs. (D) Bilde gjenoppbygging å forvandle den rå bildedata i Digital Imaging og kommunikasjon i medisin (DICOM) format ved hjelp av en programvarepakke installert på microCT skanneren. (E) Bildeanalyse og utarbeidelse av aksial / coronal bilder gjengis å ha 2 mm tykkelse ved hjelp av maksimal intensitet projeksjonsmodus. (F) Intravenøs tPA-mediert trombolyse, som kan overvåkes og analyseres ved hjelp av microCT baserte direkte trombusavbilding metode. (C - E) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Oversikt over Ex Vivo nær-infrarødt Fluorescent (NIRF) Imaging av Cerebral tromboemboli (A og B) En representant hjernevev fjernet fra en mus med tromboembolisk slag.. Ta forholdsregler for ikke å miste tromboemboli (rød pil) i midten cerebral arterie (MCA) - anterior cerebral arterie (ACA) bifurcation område av distal arteria carotis interna (ICA,blå piler) i gulvet når hjernen. (C og D) Ex vivo NIRF trombusavbilding. Hjernevevet er plassert inne i lystett kammer med en NIRF imager (C) for visualisering av tromben (rød pil D) som på forhånd er merket med fluoriserende fargestoff Cy5.5 C15 før embolisk okklusjon av MCA - ACA bifurkasjon område. Sammenlign med figur 5 for CT utseende. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Oversikt over Kvantifisering blodpropp Volume hjelp MicroCT bilder og ImageJ (1.49d) (A) Importere bilder til en ny bunke fil, konvertere filformatet inn i 8-bit gråtoner, og endre enheten.mm. (B) Bakgrunn subtraksjon. (C) Segmentering av tromboemboliske lesjoner ved å tegne den regionen av interesse (ROI) rundt hyperdense områder mens unntatt benete strukturer. (D) Anskaffe de kvantitative data for avkastningen ved å bruke menyen "Analyze> Mål". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6:. Representative direkte Cerebral trombusavbilding data innsamlet før og etter behandling av strok Mus med saltvann vs. vevsplasminogenaktivator (tPA) (A) microCT (MCT) trombusavbilding for å tillate terapeutisk overvåkning av vevsplasminogenaktivator (tPA) -mediert trombolyse . (B og
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi demonstrerte bruk av to komplementære molekylære bildeteknikker for direkte trombusavbilding i eksperimentelle modeller av embolisk slag: fibrin målrettet gull nanopartikkel (fib-GC-AuNP) for in vivo microCT basert bildebehandling, og en FXIIIa målrettet optisk avbildning probe for ex vivo fluorescerende bildebehandling.
Etter intravenøs administrering av fib-GC-AuNPs, ble tromber synlig for CT som tette strukturer, på grunn av at partiklene blir innfanget i det tromber ved virkningen av de fibrin-målsøkende peptider (på overflaten av partiklene) etter konsentrasjon-gradient- avhengig diffusjon inn i den porøse struktur, dvs. tromber. Denne fremgangsmåte viste seg å forekomme i bare en retning, og raskt forårsaket den forholdsvis lave konsentrasjoner av nanopartikler i blodet til å bli konsentrert i blodproppen, og endrer dens CT tetthet tilstrekkelig til å tillate deteksjon. Den endelige in vivo microCT bildebehandling til 24 timerpent korrelert med post-mortem NIRF avbildning av den ex vivo hjernen, som viser post-tPA rester av det opprinnelige blodpropper som var blitt fluorescensmerket med den optiske sonden erkjenner den fibrin-tverrbindingsaktiviteten av FXIIIa før det plasseres på den cerebrale arterie. På denne måten to molekylær avbildning sonder, ved hjelp av ulike virkningsmekanismer og ulike bildediagnostikk, hver rapport og tverr bekrefte funnene i den andre.
Utviklingen av tromber kunne følges ved hjelp av samme metode; spesifikt, kan trombolyse med tPA følges in vivo, slik at en hurtig og riktig avlesning av hvor vellykket trombolyse som skal utføres av CT. Dette har dyptgripende konsekvenser for klinisk trombolyse, og har også forskningsarbeid for utvikling av nye antitrombotiske eller trombolytisk behandling.
Tidligere vår gruppe var i stand til å oppdage en vanlig komplikasjon i slag terapi, re-trombose tre ofte oppstår rundt en delvis behandlet blodpropp med påfølgende re-okklusjon og forverrede utfall. Re-trombose ble modellert ved å påføre en mm FeCl3 -soaked filterpapir (klasse 42) sekvensielt på 4 forskjellige steder (venstre distal CCA, venstre proksimale CCA, rett distal CCA, og deretter til høyre proksimale CCA) til forskjellige tider i de samme dyrene . I alle tilfeller, sirkulerende fib-GC-AuNP ble demonstrert akkumuleres i tromber, og gjengi disse synlig for bildebehandling med CT. Denne varighet av denne effekten ser ut til å være begrenset bare til den biologiske halveringstiden til de fib-GC-AuNP, som for tiden ikke kjent, og er blitt observert i en lengre tid (opp til 3 uker) etter den første injeksjon av fib- GC-AuNP. Dette er av stor interesse klinisk, fordi en enkelt dose av nanopartikler middel kan være effektive for å observere både suksess og nederlag av kliniske behandlingsregimer. Videre studier er nødvendig for å vurdere farmakokinetikken og biodistrisjon av fib-GC-AuNP.
Den kjemiske syntese av fib-GC-AuNPs er tidligere beskrevet i detalj 4. I korthet, fibrin-målsøkende peptider (tyrosin-D-glutamin-cystein-hydroksyprolin-L-3-chlorotyrosine-glysin-leucin-cystein-tyrosin-isoleucin-glutamin) som benyttes i EP-2104R magnetisk resonans imaging (MRI) middel 8 er syntetiseres ved standard fastfase Fmoc peptidkjemien, og konjugert til overflaten av GC-belagt AuNPs ved bruk av 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid og n-hydroksy-succinimid. Sluttproduktene, renset fib-GC-AuNPs samles ved sentrifugering.
Den C15 NIRF probe for optisk merking av på forhånd dannet trombe er et 15-aminosyrepeptid gjenkjent av FXIIIa og merket på iU aminogruppene i lysinrester 9,10 med Cy5.5 fluorescerende fargestoff. Den optiske bilde middel er kovalent bundet til fibrin tråder av tromben ved enzymatisk handling av lovenivated koagulasjonsfaktor, når det kryssbinder fibrin-tråder under prosessen med å koagulere modnings 11,12. Den kjemiske syntese av C15 NIRF tromben men da er også tidligere blitt beskrevet i detalj 4. I korthet FXIIIa affinitet peptider (glycin-asparagin-alanin-glutamat-glutamin-valin-serin-prolin-leucin-treonin-leucin-leucin-lysin-tryptofan), basert på den N-terminale ende av Alph-2-antiplasmin syntetiseres ved fast -fase peptidsyntese og deretter merket med Cy5.5 fluorokromer via cystein-sidekjeden. Ved hjelp av væskekromatografi, er produktet renset og sluttforbindelsen samles.
Suksessen til både NIRF og gull nanopartikkel agenter er sannsynligvis på grunn av de sterke biologiske design funksjonene til disse midlene. FXIIIa 11 er et fundamentalt viktig trombin-aktivert tetramert transglutaminase, koaguleringen enzym som medierer fibrinolytisk motstand. Aktiviteten av denneEnzymet er å anse som et kjennetegn på nydannede blodpropper. Begge våre agenter samhandle sterkt med denne grunnleggende blodkoagulering enzym (ved FXIIIa-sensing C15 optisk agent) eller dets substrat (av fibrin-targeting fib-GC-AuNP CT agent).
Co-lokaliseringsstudier viste at det var en utmerket overensstemmelse mellom ex vivo fluorescens (eksogene trombe markør) og in vivo microCT-tetthet (endogen trombus markør) for cerebral blodpropper avbildes med fibrin-bindende nanopartikler, som er forventet, på grunn av den innbyrdes relaterte biologiske entrapment mekanismer for både agenter.
Det er flere ting du bør vurdere når du bruker dual-modal direkte trombusavbilding teknikk. Først, for å hindre fib-GC-AuNPs fra aggregering og for å oppnå biokompatibilitet er glykol kitosan brukes til overflatebehandling 13. Før intravenøs injeksjon bør imidlertid trombusavbilding midlet resuspenDED i PBS og sonikert for å sikre oppløsning og dispersjon av nanopartikler. Videre kan nanopartikkel stabilitet vurderes ved hjelp av ultrafiolett-synlig (UV-Vis) absorpsjon spektroskopi for å sammenligne overflate plasmon resonanstopper ferske vs gamle lagre av fib-GC-AuNPs, som begge bør være på ca 519 nm.
For det andre kan oppløsningen av microCT trombe bilder kan forbedres ved å endre skanneparametere: for eksempel øke «Let Number 'fra 600 til 1200 skiver eller øke" gjennomsnittlig "1-3, noe som vil derimot øke tiden det tar å fullføre skanningen.
For det tredje, blod og C15 NIRF avbildningsmiddel ble blandet i et forhold på 7: 3 5 for det fluorescerende merking av trombe i denne studien. Ifølge vår erfaring, kan et relativt lavt blodvolum hemme trombe formasjon, mens en relativt høy blodvolum kan redusere detectability av trombenpå grunn av dempningen av ex vivo fluorescerende signalgivende fra tromben. Dessuten er det bemerkelsesverdig at flere forskjellige fremgangsmåter kan anvendes for fluorescerende visualisering av forskjellige komponenter av en trombe 14.
For det fjerde, sammenlignet med FeCl3 -mediert in situ trombose modell hvor målet arterien er bare delvis okkluderte, microCT visualisering av cerebral tromboemboli som fullstendig okkludere karet krever relativt høye doser av fib-GC-AuNPs 4. Dermed kan det være toksisitet bekymringer, selv om gull kolloider anses å være biokompatible og fib-GC-AuNPs viste ikke merkbar systemisk / nevrotoksisitet i en tidligere studie 4.
Femte, kliniske studier viste at blodplate målrettet eller fibrin-målrettet gadolinium (Gd) -baserte MRI-midler kan øke hyperintensity av tromber i hjertekamrene, carotis, og aortabuen på T1-vektede bilder 15. Selv om MRI har en utmerket myk vev kontrast og en høy romlig oppløsning, er MR en tidkrevende test. CT lider av relativt dårlig bløtvev kontrast, men CT kan utføres raskt. Følgelig CT er fortsatt den mest brukte avbildningsteknikk i akutt behandling av slag 16. Videre gjør microCT systemer for små dyr avbildning ikke kreve arkitektonisk strålevern som skal installeres, og tilbyr høy oppløsning. Således microCT kombinert med ex vivo reflektans fluorescens avbildning eller in vivo fluorescens tomografi 17 er meget nyttig for små dyr forskning. Alternativt MR / CT dual-modal avbildning ved hjelp Au-Fe nanopartikler 18-20 kan også være en kraftig plattform for trombusavbilding hos både dyr og mennesker; MR og CT kunne utfylle hverandre og, i motsetning til optisk imaging, har de ikke lider av den lave vevspenetrasjon problem.
innhold "> I konklusjonen, kombinert CT og fluorescerende bildebehandling for direkte trombe visualisering er et kraftig forskningsverktøy for etterforskningen av iskemisk hjerneslag, og lover å forbedre deteksjonen av tromben, overvåking av terapi, og påvisning av re-trombose kompliserer terapi. i tillegg er det et betydelig potensial for kliniske anvendelser av disse teknikker.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, CH.A, og KK er patent innehavere av fibrin-målrettet gull nanopartikler (10-1474063-0000, koreansk Intellectual Property Office). De øvrige forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Korea Healthcare Technology R & D Project, Helse- og velferd (HI12C1847, HI12C0066), Bio & Medical Technology Development Program (2010-0019862) og Global Research Lab (GRL) program (NRF-2015K1A1A2028228) av National Research Foundation, finansiert av den koreanske regjeringen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
