Summary
糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。
Introduction
糖尿病は、破壊されたグルコース恒常性の一般的なエンドポイントを共有する疾患のコレクションを含みます。糖尿病のサブタイプの病原性のメカニズムは異なっているが、それらは減少したβ細胞量、 すなわち 、インスリン産生能力1,2の損失の結果を共有します。現在、糖尿病の治療戦略は、外因性インスリン、インスリン感受性のインスリン産生または増強の薬理学的刺激、およびまれに、膵島または膵臓全体3,4の移植の慢性投与に依存しています。残念ながら、これらの戦略の成功は短命であり、および/または十分に内因性インスリン産生の機能を再現することができません。 β細胞の再生を刺激するための方法の開発の有用性にもかかわらず、そのような手法は存在しません。したがって、主要な糖尿病の研究の目標は、新しいβ細胞を生成するために、または内因性β細胞量5を展開するための方法を開発することです6,7を含む代替戦略の追求を行います。重要なことには、in vivoでの新β細胞の主な供給源は、既存のβ細胞ではなく、特殊な前駆細胞8,9です。 β細胞は、制限された複製能力を有するように見えるが、β細胞量（〜30％）のわずかな増加は、多くの糖尿病患者のグルコースホメオスタシスを回復するのに十分であり得ます。また、β細胞量のその場の薬理学的刺激に潜在的に安価でスケーラブルな治療戦略です。本明細書中でβ細胞の増殖を刺激する小分子を同定し、特徴づけるためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。
インビトロ実験方法の様々な遺伝子産物および/ または分子THAを同定することができますトンの一次β細胞の複製を促進します。 β細胞複製の誘導を測定するための初期の努力は、特定の処理条件10に対応してアルデヒドチオニンまたはインスリン染色された集団内の[3 H]チミジン取り込み、BrdU取り込みや有糸分裂体を測定するために胎児げっ歯類膵臓培養または無傷の単離された膵島培養を使用しました11。これらのin vitroでのアプローチと密接な変異体は、それらのいくつかの制限があります。著名な欠陥が成熟β細胞とは異なり、高い基礎β細胞の複製速度を表示し、明確な方法12で調節成長している、胎児細胞の（1）の使用が含まれます。 （2）β細胞の複製イベントの実験に依存する裁定の主観的な性質; （3）β細胞の複製イベントの実験に依存カウントの労力と時間集約的な性質は、実験的なスループットを遅らせます。 （4）核取り込み/染色/外観を使用することはあっても、複製を識別するためにTSおよびβ細胞を同定するための非重複細胞質染色はβ細胞に近接する非β細胞複製イベントの誤帰属につながります。
より最近では、成熟一次β細胞は、β細胞の複製13-16の過剰発現導入遺伝子の影響だけでなく、遺伝子産物または化合物の治療を評価するために使用されてきました。しかし、これらの研究はまた、複製イベント、β細胞の同定および/ またはスループットを制限する労働集約型の手順、 例えば 、細胞または無傷の膵島の個々のスライドウェルめっきの細胞質staining-または非特異的な方法の主観的なカウントに依存していますパラフィン包埋し、処理17。なお、本明細書に提示1に似たイメージベースのヒトβ細胞複製のスクリーニング方法は、18を公開されています。しかしながら、このアッセイの使用の成功が実証されておらず、一次スクリーニングのためのヒト膵島の使用が広くFEAではないかもしれませんsible。
複製促進物質を同定するための代替戦略は、β細胞株の増殖の誘導を評価することです。初期の努力は、MIN6細胞またはINS 13分の832細胞14,19-21形質転換β-細胞株を使用していました。しかし、これらの細胞株は、気ままな成長を示し、高分化型β細胞22に少し似ていません。したがって、成長誘導能力は、最小限の不明確関連性と再現することが困難な場合があります。細胞株ベースのスクリーニングのための改良された戦略は、テトラサイクリン（ドキシサイクリン）の非存在下での増殖停止依存SV40のT抗原の発現23,24ある細胞を「可逆的に形質転換された」利用します。しかし、これらの細胞はドキシサイクリンの除去の際に「正常な」β細胞様の状態に戻すかどうかは不明です。残念ながら、これらの細胞の使用は、即時の有用性を有するとは思われない一般的な成長促進化合物をもたらしました24。全体的に、最小限の自発的複製活性を示す細胞型の成長調節を研究するための細胞系の使用が制限された適用性を有していてもよいです。
本明細書に提示β細胞複製スクリーニングプラットフォームは、マルチ、成熟した初代ラットβ細胞は、系統制限成長促進活動の識別を可能にするために、可能な限り生体内増殖調節、混合細胞型組成物の膵島細胞培養で保持することを利用しますバイアスを排除し、スループットを容易にするために、スループットと自動分析を最大化するために、書式設定型ウェル。このプラットフォームの使用の成功は、β細胞の複製25,26を促進するいくつかの化合物の同定を可能にしました。さらに、アッセイは、β細胞の複製の分子調節に機構的洞察を提供するために、構造活性相関研究および化学エピスタシス実験に使用されてきました。提示プラットフォームが正常にfoが適応されましたRβ細胞複製のレンチウイルスのRNAiベースの調査は25の経路。アッセイの制限事項は、（一次細胞の使用）スケーラビリティを制限含まれ、むしろ抗体ベースのイメージングおよび一次膵島の使用、使用に関連した（アッセイは、ヒト膵島研究のために適合させることができるけれども）は、ヒト膵島細胞、費用よりもげっ歯類の使用画像収集および分析機能を備えた自動顕微鏡の利用時に自動化された画像の取得と依存性を容易にするために、分散した島（破壊された膵島アーキテクチャ）の。遺伝子産物またはその場での β細胞の再生を刺激する化合物を同定するための容易なin vivoでのスクリーニング方法が理想的であろうが、このようなプラットフォームは、まだ27利用できません。したがって、記載プラットフォームはβ細胞複製のほとんどの側面を調査することに興味の研究者に適しています。
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Protocol
このプロトコルは、スタンフォード大学医学部の施設内動物管理使用委員会（IACUC）に準じて行きました。膵島細胞複製の評価のための384ウェルプレートのウェル228を生成するのに十分である - （9週齢8）雄性Sprague Dawleyラット300 - Gに記載のプロトコルは、6つの250からの膵島単離のためにスケーリングされます。
1.材料の準備
- 15cmの組織培養皿28に3日間前にコンフルエントに維持804Gラット膀胱癌細胞の馴化培地を収集することによって、膵島の分離を開始する（RPMI1640 20 ml）をコーティング媒体を準備します。滅菌フィルターとストア（-20℃）後の使用のために馴化培地。
- 手術器具を滅菌する（1 12センチメートル歯状の組織鉗子、1 11.5センチメートル細かいハサミ、1 14.5センチメートル手術用はさみ、2 16センチメートルの湾曲鉗子、1 12センチメートル湾曲した止血剤、1〜12センチメスハンドル）とinitの前に1 30メッシュの組織ふるいです膵島単離をiating。
- 60％を溶解することによって、膵臓消化溶液を準備し、精製クラスIの40％混合物：クラスIIコラゲナーゼ（300,000総コラゲナーゼ活性- 40万台）をカルシウムおよびマグネシウムを補充した1×ハンクス平衡塩溶液（HBSS）60ml中。氷上で1「22 G針と場所で10mlシリンジ（6）への膵臓消化バッファーの負荷10ミリリットル。
注：消化溶液の10mlを、ラットあたりに噴射されます。それに応じてスケール。 - ケタミンの1.3ミリリットル（100 mg / mlで）、キシラジンの0.2ミリリットル（100 mg / mlで）およびPBSの3ミリリットルを混合することにより、換気フード内で麻酔薬カクテルの4.5ミリリットルを準備します。膵島単離を開始する1時間以内に麻酔薬カクテルを準備します。
- HBSSの500ミリリットルに新生仔ウシ血清の25ミリリットルを追加することで、 洗浄バッファーを準備します。後で使用するために氷の上に洗浄バッファーを置きます。
- 低グルコースのダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、5の500ミリリットルである膵島媒体の1瓶を準備0 mlのウシ胎児血清（FBS）、ペニシリンの5,000単位/ ml及びストレプトマイシンの5,000μgの/ mlです。
- 2％FBS、2mMグルタミン、ペニシリンの5 mMグルコース、5000単位/ mlおよびストレプトマイシンの5,000μgの/ mlの機能/生存性溶液（500ミリリットル）から膵島機能媒体を準備します。後で使用するために膵島機能メディア （4℃）で保管してください。
- 1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）のミリリットル37.38 2.5 mLのロバ血清0.12 mLのトリトンX-100を添加することによって、ブロッキング緩衝液40ミリリットルを準備します。後で使用するためにストアブロッキングバッファー（4℃）。
- プロトコルを開始する前に必要な抗体を得ます。
注：PDX-1（TRITC）およびKi-67（FITC）の共染色は、一次β細胞複製のスクリーニングのために使用されます。 PDX（Cy5の）およびKi-67（FITC）染色、核（DAPI）と一緒に、追加のセルアイデンティティマーカー（TRITCインスリン、グルカゴン、ビメンチンまたはソマトスタチン）のための免疫蛍光染色を行い、系統特異的複製分析のため。代替担当者licationマーカー、 例えば 、PCNAは、使用してもよいです。 - 四重に行われる各処理条件で228ウェルの治療計画を準備します。 （：666希釈DMSO 1）をウェルポジティブ（5-ヨードツベルシジン[1μM]またはジピリダモール[15μM]）および車両制御が含まれます。
膵臓の2灌流
- 希釈された麻酔薬カクテル溶液（0.30ミリリットル/ 100g体重）の腹腔内注射によって、ラットを麻酔。ラットが完全に麻酔をかけ、有害な刺激に応答しなくなったら、頸椎脱臼を行います。
- ペーパータオルのスタック上に仰臥位（頭尾の向き）に安楽死させたラットを置き、70％エタノールで腹部をスプレー。
- U-切開（陰部の塩基）と腹腔を開き、腹腔を露出するように胸の上に吻側方向に皮膚を撤回。
- 慎重に、湾曲した鉗子の2ペアを使用して十二指腸をつかむ共通Bの十二指腸エントリを見つけますイルダクト（オッディの括約筋）とは、湾曲した止血剤と乳頭で十二指腸開口部をクランプします。
- 総胆管乳頭をクランプし、湾曲した鉗子を使用して肝臓に近い胆管をつかむために使用される湾曲した止血剤を持ち上げます。胆管を分離し、公開するために、湾曲鉗子で鈍的切開を使用してください。
- ヘッド近位と足の先端でラットを再配置します。
- 膵臓の消化液で嚢胞と共通の肝管の接合部に総胆管（CBD）で、またはちょうど遠位にカニューレを挿入10ミリリットル注射器を-loaded、ゆっくりと膵臓の消化溶液の10ミリリットルを注入。注入しながら、メスハンドルにCBDをサポートしています。ダクトと膵臓は膨らまに失敗した場合、針の位置を変更します。
- 下行結腸、腸、胃と脾臓からそれを分離するために、湾曲鉗子と細かいハサミを使用して膨張した膵臓を削除します。 5 mlを含む50mlチューブ中で、氷上で膨張した膵臓を置き
膵臓の3解離
- いったんすべて膵臓が採取され、15分間37℃の水浴中に消化管を置きます。静かにチューブを3分毎に渦巻きます。
- 15分後、精力的にチューブを（垂直方向）を10回振ると冷 洗浄緩衝液 10mlを追加します。精力的にチューブをさらに5回振って、氷上に置きます。
- 冷洗浄緩衝液で50mlに消化管を記入し、チューブを5回転倒混和します。
- 4℃で1分間97×gでチューブを遠心し、上清を捨てます。ペレット化した組織を落とさないように注意してください。
- 25ミリリットルの洗浄緩衝液を加え、穏やかにボルテックスして組織を再懸濁。繰り返しをさらに2回3.4と3.5を繰り返します。
- 目の上に30メッシュの組織ふるいを置きerile 250ミリリットルのビーカーとふるい上に組織懸濁液を注ぎます。 洗浄バッファーの追加の20ミリリットルでの消化管を洗浄し、メッシュの上に注ぎます。未消化膵臓および脂肪組織は、この段階で除去されます。
- 2新鮮な50mlチューブ中に濾過材を注ぎ、4℃で1分間、97×gで回転させて組織をペレット。上清をデカントし反転チューブは、過剰なバッファを排出します。
島の4精製
- ペレット化した膵臓組織に冷たいポリス/ジアトリゾ酸ナトリウム溶液20ml（1.119グラム/ mlの濃度）を追加します。均一にそっとピペットで5回上下各管の内容物を再懸濁。
- 静かに10ミリリットルのHBSSとポリス/ジアトリゾ酸ナトリウム水溶液を重ねます。ゆっくり管壁に沿ってHBSSを追加することで、シャープな液体界面を維持します。
- 緩加速とブレーキなしで15分間（4℃）560×gで消化された膵臓を遠心。
- 共同10ミリリットルのピペットを使用して、インターフェイスからの膵島層llect、新鮮な50mlチューブに島を置きます。この段階で島をプールしないでください。
- 4℃で140×gで1分間、各50mlチューブやスピンに洗浄緩衝液の40ミリリットルを追加します。
- 上清を捨て、チューブを数回反転させて、洗浄緩衝液 50ml中のプールされた膵島を再懸濁します。ペレット中に膵島を収集するために、4℃で97×gで1分間チューブを遠心します。
- 洗浄緩衝液を捨て、洗浄を繰り返します。組織培養フードの中に島を持参し、上清を吸引除去します。
- 膵島培地 6ml中膵島の各チューブを再懸濁します。
- 6ウェル組織培養皿のウェルに各50ミリリットルチューブから膵島を転送します。ウェルの中央に島を収集し、顕微鏡下で膵島の品質と純度を観察するために6ウェルディッシュを渦巻。
- 手動で1ミリリットルピペットを用いて膵島を収集し、隣接に選ばれた膵島を転送よく膵島メディアの6ミリリットルを含みます。膵島旋回を繰り返し、> 90％の純度が達成されるまで、ピッキング。
- 膵島培地 20mlを含む10cmの組織培養皿に精製された膵島を転送します。
- 組織培養インキュベーターに入れ島（37℃、5％CO 2）で一晩（ 図1A）。
- 膵島細胞、コートウェル当たり804G馴化培地40μlの384ウェルプレートのウェルを、めっきの製造において。組織培養インキュベーター中で一晩インキュベートします。
5.分散および膵島細胞のメッキ
- 次の日は、静かに、セルスクレーパーで10cmの皿から膵島を切り離し、50ミリリットルチューブに膵島を移します。
- 室温で22×gで1分間遠心分離することにより、島をペレット。上清を吸引除去します。
- 温かいPBS 20mlで膵島を洗浄し、上記のようにデカント。
- 0.25％トリプシンで膵島（ラット膵臓あたり150μLを再サスペンド）と37℃で10分間インキュベートします。ピペットアップ膵島ダウン10時間インキュベーションの5および10分後、1 mlピペットを用いて。
- 10分後、完全な消化を保証し、血球計数器を使用して、膵島細胞をカウントするために顕微鏡下でトリプシン処理した膵島の20μlのサンプルを評価します。 5分であり、ピペットを上下に10回以上 - 未消化の島が残っている場合は、追加の3のためのインキュベーションを続けます。必要に応じて繰り返します。
注：典型的な収量は〜125,000である - ラット15万膵島細胞。 - インキュベーターから804G馴化培地でコーティングされた384ウェルプレートを取り外し、12ウェルマニホールドアスピレーターを使用してメディアを削除します。
- 膵島機能培地 1ml当たり45,000細胞の密度で膵島細胞を懸濁し、マルチチャンネルピ ペット（図1B）でウェルあたり70μL（3150細胞）をプレート。
注：外側のウェルに位置するβ細胞がNと列にプレート使用行Cの周囲に向かって移動する傾向があるので46匹のラットから単離した膵島細胞を228ウェルプレートに21に。 - 細胞接着を可能にするために、48時間組織培養インキュベーター中でプレートを置き。
6.膵島細胞培養処理、固定および染色
- 膵島機能の培地中の 2倍の濃度で（処理条件は、四重に行われている）は、車両および化合物の200μlのを準備します。マルチウェルピペッティングを容易にするために、滅菌96ウェルプレート中の化合物を配置します。
- 慎重に12ウェルマニホールドアスピレーターで膵島培地を除去し、12ウェルピペットを用いて膵島機能媒体（35μL/ウェル）と交換してください。 （図1C）を乾燥させるリスクを制限するために、一度に1行からメディアを取り外し、交換してください。
- 2倍の化合物溶液35μlの/ウェルを転送することにより、治療を開始します。 48時間の治療期間のためのインキュベーターにプレートを返します。
- 処理の48時間後、プレートを反転させて処理媒体をデカント。</李>
- 静かに1×PBS（1分）のウェルあたり50μlの膵島細胞を洗浄します。マルチチャンネルピペットを用いてPBSを加えます。
- PBSをデカントし、1×PBSで希釈し、冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）のウェルあたり50μLを追加することにより、細胞を固定。 4℃で15分間細胞をインキュベートします。
- PFAを除去するためにプレートを反転させ、ゆっくりと上記のようにウェルあたりPBSを60μlを添加することによって、細胞を3回（各5分）洗浄します。
- ホルムアミド14.25ミリリットルと0.75ミリリットル0.15 Mクエン酸ナトリウム（pHが6）を混合して15ミリリットル抗原回復溶液を調製します。使用直前に、抗原回復溶液を作ります。
- プレートを反転させたウェルからPBSを削除し、各ウェルに60μlの抗原回復ソリューションを追加します。 45分間70℃の水浴中でプレートを加熱します。マルチウェルプレートの反りを防ぐために、このインキュベーション中、プレートの上に加熱ブロックを配置します。
注意：水は、プレートスカートハーフウェイアップでなければなりません。プレートが水没するべきではありません。 - 1×PBSのウェルあたり60μlの3回（各5分）で細胞を洗浄。マルチチャンネルピペットを用いてPBSを加え、プレートを反転させ、PBSをデカント。
- ブロッキング緩衝液をウェルあたり40μLを添加し、室温で30分間インキュベートし、マルチチャンネルピペットを使用。プレートを反転し、デカントすることによりブロッキングバッファーを削除します。
- そしてヤギ抗ヒトPDX-1（1：100）：マウス抗ヒトのKi-67（200 1）40μlの追加を各ウェルにブロッキング緩衝液中に希釈した抗体を、4℃で一晩インキュベートします。
- 翌日、抗体溶液をデカントし、上記のように1×PBSで3回（各5分）で細胞を洗浄します。 PBSをデカント。
- ブロッキング緩衝液中のビオチン化ロバ抗マウスIgGおよびローダミン結合ロバ抗ヤギIgG：希釈（200 1）のウェルあたり40μLを加えます。 1時間インキュベート室温で。
- 1×PBSで3回、5分ごとに細胞を洗浄。各ウェルにフルオレセイン結合ストレプトアビジン：（ブロッキング緩衝液中で400 1）で希釈し、40μlのを追加します。室温で30分間インキュベートします。
- 1×PBSで3回、5分ごとに細胞を洗浄。 DAPIのウェルあたり40μlの（ブロッキング緩衝液で300 nM）を添加し、室温で15分間インキュベートします。
- 1×PBSで2回細胞を洗浄し、PBS 1×40μlの細胞を残します。プレートは現在、分析する準備ができました。
7.β-細胞複製の分析
注：アッセイプロトコルは、β細胞の複製を測定するために使用される高含量スクリーニング顕微鏡のために確立されなければなりません。その最も単純な組成物では、このプロトコルは、識別マーカーはβ細胞（PDX-1 +β細胞）の定義に使用され、複製マーカー（KI-67）細胞分裂イベントを定義するために使用される2色アッセイです。
- averagに基づいてオブジェクト（β細胞）を同定β細胞の核（図2A）の予想される画素領域内：近似円（幅<1.6長）内のPDX-1染色（549 nmのフィルター）の電子蛍光強度。
- 次に、PDX-1 +領域（図2B）内の平均蛍光強度（485 nmのフィルター）に基づいて複製イベント（のKi-67-陽性）を識別するための設定を確立。
注：露光時間は、画像全体の画素強度の比較を可能にするために修正する必要があります。アッセイプロトコルパラメータは、マシンの呼び出しが一貫悪影響データの品質に影響を与える可能性がある非特異的な染色、破片および細胞凝集体を除外するように調整されています。 - 精度と限界可変性を最大化するために、ウェルあたり500β細胞の最小値を分析します。
注： - 3％のラット膵島培養における基底β細胞複製指数は0.5であることが期待されます。一般的に、ウェルあたり40の画像は、500β細胞を識別するのに十分以上のものです。 - 分析の前にプレート全体を、選択されたネガ型（DMSO処理）および陽性対照分析（5-ヨードツベルシジン[1μM]またはジピリダモール[15μM]）をアッセイプロトコルの妥当性を評価するために井戸を処置されました。アッセイが正しく確立されると、正の対照化合物は、β細胞の複製の割合の少なくとも2倍の増加を誘導します。
- アッセイプロトコルが検証された後、プレート全体をお読みください。
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Representative Results
β細胞またはα-細胞複製を評価するために、四色アッセイプロトコルが必要とされます。まず、オブジェクトは、DAPI染色（チャンネル1、386ナノメートル）によって識別されます。次に、β細胞（イベント1）がカウントされます：PDX-1 +（チャネル2、650 nm）を核周囲インスリン（チャネル3、549 nm）を同時発現するオブジェクトを。その後、複製β細胞（イベント2）をカウントされています（イベント1）その共発現のKi-67（チャンネル4、485 nm）を（図3）β細胞。 β細胞の複製の割合が計算されます（イベント2 /イベント1）はα-細胞複製を定量化するために×100、合計オブジェクトは、DAPI染色（チャネル1）によって識別され、その後、α細胞（イベント1）はによって列挙されていますPDX-1染色（チャネル2）および核周囲グルカゴン染色（チャネル3）の存在の不在。 α細胞（イベント2）を複製するのKi-67（チャンネル4）（図 4）を共発現するα細胞の数です。α-複製細胞の割合が計算されます（イベント2 /イベント1）×100。
実験を開始する前に、化合物の治療計画は、（表1A）からなります。ここでは、小規模なアッセイは、（384ウェルフォーマットでのβ細胞とα-細胞複製、陰性対照（DMSO処理）および陽性対照（ジピリダモールで処理された[15μM]）を使用して、PDX-1を評価するための条件を実行しましたウェルあたり49画像）。実験データは、選択的にPDX-1 +β細胞とβ細胞の複製ではなく、α細胞の複製を促進するためにジピリダモールを示しています。ウェルあたり識別さPDX-1細胞の平均数はジピリダモールで処理された条件のためのDMSO処理および6439±363（P <0.01）のための5541±555でした。 PDX-1細胞数（表1B、トップ）でジピリダモール依存性の増加が実証された。平均パーセントPDX-1 +β細胞複製（DMSO + PDX-1 +のKi-67 + </ SUP> / DMSO + PDX-1 +）ジピリダモールで処理された条件（P <0.01）（表1B、下）のためのDMSO処理および10.10±0.98パーセントのための3.35±0.50％です。 DMSO = 3.3±0.66（行CF）および3.4±0.23（行：重要なことは、その後β細胞（行CF）およびα-細胞複製（行GJ）について分析したウェル中で同様のPDX-1 + -cell複製率がありますGJ）（P = 0.80）。ジピリダモール= 9.8±0.86（行CF）および10.4±0.1.1（行GJ）（P = 0.43）。したがって、これらのウェルは、異なる細胞系統マーカー（インスリンおよびグルカゴン）のために染色したが、薬物治療と同様に反応しました。
β細胞とα細胞の次の複製速度は、生データ（表2）から計算しました。 DMSO 3,930±488 対 ：β細胞（イベント1）の平均数は、ジピリダモールの治療に反応して増加しました。ジピリダモール4589±218（P <0.05）。注目すべきことに、PDX-1細胞（5,541±555）（P <0.01）と比較してβ細胞（3,930±488）の数の有意な減少があります。 β細胞数、 例えば、δ細胞またはβ細胞の前駆細胞、およびインスリン+であることがβ細胞を必要とする追加の緊縮性から-これは、インスリンであるPDX-1 +β細胞を除いた結果です。特に、α細胞（イベント1）の数は、ジピリダモールの治療で増加しなかった（ジピリダモール1467±74.7 対 DMSO 1,465±123; P = 0.93）。したがって、ジピリダモールは、選択β細胞の数を増加させます。複製β細胞（イベント2）の数は、ジピリダモールの治療（ジピリダモール476.5±39.6 対 DMSO 131±31; p <0.01）に応答して増加するが、複製α細胞（イベント2）の数は（DMSOありませんジピリダモール9.0±1.6 対 10.25±3; P = 0.5）。複製β-CEの最後割合LLSとα細胞は（（イベント2 /イベント1）×100）を算出します。確かに、ジピリダモールは、β細胞ではなく（ 図5にまとめた）α-複製細胞の割合を増加させます。重要なことは、健全な文化の基底β細胞の複製速度は、実験の間で変化する（0.5から3パーセント）が、実験内の井戸全体で非常に一貫している必要があります。基礎レプリケーションが可変であるため、化合物によって誘導されるβ細胞の複製速度はまた、実験全体の変数です。しかし、β細胞複製の誘導倍率は、実験全体で一貫しており、化合物の有効性を確実に実験間で比較することができます。特に、α-細胞複製率は、β細胞の複製速度よりも約5倍低いと文化は〜1月3日と同数のα細胞、β細胞が含まれています。その結果、α-細胞複製のインデックスが表示され、β細胞の複製指数に比べて変動性を増加させました。変動を制限するために、ウェルあたりの画像81の最大に（ここで使用される）49から増加しています。
図1：絶縁および分散ラット島。 （A）健康単離したラット膵島 の顕微鏡写真。 100μmのスケールバー示します。 1時間のメッキ後の分散ラット島の（B）顕微鏡写真（5Xおよび10X目標）。 100（左）および200μm（右）に示すバーを拡張できます。分散ラットの（C）顕微鏡写真（5Xおよび10X目標は）めっき後48時間膵島。 100（左）および200μm（右）に示すバーを拡張できます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：PDX-1 +の自動識別 +膵島細胞。 PDX-1について染色した（A）化合物で処理した分散ラット島細胞。 PDX-1 +オブジェクトは、青丸で囲まれています。除外されたオブジェクトは、オレンジ色で丸で囲まれています。 150μmのスケールバーが表示します。 （B）のKi-67について染色された膵島細胞の同じフィールド。 PDX-1 + KI-67 +二重陽性細胞は緑色の丸で囲まれています。示さ150μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：β細胞の複製の自動識別 β細胞をDAPI（左上隅、青丸）によって識別される複製、PDX-1（右上隅、緑の円）、インスリン（左下隅、マゼンタ。丸）およびKi-67（右下隅、赤丸）共同電子XPRESSION。マージされた画像（右）は、いくつかの複製β細胞を示しています。示さ150μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4：α細胞の複製の自動識別複製α細胞をDAPI（左上隅、青丸）、PDX-1（右上隅、緑の円）の不在によって識別され、グルカゴン（左下。コーナー、マゼンタ円）およびKi-67（右下隅、赤い丸）共発現。マージされた画像（右）はα細胞の希少複製ダブレット（黄色の矢印）を示しています。示さ150μmのスケールバー。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5： ジピリダモールは、PDX-1 +を 誘導する -とβ細胞の複製ではなく、α-細胞複製 PDX-1細胞のグラフ表示（左上）、β細胞（右上）およびα細胞（左下）。 DMSO-およびジピリダモールで処理したウェル中のレプリケーションが示されています。バーは（PDX-1複製、N = 8;β細胞とα-細胞複製、n = 4）は独立して処理したウェルの平均を表します。エラーバーは標準偏差を示す（* P <0.01）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
| A. | 治療： | 染色： | |
| 4 | 5 | ||
| C言語 | DMSO | ジピリダモール | インスリン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| D | DMSO | ジピリダモール | インスリン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| E | DMSO | ジピリダモール | インスリン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| F | DMSO | ジピリダモール | インスリン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| G | DMSO | ジピリダモール | グルカゴン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| H | DMSO | ジピリダモール | グルカゴン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| 私 | DMSO | ジピリダモール | グルカゴン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| J | DMSO | ジピリダモール | グルカゴン、DAPI、PDX-1、のKi-67 |
| B. | PDX-1 +細胞の数 | ||
| DMSO | ジピリダモール | ||
| 4 | 5 | ||
| C言語 | 5158 | 6249 | |
| D | 6365 | 6795 | |
| E | 4830 | 6974 | |
| F | 5988 | 6408 | |
| G | 5574 | 6532 | |
| H | 5939 | 6411 | |
| 私 | 5612 | 6387 | |
| J | 4862 | 5759 | |
| PDX-1 +のKi-67 +細胞のパーセント | |||
| DMSO | ジピリダモール | ||
| 4 | 5 | ||
| C言語 | 3.04 | 9.99 | |
| D | 3.91 | 10.57 | |
| E | 2.51 | 8.58 | |
| F | <TD> 3.7710.14 | ||
| G | 3.44 | 10.1 | |
| H | 3.06 | 10.69 | |
| 私 | 3.58 | 9.07 | |
| J | 3.52 | 11.74 | |
表1：代表的実験計画とPDX-1 +β細胞レプリケーションデータ。 （A）治療計画の概要を示しています。ウェルを、DMSO（カラム4）、ジピリダモール（カラム5）で処理しました。染色は、DAPI、抗PDX-1、PDX-1 +細胞（上、DAPI +の抗インスリン（通常の文字）または抗グルカゴン（斜体文字）およびKi-67（B）の合計数を用いて行きましたPDX-1ウェルあたりウェルおよびPDX-1細胞を複製の割合（下、DAPI + PDX-1 +のKi-67 + / DAPI + PDX-1 +×100）あたり+）が示されています。
| イベント1： | |||
| DMSO | ジピリダモール | ||
| 4 | 5 | ||
| C言語 | 3557 | 4352 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+） |
| D | 4387 | 4542 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+） |
| E | 3462 | 4879 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+） |
| F | 4315 | 4585 ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+） | |
| G | 1594 | 1567 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+） |
| H | 1477 | 1439 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+） |
| 私 | 1491 | 1390 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+） |
| J | 1298 | 1474 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+） |
| イベント2： | |||
| DMSO | ジピリダモール | ||
| 4 | 5 | ||
| C言語 | 113 | 425 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+）のKi-67（+） |
| D | 152 | 511 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+）のKi-67（+） |
| E | 97 | 466 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+）のKi-67（+） |
| F | 163 | 504 | ＃DAPI（+）PDX-1（+）インスリン（+）のKi-67（+） |
| G | 13 | 9 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+）のKi-67（+） |
| H | 10 | 9 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+）のKi-67（+） |
| 私 | 6 | 11 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+）のKi-67（+） |
| J | 12 </ em>の | 7 | ＃のDAPI（+）PDX-1（+）グルカゴン（+）のKi-67（+） |
| ％のレプリケーション： | |||
| DMSO | ジピリダモール | ||
| 4 | 5 | ||
| C言語 | 3.18 | 9.77 | |
| D | 3.47 | 11.25 | |
| E | 2.8 | 9.55 | |
| F | 3.78 | 10.99 | |
| G | 0.82 | 0.57 | |
| H | 0.68 | 0.63 | |
| 私 | 0.4 | 0.79 | |
| J | 0.92 | 0.48 | |
表2：代表的β細胞とα細胞レプリケーションデータ β細胞の総数（イベント1：DAPI + PDX-1 +インスリン+;トップテーブルの行CF、通常の文字）。）、α細胞（イベント1 ：DAPI + PDX-1 +グルカゴン+;トップテーブルの行GH、イタリック文字）、β細胞（イベント2を複製：DAPI + PDX-1 +インスリン+のKi-67 +;中間のテーブルの行CF、通常の文字）およびα β細胞（イベント2：DAPI + PDX-1 +グルカゴン+のKi-67 +;中間のテーブルの行GH、イタリック文字）ウェル当たり示されています。さらに、β細胞（DAPI + PDX-1 +インスリン+のKi-67 + / DAPI + PDX-1 +インスリン+×100、下の表の行CF、通常のレタリング）複製の割合およびα細胞（DAPI + PDXを-1 +グルカゴン+のKi-67 + / DAPI + PDX-1 + +×100グルカゴン;ウェルあたり下部テーブルの行GJ、イタリック文字）が示されています。
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Discussion
β細胞の成長と再生を制御する分子経路を研究するための実験方法は、糖尿病の研究者のための重要なツールです。ここで、β細胞複製の小分子の刺激を同定および特徴付けるラット膵島ベースのスクリーニングプラットフォームが提供されます。
このプロトコルのほとんどの側面を容易に経験豊富な研究者によって行われているが、いくつかの手順は、特定の技術を必要とします。まず、膵島単離の間に、その完全性を中断することなく、胆管のカニューレ挿入は練習が必要です。役に立つ戦略は最小限に完全に膵臓の消化溶液を分配する前に、針の適切な位置決めを確実にするために、胆管を膨らませることです。第二に、外分泌組織からの効率的な膵島単離は、消化期間と適切な攪拌に細心の注意が必要です。ケアは、断続的な渦巻きを通じてダイジェスト全体に均一な加熱を確実にするために取られるべきです。第三に、実験の成功が左右されるマニュアル膵島ピッキング時の膵島と外分泌の破片の間堪能差別時の。このスキルは、練習で改善されます。第四に、膵島分散めっきは、全ての島は、単一細胞および二、三の細胞の小さなクラスターの混合物に分散されるように行われます。オーバーやアンダー消化実験的パフォーマンスに影響を及ぼすメッキする前に島の。たてメッキ膵島細胞が拡散し、邪魔されずに48時間かけて付着させ前に、約50％のコンフルエントであるべきである。 図1は、メッキ後の様々な時点で成功した膵島細胞培養物の外観を示しています。第五に、膵島細胞培養のためのメディアの変更は弱く付着細胞の破壊を避けるために慎重に行われます。第六に、抗原回復は、マルチウェルプレートの反りを回避するために慎重に行わなければなりませんが、十分に不足や露出オーバー温度上昇の両方に敏感である成功のKi-67染色を可能にするために、反ったプレートは使用することはできません自動化された画像取得。注、過度の膵臓消化、外分泌組織片および/またはトリプシン処理への曝露は、膵島細胞培養の失敗の一般的な原因です。
このプロトコルの1つの制限は、β細胞のアイデンティティと複製イベントの特異的な発現マーカーを頼りです。単一マーカーの使用は誤解を招く可能性を秘めています。例えば、PDX-1は、β細胞、ソマトスタチン発現δ細胞およびβ細胞前駆体29,30のサブセットによって表現されます。したがって、PDX-1細胞の複製を増加させる化合物は、具体的には、非β細胞集団に作用する可能性があります。その結果、代替β細胞マーカーを使用確証研究が必要です。同様に、のKi-67の発現は、複製などのBrdUのような追加の指標とホスホ-ヒストン3のための完璧なマーカーは31を使用すべきではありません。このアッセイの第2の制限は、β細胞の複製を誘導する化合物はsimultaneかもしれないということですouslyβ細胞のアポトーシスまたは脱分化を増加させます。したがって、化合物は、β細胞数の絶対的増加を誘導するかどうかを評価することが重要であり、および/ またはβ細胞のアポトーシスを誘導する化合物で処理したβ細胞が正常な機能（グルコース刺激インスリン分泌）32を保持しているかどうか。このアッセイの第三の制限は、一次膵島細胞の使用に関連した控えめなスループットです。 6匹のラットからの膵島は〜55の化合物は、四重（プラス陽性および陰性対照）でスクリーニングすることを可能にする228実験ウェルを生成します。記載β細胞複製スクリーニングプラットフォームの追加の制限は、ラット膵島ではなく、ヒト膵島の使用です。ヒトおよびラットの島との違いは、ラット膵島培養を用いて同定された全ての複製を促進する化合物は、ヒト膵島培養液を使用して確認することを必要とするのに十分です。しかし、限られた利用可能性を与え、そしてヒト膵島の高コスト、人間の私との一次スクリーニングsletsは、ほとんどの研究者にとって実用的ではありません。
このプロトコルの主な利点は次のとおりです。1）新たに単離した一次島の使用は可能な限り正常な成長の制約を維持するために、2）384ウェルフォーマットの使用は、中程度のスループットスクリーニングを可能にするために（典型的には6匹のラットから単離した膵島）228ウェルについて十分であり、3）自動画像収集と分析の使用は、実験のペースを加速するために、バイアスを制限します。これとは対照的に、一般的に使用される代替的なアプローチは、手動の画像取得およびβ細胞の複製15,17対細胞linages、例えば線維芽細胞とを区別しないβ細胞複製イベントや放射性チミジンの全膵島取り込みの主観的な評価に依存しています。したがって、提示されたプロトコルは、β細胞の成長調節を調査するための重要かつ改良されたツールを表します。
私たちは、適応の多様性を思い描きますこのスクリーニングプラットフォームのために使用しています。又はインスリン+β細胞-まず、β細胞数の絶対的な増加は、PDX-1 +の数を数えることによって測定することができます。条件ごとに反復のウェルより多数あたり播種した細胞数の変動を考慮するために含まれてもよい（典型的にはn = 8）。第二に、プラットフォームはレンチウイルスベースの過剰発現のために適合させることができるか、ノックアウト/ダウン実験をβ細胞の複製に関与する経路を同定すること。要約すると、説明した実験技術は、化合物およびβ細胞の複製を調節する分子経路を同定するために広く有用です。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 250 g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 ml | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 ml | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
References
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