Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

En High-innhold Published: July 16, 2016 doi: 10.3791/54298
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Endocrinology, Stanford University School of Medicine

Summary

Kritiske utfordringer for diabetes forskningsfeltet er å forstå de molekylære mekanismene som regulerer holmen β-celle replikering og å utvikle metoder for å stimulere β-celle gjenfødelse. Heri et høyt innhold av screening-metoden for å identifisere og vurdere β-celle-replikasjon-fremmende aktivitet av små molekyler er presentert.

Introduction

Diabetes omfatter en samling av forstyrrelser som deler den felles sluttpunkt forstyrret glukose homeostase. Selv om de patogene mekanismene for diabetes subtyper er adskilte, men de deler som følge av redusert β-cellemasse, dvs. tap av insulinproduksjonskapasitet 1,2. I dag, diabetes behandlingsstrategier stole på kronisk administrering av eksogent insulin, farmakologisk stimulering av insulin produksjon eller forbedring av insulinfølsomhet, og sjelden, transplantasjon av pankreas holmer eller hele bukspyttkjertelen 3,4. Dessverre, suksessen av disse strategiene er kortvarig og / eller unnlater å tilstrekkelig rekapitulere funksjonen av endogen insulinproduksjon. Til tross for anvendeligheten av å utvikle en metode for å stimulere β-celle regenerering, foreligger ingen slik tilnærming. Følgelig er et viktig diabetesforskning mål å utvikle metoder for å generere nye p-celler, eller for å utvide endogen β-cellemasse 5 6,7. Viktigere er den dominerende kilde til nye p-celler in vivo pre-eksisterende p-celler i stedet for spesialiserte stamceller 8,9. Selv om p-celler synes å ha begrenset kapasitet replikasjon, en liten økning i β-cellemasse (~ 30%) kan være tilstrekkelig til å gjenopprette glukosehomeostase i mange diabetikere. Videre in situ farmakologisk stimulering av β-cellemasse er et potensielt billig og skalerbar behandlingsstrategi. Heri et høyt innhold screening fremgangsmåte for å identifisere og karakterisere små molekyler som stimulerer β-cellevekst er presentert.

En rekke in vitro eksperimentelle metoder kan anvendes for å identifisere genprodukter og / eller molekyler that fremme primære β-celle replikering. Tidlig innsats for måling av β-celle replikering induksjon brukes fosterets gnager pankreata kultur eller intakte isolert holmen kulturer å måle [3H] tymidin inkorporering, BrdU inkorporering eller mitotiske organer innenfor aldehyd-thionin eller insulin farget befolkning som svar på konkrete behandlingsforhold 10, 11. Disse in vitro tilnærminger og nære varianter av disse har flere begrensninger. Prominente mangler inkluderer (1) bruk av føtale celler som, i motsetning til modne p-celler, viser en høy basal β-celle replikering rate og er vekst regulert i en tydelig måte 12; (2) den subjektive natur eksperimentator avhengig pådømmelse av β-celle replikering hendelser; (3) arbeids- og tidkrevende natur eksperimentator avhengig telling av β-celle replikering hendelser forsinker eksperimentell gjennomstrømming; (4) bruk av kjernefysisk innlemmelse / beis / utseende til å identifisere replikering selvts og en ikke-overlappende cytoplasmisk flekken for å identifisere p-celler fører til misattribution av tilgrensende ikke-β-cellereplikasjonshendelser til p-celler.

Mer nylig modne primære p-celler er blitt anvendt for å vurdere effekten av transgene over-ekspresjon, så vel som genprodukt eller behandling med forbindelsen på β-celle-replikasjon 13-16. Imidlertid har disse studiene også grunnlag subjektive telling av replikering hendelser, cytoplasmatiske staining- eller ikke-spesifikke metoder for β-celle identifisering og / eller arbeidskrevende tiltak som begrenser gjennomstrømning, f.eks enkelte slide-vel plating av celler eller intakt holme parafin embedding og behandling 17. Spesielt, en bildebasert human β-celle-replikasjon screening metode, lik den som er presentert heri, er blitt publisert 18; har imidlertid vellykket bruk av denne analysen ikke blitt demonstrert og bruken av humane øyer for primær screening kan ikke bli så å si fealig.

En alternativ strategi for å identifisere replikasjonsfremmende stoffer er å vurdere veksten induksjon av β-cellelinjer. Innledende forsøk brukes forvandlet betacellelinjer som min6 celler eller INS 832/13-celler 14,19-21. Men disse cellelinjer demonstrere uhemmet vekst og har liten likhet med godt differensierte p-celler 22. Følgelig er minimalt, av uklare relevans og noen ganger vanskelig å rekapitulere vekst-induksjon kapasitet. En forbedret strategi for cellelinje basert screening benytter "reversibelt transformerte" celler som er veksten arrestert i fravær av tetracyklin (doksycyklin) -avhengig SV40 T-antigen ekspresjon 23,24. Imidlertid er det uklart om disse cellene gå tilbake til en "normal" β-celle-lignende tilstand etter doksycyklin fjerning. Dessverre har bruken av disse cellene ga en generell vekstfremmende stoffer som ikke synes å ha umiddelbar nytte24. Samlet bruk av cellelinjene for å studere vekstregulering av en celletype som viser minimal spontan replikasjonsaktivitet kan ha begrenset anvendelighet.

Den β-celle replikering screening plattform som presenteres her benytter modne primære rotte p-celler til å beholde in vivo vekstregulering i den grad det er mulig, holme-cellekulturer med blandet celletype sammensetning for å muliggjøre identifisering av avstamning begrensede vekstfremmende aktiviteter, multi -Vel formatering for å maksimere gjennomstrømningen og automatisert analyse for å eliminere skjevhet og legge til rette for gjennomstrømming. Vellykket bruk av denne plattformen har gjort det mulig identifisering av flere forbindelser som fremmer β-celle replikering 25,26. I tillegg har analysen vært brukt til struktur-aktivitetsforhold studier og kjemiske epistasis eksperimenter for å tilveiebringe mekanistiske innsikt i den molekylære regulering av β-celle-replikasjon. Den presenterte plattformen ble vellykket tilpasset for lentiviral RNAi-basert undersøkelse av β-celle replikering trasé 25. Begrensninger av analysen omfatter bundne skalerbarhet (bruk av primærceller), bruk av gnager heller enn menneskelige holmen-celler (selv om analysen kan tilpasses for menneske holmen studier), kostnader forbundet med antistoff-basert bildebehandling og primær holme bruk, bruk av spredte holmer (forstyrret holme arkitektur) for å lette automatisert bilde oppkjøpet og avhengighet av tilgjengeligheten av en automatisert mikroskop med bilde oppkjøpet og analyse evne. Selv om en lettvint in vivo screening-metoder for identifisering av genprodukter eller forbindelser som stimulerer β-celle regenerering in situ ville være ideelt, er en slik plattform ikke ennå er tilgjengelig 27. Følgelig er hensiktsmessig for forskeren er interessert i å undersøke de fleste aspekter av β-celle replikering den beskrevne plattformen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen ble utført i samsvar med Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Stanford University School of Medicine. Den beskrevne protokoll er skalert for holme isolert fra seks 250-300 g (8 - 9 uker gamle) Sprague Dawley hannrotter, som er tilstrekkelig til å generere 228 brønner i en 384-brønners plate for islet celle-replikasjon vurdering.

1. Material Forberedelse

  1. Forbered belegg media før start holme isolasjon ved å samle det kondisjonerte medium av 804G rotte blære carcinoma celler opprettholdt ved samløpet for 3 dager (20 ml RPMI 1640) i en 15 cm vev kultur tallerken 28. Steril filter og butikken (-20 ° C) det kondisjonerte medium for senere bruk.
  2. Steril kirurgiske verktøy (en 12 cm tannvevet tang, en 11,5 cm gode saks, en 14,5 cm kirurgisk saks, to 16 cm buet tang, en 12 cm buet pinsetten, en 12 cm skalpell håndtak) og en 30 mesh vev sil før initiating holme isolasjon.
  3. Fremstille bukspyttkjertel fordøyelse oppløsning ved å oppløse et 60%: 40% blanding av renset klasse I: klasse II kollagenaser (total kollagenase aktivitet på 300.000 - 400 000 enheter) i 60 ml 1 x Hanks 'Balanced Salt Solution (HBSS) supplementert med kalsium og magnesium. Load 10 ml bukspyttkjertelen fordøyelsen buffer i 10 ml sprøyter (seks) med en "22 G nål og legg på is.
    Merk: 10 ml fordøyelse oppløsningen blir injisert per rotte. Skalere tilsvarende.
  4. Forbered 4,5 ml av bedøvelse cocktail i en ventilert hette ved å blande 1,3 ml av ketamin (100 mg / ml), 0,2 ml av xylazin (100 mg / ml) og 3 ml PBS. Klargjør bedøvelse cocktail innen 1 time initiere holme isolasjon.
  5. Tilberede vaskebuffer ved tilsetning av 25 ml serum fra nyfødt kalv til 500 ml HBSS. Plasser vaskebuffer på is for senere bruk.
  6. Forbered en flaske holmen medium som er 500 ml lav glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 50 ml føtalt bovint serum (FBS), 5000 enheter / ml penicillin og 5000 ug / ml streptomycin.
  7. Forbered holme funksjon medium fra funksjonalitet / levedyktighet oppløsning (500 ml) med 2% FBS, 2 mM glutamin, 5 mM glukose, 5000 enheter / ml penicillin og 5000 ug / ml streptomycin. Oppbevar holme funksjon media (4 ° C) for senere bruk.
  8. Fremstille 40 ml blokkeringsbuffer ved tilsetning av 2,5 ml esel serum og 0,12 ml triton X-100 til 37,38 ml av 1 x fosfatbufret saltvann (PBS). Butikkblokkeringsbuffer (4 ° C) for senere bruk.
  9. Oppnå de nødvendige antistoffer forut for oppstart av protokollen.
    Merk: PDX-1 (TRITC) og Ki-67 (FITC) co-farging er brukt for primær β-celle replikering screening. For avstamning spesifikke replikering analyse, utføre immunfluorescens farging for ekstra celle identitetsmarkører (insulin, glukagon, vimentin eller somatostatin, TRITC) sammen med kjernefysiske (DAPI), PDX (Cy5) og Ki-67 (FITC) farging. alternative replication markører, f.eks, PCNA, kan også anvendes.
  10. Forbered en 228-godt behandlingsplan med hver behandling tilstand utført i fire. Inkluder positivt arbeidende (5-Iodotubercidin [1 mikrometer] eller dipyridamol [15 mikrometer]) og kjøretøykontroll (DMSO 1: 666 fortynning) brønner.

2. perfusjon av Pancreas

  1. Bedøve rotter ved ip injeksjon av fortynnet bedøvelse cocktail-oppløsning (0,30 ml / 100 g kroppsvekt). Når rotta er fullt bedøvet og ikke svarer til skadelige stimuli, utføre halshugging.
  2. Plasser avlives rotte i liggende stilling (kranie-kaudal retning) på en bunke med papirhåndkle og spray mageområdet med 70% etanol.
  3. Åpne bukhulen med en U-snitt (base på kjønnshår regionen) og trekke huden i rostral retning over brystet å avsløre bukhulen.
  4. ta tak i tolvfingertarmen ved hjelp av to par buede tang nøye, finn duodenal oppføring av felles bile kanal (sphincter Oddi) og klemme duodenal åpningen på papilla med en buet pinsetten.
  5. Løft den buede pinsetten brukes til å klemme felles gallegang papilla og ta tak i gallegang nær leveren ved hjelp av en buet pinsett. Bruk stump disseksjon med buede tang for å isolere og avsløre gallegangen.
  6. Flytt rotte med hodet proksimale og føttene distal.
  7. Cannulate felles gallegang (CBD) ved eller bare distal til krysset av cystisk og felles lever kanaler med bukspyttkjertelen fordøyelsen løsning -loaded 10 ml sprøyten og injiser langsomt 10 ml av bukspyttkjertel fordøyelsen løsning. Mens injisere, støtter CBD med en skalpell håndtak. Flytt nålen hvis kanalen og bukspyttkjertelen ikke klarer å blåse.
  8. Fjern de oppblåste bukspyttkjertelen ved hjelp av buede tang og fine saks for å skille den fra synkende kolon, tarmer, mage og milt. Plasser den oppblåste bukspyttkjertelen på is i en 50 ml tube inneholder 5 ml Merk: For maksimal holme yield, samle alle pankreata innen 30 min og sted bare en eller to pankreata i hver 50 ml fordøyelsen tube.

3. Dissosiasjon av Pancreas

  1. Når alle pankreata er samlet, plassere fordøyelse rørene inn i et 37 ° C vannbad i 15 min. Virvle rørene hver 3 min.
  2. Etter 15 minutter ble kraftig rist (loddrett) rørene 10 ganger og tilsett 10 ml kald vaskebuffer. Rist rørene ytterligere 5 ganger og legg på is.
  3. Fyll fordøyelse rørene til 50 ml med kald vaskebuffer og blanding ved å snu rørene 5 ganger.
  4. Sentrifugere rørene ved 97 xg ved 4 ° C i 1 min og hell av supernatanten. Vær forsiktig med å løsne pelletert vev.
  5. Tilsett 25 ml vaskebuffer, og re-suspen vevet ved forsiktig virvling. Gjenta trinn 3,4 og 3,5 ganger mer.
  6. Plasser en 30 mesh vev sil over en sterile 250 ml begerglass og hell vev suspensjon på sikten. Skyll fordøyelse røret med ytterligere 20 ml vaskebuffer og hell på trådduken. De ufordøyde bukspyttkjertelen og fettvev blir fjernet på dette trinnet.
  7. Hell den filtrerte materialet i to friske 50 ml rør og pelletere vev ved spinning ved 97 x g i 1 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten og invertere rør for å drenere overflødig buffer.

4. Rensing av holmer

  1. Tilsett 20 ml kald polysucrose / natrium- diatrizoat-løsning (1,119 g / ml tetthet) til den pelletisert pankreasvevet. Homogent resuspendere innholdet i hvert rør ved forsiktig pipettering opp og ned fem ganger.
  2. Forsiktig overlappe polysucrose / natrium diatrizoat løsning med 10 ml HBSS. Opprettholde en skarp væske-grenseflaten ved langsom tilsetning av den HBSS langs rørveggen.
  3. Sentrifuger den spaltet pankreata ved 560 xg i 15 minutter (4 ° C) med langsom akselerasjon og ingen brems.
  4. Collect holmen lag fra grensesnittet ved hjelp av en 10 ml pipette og sted holmer i friske 50 ml rør. Ikke basseng holmer på dette stadiet.
  5. Legg 40 ml vaskebuffer til hver 50 ml rør og sentrifugering i 1 minutt ved 140 xg ved 4 ° C.
  6. Hell av supernatanten og re-suspen sammenslåtte holmer i 50 ml vaskebuffer ved å snu rørene flere ganger. Sentrifuger rør for 1 min ved 97 xg ved 4 ° C for å samle holmer i en pellet.
  7. Hell av vaskebuffer og gjenta vaskingen. Bringe holmer inn i vevskultur hette og aspirer supernatanten.
  8. Re-suspendere hvert rør av holmer i 6 ml holme medium.
  9. Overfør holmer fra hver 50 ml tube i en brønn av seks-brønns vevskultur parabolen. Virvle 6-brønners skål for å samle holmer inn i midten av brønnen og observere holmen kvalitet og renhet under et mikroskop.
  10. samle manuelt holmer ved anvendelse av en 1 ml pipette og overføre de plukkede bitene inn i tilstøtendebrønn som inneholder 6 ml holmen medier. Gjenta holmen virvlende og plukke til> 90% renhet er oppnådd.
  11. Overfør det rensede holmer til en 10 cm vevskultur skål inneholdende 20 ml medium holme.
  12. Plasser holmer i en vevsdyrkningsinkubator (37 ° C, 5% CO 2) over natten (figur 1A).
  13. Ved fremstilling av platekledning øyceller, belegge brønnene i en 384-brønners plate med 40 ul 804G kondisjonerte medium per brønn. Inkuber over natten i en vevskulturinkubator.

5. Spredning og plating av øyceller

  1. Dagen etter, forsiktig løsne holmer fra 10 cm tallerken med en celleskrape og overføre holmene i en 50 ml tube.
  2. Pellet holmer ved sentrifugering i 1 minutt ved 22 xg ved romtemperatur. Aspirer supernatanten.
  3. Vask holmer med 20 ml varm PBS og dekanter som ovenfor.
  4. Re-suspendere holmer i 0,25% trypsin (150 mikroliter per rotte bukspyttkjertelen) Og inkuberes ved 37 ° C i 10 min. Pipetter holmer opp og ned 10 ganger ved hjelp av en ml pipette etter 5 og 10 min av inkubasjon.
  5. Etter 10 min, evaluere en 20 ul prøve av trypsinbehandlet holmer i mikroskop for å sikre fullstendig nedbrytning og for å telle øyceller ved hjelp av et hemocytometer. Hvis ufordøyde holmer forbli, fortsette inkubasjon i ytterligere 3 - 5 min og pipette opp og ned 10 ganger. Gjenta om nødvendig.
    Merk: Den typiske utbyttet er ~ 125.000 - 150.000 holmen-celler per rotte.
  6. Fjern 804G betinget media-belagt 384-brønners plate fra inkubatoren og fjerne medier med en 12-brønns manifold aspirator.
  7. Suspendere øyceller ved en tetthet på 45.000 celler per ml i Islet funksjon medium og plate 70 ul (3,150 celler) pr brønn med en multikanal pipette (figur 1B).
    Merk: Siden p-celler som befinner seg i de ytre brønnene har en tendens til å migrere mot omkretsen av platen bruk rader C til N og kolonnene 421 til plate 228 brønner med øyen-celler isolert fra 6 rotter.
  8. Sett platen i vevskultur-inkubator i 48 timer for å tillate celleadhesjon.

6. Islet-celle Kultur Treatment, Fiksering og farging

  1. Fremstille 200 ul kjøretøy og forbindelser (behandlingsforhold er utført i fire eksemplarer) ved en 2x konsentrasjon i Islet funksjon medium. Ordne forbindelser i en steril 96-brønners plate for å lette multi-brønn pipettering.
  2. Fjern forsiktig holme medium med en 12-brønns manifold aspirator og erstatte med holme funksjon medium (35 ul / brønn) ved anvendelse av en 12-brønns pipette. Ta ut og erstatte media fra én rad om gangen for å begrense risikoen for tørking (figur 1C).
  3. Initiere behandling ved å overføre 35 ul / brønn av 2 x sammensatte løsninger. Returner plate til inkubatoren for 48 timers behandlingsvarighet.
  4. Etter 48 timers behandling, dekanter behandling media ved å snu platen. </ Li>
  5. Vask forsiktig øyen celler med 50 ul per brønn av 1x PBS (1 min). Tilsett PBS ved anvendelse av en multikanal pipette.
  6. Dekanter PBS og fikse cellene ved å tilsette 50 mL per brønn kald 4% paraformaldehyde (PFA) fortynnet i 1x PBS. Inkuber cellene i 15 minutter ved 4 ° C.
  7. Vask cellene tre ganger (5 min hver) ved å snu platen for å fjerne den PFA og forsiktig tilsetning av 60 ul av PBS per brønn som ovenfor.
  8. Forbered 15 ml antigen gjenfinning løsning ved å blande 14.25 ml formamide og 0,75 ml 0,15 M natriumsitrat (pH 6). Gjør antigen henting løsning umiddelbart før bruk.
  9. Fjern PBS fra brønner ved å snu platen og tilsett 60 pl antigen henting løsning til hver brønn. Varm opp platen i 70 ° C vannbad i 45 min. Plassere en varmeblokk på toppen av platen i løpet av denne inkubasjonen for å forhindre vridning av multi-brønn plate.
    Merk: Vannet skal være halvveis opp tallerkenen skjørt; plate bør ikke være neddykket.
  10. Vask cellene med 60 mL per brønn av 1x PBS tre ganger (5 min hver). Legg PBS med en multikanal pipette og dekanter PBS ved å snu platen.
  11. Bruke en flerkanals pipette for å legge til 40 ul per brønn av blokkeringsbuffer og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Fjern blokkeringsbufferen ved å snu platen og dekantering.
  12. Legg 40 ul av mus anti-human Ki-67 (1: 200) og geite-anti-humant PDX-en (1: 100) antistoff fortynnet i blokkeringsbuffer til hver brønn og inkuber ved 4 ° C over natten.
  13. Den neste dag dekanteres anti-legeme-løsning og vask av cellene med 1 x PBS tre ganger (5 min hver) som beskrevet ovenfor. Dekanter PBS.
  14. Legg 40 ul per brønn av fortynnet (1: 200) biotinylert esel-anti-muse-IgG og rhodamin-konjugert esel anti-geit-IgG i blokkeringsbuffer. Inkuber i 1 timeved romtemperatur.
  15. Vask cellene med 1 x PBS tre ganger, 5 min hver. Legg 40 ul fortynnet (1: 400 i blokkeringsbuffer) fluorescein-konjugert streptavidin til hver brønn. Inkuber 30 minutter ved romtemperatur.
  16. Vask cellene med 1 x PBS tre ganger, 5 min hver. Legg 40 ul per brønn av DAPI (300 nM i blokkerende buffer) og inkuberes i 15 minutter ved romtemperatur.
  17. Vask cellene med 1x PBS to ganger og la cellene i 40 mL 1x PBS. Platen er nå klar til å bli analysert.

7. β-Cell Replication Analysis

Merk: En analyseprotokollen må etableres for det høye innhold screening mikroskop benyttet for å måle β-celle-replikasjon. I sin enkleste sammensetning, er denne protokollen et to-fargeanalyse hvor en identitet markør blir brukt til å definere p-celler (PDX-1 +-cellene) og et replikasjonsmarkør (Ki-67) brukes til å definere celledelings arrangementer.

  1. Identifiser objekter (betacellene) basert på average fluorescensintensitet av PDX-1-farging (549 nm filter) i en tilnærmet sirkel (lengde: bredde <1,6) innenfor det forventede pikselområde av en β-cellekjernen (figur 2A).
  2. Deretter etablere innstillinger for å identifisere replikering hendelser (Ki-67-positivitet) basert på gjennomsnittlig fluorescens intensitet (485 nm filter) i (figur 2B) PDX-1 + området.
    Merk: Eksponeringstiden må festes slik at pixel intensitet sammenligninger på tvers av bilder. Analyseprotokollparametere justeres slik at maskin samtaler konsekvent utelukke uspesifikke flekker, rusk og celle aggregater som kan påvirke datakvaliteten.
  3. Analyser minst 500 p-celler per brønn for å maksimere nøyaktigheten og grense variabilitet.
    Merk: basal β-cellereplikasjon indeks i rotte holmen kulturer er forventet å være 0,5 til 3%. Typisk, 40 bilder per brønn er mer enn tilstrekkelig til å identifisere 500 p-celler.
  4. Før analyserehele platen, analysere valgt negativ-(DMSO-behandlede) og positivkontrollen (5-iodotubercidin [1 uM] eller dipyridamol [15 uM]) -behandlet brønner for å vurdere gyldigheten av analyseprotokollen. Når analysen er etablert på riktig måte, positive kontrollforbindelser indusere minst en to gangers økning i prosentandelen av replikerende p-celler.
  5. Les hele platen når analyseprotokollen er validert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å vurdere β-celle eller α-celle-replikasjon, er en fire-fargers analyseprotokollen som kreves. Først blir gjenstander identifiseres ved DAPI farging (kanal 1, 386 nm). Deretter blir p-celler (event 1) telles: objekter som co-uttrykke PDX-1 + (kanal 2, 650 nm) og peri-atom insulin (kanal 3, 549 nm). Deretter blir replikere p-celler (hendelses 2) telles: P-celler (event 1) som co-express Ki-67 (kanal 4, 485 nm) (figur 3). Prosentandelen av replikerende p-celler beregnes: (event 2 / hendelse 1) x 100. For å kvantifisere α-celle-replikasjon, er samlede gjenstander identifiseres ved DAPI farging (kanal 1) og deretter a-celler (event 1) er nummerert etter fraværet av PDX-1-farging (kanal 2) og tilstedeværelsen av perinukleære glukagon farging (kanal 3). Innlæring av alfa-celler (hendelses 2) er nummer av a-celler som co-express Ki-67 (kanal 4) (figur 4).Prosentandelen av a-replikerende celler beregnes: (event 2 / hendelse 1) x 100.

Før start av forsøket, blir en forbindelse behandlingsplan laget (tabell 1A). Her ble en liten skala-analysen kjøres med negativ kontroll (DMSO-behandlede) og positiv kontroll (dipyridamol-behandlede [15 uM]) betingelser for å vurdere PDX-1, β-celle og α-celle-replikasjon i et 384-brønnformat ( 49 bilder per brønn). Eksperimentelle data viser dipyridamol for selektivt å fremme PDX-1 +-celle og β-celle-replikasjon, men ikke α-celle-replikasjon. Gjennomsnittlig antall identifiserte PDX-1-celler per brønn var 5541 ± 555 for DMSO-behandlet og 6439 ± 363 for dipyridamol behandlet forhold (p <0,01); viser et dipyridamol-avhengig økning i PDX-1 celletall (tabell 1B, øverst). Den gjennomsnittlige prosent PDX-1 +-celle-replikasjon (DMSO + PDX-1 + Ki-67 + </ sup> / DMSO + PDX-1 +) er 3,35 ± 0,50% for DMSO-behandlet og 10,10 ± 0,98% for dipyridamol behandlet forhold (p <0,01) (Tabell 1B, nederst). Viktigere er det tilsvarende PDX-1 +-celle replikering priser i brønner senere analysert for β-celle (rader CF) og α-celle replikering (rader GJ): DMSO = 3,3 ± 0,66 (rader CF) og 3,4 ± 0,23 (rader GJ) (p = 0,80); dipyridamol = 9.8 ± 0.86 (rader CF) og 10,4 ± 0.1.1 (rader GJ) (p = 0,43). Derfor disse brønnene, men farget til ulike celle-avstamning markører (insulin og glukagon), svarte på samme måte som medikamentell behandling.

Neste replikering forekomst av p-celler og a-celler ble beregnet fra de rå data (tabell 2). Gjennomsnittlig antall p-celler (event 1) ble økt som følge av dipyridamol behandling: DMSO 3930 ± 488 vs. dipyridamol 4589 ± 218 (p <0,05). Spesielt, er det en betydelig reduksjon i antallet av p-celler (3930 ± 488) i forhold til PDX-1-celler (5541 ± 555) (p <0,01). Dette er et resultat av eksklusiv PDX-1 +-cellene som er insulin - fra den β-celletall, for eksempel δ-celler eller β-celle stamceller, og den ytterligere stringens for å kreve p-celler til å være insulin +. Spesielt gjorde antall a-celler (event 1) ikke øke med dipyridamol behandling (DMSO 1465 ± 123 vs dipyridamol 1467 ± 74,7; p = 0,93). Derfor øker dipyridamol selektivt β-celle nummer. Antallet replikerende p-celler (hendelse 2) økes som respons på behandling dipyridamol (DMSO 131 ± 31 vs. dipyridamol 476,5 ± 39,6; p <0,01), men antallet replikerende a-celler (hendelse 2) ikke er (DMSO 10.25 ± 3 vs. dipyridamol 9,0 ± 1,6; p = 0,5). Endelig er den prosentandel av replikerende β-cells og a-celler beregnes ((hendelse 2 / event 1) x 100). Faktisk øker dipyridamol prosentandelen av replikerende p-celler, men ikke a-celler (som er oppsummert i figur 5). Viktigere er det basale β-cellereplikasjon hastigheten for en sunn kultur varierer mellom forsøkene (0,5 til 3%), men bør være svært konsistent på tvers av brønner innenfor et eksperiment. Fordi den basale replikasjon er variabel, er forbindelsen induserte β-celle-replikasjon hastighet også varierende grader eksperimenter; men fold-induksjon av β-celle replikering er konsistent på tvers av eksperimenter og lar sammensatte effekt å bli pålitelig sammenlignes på tvers eksperimenter. Spesielt, er det α-celle-replikasjon hastighet ~ 5 ganger lavere enn den β-celle-replikasjon hastighet og kulturene inneholde ~ 1/3 så mange a-celler som p-celler; følgelig vil α-celle-replikasjonsindeks viser økt variasjon i forhold til β-celle-replikasjon indeks. For å begrense variabiliteten bildene per brønnøkes fra 49 (benyttet her) til et maksimum på 81.

Figur 1
Figur 1: Isolert og Spredt rotteøyer. (A) Et mikrofotografi av friske isolerte rotte-øyer; 100 mikrometer skala bar vist. (B) Mikrografer (5X og 10X mål) av spredt rotteøyer en time etter plating; 100 mikrometer (til venstre) og 200 mikrometer (til høyre) skalere barer vist. (C) Mikrografer (5X og 10X mål) dispergert rotte holmer 48 timer etter plating; 100 mikrometer (til venstre) og 200 mikrometer (til høyre) skalere Strekene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Automatisk Identifikasjon av PDX-1 + + øyceller. (A) Sammensatte behandlet spredt rotte øyceller farget for PDX-en. PDX-1 + objekter sirklet i blått; ekskluderte objekter er innringet i oransje. Scale bar på 150 mikrometer vist. (B) Den samme felt av øyen-celler farget for Ki-67. PDX-1 + ki-67 + dobbel-positive celler er sirklet i grønt. Scale bar på 150 mikrometer vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Automatisert Identifisering av Replikere p-celler Replikere p-celler er identifisert ved DAPI (venstre øvre hjørne, blå sirkler), PDX-1 (høyre øvre hjørne, grønne sirkler), insulin (venstre nedre hjørne, magenta sirkler) og Ki-67 (høyre nedre hjørne, røde sirkler) co-eXpression. Den sammenslåtte bildet (til høyre) viser flere replikere p-celler. Scale bar på 150 mikrometer vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Fig. 4: Automatisert Identifisering av Replikering a-celler Replikering a-celler er identifisert med DAPI (venstre øvre hjørne, blå sirkler), fravær av PDX-1 (høyre øvre hjørne, grønne sirkler), glukagon (venstre nedre hjørne, magenta sirkler) og Ki-67 (høyre nedre hjørne, rød sirkel) co-uttrykk. Den sammenslåtte bildet (til høyre) viser en sjelden replikere dublett av a-celler (gul pil). Scale bar på 150 mikrometer vist. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 5:. Dipyridamole Induserer PDX-1 + - og β-celle Replication men ikke α-celle Replication Grafisk fremstilling av PDX-en-celle (øverst til venstre), β-celle (øverst til høyre) og α-celle (nederst til venstre) replikasjon i DMSO og dipyridamol-behandlede brønner er vist. Stolper representerer gjennomsnittet av uavhengig behandlede brønner (PDX-1-replikasjon, n = 8; β-celle og α-celle-replikasjon, n = 4). Feilfelt angir standardavviket (* p <0,01). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

<td> 3,77
EN. Behandling: farging:
4 5
C DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-en, Ki-67
D DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-en, Ki-67
E DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-en, Ki-67
F DMSO dipyridamol Insulin, DAPI, PDX-en, Ki-67
G DMSO dipyridamol Glukagon, DAPI, PDX-en, Ki-67
H DMSO dipyridamol Glukagon, DAPI, PDX-en, Ki-67
jeg DMSO dipyridamol Glukagon, DAPI, PDX-en, Ki-67
J DMSO dipyridamol Glukagon, DAPI, PDX-en, Ki-67
B. Antall PDX-1 + Cells
DMSO dipyridamol
4 5
C 5158 6249
D 6365 6795
E 4830 6974
F 5988 6408
G 5574 6532
H 5939 6411
jeg 5612 6387
J 4862 5759
Prosent av PDX-1 + Ki-67 + Cells
DMSO dipyridamol
4 5
C 3.04 9.99
D 3,91 10.57
E 2,51 8,58
F 10.14
G 3,44 10.1
H 3,06 10.69
jeg 3,58 9.07
J 3,52 11.74

Tabell 1: Representant Experimental Plan og PDX-1 +-celle replikering av data. (A) Et omriss av behandlingsplan er vist. Brønnene ble behandlet med DMSO (kolonne 4) og dipyridamol (kolonne 5). Farging ble utført med DAPI, anti-PDX-en, anti-insulin (normal skrift) eller anti-glukagon (kursiv skrift) og Ki-67 (B) Totalt antall PDX-1 + celler (topp, DAPI +PDX-1 +) per brønn og prosentandelen av replikerende PDX-1-celler (nederste, DAPI + PDX-1 + Ki-67 + / + DAPI PDX-1 + x 100) per brønn er vist.

Hendelse 1:
DMSO dipyridamol
4 5
C 3557 4352 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
D 4387 4542 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
E 3462 4879 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
F 4315 4585 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+)
G 1594 1567 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
H 1477 1439 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
jeg 1491 1390 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
J 1298 1474 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+)
Hendelse 2:
DMSO dipyridamol
4 5
C 113 425 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
D 152 511 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
E 97 466 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
F 163 504 # DAPI (+) PDX-1 (+) Insulin (+) Ki-67 (+)
G 1. 3 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
H 10 9 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
jeg 6 11 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
J 12 </ Em> 7 # DAPI (+) PDX-1 (+) Glucagon (+) Ki-67 (+)
% Replication:
DMSO dipyridamol
4 5
C 3.18 9,77
D 3,47 11.25
E 2.8 9,55
F 3,78 10.99
G 0,82 0,57
H 0,68 0,63
jeg 0.4 0,79
J 0,92 0,48

Tabell 2: Representative β-celle og α-celle Replication data Det totale antall p-celler (hendelse 1: DAPI + PDX-1 + insulin +; topp tabellrader CF, normal skrift).), Α-celler (Hendelse 1 : DAPI + PDX-1 + glukagon +; toppen tabellrader GH, kursiv skrift), replikere betaceller (Hendelse 2: DAPI + PDX-1 + insulin + Ki-67 +, middeltabellrader CF, normal skrift) og α -cellene (Hendelse 2: DAPI + PDX-1 + glukagon + Ki-67 +, middeltabellrader GH, kursiv skrift)per brønn er vist. I tillegg er prosentandelen av replikerende p-celler (DAPI + PDX-1 + insulin + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + insulin + x 100; bunntabellrader CF, normal skrift) og a-celler (DAPI + PDX -1 + glukagon + Ki-67 + / DAPI + PDX-1 + glukagon + x 100; bunnen tabellrader GJ, kursiv skrift) per brønn er vist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksperimentelle metoder for å studere de molekylære stier som styrer β-cellevekst og regenerering er viktige verktøy for diabetes forskere. Heri, til en rotte-islet-basert screening plattform identifisere og karakterisere små-molekyl stimulatorer for β-celle-replikasjon er presentert.

Mens de fleste aspekter av denne protokollen er lett utføres av erfarne forskere, noen få skritt krever spesiell teknikk. Først i løpet av holmen isolasjon, kanylering av galle-kanal uten å forstyrre sin integritet krever øvelse. En nyttig strategi er å minimalt blåse opp gallegang å sikre riktig plassering av nålen før fullt utlevering bukspyttkjertelen fordøyelsen løsning. Sekund, effektiv holme isolasjon fra eksokrine vev krever nøye med varighet fordøyelse og hensiktsmessig agitasjon. Forsiktighet bør tas for å sikre jevn varme i hele fordøye gjennom periodisk virvlende. Tredje, eksperimentell suksess avhengers på dyktig diskriminering mellom holmer og eksokrin rusk under manuell holme plukking; denne ferdigheten øker med praksis. For det fjerde er holmen dispersjon og plating gjort slik at alle biter ble dispergert i en blanding av enkelt-celler og små klynger av to eller tre celler. Over- og under fordøyelsen av holmer før plating forstyrre eksperimentelle resultatene. Fersk belagt holmen-cellene skal være ca 50% sammenflytende før den spredte seg og lov til å feste over 48 timer uten å bli forstyrret. Figur 1 viser utseendet av vellykkede holme cellekulturer på ulike tidspunkter etter plating. Femte, er medie endringer for holmen-cellekulturer gjøres nøye for å unngå avbrudd i svakt heftende celler. For det sjette må antigen gjenfinning gjøres med forsiktighet for å unngå fordreining av multi-brønn plate, men tilstrekkelig til å muliggjøre vellykket Ki-67 farging som er følsomme for både under- og overeksponering av temperaturstigning; vridd plater kan ikke brukes forautomatisert image oppkjøpet. Note, overdreven bukspyttkjertelen fordøyelsen, eksponering for eksokrine vevet rusk og / eller trypsinering er vanlige årsaker til holme-cellekultur svikt.

En begrensning av denne protokollen er avhengighet av spesifikke uttrykk markører for β-celle identitet og replikering hendelser. Bruk av ett markører har potensial til å være misvisende. For eksempel er PDX-1 uttrykkes av p-celler, en undergruppe av somatostatin-uttrykkende S-celler og β-celle stamceller 29,30; derav, kan forbindelser som øker PDX-1-celle-replikasjon være spesifikt virker på en ikke-β-cellepopulasjon. Følgelig bekreftende undersøkelser som bruker alternative β-cellemarkører er nødvendig. Tilsvarende er Ki-67 uttrykk ikke en perfekt markør for replikering og flere indikatorer som BrdU og fosfor-histon 3 skal brukes 31. En andre begrensning av denne analysen er at forbindelser som induserer β-celle-replikasjon kan simultanégere øke β-celle apoptose eller de-differensiering. Derfor er det viktig å evaluere hvorvidt en forbindelse som induserer en absolutt økning i β-celle nummer, og / eller induserer β-celle apoptose og hvorvidt forbindelsesbehandlede p-celler opprettholde normal funksjon (glukose-stimulerte insulin sekresjon) 32. En tredje begrensning av denne analysen er den beskjedne gjennomstrømningen forbundet med bruk av primære islet-celler; holmer fra seks rotter genererer 228 eksperimentelle brønner som gjør det mulig ~ 55 forbindelser som skal screenes i fire (pluss positive og negative kontroller). En ytterligere begrensning av den beskrevne β-celle-replikasjon screening plattformen er anvendelse av rotteøyer i stedet for humane øyer. Forskjeller mellom menneskelige og rotteøyer er tilstrekkelig å kreve at alle replikering fremmende forbindelser identifisert ved hjelp av rotte holmen kulturer blir bekreftet ved hjelp av humane holmen kulturer. Men gitt begrenset tilgjengelighet og høye kostnader av menneskelige holmer, primærscreening med menneskelig jegslets er upraktisk for de fleste forskere.

De viktigste fordelene med denne protokollen er: 1) bruk av nylig isolerte primære holmer å opprettholde normale vekst begrensninger i størst mulig grad, 2) bruk av en 384-brønners format for å tillate moderat throughput screening (vanligvis holmer isolert fra seks rotter er tilstrekkelig for 228 brønner) og 3) bruk av automatisert bilde oppkjøpet og analyse for å akselerere tempoet i eksperimentering og å begrense bias. I motsetning brukte alternative tilnærminger stole på manuell bilde oppkjøp og subjektiv vurdering av β-celle replikering hendelser eller hel holme inkorporering av radioaktivt tymidin som ikke diskriminerer mellom celle linages, eksempel fibroblast versus β-celle replikering 15,17. Derfor representerer den presenterte protokollen en viktig og forbedret verktøy for å undersøke veksten gulering av p-celler.

Vi ser for oss en rekke tilpassetbruker for screening plattform. For det første kan en absolutt økning i β-celle nummer bli målt ved å telle antallet av PDX-1 + - eller insulin +-cellene. Å ta hensyn til variasjonen i antall celler pr brønn belagte et høyere antall replikater pr tilstand kan være innbefattet (vanligvis n = 8). For det andre, kan plattformen være tilpasset for lentivirus-baserte overekspresjon eller knock-out / ned eksperimenter for å identifisere måter med β-celle-replikasjon. Oppsummert er det beskrevet eksperimentell teknikk bredt nyttig for å identifisere forbindelser og de molekylære stier som regulerer β-celle replikering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
250 g male Male Sprague Dawly Rat Charles River Stain # 400
12 cm teeth tisuue forceps Fine Science Tools 11021-12
11.5 cm fine scissors Fine Science Tools 14058-11
14.5 cm surgical scissors Fine Science Tools 14001-14
16 cm curved forceps Fine Science Tools 11003-16
12 cm curved hepostat Fine Science Tools 13011-12
12 cm scalpel handle Fine Science Tools 10003-12
Tissue sieve-30 mesh Bellco Glass 1985-85000
Cizyme RI, 375,000 CDA units VitaCyte 005-1030
Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) Gibco 24020-117
Ketamine HCl (200 mg/20 ml) JHP Pharmaceuticals NDC# 42023-113-10 to make anesthetic cocktail 
Xylazine (5 g/50 ml) LLOYD NADA# 139-236 to make anesthetic cocktail 
Histopaque 1077 Sigma H-1077 to make histopaque 1100
Histopaque 1119 Sigma H-1119 to make histopaque 1100
Newborn Calf Serum 500 ml Hyclone SH30118.03
Hanks' Balanced Salt solution Hyclone SH30268.01
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose  Hyclone SH30021.01
Functionality/Viability Solution  Mediatech 99-768-CV
RPMI1640 media  Hyclone SH30096.01 to make conditioned medium
804G rat bladder carcinoma cell-line Available upon request to make conditioned medium
Fetal Bovine Serum, Qualified Gibco 26160
GlutaMax-I Gibco 35050-061
Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml)  MP Biomedicals 1670049
Formamide 500 ml Fisher BioReagents BP227-500
Antigen Unmasking Solution 250 ml (pH 6.0) Vector Laboratories H-3300 to make 0.15 M Sodium Sitrate solution
Dextrose, Anhydrous EMD Chemicals DX0145-1 to make 1 M glucose solution
Nomal Donkey Serum (Powder) Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Triton X-100 Sigma T8787-100ML
Mouse anti-human Ki67 antibody BD Biosciences 556003
Goat anti-human PDX-1 antibody R&D Systems AF2419
Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody Dako 2016-08
Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody Dako 2014-06
Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody Dako 2011-08
Polyclonal chicken anti-vimentin antibody abcam ab24525
Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG Jackson ImmunoResearch 715-065-150
StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated  Invitrogen S32354
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG  Jackson ImmunoResearch 705-025-147
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-025-148
Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-025-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG  Jackson ImmunoResearch 706-175-148
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG Jackson ImmunoResearch 705-175-147
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG Jackson ImmunoResearch 711-175-152
Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG Jackson ImmunoResearch 703-175-155
DAPI Millipore S7113
Disposable Reagent Reservoir 25 ml Sorenson BioScience 39900
384 well, black/clear, tissue culture treated plate BD Falcon 353962
96 well, black/clear, tissue culture treated plate Costar 3603
Multi-channel pipettor Costar 4880
12-channel vaccume aspirator Drummond 3-000-096
Cell Scraper Falcon 353085
Isotemp Water Bath Model 2223  Fisher Scientific
High-content screening instrument: ArrayScan VTI Thermo Scientific

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Butler, A. E., et al. Beta-cell deficit and increased beta-cell apoptosis in humans with type 2 diabetes. Diabetes. 52 (1), 102-110 (2003).
  2. Kloppel, G., Lohr, M., Habich, K., Oberholzer, M., Heitz, P. U. Islet pathology and the pathogenesis of type 1 and type 2 diabetes mellitus revisited. Surv Synth Pathol Res. 4 (2), 110-125 (1985).
  3. Harlan, D. M., Kenyon, N. S., Korsgren, O., Roep, B. O. Current advances and travails in islet transplantation. Diabetes. 58 (10), 2175-2184 (2009).
  4. Nath, D. S., et al. Outcomes of pancreas transplants for patients with type 2 diabetes mellitus. Clin Transplant. 19 (6), 792-797 (2005).
  5. Nichols, R. J., New, C., Annes, J. P. Adult tissue sources for new beta cells. Transl Res. 163 (4), 418-431 (2014).
  6. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  7. Kushner, J. A., MacDonald, P. E., Atkinson, M. A. Stem cells to insulin secreting cells: two steps forward and now a time to pause. Cell Stem Cell. 15 (5), 535-536 (2014).
  8. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429 (6987), 41-46 (2004).
  9. Meier, J. J., et al. Beta-cell replication is the primary mechanism subserving the postnatal expansion of beta-cell mass in humans. Diabetes. 57 (6), 1584-1594 (2008).
  10. Chick, W. L., Lauris, V., Flewelling, J. H., Andrews, K. A., Woodruff, J. M. Effects of glucose on beta cells in pancreatic monolayer cultures. Endocrinology. 92 (1), 212-218 (1973).
  11. Brelje, T. C., Sorenson, R. L. Role of prolactin versus growth hormone on islet B-cell proliferation in vitro: implications for pregnancy. Endocrinology. 128 (1), 45-57 (1991).
  12. Chen, H., et al. PDGF signalling controls age-dependent proliferation in pancreatic beta-cells. Nature. 478 (7369), 349-355 (2011).
  13. Liu, H., et al. Glycogen synthase kinase-3 and mammalian target of rapamycin pathways contribute to DNA synthesis, cell cycle progression, and proliferation in human islets. Diabetes. 58 (3), 663-672 (2009).
  14. Metukuri, M. R., et al. ChREBP mediates glucose-stimulated pancreatic beta-cell proliferation. Diabetes. 61 (8), 2004-2015 (2012).
  15. Wang, P., et al. A high-throughput chemical screen reveals that harmine-mediated inhibition of DYRK1A increases human pancreatic beta cell replication. Nat Med. 21 (4), 383-388 (2015).
  16. Schisler, J. C., et al. Stimulation of human and rat islet beta-cell proliferation with retention of function by the homeodomain transcription factor Nkx6.1. Mol Cell Biol. 28 (10), 3465-3476 (2008).
  17. Fueger, P. T., Hernandez, A. M., Chen, Y. C., Colvin, E. S. Assessing replication and beta cell function in adenovirally-transduced isolated rodent islets. J Vis Exp. (64), (2012).
  18. Walpita, D., et al. A human islet cell culture system for high-throughput screening. J Biomol Screen. 17 (4), 509-518 (2012).
  19. Miyazaki, J., et al. Establishment of a pancreatic beta cell line that retains glucose-inducible insulin secretion: special reference to expression of glucose transporter isoforms. Endocrinology. 127 (1), 126-132 (1990).
  20. Song, W. J., et al. Phosphorylation and inactivation of glycogen synthase kinase 3beta (GSK3beta) by dual-specificity tyrosine phosphorylation-regulated kinase 1A (Dyrk1A). J Biol Chem. 290 (4), 2321-2333 (2015).
  21. Hohmeier, H. E., et al. Isolation of INS-1-derived cell lines with robust ATP-sensitive K+ channel-dependent and -independent glucose-stimulated insulin secretion. Diabetes. 49 (3), 424-430 (2000).
  22. Cozar-Castellano, I., et al. Lessons from the first comprehensive molecular characterization of cell cycle control in rodent insulinoma cell lines. Diabetes. 57 (11), 3056-3068 (2008).
  23. Efrat, S., Fusco-DeMane, D., Lemberg, H., aL Emran, O., Wang, X. Conditional transformation of a pancreatic beta-cell line derived from transgenic mice expressing a tetracycline-regulated oncogene. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3576-3580 (1995).
  24. Wang, W., et al. Identification of small-molecule inducers of pancreatic beta-cell expansion. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (5), 1427-1432 (2009).
  25. Annes, J. P., et al. Adenosine kinase inhibition selectively promotes rodent and porcine islet beta-cell replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (10), 3915-3920 (2012).
  26. Zhao, Z., et al. Repurposing cAMP-modulating medications to promote beta-cell replication. Mol Endocrinol. 28 (10), 1682-1697 (2014).
  27. Chen, C. A., Carolan, P. J., Annes, J. P. In vivo screening for secreted proteins that modulate glucose handling identifies interleukin-6 family members as potent hypoglycemic agents. PLoS One. 7 (9), e44600 (2012).
  28. Izumi, K., Hirao, Y., Hopp, L., Oyasu, R. In vitro induction of ornithine decarboxylase in urinary bladder carcinoma cells. Cancer Res. 41 (2), 405-409 (1981).
  29. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochem J. 310, (Pt 3) 997-1003 (1995).
  30. Szabat, M., Luciani, D. S., Piret, J. M., Johnson, J. D. Maturation of adult beta-cells revealed using a Pdx1/insulin dual-reporter lentivirus. Endocrinology. 150 (4), 1627-1635 (2009).
  31. Rieck, S., et al. Overexpression of hepatocyte nuclear factor-4alpha initiates cell cycle entry, but is not sufficient to promote beta-cell expansion in human islets. Mol Endocrinol. 26 (9), 1590-1602 (2012).
  32. Wang, P., et al. Diabetes mellitus--advances and challenges in human beta-cell proliferation. Nat Rev Endocrinol. 11 (4), 201-212 (2015).

Tags

Medisin Rat holme isolasjon β-celle diabetes Ki-67 PDX-1 insulin gjenfødelse replikering
En High-innhold<em&gt; In Vitro</em&gt; Bukspyttkjertelen Islet β-celle Replication Discovery Platform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, … More

Zhao, Z., Abdolazimi, Y., Armstrong, N. A., Annes, J. P. A High-content In Vitro Pancreatic Islet β-cell Replication Discovery Platform. J. Vis. Exp. (113), e54298, doi:10.3791/54298 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter