Summary
Этот протокол описывает применение комбинированных ближней инфракрасной области спектра флуоресцентные (NIRF) изображений и микро-компьютерная томография (microCT) для визуализации церебральной тромбоэмболию. Этот метод позволяет количественно оценить бремя тромба и эволюции. Метод визуализации NIRF визуализирует флуоресцентно меченных тромб в вырезанной головного мозга, в то время как метод microCT визуализирует тромбы внутри живых животных с использованием золотосодержащих наночастиц.
Abstract
Прямая визуализация тромба визуализирует основную причину тромбоэмболических миокарда. Будучи в состоянии тромба изображения непосредственно позволяет намного лучше исследовать инсульта, чем полагаться на косвенные измерения, и будет мощным и надежным инструментом исследования сосудистой системы. Мы используем подход оптического изображения, что метки тромбы с молекулярной визуализации тромба маркером - Cy5.5 ближней инфракрасной области флуоресцентный (NIRF) зонд, который ковалентно связан с нитями фибрина тромба фибрином-сшивающий ферментное действие активированного фактора свертывания крови XIIIa во время процесса созревания сгустка. Микро-компьютерная томография (microCT) основе подход использует наночастицы золота тромба ищущим (AuNPs) функционализированные целевой основной компонент сгустка: фибрина. В данной статье описывается подробный протокол для комбинированной в естественных условиях microCT и экс естественных условиях NIRF визуализации тромбоэмболию в модели мыши эмболии инсульта. Покажем , что в естественных условиях </ EM> microCT и фибрина таргетингом гликоль-хитозан AuNPs (FIB-GC-AuNPs) может быть использован для визуализации как в месте тромбов и церебральной эмболии тромбов. Мы также описывают применение в естественных условиях microCT на основе прямой визуализации тромбов , чтобы последовательно контролировать терапевтический эффект тканевого активатора плазминогена-опосредованной тромболизиса. После последней сессии изображений, мы демонстрируем экс естественных условиях NIRF визуализации степень и распределение остаточного тромбоэмболию в головном мозге. Наконец, мы опишем количественный анализ изображения данных изображений microCT и NIRF. Комбинированная методика прямого тромба визуализации позволяет использовать два независимых метода визуализации тромба для сравнения: площадь тромба , связанных с флуоресцентного сигнала на ех естественных условиях NIRF формирования изображения по сравнению с объемом сверхплотный microCT тромбов в естественных условиях.
Introduction
Один из 6 человек будет иметь инсульт в какой-то момент в их жизни. Ишемический инсульт является на сегодняшний день наиболее распространенный тип инсульта, на долю которого приходится около 80 процентов всех случаев инсульта. Поскольку тромбоэмболию вызывают большинство этих ишемических инсультов, существует растущий интерес к прямым тромба визуализации.
Было подсчитано , что около 2 миллионов клеток мозга умирают в течение каждой минуты окклюзии средней мозговой артерии 1, что приводит к лозунгу «Время мозга». Компьютерная томография (КТ) исследования может быть сделано быстро и широко доступны; по этой причине, КТ остается визуализация выбора для начальной диагностики и лечения гиперострой ишемического инсульта. КТ является особенно ценным для информирования критических ранних решений: введение активатора тканевого плазминогена (ТАП) для тромболизиса и / или сортировкой к эндоваскулярной сгустка-поиска 2. Текущие КТ на основе тромб формирования изображения, однако, не может последовательно отслеживать Cerebraл тромбоэмболию в естественных условиях, так как он использует косвенные методы для демонстрации тромбы: после того, как помутнение пула крови по йодированного Напротив, тромбы демонстрируются , как дефекты наполнения в сосудах. Есть предельно допустимые дозы облучения и риски, связанные с повторным введением йодированного контраста, которые исключают возможность повторных визуализации тромбов таким образом.
Таким образом, существует острая необходимость в прямой методики визуализации для мозгового тромбов у пациентов, перенесших инсульт, чтобы быстрее и лучше решения в отношении лечения должны быть сделаны. Мы предлагаем для достижения этой цели путем повышения значения трансформатора тока, используемого в настоящее время фронтовой методом визуализации инсульта, с использованием тромба ищущим nanoparticular агента молекулярной визуализации.
Мы продемонстрировали использование этого агента с помощью микро-компьютерной томографии (microCT), с высокой разрешающей способностью ех естественных условиях или в естественных условиях (мелких животных) версии изображений КТ , что позволяет получать быстрые данные <SUP> 3,4. Даже при относительно плохой контраст мягких тканей, доступных для мелких животных microCT (намного хуже, чем доступно от сканеров человека размера), агент визуализации смог найти и пометить тромбы, сделав их гиперплотной на КТ, а 'плотном знак сосуда "усиливается молекулярно изображений.
Дополняя технику КТ, наша группа ранее разработала оптический прямой метод тромб изображений с использованием Cy5.5 ближней инфракрасной области спектра флуоресцентные (NIRF) зонд для визуализации церебральной тромба нагрузку 5. Это бывший естественных условиях техника на посмертном мозге, но очень чувствителен, и служит для подтверждения в данных естественных условиях в условиях исследования.
Имея как КТ и NIRF на основе тромба ищущим методов визуализации позволяет сравнить и сопоставить эти методы, чтобы достигнуть высоко информативные данные о роли тромба и визуализации тромба в процессе развития ишемического инсульта.
ЧАСERE, мы описываем подробный протокол комбинированной методики microCT в естественных условиях и бывших естественных NIRF визуализации непосредственно визуализировать тромбоэмболию в модели мыши эмболии инсульта. Эти простые и надежные методы полезны для улучшения нашего понимания тромботических заболеваний, позволяя точный в естественных условиях оценки тромба бремени / распределения и характеристики эволюции динамической тромба в быстрое и количественном выражении в естественных условиях во время терапии, после чего экс естественных данных , который служит в качестве контроля и эталона для подтверждения результатов визуализации в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры на животных продемонстрировали в этом протоколе были рассмотрены и одобрены Ilsan животных больницы по уходу и использованию комитета Тонгук Университетской и проводится в соответствии с принципами и процедурами, изложенными в Руководстве NIH по уходу и использованию животных.
1. Получение экзогенно Сформированный Сгусток Маркированный с флуоресцентной Marker (Рисунок 1)
- Обезболить мышь в индукционной камере с использованием 3% изофлуран смешивают с 30% кислорода (1,5 л / мин 100% кислорода). Обеспечить достаточную глубину анестезии, наблюдая мышечного тонуса и подтверждая отсутствие пальца щепоткой рефлекса.
- Поместите животное на стерильной драпировки в положении лежа, и держать его под анестезией с использованием маски для ингаляции и 2% изофлуран, смешанный с 30% кислорода. Выполните следующие процедуры с использованием асептических методов и стерильные халаты / маски / перчатки / инструменты. Поддержание стерильных условий путем очистки и дезинфекции экспериментальную зону с 70% -ным спиртом до того,й после процедур.
- Собрать около 300 ~ 1000 мкл артериальной крови после пункции сердца 6. Смешайте 70 мкл цельной крови с 30 мкл C15 зонда 5 (20 мкмоль / л) концентрации, в Cy5.5 флуоресцентного зонда , чувствительного к фибрин-сшивающий активности активированного фактора XIII (FXIIIa) коагуляция фермента, чтобы флуоресцентно отметить сгустка (рис 1A ). Внедрить смешанную кровь с помощью 3 мл шприц (23 калибр иглы) в 20 см длиной полиэтиленовой трубы (ПЭ-50, ID 0,58 мм). ПЭ труб должны быть стерилизованы (сертифицирован или стерильным производителем) и сгустки должны быть подготовлены асептически в капюшоне культуры ткани.
- Проверьте смерть животного, наблюдая отсутствие дыхания и сердечного пульса.
- Оставьте кровь загруженным ампуле при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем при температуре 4 ° С в течение 22 ч, и выполняют следующие процедуры, как сообщалось ранее 7.
- Обрежьте тромба содержащих трубку в 1,5 см-длинные куски, С помощью 3 мл шприц, заполненный фосфатно-солевым буфером (PBS), выталкивать тромб на ФБФР-содержащей пластину 6-луночный, осторожно инъекционного PBS в каждую часть трубки. Промыть тромбов три раза PBS (Фиг.1В).
- Нагрузка дистальный концевой участок 15 см длиной ПЭ-10 трубки (ID 0,28 мм) с 1,5 см длиной тромба путем тщательно выводили промытый тромб, избегая при этом пузырьки воздуха, используя заполненные физиологическим раствором 1 мл шприц с 30 датчик иглы, которая вставляется в проксимальный конец трубки.
- Подключение тромба загруженным ПЭ-10 трубки с длиной 3 см трубки ПЭ-50 (ID 0,58 мм) модифицированной таким образом, имеют конусный конец (ID 200 мкм), которые будут размещены на средней мозговой артерии (MCA) - передняя мозговая артерии (ПМА) бифуркация площадь внутренней сонной артерии (ВСА) в модели мыши эмболии инсульта (Рисунок 1С).
2. Моделирование мышиной модели тромбоэмболических Stroke (Рисунок 2)
- AnesthetizЭА мышиные гладить , как сообщалось ранее 7 в индукционной камере с использованием 3% изофлуран смешивают с 30% кислорода (1,5 л / мин). Вводят мелоксикам (5 мг / кг) подкожно, чтобы облегчить послеоперационную боль. Обеспечить достаточную глубину анестезии, наблюдая мышечного тонуса и подтверждая отсутствие пальца щепоткой рефлекса.
- Нанесите небольшое количество мази в ветеринарии для каждого глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии. Выполните следующие хирургические процедуры с использованием асептических методов и стерильные халаты / маски / перчатки / инструменты. Поддержание стерильных условий путем очистки и перед дезинфицирующим хирургическую область с 70% алкоголя, во время и после операции.
- Перемещение мыши на операционном столе. Поместите животное на стерильной драпировки в положении лежа, и держать его под анестезией с использованием маски для ингаляции и 2% изофлуран. Затем зажать температуру тела при 36,5 ° С, используя теплокровных одеяло с обратной связью от ректального термометра.
- После того, как Surgiкал Prep бетадин и 70% спирта, делают вертикальный разрез длиной 1 см с помощью скальпель на кожу головы между левым ухом и глазом. Клей дистальный конец оптического волокна лазерного доплеровского расходомера на открытую левой височной кости поверхности (1 мм слева и 4 мм ниже от темени). Затем начать мониторинг потока Доплера (рис 2A).
- Лягте животное. Выпрямите шею, потянув за верхний передний зуб со строкой, прикрепленной к булавкой и брить область шеи. Затем, сделайте 3 см по вертикали срединный разрез, распространение ее открытой, и выставить область лампы левой сонной рассечением пери-сосудистых мягких тканей. Будьте осторожны, чтобы не повредить блуждающий нерв.
- Перевязывать левую проксимальных общей сонной артерии (CCA) с помощью стерильного 6-0 черный шелковый шов, и лигируют левой ВСА и левой крылонебной артерии (PPA), используя стерильные 7-0 черные шелковые швы.
- Cauterize левой верхней щитовидной артерии, которая является ветвью USI левой наружной сонной артериинг однополярного электрического прижигание, и перевязывать левую проксимального наружную сонную артерию (ECA) свободно и более дистальный участок плотно, используя стерильные 7-0 черные шелковые швы.
- Использование микро-ножницы, сделать небольшое отверстие (около 0,2 ~ 0,25 мкм в диаметре) между лигировали участков ЭКА.
- Вставьте тромба содержащего катетер в отверстие в ЕСА при ослаблении проксимального ECA перевязку. Затянуть проксимального ECA перевязки снова после продвижения катетера в ОСА, чтобы CINCH катетер на месте.
- Cauterize сократить дистальной части ECA, которая дистально по отношению к дистальному сайта лигирования, и повернуть свободный проксимальный ECA по часовой стрелке, чтобы привести его в направлении МКА при выводе катетера из CCA. Затем продвигать катетер около 9 мм в MCA - бифуркационной области ACA дистального ВСА сразу после того, как рыхление перевязку ICA. Затем затяните лигирование ICA.
- Поместите тромб в области бифуркации, осторожнонажав шприца 1 мл для введения тромб. Проверьте снижение Доплера мозгового кровотока (CBF), которая должна быть снижена на 30% или ниже по сравнению с исходным уровнем, если тромб успешно окклюзия сосуда (рис 2B).
- Удалите катетер, и немедленно и плотно перевязывать проксимального сайт ECA. Кроме того, unligate ОАС и PPA.
- Закройте место разреза, используя 6-0 шелковыми швами. Прекратить анестезию после продолжения доплеровское в течение необходимого промежутка времени (здесь, в течение 30 мин после инъекции тромба). Возвращает мышь в пустую клетку, и держать его теплым с нагревательным лампой. Не оставляйте мышь без присмотра, пока он не получил достаточного сознания для поддержания грудины лежачее.
3. В Vivo MicroCT визуализации церебральной тромб (Рисунок 3)
- Повторно анестезию мыши с 2% изофлуран, как описано на стадии 2.1 в заранее заданный временной точке (здесь, 1 час) после началаэмболических инсульта из-за расположения тромба в артерии головного мозга. Обеспечить достаточную глубину анестезии, подтвердив отсутствие пальца щепоткой рефлекса. Нанесите небольшое количество мази в ветеринарии для каждого глаза, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Ресуспендируют фибрин ориентированные на наночастицы золота (FIB-GC-AuNP 4) при концентрации 10 мг Au / мл в 10 мМ PBS, и разрушать ультразвуком агент тромб формирования изображения в течение 30 мин , чтобы обеспечить растворение и дисперсию наночастиц. Вводят 300 мкл Фибо-GC-AuNP (10 мг / мл) в половом члене вены.
- Место животное на кровати в microCT машины и выпрямить шею, потянув за верхний передний зуб со строкой, прикрепленной к булавку, чтобы уменьшить артефакты движения.
- В 5 мин после инъекции Фибо-GC-AuNP, начинают получать microCT изображения головного мозга. Для экспериментов , описанных здесь, используют следующие параметры изображения: 65 КВП, 60 мкА, 26,7 х 26,7 х 27,9 мм 3 поля зрения, 0,053 х 0,053 х 0,054 мм 3 размер воксела, 100 миллисекунд на кадр, 1 усреднения, 360 просмотров, 512 х 512 матрица реконструкции, 600 ломтиков, 64 сек Время сканирования.
- Возвращает мышь в пустую клетку, и держать его теплым с нагревательным лампой. Не оставляйте мышь без присмотра, пока он не получил достаточного сознания для поддержания грудины лежачее.
- Преобразование исходных данных изображения в цифровой обработки изображений и коммуникации в формате DICOM (Medicine) с помощью команды "Пуск" на панели "Реконструкция" в пакете программного обеспечения , установленного на сканере microCT.
- Для количественного анализа изображений (на этапе 6), преобразование данных в формат DICOM TIFF с использованием коммерчески доступного пакета программного обеспечения в соответствии с инструкциями изготовителя.
- Для качественного анализа, а также количественный анализ в более простой и быстрый способ, с помощью пакета программного обеспечения и оригинальные 0,054 мм толщиной изображения в формате DICOM для создания нового набораосевые и корональной изображения, оказанные иметь 1 или 2 мм (здесь, 2 мм) толщиной, следующим образом.
- Выберите папку DICOM на дереве "Источник данных", щелкните правой кнопкой мыши, а затем импортировать папку 'MasterDB' или 'PrivateDB'.
- Нажмите 'MasterDB' или '' PrivateDB в дереве "Источник данных" и выберите импортируемый папку. После нажатия на вкладку "3D" на крайней левой панели , когда окно "Загрузка Параметры" всплывает, нажмите "OK" , чтобы импортировать последовательность изображений в папке в виде стека.
- Измените представление изображения в формате проекция максимальной интенсивности (MIP), нажав на слово "MRP" в осевой и корональных окна изображения и выбирая "MIP" на всплывающем меню. Затем измените толщину изображения до 2 мм после нажатия 'TH: 0 [мм]' в тех же окнах.
- Используя 2 мм Ширина 3D наvigator бар, что позволяет исследовать стек изображения и разделки его под соответствующим углом и местоположению, подготовить 2 мм толщиной осевое сечение изображение с полным охватом круга Уиллиса (КПС), которая укрывает тромбы. Нажмите кнопку съемки (значок камеры) на панели "Output". Сохранить изображение в формате TIFF.
- Затем готовят пять толщиной 2 мм корональные разделе изображений, которые покрывают смежно от лобной доли мозжечка.
- Во-первых, подготовить второй кусочек, тщательно выравнивая планку навигатор от осевого изображения таким образом, что корональные изображение может наилучшим образом визуализировать MCA - тромбы ACA.
- Далее, подготовить остальные четыре ломтика в непрерывном пути. Нажмите кнопку съемки (значок камеры) на панели "Output". Сохранение изображений в формате TIFF.
4. тромболизиса и в естественных условиях MicroCT визуализации церебральной тромб (Рисунок 3)
- Готовят в длину 100 см PE-10 трубка с иглой калибра 30 на одном конце и 1 мл шприца, на другом конце. Заполните пробирку либо физиологическим раствором (600 мкл), или ТАП (здесь, 24 мг / кг, 600 мкл), избегая при этом пузырьки воздуха.
- Re-обезболить мышь, как описано на стадии 2.1. Вставьте кончик иглы в пределах пенильной вену животного. Поместите животное осторожно на ложе microCT машины. Затем, иммобилизации и стабилизировать внутривенно часть системы катетера пластырем его к кровати.
- Выполните последующую сессию формирования изображения в качестве предварительной обработки исходных условий. Затем вводят либо 60 мкл физиологического раствора или ТАП путем нажатия на поршень шприца в систему катетера. После болюсной инъекции, начинают вливать оставшийся раствор (540 мкл) в течение периода времени (здесь, 30 мин).
- Получить microCT изображения, используя те же параметры, что и в шаге 3.4 на заранее определенные моменты времени: здесь, на 3 и 24 ч после болюсной инъекции. Для того, чтобы выполнить следующие действия ех естественных NIRF тромбофлебитШина томография головного мозга, эвтаназии животных под анестезией путем цервикальной дислокации.
5. Ex Vivo NIRF Тромб визуализации и трифенил тетразолия Хлорид (TTC) Окрашивание ткани головного мозга (Рисунок 4)
- После того, как обезглавливание, снимите кожу головы и вырезать через череп с ножницами из затылочного отверстия вверх в сторону сагиттального шва. Удалите черепной коробки, осторожно поднимая края вырезанной черепа с помощью ножниц, избегая травм к нижележащему мозга, тем самым обнажая полушарий.
- Вырежьте зрительных нервов в мозге базы как можно ближе к поверхности мозга, так как они могут частично совпадать с кругом Willis артерий, которые должны быть визуализированы на визуализации NIRF. Затем, для того, чтобы четко визуализировать Y-образную форму 'MCA / АСА / дистальный ICA' для визуализации NIRF тромба, вырезали дистальную ОцИК, насколько это возможно, к поверхности мозга после того, как нежно сжимая мозжечковая основание разоблачить-йе точки резания (рис. 4А)
- Выполните NIRF томографию (возбуждение / излучение, 675/690 нм; 1 сек экспозиции) удаляемого ткани мозга с его основание направлен вверх (рис 4B, C), который визуализирует флуоресцентно меченого тромбоэмболию в артериях КПС (рис 4D) , Затем выполнить дополнительные визуализации с вершиной мозга направлен вверх, который визуализирует корковых тромбоэмболию. Избегайте сушки мозга, поставив несколько капель физиологического раствора на ткани.
- Используя матрицу мозга устройства в соответствии с инструкциями изготовителя, быстро подготовить толщиной 2 мм срезах мозга коронковой: 6 кусков толщиной 2 мм ломтиков (2,3, 0,3, -1,7, -3,7, -5,7 мм от темени). Избегайте высыхания срезах мозга с помощью солевых капель, а также выполнять NIRF визуализацию на передней и задней поверхности секций.
- Помещенный срезах мозга в 2% растворе хлорида трифенил тетразолия (TTC) в течение 20 мин, в то время как избежать контакта LIGHт. Затем переместите ломтиков в 4% -ный раствор формальдегида при 4 ° С, в то время как избежать воздействия света.
6. Количественное тромба района с использованием MicroCT изображений и ImageJ (1.49d) Программное обеспечение (рисунок 5)
- Открыть изображения (рис. 5А)
- Открытые файлы последовательности изображений для создания файла стека, выбрав "Файл> Импорт> последовательность изображений" или "Файл> Открыть". Преобразование изображения в 8-битные оттенки серого с помощью 'Image> Type> 8 бит'.
- Преобразовать блок от дюйма до миллиметрового (рис 5А).
- Когда один пиксель файлов CT изображения соответствует 0,053 мм, используйте 'Анализировать> Set Scale »для входа в ' 1 ',' 0,053 ', и' мм 'для' Расстояние в пикселях ',' Известное расстояние 'и' единица длины 'соответственно.
- Когда (только) шкала бар доступен,с помощью инструмента «прямой линии» нарисовать линию с его длиной, равную масштабной линейки. Затем используйте "Анализ> Установить масштаб" , чтобы ввести длину шкалы бара в миллиметр.
- Вычитание фона (рис 5B)
- С помощью "Edit> Selection> Укажите 'место круглую или прямоугольную область интереса (ROI) на площади паренхимы мозга без тромба или связанных с костями регионов гиперплотной. Поскольку указанный ROI относится к каждому ломтиком стека, проверьте, чтобы быть уверенным, если он не перекрывается с гиперплотной областей в каждом срезе.
- Выберите 'Plugin> ROI> BG вычитания из ROI "и введите 2.0 для' Количество СТАНДОТКЛОН от среднего значения '.
- Сегментация тромбоэмболию связанных с гиперплотной поражениями (Рисунок 5C)
- Выберите 'Image> Adjust> Threshold' и введите значения 'LoWER Level Порог "и" Верхний уровень Порог ", как 22 и 255, соответственно. Выберите 'Over / Under " , чтобы отобразить пиксели ниже нижнего порогового значения в синем, порогами пикселей в оттенках серого, а пиксели выше верхнего порогового значения в зеленый цвет.
- Используйте 'Freehand Selection Tool ", чтобы нарисовать трансформирования, которые окружают тромбоэмболию, связанных с гиперплотной поражений, не включая костные участки. Во время розыгрыша, продолжайте нажимать либо [Shift] или [Alt], чтобы добавить или удалить область, соответственно.
Примечание: Если гиперплотной тромбоэмболические поражения удаленных от костных структур, вместо 'Freehand Selection Tool "," Wand Tool "можно безопасно использовать без изменения его уровня" толерантности ".
- Количественное сегментированного поражениями (рис 5D)
- Используйте 'Анализ> Установить Измерения " , чтобы выбрать« Район »,« Среднее значение серого "и" интегральная плотность (площадь X среднее)9 ;. Проверьте следующие параметры: 'Limit пороговому' и 'Display ярлык'. Используйте 'Анализ> Измерение' , чтобы получить количественные данные. Затем сохраните результаты в виде файла ".xls".
- Сохраните файл стека в формате TIFF. Кроме того, использование "Анализ> Инструменты> менеджер ROI" , чтобы сохранить трансформирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Базовые microCT изображения, полученные в естественных условиях после введения FIB-GC-AuNP (10 мг / мл, 300 мкл) на 1 ч после эмболии инсульта, четко визуализируются церебральный тромбоз в MCA - ACA область раздвоению дистального отдела внутренней сонной артерии (рисунок 6 ). Последующая деятельность по итогам формирования изображения microCT не показали никаких изменений в КПС тромба с физиологическим раствором лечения. Однако лечение ТАП показал постепенное растворение тромба КОРОВЫ (синие Arrowheads на рисунке 6). Эта находка свидетельствует о том, что microCT тромб томография может позволить терапевтический мониторинг тромболизиса. Существует отличная соответствие между плотностью в естественных условиях КТ и экс естественных условиях NIRF для остаточного тромбоэмболию в 24 ч. Обратите внимание, что сверхплотный microCT области из-за эндогенного тромба маркировки фибрином таргетирования AuNPs красиво колокализуются с сигнальными областях NIRF вследствие экзогенного тромб маркировки, которая была проведена до EMBOинсульт LIC с помощью флуоресцентного зонда Cy5.5 чувствительного к фактору свертывания крови XIIIa-опосредованной фибрином сшивающий активность в процессе созревания предварительно сформированного тромба (рисунок 6). Комбинированный метод прямого тромба визуализации для демонстрации ТПА-опосредованный эффект тромболитической отражает гистологический исход инсульта, как измерено с помощью TTC окрашивания. TTC окрашивание показали четкое снижение количества ишемического повреждения головного мозга (беловатые области на рисунке 6) для животного , получающего ТАП тромболизиса.
Рисунок 1:. Обзор Приготовление флуоресцентно меченого сгустка крови (A) Смешивание свежей цельной крови с Cy5.5 ближней инфракрасной области флуоресцентной (NIRF) зонд (C15) , который ковалентно связан с нитями фибрина тромба в фибрин -crosslinking ферментативного действия активированного coaguтаже фактор XIIIa во время процесса созревания сгустка. Приготовленный кровь вводят в полиэтилен (PE) -50 трубки и оставляли в течение 24 часов, чтобы позволить образование тромбов и созреванию. (B) NIRF изображений , чтобы подтвердить оптическую маркировку тромба с зондом C15. Обратите внимание на упорную флуоресценцию после промывания тромб, который был удален из полиэтиленовой трубки. (С) Тромб загруженным ПЭ-10 трубка с трубки ПЭ-50 для модифицированной имеют конусный конец (диаметр 200 мкм) для тромбоэмболии в средней мозговой артерии - передняя мозговая зона раздвоение артерии внутренней сонной артерии у мышей. Шкала баров:. 2 мм Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Обзор Моделирование мышиную модель Thromboembolic церебральным инфарктом. (А) лазерный доплеровский мониторинг мозгового кровотока (CBF) до и после окклюзии средней мозговой артерии (СМА), с дистальным концом оптического волокна лазерного доплеровского расходомера , приклеенной к левой височной кости поверхности (1 мм слева и 4 мм ниже от темени). Обратите внимание на снижение после окклюзия Доплера CBF, которая должна быть снижена на 30% или ниже по сравнению с исходным уровнем. (B) Вставка тромб содержащего катетер (т.е. дистально коническая полиэтилен-50 трубка на фиг.1C) в отверстие в наружной сонной артерии (ЭКА), а затем ( в конце концов), продвигая катетер около 9 мм в MCA - передней мозговой артерии (ПМА) бифуркация область дистального отдела внутренней сонной артерии (ВСА). CCA, общая сонная артерия; PPA, крылонебный артерии. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотретьувеличенная версия этой фигуры.
Рисунок 3: Обзор В естественных условиях MicroCT на основе прямого Тромб визуализации с использованием фибрина целенаправленную наночастицами золота для визуализации церебральный тромбоэмболию и монитор тканевой активатор плазминогена (ТАП) -опосредованной тромболитической эффекты (А) Внутривенная инъекция наночастиц золота фибрина таргетингом гликолей хитозан. (FIB-GC-AuNPs) у мышей с тромбоэмболических инсульта. (B) Мышь помещают на кровати в microCT томографа. (C) Получение microCT изображений через 5 мин после инъекции Фибо-GC-AuNPs. (D) реконструкция изображения для преобразования исходных данных изображения в цифровой обработки изображений и коммуникации в формате Medicine (DICOM) с помощью программного пакета , установленного на сканере microCT. (Е) Анализ изображений и подготовка осевым / сoronal изображения оказываемых иметь толщину 2 мм, используя режим максимальной интенсивности проекции. (F) Внутривенное ТАП-опосредованной тромболизис, которые могут быть проверены и проанализированы с помощью метода визуализации с прямым тромба microCT основе. (C - E) Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Обзор Ex Vivo Near-Infrared Fluorescent (NIRF) Визуализация церебральным тромбоэмболию (А и В) представитель мозговой ткани удаляется от мыши с тромбоэмболических инсульта.. Примите меры предосторожности, чтобы не потерять тромбоэмболию (красная стрелка) в средней мозговой артерии (MCA) - область передней мозговой артерии (ПМА) бифуркационную дистального отдела внутренней сонной артерии (ВСА,синие стрелки) при демонтаже мозга. (C и D) Ex естественных условиях NIRF тромб визуализации. Мозговой ткани помещается внутри светонепроницаемой камере NIRF томографа (C) для визуализации тромба (красная стрелка в D) предварительно меченных с Cy5.5 флуоресцентным маркером С15 до эмболии окклюзии MCA - ACA раздвоение площадь. Сравните на рисунке 5 для появления КТ. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Обзор Количественная тромба тома с помощью MicroCT изображений и ImageJ (1.49d) (A) Импорт изображений в новый файл стека, преобразование формата файла в 8-битной серой шкале, и переключения устройства.мм. (B) вычитание фона. (С) Сегментация тромбоэмболических поражений, нарисовав область интереса (ROI) вокруг областей гиперплотной исключая при этом костные структуры. (D) Получение количественных данных для ROI с помощью меню "Анализ> Measure". Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 6:. Представитель Прямая церебральный Тромб обработки изображений данных, зарегистрированных до и после обработки Stroked мышей физраствором против тканевого активатора плазминогена (ТАП) (А) microCT (MCT) тромба визуализации , чтобы терапевтический мониторинг активатора тканевого плазминогена (ТАП) -опосредованного тромболизис , (В и
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы продемонстрировали использование двух дополнительных методов молекулярной визуализации для прямого тромба визуализации в экспериментальных моделях эмболических инсульта: фибрин целевых наночастиц золота (FIB-GC-AuNP) для визуализации microCT основе в естественных условиях, и FXIIIa целевой оптический датчик изображения для экс Vivo флуоресцентных изображений.
После внутривенного введения Фибо-GC-AuNPs, тромбы стал видимым для КТ в плотные структуры, вызванные частицами оказаться вовлеченными в тромбы действием фибрина нацеливания пептидами (на поверхности частиц) после концентрирования-gradient- зависимой диффузии в пористую структуру, то есть тромбы. Этот процесс, как представляется, происходит только в одном направлении, и быстро вызвало относительно низкие концентрации наночастиц в крови, чтобы концентрироваться в сгустке, и изменение его плотности КТ достаточно, чтобы обнаружить. Конечный в естественных условиях microCT изображений через 24 часахорошо коррелирует с посмертном NIRF визуализации экс виво мозга, показывая после ТАП невязку начального тромбов , которые были флуоресцентно - меченного с оптическим зондом , распознающим фибрин-сшивающий активность FXIIIa перед помещением в мозговой артерии. Таким образом, два молекулярных зондов изображение, использующее различные механизмы действия и различных методов визуализации, каждого отчета и перекрестной проверки результатов другого.
Эволюция тромбов может следовать тем же способом; В частности, тромболитическая терапия с ТАП можно было бы следовать в естественных условиях, что позволяет быстрое и своевременное считывание успеха тромболизиса быть выполнены с помощью КТ. Это имеет глубокие последствия для клинической тромболизиса, а также научно-исследовательских приложений для разработки новых антитромботических или тромболитической терапии.
Раньше наша группа была в состоянии обнаружить общее осложнение в терапии инсульта, то ге-тромбоз 3 часто происходит вокруг частично обработанного сгустка, с последующей повторной окклюзии и ухудшения результатов. Re-тромбоз был смоделирован с применением 1 мм FeCl 3 -soaked фильтровальная бумага (класс 42) последовательно на 4 разных местах (левая дистальной CCA, левый проксимальный ОАС, правый дистальный ОАС, а затем правый проксимальная КДД) в разное время в одних и тех же животных , Во всех случаях, циркулирующих FIB-GC-AuNP были продемонстрированы накапливаясь в тромбы и рендеринга их видимыми для получения изображения с КТ. Эта длительность этого эффекта, как представляется, ограничивается только биологическим периодом полураспада Фибо-GC-AuNP, который в настоящее время неизвестно, и наблюдается в течение длительного времени (до 3-х недель) после первой инъекции фибринопептида GC-AuNP. Это представляет большой интерес клинически, так как разовая доза наночастицами агента может оказаться эффективным для наблюдения как успехи и неудачи клинических схем лечения. Необходимы дальнейшие исследования для оценки фармакокинетики и biodistriпределение Фибо-GC-AuNP.
Химический синтез Фибо-GC-AuNPs было ранее описано подробно 4. Вкратце, пептиды фибрин-нацеливание (тирозин-D-глутамин-цистеин-гидроксипролин-L-3-chlorotyrosine-глицин-лейцин-цистеин-тирозин-изолейцин-глютамин) , используемый в ЕР-2104R магнитно - резонансной томографии (МРТ) , агент 8 являются синтезированы стандартным твердофазным Fmoc химии пептидов, и конъюгированные с поверхности GC покрытием AuNPs с использованием 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида и н-гидроксисукцинимида. Конечные продукты, очищенные FIB-GC-AuNPs собирают центрифугированием.
С15 NIRF зонд для оптической маркировки предварительно сформированного тромба представляет собой пептид 15-аминокислоты признан FXIIIa и маркированы на е - аминогрупп остатков лизина 9,10 с флуоресцентным красителем Cy5.5. Агент оптических изображений ковалентно связан с нитями фибрина тромба путем ферментативного действия актаivated фактор свертывания, когда он сшивает нити фибрина во время процесса созревания сгустка 11,12. Химический синтез тромб маркера С15 NIRF также ранее подробно описаны 4. Вкратце, пептиды FXIIIa сродством (глицин-аспарагин-аланин-глутамат-глутамин-валин-серин-пролин-лейцин-треонин-лейцин-лейцин-лизин-триптофан) на основе N-конце Alph-2-антиплазмином синтезируются твердые -фазы синтез пептидов, а затем метили Cy5.5 флуорохромии через боковую цепь цистеина. С помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии, продукт очищают и окончательное соединение собирают.
Успех как NIRF и золотых наночастиц агентов, вероятно, из-за сильных биологических особенностей конструкции этих агентов. FXIIIa 11 является принципиально важным тромбин-активированный тетрамерная трансглютаминазы, коагуляция фермент , который посредничает фибринолитическую сопротивление. Активность этогофермент рассматривается как признак вновь образованных тромбов. Оба наши агенты сильно взаимодействуют с этой фундаментальной коагуляции крови фермента (по FXIIIa-чувствительного оптического агента C15) или его субстратом (фибрином таргетирования Фибо-GC-AuNP CT агента).
Со-локализация исследования показали , что существует отличная соответствие между ех естественных условиях флуоресценции (экзогенные тромб маркер) и в естественных условиях microCT плотности (эндогенный тромб маркер) для головного мозга тромбов изображаемого с фибрин-связывающим наночастицу, которая , как ожидается, из - за взаимно связанные биологические механизмы застойные для обоих агентов.
Есть несколько вещей, которые необходимо учитывать при использовании прямой метод двойного покадрово тромб формирования изображения. Во- первых, для предотвращения Фибо-GC-AuNPs от агрегации и для достижения биосовместимости, гликоль хитозан используется для покрытия поверхности 13. Перед внутривенным введением Однако агент тромб формирования изображения должен быть resuspenDed в PBS, и обрабатывают ультразвуком, чтобы обеспечить растворение и дисперсию наночастиц. Кроме того, стабильность в виде наночастиц может быть оценена с помощью ультрафиолетовой и видимой (UV-VIS) абсорбционной спектроскопии для сравнения поверхностного плазмонного резонанса пиков свежих против старых запасов Фибо-GC-AuNPs, оба из которых должны быть примерно в 519 нм.
Во- вторых, разрешение тромба изображений microCT может быть улучшена за счет изменения параметров сканирования: например, увеличение 'Число сканирования "от 600 до 1200 ломтиков или увеличивая" Среднее значение "от 1 до 3, который, однако , будет увеличивать время , необходимое для завершения сканирование.
В- третьих, кровь и С15 NIRF визуализирующего агента смешивали в соотношении 7: 3 5 для флуоресцентного мечения тромба в этом исследовании. По нашему опыту, относительно низкий объем крови может препятствовать образованию тромбов, в то время как относительно высокий объем крови может привести к снижению выявляемости тромбаза счет ослабления экс естественных условиях флуоресцентного сигнала , излучающей от тромба. Кроме того, следует отметить , что несколько различных подходов могут быть использованы для флуоресцентного визуализации различных компонентов тромбом 14.
В- четвертых, по сравнению с FeCl 3 -опосредованного на месте тромбоза на экспериментальной модели , где целевой артерии лишь частично перекрыта, microCT визуализация головного мозга тромбоэмболию , что полностью закупорить сосуд , требует относительно высоких доз-Фибо-GC-AuNPs 4. Таким образом, не может быть токсичность проблемы, хотя золотые коллоиды считаются биологически совместимыми и приврать-GC-AuNPs не показали заметного системного / психофизиологические токсичности в предыдущем исследовании 4.
В-пятых, клинические испытания показали, что тромбоциты целевые или фибрин-мишенью гадолиний (Gd) основе агенты МРТ может увеличить гиперинтенсивности тромбов в камерах сердца, сонных артерий и дуги аорты на T1-взвешенных изображениях 15. Несмотря на то, МРТ имеет отличный контраст мягких тканей и высокое пространственное разрешение, МРТ является тест отнимает много времени. КТ страдает от относительно плохой контраст мягких тканей, однако КТ может быть быстро выполнена. Соответственно, КТ остается наиболее широко используемый метод визуализации в остром управлении инсульта 16. Кроме того, microCT системы для небольшого изображения животных не требуют архитектурно радиационной защиты должны быть установлены, и предлагают изображения с высоким разрешением. Таким образом, microCT в сочетании с экс естественных условиях отражательной способности визуализации флуоресценции или в естественных условиях флуоресцентной томографии 17 является очень полезным для небольших исследований на животных. В качестве альтернативы, МРТ / КТ двойного модальный изображения с использованием Au-Fe наночастиц 18-20 может также быть мощной платформой для визуализации тромбов в обоих животных и человека; МРТ и КТ могут дополнять друг друга и, в отличие от оптических изображений, они не страдают от проблемы низкого проникновения в ткани.
Содержание "> В заключение, в сочетании КТ и флуоресцентной визуализации для прямой визуализации тромба является мощным инструментом исследования для изучения ишемического инсульта, пообещав улучшить обнаружение тромбов, мониторинг терапии, а также обнаружение повторного тромбоза осложняющий терапии. Кроме того, существует значительный потенциал для клинического применения этих методов.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
DE.K., JY.K, Ch.A и KK являются патентодержатели фибрина, ориентированных наночастиц золота (10-1474063-0000, Корейский ведомство интеллектуальной собственности). Остальные авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Корея Healthcare Technology R & D проекта, Министерство здравоохранения и социального обеспечения (HI12C1847, HI12C0066), Программа Bio & Medical Technology Development (2010-0019862) и Global Research Lab (ОСТ) программы (СРН-2015K1A1A2028228) из Национальный исследовательский фонд, финансируемый правительством Кореи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| ImageJ software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28 mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 ml |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 ml |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 ml |
References
- Saver, J. L. Time is brain--quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. Fisher, M. 92, Elsevier. 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. Jr In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
