Introduction
Angina pectoris er kendetegnende for koronararteriesygdom og begrebet epikardiel stenose forårsager myokardieiskæmi og anstrengelsesudløst angina er blevet etableret i mange år. Men mange patienter med angina pectoris ikke den typiske triade af retrosternal smerte, debut under træning og lindring ved nitroglycerin eller hvile. Ofte patienter rapporterer angina pectoris i hvile eller en kombination af anstrengelses og hvile angina samt åndenød ved anstrengelse som en mulig angina tilsvarende. I 1959 Prinzmetal var den første til at introducere begrebet forbigående spasmer af kranspulsårerne forårsager angina i hvile forbundet med ST-segment elevation på elektrokardiogram (EKG), men med bevaret motion kapacitet 1. Denne hypotese blev bekræftet senere med koronar angiografi og det viste sig, at koronar spasme kan være til stede i patienter med epikardiale stenoser eller normale koronararterier 2. I 1980ies intrakoronar acetylcholin provokation test (ACH-test) til påvisning af koronar spasmer blev etableret i Japan og efterfølgende interesseret i klinisk forskning for koronar spasmer steg 3.
Men efter indførelsen af perkutan koronar intervention i 1977 og den første stent implantation i 1986 interessen for koronar vasomotoriske lidelser faldet betydeligt i hvert fald i Europa og USA. Dette kan også skyldes den invasive natur af ACH-test (på grund af den korte halveringstid af ACH det kan kun indgives i koronararterierne for vurdering af koronar spasme). Stadig, mange patienter med tegn og symptomer på myokardieiskæmi ikke have nogen relevant epikardial stenose på koronar angiografi 4,5,6. I sådanne patienter intrakoronar acetylcholin provokation test er nyttigt at opdage en klinisk relevant koronar vasomotorisk uorden og indføre passende medicinsk behandling Acetylcholin er en neurotransmitter i det parasympatiske nervesystem. Det virker via nikotinerge samt muscarinergic (mAChR) receptorer. Sidstnævnte er vigtige for vaskulær homeostase og acetylcholin binder på mAChR som en ikke-selektiv agonist. Aktivering af disse receptorer på endotel niveau fører til nitrogenoxid medieret vasodilatation henviser aktivering af mAChR på de vaskulære glatte muskelceller fører til vasokonstriktion 8. Afhængigt af integriteten af endotelet og reaktiviteten af de glatte muskelceller nettoeffekten af intrakoronar acetylcholin administration er vasodilatation eller vasokonstriktion. Den fysiologiske reaktion af koronararterier som reaktion på acetylcholin med mennesker er ikke fuldt forstået, men det er blevet rapporteret, at vasodilatation samt vasokonstriktion på op til 25% af diameteren fartøj kan være fysiologisk som vist i patienter med normale koronararterier og ingen angina pecToris 9. Intrakoronar acetylcholin provokation test er blevet anbefalet af European Society of Cardiology retningslinjer 10 samt de japanske Circulation Society retningslinjer 11 for vurdering af epicardiale og / eller mikrovaskulære krampe hos patienter med angina pectoris og uhindret kranspulsårerne. Intrakoronar acetylcholin provokation test er blevet etableret i daglig klinisk rutine i kateterisation laboratorium vores institution i 2003. Siden 2006 en standardiseret protokol er blevet fulgt 12. ACH-test er generelt udført i alle patienter med tegn og symptomer på myokardieiskæmi endnu ingen relevante epikardial stenose (<50%) på koronar angiografi. ACH-undersøgelserne udføres umiddelbart efter diagnostisk koronar angiografi ifølge protokollen beskrevet nedenfor. Ergonovin er et andet middel, der anvendes til krampe provokation test med en anden virkningsmekanisme. detaljeretoplysninger om ergonovin test kan findes andre steder 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
BEMÆRK: Intracardiac acetylcholin test er blevet godkendt af den lokale etiske komité og protokollen følger retningslinjerne i vores institution til human forskning.
1. Fremstilling af acetylcholinet Solutions (se Materialer tabel)
- Bland 20 mg acetylcholin med de 2 ml solvens følger med pakken.
- Tilsæt 2 ml ACH-opløsning til 98 ml NaCl 0,9%. Dette svarer til en dosis på 0,2 mg / ml og kaldes stamopløsning 1. Tilsæt 9 ml stock opløsning 1 til 91 ml NaCl 0,9%, svarer dette til en dosis på 18 ug / ml og kaldes stamopløsning 2.
- Forbered 3 perfusion sprøjter (hver på 50 ml) er mærket som "høj", "middel" og "lav". Fyld perfusion sprøjte en mærket "høj" med 40 ml stamopløsning 2.
- Fyld perfusion sprøjten 2 (mærket "medium") med 8 ml af perfusion sprøjte 1 (høj), og der tilsættes 32 ml NaCl 0,9%. Dette svarer til endosis på 3,6 ug / ml.
- Fyld perfusion sprøjten 3 (mærket "lav") med 4 ml af perfusion sprøjten 2 (medium), og der tilsættes 36 ml NaCl 0,9%. Dette svarer til en dosis på 0,36 ug / ml.
2. Forberedelse af sprøjter Intracardiac Injektion af Acetylcholin
- Forbered 5 sprøjter for intrakoronar injektion (4 sprøjter med 5 ml [# 1, # 2, # 3, # 4] og 1 sprøjte på 10 ml).
- Fyld 5 ml sprøjte # 1 med 6 ml fra perfusion sprøjte mærket "lav" (se trin 1.5). Dette svarer til en dosis på ca. 2 ug.
- Fyld 5 ml sprøjte # 2 med 6 ml fra perfusion sprøjte mærket "medium". Dette svarer til en dosis på ca. 20 ug.
- Fyld 5 ml sprøjte # 3 med 5,5 ml fra perfusion sprøjte mærket "høj". Dette svarer til en dosis på ca. 100 ug.
- Fyld 10 ml sprøjte med 11 ml fra perfusion sprøjten mærket4;. Høj "Dette svarer til en dosis på ca. 200 mg.
- Fyld 5 ml sprøjte # 4 med 4,5 ml fra perfusion sprøjte mærket "høj". Dette svarer til en dosis på ca. 80 ug. Put denne sprøjte til side og kun bruge den til vurdering af den højre kranspulsåre.
3. Diagnostisk koronarangiografi
- Injicer lokalbedøvelse enten i nærheden af den højre radiale arterie (sædvanligvis 2 ml mepivacain) eller i nærheden af den højre femorale arterie (normalt 15 ml mepivacain).
- Bekræft succes lokalbedøvelse er ved at prikke den bedøvet-huden med nålen og spørge patienten, hvis smerten er stadig til stede.
- Punktere arterie i henhold til Seldinger teknik 13 med en kanyle, og sæt derefter ledningen gennem kanylen og fjern det. Sæt kappen (sædvanligvis 5F) over tråden. Udfør koronar angiografi under sterile betingelser.
- Advance wire thru hylsteret til aorta ascendens og placer diagnostiske kateter over aortaklappen. Derefter fjerne ledninger og forbinde kateteret med kontrast sprøjte.
BEMÆRK: kontrastmiddel indeholder iomeprol, Trometamol, saltsyre og vand. - Placer diagnostisk kateter til venstre koronararterie i venstre hovedstammen ved let trække og dreje kateteret. Bekræft korrekt positionering af kateteret ved at injicere 2 ml kontrastmiddel.
- Udfør koronar angiografi henhold til judkins teknik 14 med manuelle injektioner af ca. 10 ml modsætning til visualisere kranspulsårerne i forskellige visninger.
BEMÆRK: Normalt LAO 40 ° og RAO anvendes 35 ° til højre kranspulsåre og LAO 45 ° / CRAN 25 °, RAO 30 ° / CRAN 30 ° og RAO 20 ° / CAUD 30 ° anvendes til venstre koronararterie. - Start acetylcholin test efter udelukkelse af alle relevante epicardiale stenose (≥50%) Ved visuel vurdering.
4. Intracardiac Injektion af Acetylcholin
- Injicer 6 ml af 2 ug sprøjten # 1 i den venstre koronararterie. Indsprøjtes dette inden 20 sek med løbende overvågning af EKG og patientens symptomer (f.eks brystet smerte, åndenød, svimmelhed). Udfør koronar angiografi af den venstre koronararterie (normalt en RAO 20 ° / CAUD 30 ° projektion er bedst projektion) efter injektion af de 6 ml.
- Udfør koronar angiografi ved at injicere 10 ml kontrast manuelt via kontrasten sprøjten ind i kateteret. Den 12-bly-EKG bør registreres og udskrives efter hver dosis af acetylcholin. En pause på 1 min skal ligge mellem hver dosis.
- Injicer 6 ml af 20 ug sprøjten # 2 i den venstre koronararterie. Indsprøjtes dette inden 20 sek med løbende overvågning af EKG og patientens symptomer. Udfør koronar angiografi af den venstre koronararterie efter injektionaf de 6 ml som nævnt ovenfor.
- Injicer 5,5 ml af 100 ug sprøjten # 3 ind i den venstre kranspulsåre. Indsprøjtes dette inden 20 sek med løbende overvågning af EKG og patientens symptomer. Udfør koronar angiografi af den venstre koronararterie efter injektion af de 5,5 ml som nævnt ovenfor.
BEMÆRK: De fleste patienter rapporterer nogle symptomer, viser EKG-ændringer eller epikardial vasokonstriktion ved denne dosis. Undertiden nødt til at blive bremset hastigheden af den manuelle injektion. Som nævnt nedenfor forskellige protokoller for ACH-testing er i brug med en anden hastighed af injektion. En langsommere injektion over en periode på 3 minutter i forhold til injektionen inden 20 sek kan også være mulig. - Hvis der ikke spasmer (dvs.> 90% vasokonstriktion i forhold til den afspændte tilstand af fartøjet efter 200 ug nitroglyercine injektion) forekommer ved 100 ug dosis fortsætte med 200 ug (10 ml sprøjte) ACH dosis. Injicer 11 ml inden 20 sek med kontinuerlig monitoring af EKG og patientens symptomer.
- Udfør koronar angiografi af den venstre koronararterie efter injektion af de 11 ml som nævnt ovenfor (afsnit 3).
BEMÆRK: Selvom 200 pg dosis er anvendt i mange patienter bør det nævnes, at passende doser af intrakoronar acetylcholin mangler at blive fuldt ud defineret. Nogle forfattere foreslår, at 100 ug bør være den maksimale dosis for den venstre koronararterie.
BEMÆRK: Ofte bradykardi forekommer, og hastigheden af injektionen skal bremses. - Injicer 80 ug ACH (4,5 ml, sprøjte # 4) i den højre kranspulsåre, hvis der ikke unormale resultater ses under test af venstre koronararterie. Indsprøjtes dette inden 20 sek med løbende overvågning af EKG og patientens symptomer. Ofte bradykardi forekommer, og hastigheden af injektionen skal bremses for at forhindre langvarig bradykardi og / eller asystoli.
- Udfør koronar angiografi af højre kranspulsåreefter injektion af de 4,5 ml (normalt en LAO 40 ° / 0 ° projektion er bedst) som nævnt ovenfor (afsnit 3).
- Injicere intrakoronar nitroglycerin med en dosis på 200 ug i hver undersøgt arterie efter testen, eller når alvorlige symptomer (dvs. alvorlige brystsmerter eller svær åndenød), iskæmiske EKG forskydninger eller epikardiel spasme opstår.
- Billede skibet som nævnt i trin 4.2 efter et minut til at dokumentere reversion af krampe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fortolkning af acetylcholin Testen er baseret på tre kriterier. Først, er patienten spurgt hele testen hvorvidt symptomer opstår. Ofte, patienter rapportere en reproduktion af deres sædvanlige symptomer såsom brystsmerter, åndenød eller andre symptomer. Dette er et vigtigt punkt for den samlede fortolkning af testen. For det andet er en 12-bly-EKG registrering udføres løbende under hele testen med en særlig vægt på iskæmiske EKG skift såsom ST-segment depression, ST-segment elevation og T-bølge alternans. For det tredje er koronar angiogram gentaget efter hver dosis af acetylcholin at vurdere epikardial indsnævring i forhold til den afslappede tilstand efter nitroglycerin administration. Sidstnævnte sker visuelt, men er også gjort kvantitativt med dedikeret software bagefter. En fokal eller diffus reduktion epikardial diameter 90% i forhold til den afslappede tilstand efter nitroglycerin administra tion anses patologisk (tidligere et kriterium på 75% blev anvendt, men vi valgte at nu følge de japanske guidelines 11).
Den acetylcholin testen er begivenhedsløs, hvis ingen af de ovennævnte kriterier er opfyldt. Hvis en af ovennævnte kriterier er opfyldt (fx udelukkende reproduktion af symptomer eller iskæmiske EKG skift kun) testen betegnes utvetydig. Epikardiel coronar spasme er diagnosticeret, når en epikardial vasokonstriktion 90% i forhold til den afslappede tilstand efter nitroglycerin administration sammen med iskæmiske EKG skift og reproduktion af patientens symptomer ses (figur 1 og 2). Mikrovaskulær spasmer diagnosticeres i tilfælde af en reproduktion af patientens symptomer med iskæmiske EKG skift (sædvanligvis ST-segment depression) i løbet af ACH-test uden epikardial vasokonstriktion 90% (figur 3) 15.
t "fo: holde-together.within-side =" 1 ">
Figur 1: Diffus Epikardial Krampe Venstre kranspulsåren angiogrammer og EKG'er af en 40-årig kvindelig patient med brystsmerter i hvile viser diffus epikardial spasmer (hovedsagelig af den venstre forreste nedadgående arterie) efter 100 ug acetylcholin (øverst) med ledsagende ST-. segment depression (røde pile) og reproduktion af patientens sædvanlige symptomer. Sidstnævnte fund forsvandt efter intrakoronar nitroglycerin injektion (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Prinzmetal-Type Epikardial Krampe Venstre kranspulsåren angiogrammer og EKG'er af en 43.årig mandlig patient med brystsmerter i hvile viser omdrejningspunkt Prinzmetal-typen epikardial krampe i venstre cirkumfleks arterie efter 100 ug acetylcholin (øverst) med samtidig ST-segment elevation (røde pile) og reproduktion af patientens sædvanlige symptomer. Sidstnævnte fund forsvandt efter intrakoronar nitroglycerin injektion (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Koronar mikrovaskulære Krampe Venstre kranspulsåren angiogrammer og EKG'er af en 66 år gammel kvinde med åndenød ved anstrengelse og hvile angina viser ingen epikardial krampe efter 100 ug acetylcholin men ST-segment depression (røde pile) og reproduktion af patientens sædvanlige symptomer. Det sidstefund forsvandt efter intrakoronar nitroglycerin injektion (nederst). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det er muligt at gennemføre den acetylcholin test i daglig klinisk rutine i kateterisering laboratorium. Bortset fra udarbejdelsen af ACH-løsninger er der flere tekniske problemer, der skal løses, før du starter testen herunder radiolucent EKG fører til kontinuerlig 12-lead EKG registrering. Dette er væsentligt for at kunne detektere forbigående iskæmiske EKG-ændringer under testen. Desuden er det vigtigt at vide, at ACH løsninger kun kan bruges i 2 timer. Efter at de skal være nyligt forberedt.
Det er vigtigt at afhøre patienten om symptomer opstår under testen (kendt eller ukendt). Man skal ikke kun bede om smerter eller dyspnø i brystet, men nogen symptomer, som patienten kan opleve under testen. Derudover skal patienten spurgt, om tidligere er forekommet symptomer i hverdagen.
Ofte, ACH administration fører til bradykardi og atrio-ventricular (AV) blok. Men på grund af den korte halveringstid af acetylcholin dette er kun af kort varighed, hvis den manuelle injektion forsinkes eller kort afbrudt. Efter restaurering af normal sinusrytme acetylcholin injektion kan fortsættes med en langsommere hastighed. Imidlertid er AV-blok undertiden vedvarende og kan forårsage alvorlig bradykardi med Adams-Stokes-angreb. Således kan indsættelse af en midlertidig pacing ledning anbefales i udvalgte tilfælde.
Der er ingen aktuelle enighed om hastigheden af injektionen. Tidligere protokoller har anvendt manuelle injektioner over 3 minutter for hver dosis. Men de japanske retningslinjer anbefaler manuelle injektioner inden 20 sek. Af note, kan disse hurtigere injektioner kun være muligt, når en midlertidig pacing ledning er på plads på grund af risikoen for bradykardi, især når den højre kranspulsåre udfordres.
Hvis patienten oplever alvorlige symptomer og / eller væsentlige EKG-forandringer ses than test skal stoppes, og fartøjet skal afbildes endnu en gang. Efter at intrakoronar nitroglycerin administration skal straks udføres (normalt 200 mg). I de fleste tilfælde vil dette lindre symptomerne og vende den spasmer og EKG-forandringer. Nogle gange, ofte i patienter med mikrovaskulære spasmer, anden nitroglycerin injektion er nødvendig. I sjældne tilfælde med refraktær spasmer trods intrakoronar nitroglycerin administration atropin (eksempelvis 1 mg) administreres intravenøst som dette er antagonist af acetylkolin. Dette fører sædvanligvis til vasodilatation og forbedring af symptomerne. Generelt komplikation sats er omkring 1%, herunder fx ikke-vedvarende ventrikulær takykardi, bradykardi eller koronar dissektion. Denne sats svarer til den komplikation sats beskrevet for diagnostisk koronar angiografi 16.
Ofte vurdering af den venstre og højre kranspulsåre med acetylcholin kanikke være muligt på grund af en patologisk testresultat under vurderingen af den venstre koronararterie injektion og behovet for intrakoronar nitroglycerin injektion. Dette efter vores mening kan ændre resultaterne for højre kranspulsåre. Dog kan vurdering af sværhedsgraden af spasmer (dvs. tilstedeværelse af multikarsygdom spasmer) kun være muligt, når alle kranspulsårerne bliver udfordret.
En hyppig kritik vedrører specificitet acetylcholin test, dvs det antydes, at acetylcholin ville fremkalde koronar spasmer i enhver person, hvis dosis er kun høj nok. Faktisk er der ingen data om virkningen af intrakoronar acetylcholin test med mennesker uden koronar patologi. Men omkring 30% af patienterne udviser koronar mikrovaskulære spasmer som reaktion på acetylcholin uden relevant epikardial vasokonstriktion indikerer, at trods den høje dosis på 200 ug ACH i den venstre koronararterie epikardial spasmer ofte cannot blive provokeret. Ikke desto mindre ville en undersøgelse af raske unge frivillige vurdere virkningerne af intrakoronar acetylcholin administration være ønskeligt, selv om en sådan undersøgelse kan være vanskelig at udføre på grund af den invasive natur af acetylcholin testen.
I de senere år har det vist sig, at ACH-testen ikke kun en test til vurdering af epicardiale koronar spasme men også for koronar mikrovaskulære spasmer. Selvom koronar mikrocirkulationen ikke kan visualiseres i mennesker in vivo i øjeblikket, har kombinationen af iskæmiske EKG-ændringer under ACH-test sammen med reproduktion af patientens symptomer uden påviselig epikardial spasmer på angiografi blevet accepteret som en definition for mikrovaskulær spasmer . Således kan koronare mikrovaskulære spasme patienter betragtes som en undergruppe af patienter med koronar mikrovaskulær dysfunktion.
Fremtidige anvendelser af denne protokol kan omfatte serielle æslersments med ACH som en del af en undersøgelse af nye farmakologiske stoffer. Afhængigt farmakokinetikken af det respektive lægemiddel ACH-test kunne udføres ved baseline og efter administration af et medicin vurdering koronar vasomotion før og efter behandling. På grund af den korte halveringstid af ACH testen kun kan udføres invasivt ved at indsprøjte ACH ind kranspulsårerne. Andre stoffer, såsom ergonovin kan gives intravenøst, men det er blevet drøftet, om en sådan fremgangsmåde er lige så effektive. Desuden har andre ikke-invasive tests for provokation af koronar spasme såsom hyperventilation prøven har begrænset følsomhed og er således begrænset anvendelse 17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vial of 20 mg acetylcholine chloride powder and 1 Ampoule of 2 ml diluent | Bausch & Lomb | NDC 24 208-539-20 | |
| 3x 100 ml NaCl 0.9 % | BBraun | 3200950 | |
| 3x syringe 50 ml each | BBraun | 4187903 | |
| 1x 2 ml syringe | BBraun | 4606027V | |
| 1x 10 ml syringe | BBraun | 4606108V | |
| 2x cannula 20 G 70 mm | BBraun | 4665791 | |
| 5x 5 ml syringe | BBraun | 4606051V | |
| Contrast agent Imeron 350 with a 10 ml syringe for contrast injection | Bracco Imaging | 30699.03.00 | |
| Coronary angiography suite (AXIOM Artis MP eco ) | Siemens | n/a |
References
- Prinzmetal, M., Kennamer, R., Merliss, R., Wada, T., Bor, N. Angina pectoris. I. A variant form of angina pectoris; preliminary report. Am J Med. 27, 375-388 (1959).
- Cheng, T. O., Bashour, T., Kelser, G. A. Jr, Weiss, L., Bacos, J. Variant angina of Prinzmetal with normal coronary arteriograms. A variant of the variant. Circulation. 47 (3), 476-485 (1973).
- Yasue, H., et al. Induction of coronary artery spasm by acetylcholine in patients with variant angina: possible role of the parasympathetic nervous system in the pathogenesis of coronary artery spasm. Circulation. 74 (5), 955-963 (1986).
- Bell, M. R., Berger, P. B., Holmes, D. R. Jr, Mullany, C. J., Bailey, K. R., Gersh, B. J. Referral for coronary artery revascularization procedures after diagnostic coronary angiography: evidence for gender bias? J Am Coll Cardiol. 25 (7), 1650-1655 (1995).
- Patel, M. R., et al. Low diagnostic yield of elective coronary angiography. N Engl J Med. 362 (10), 885-895 (2010).
- Pocock, S. J., Henderson, R. A., Seed, P., Treasure, T., Hampton, J. R. Quality of life, employment status, and anginal symptoms after coronary angioplasty or bypass surgery. 3-year follow-up in the Randomized Intervention Treatment of Angina. Circulation. 94 (2), 135-142 (1996).
- Ong, P., Athanasiadis, A., Borgulya, G., Mahrholdt, H., Kaski, J. C., Sechtem, U. High prevalence of a pathological response to acetylcholine testing in patients with stable angina pectoris and unobstructed coronary arteries. The ACOVA Study (Abnormal COronary VAsomotion in patients with stable angina and unobstructed coronary arteries). J Am Coll Cardiol. 59 (7), 655-662 (2012).
- Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
- Shimizu, H., Lee, J. D., Ogawa, K., Hara, A., Nakamura, T. Coronary artery vasoreactivity to intracoronary acetylcholine infusion test in patients with chest pain syndrome. Intern Med. 31 (1), 22-27 (1992).
- Montalescot, G., et al. 2013 ESC guidelines on the management of stable coronary artery disease: the Task Force on the management of stable coronary artery disease of the European Society of Cardiology. Eur Heart J. 34 (38), 2949-3003 (2013).
- JCS Joint Working Group. Guidelines for diagnosis and treatment of patients with vasospastic angina (Coronary Spastic Angina) (JCS 2013). Circ J. 78 (11), 2779-2801 (2014).
- Ong, P., Athanasiadis, A., Sechtem, U. Patterns of coronary vasomotor responses to intracoronary acetylcholine provocation. Heart. 99 (17), 1288-1295 (2013).
- Seldinger, S. I. Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography; a new technique. Acta radiol. 39 (5), 368-376 (1953).
- Judkins, M. P. Selective coronary arteriography. I. A percutaneous transfemoral technic. Radiology. 89 (5), 815-824 (1967).
- Mohri, M., et al. Angina pectoris caused by coronary microvascular spasm. Lancet. 351 (9110), 1165-1169 (1998).
- Chandrasekar, B., et al. Complications of cardiac catheterization in the current era: a single-center experience. Catheter Cardiovasc Interv. 52, 289-295 (2001).
- Nakao, K., et al. Hyperventilation as a specific test for diagnosis of coronary artery spasm. Am J Cardiol. 80 (5), 545-549 (1997).
