Introduction
La recherche de biomarqueurs génomiques cherche à identifier les corrélats moléculaires qui reflètent avec précision et de manière fiable l' état de la maladie, et le font d'une manière cliniquement utile. 1 Le développement Biomarker est tributaire de l' analyse rétrospective des échantillons de tissus bien annotés. des échantillons de tissus malades et normaux sont stockés soit le tissu frais congelé dans des biobanques spécialisées ou tissu enrobé de paraffine (FFPET) blocs fixés au formol dans les archives cliniques. Les tissus frais congelé permet l'extraction des acides nucléiques de haute qualité et a été largement utilisé dans les études de découverte de biomarqueurs génomiques. 2,3 Cependant, moins d' échantillons de tissus sont disponibles dans les biobanques et à étudier un tel tissu introduit un biais vers des échantillons plus larges, des catégories inhabituelles de la maladie, et les patients vus dans des centres spécialisés avec une plus grande capacité au tissu bancaire. 4 FFPET, en revanche, est la méthode de stockage par défaut pour les tissus humains et animaux malades. Bien que les blocs FFPET maintiennent m cellulaireorphology, le processus de fixation des liens croisés autres constituants cellulaires à des acides nucléiques. ARN et l' ADN réticulé sont recouvrables, mais seulement dans des formes dégradées, très fragmentées. 5,6 Cependant, ces fragments d'ADN et d' ARN se prêtent à une analyse par un éventail croissant de tests, y compris l' expression de l' ARNm, l' ADN hypermethylation, et le séquençage ciblé. 7,8 pour exploiter cette occasion dans la grande quantité et variété de FFPET disponible pour la recherche, il existe un besoin pour un protocole d'extraction efficace et fiable.
Une grande partie de la recherche de marqueurs biologiques dans le tissu se concentre sur le cancer. Comme d'autres types de tissus malades, le tissu cancéreux se manifeste souvent hétérogénéité régionale importante en matière de préservation des cellules et le type de cellule. Puisque la recherche de marqueurs biologiques repose sur la capacité à corréler constituants du tissu malade avec des caractéristiques moléculaires, une étape critique de ce processus est la récolte précise du tissu qui est bien préservé et enrichi pour la dalad ie l'étude. Dans FFPET, deux techniques d'enrichissement sont souvent utilisées: microdissection par capture laser (LCM), et la coupe du microtome. LCM permet fortement axé la récolte des tissus et peut être utilisé pour isoler des types cellulaires spécifiques, bien conservés dans les tissus hétérogènes. 9,10 Cependant, LCM nécessite un équipement coûteux et est extrêmement laborieuse , pour un grand nombre d'échantillons. Tronçonnage Microtome est un processus plus largement utilisé où les sections minces sont découpées à partir de blocs FFPET. 11,12 sections Microtome coupées comprennent souvent un tissu qui est hétérogène dans la préservation de la cellule (par exemple, par rapport à nécrotique bien conservé) et de la composition (par exemple, le cancer vs. parenchyme bénigne), et peut donc conduire à l'homogénéisation des caractéristiques moléculaires meilleurs étudiés séparément. Par conséquent, il existe un besoin pour un procédé à haut débit, qui enrichit les cellules d'intérêt. Une troisième méthode, l'isolement des acides nucléiques à partir des noyaux de FFPET, fournit cet enrichissement, convient pour une grande throughput protocoles, et a été utilisé par d' autres pour isoler l' ARN ou de l' ADN à partir de noyaux de tissus séparés. 7,13,14
Un certain nombre de protocoles publiés de préciser les méthodes d'extraction d' acides nucléiques à partir de FFPET (tableau 1). Cependant, les protocoles où l' ARN et l' ADN sont extraits du même tissu ont été optimisés pour des coupes de tissus microtome, mais pas pour les cœurs de tissu. 15,16 protocoles De même, publiés qui offrent une spécificité accrue de tissus, soit par des noyaux de tissus ou microdissections de diapositives, spécifier les procédures pour l' extraction de l' ADN, mais pas l' ARN. 7,17 ici, un protocole optimisé pour une double extraction à la fois de l' ADN et de l' ARN à partir du même cœur de tissu est démontrée. noyaux de tissus sont récoltés en insérant microarray de tissu (TMA) poinçons dans des régions d'intérêt mappés sur des blocs de FFPET. La mise en correspondance est effectuée en annotant une lame de microscope avec un stylo marqueur et transférer l'annotation à la surface correspondante de la FFPEBloc de T (figure 1).
Des travaux antérieurs qui ont conduit à l'élaboration de ce protocole comprenait une comparaison de plusieurs systèmes d'extraction d'acide nucléique disponibles dans le commerce. Dans cette comparaison, les modifications des protocoles commerciaux, tels que décrits ci - après à condition que les ADN et ARN plus hauts rendements et de la qualité (Selvarajah et al., En préparation). Carottes de tissu sont plus épaisses que les sections de 5 à 10 microns um typiquement utilisés dans des protocoles d'extraction FFPET 11,12,14,18 - 20, et peuvent contenir des quantités variables de plus de paraffine. Pour compenser cela, déparaffinage a été renforcée par la répétition des traitements de xylène et l' éthanol et en introduisant une étape d'homogénéisation motorisé (Figure 1). Par ailleurs, la protéinase K temps de digestion ont été allongées pour augmenter le rendement de l'ADN. Dans l'ensemble, ce protocole est rentable et permet l'établissement de liens entre les caractéristiques moléculaires et histopathologiques de la maladie dans large, populations bien caractérisées. Le protocole dans son intégralité peut être effectuée de manière fiable dans les 2 jours, y compris 3 heures de mains sur le temps, avec peu de besoin d'équipement spécialisé ou coûteux.
Le protocole étape par étape est ci-après comme une version modifiée du protocole du fabricant. 21 S'il vous plaît voir le tableau des matériaux / équipement pour les réactifs spécifiques, l' équipement et les fabricants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" | Bemis | RK-06720-40 | Any generic paraffin film will work as a substitute |
| Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" | Likewise | 53-2879-2 | Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact. |
| Molecular biology grade absolute ethanol | Fisher BioReagents | BP2818-500 | Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute |
| Molecular Grade H2O | G-Biosciences | 786-293 | Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O |
| 0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments | Estigen | MPO6[Yellow] | Make sure to use the red receiver punch from the set |
| Fine point permanent marker | Sharpie | 10365796S | Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required |
| FFPE tissue block | |||
| Stained tissue slide corresponding to FFPE block | |||
| 1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes | Fisher BioReagents | 05-408-137 | |
| 2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431048 | |
| 1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) | Eppendorf | 22431021 | |
| Histology Xylene | VWR | CA 95057-822 | Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute |
| Molecular Biology Grade 2-Propanol | Sigma | I9516 | |
| AllPrep FFPE DNA/RNA Kit | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
| Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution | Qiagen | 80234 | Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21 |
| Temperature stable proteinase K | Qiagen | 80234 | |
| High potency proteinase K | Invitrogen | 25530-049 | Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute |
| RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) | Molecular BioProducts | 7003 | |
| RNaseA 100 mg/ml | Qiagen | 19101 | |
| BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2 | BD | 305274 | |
| Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) | Qiagen | 9001271 | Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute |
| -20 °C and -80 °C Laboratory Freezer | |||
| Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes | |||
| Digital Vortex Mixer | |||
| Pipettes and filter tips | |||
| Heating blocks or water baths | |||
| Tris Hydrochloride | Amresco | 0234 | |
| Sodium Chloride | Amresco | 0241 | |
| Anhydrous Magnesium Chloride | Sigma | M8266 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma | L4509 | |
| Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane | Pall | PN 4614 | |
| Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml | BD Integra | 305274 | |
| Hydrochloric Acid | BDH | 3026 | |
| Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) | Nanostring nCounter platform, Nanostring | ||
| Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) | Invitrogen |
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