Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Fremstilling af formalin-fikseret paraffinindlejret væv borekerner til både RNA og DNA ekstraktion

Published: August 21, 2016 doi: 10.3791/54299
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 3, 4, 3, 1, 1,2, 1,2
1Department of Pathology & Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology & Genetics, Queen's Cancer Research Institute, Queen's University, 3Department of Surgery, Division of Urology, McGill University, 4Transformative Pathology Program, Ontario Institute for Cancer Research (OICR)

Summary

Denne modificerede udvinding protokol forbedrer RNA og DNA udbytter fra mere præcist målrettede områder af interesse i histopatologiske væv blokke.

Introduction

Genomisk biomarkør forskning søger at identificere molekylære korrelater, som præcist og pålideligt afspejler sygdomsstatus, og gøre det i en klinisk anvendelig måde. 1 Biomarkør udvikling er afhængig af retrospektiv analyse af godt kommenterede vævsprøver. Syge og normale vævsprøver opbevares enten som frisk frosset væv i specialiserede biobanker eller som formalin-fikseret paraffinindlejret væv (FFPET) blokke i kliniske arkiver. Frisk frosset væv giver mulighed for udvinding af høj kvalitet nukleinsyrer og har været meget anvendt i genomiske biomarkør opdagelse studier. 2,3 Men færre vævsprøver fås i biobanker og studere sådant væv introducerer en bias i retning af større prøver, usædvanlige kategorier af sygdom, og patienter ses på specialiserede centre med større evner til bank væv. 4 FFPET derimod er standard opbevaring metode til syge mennesker og dyr væv. Mens FFPET blokke opretholde cellulær morphology optagelsen proces tværbindinger andre cellulære bestanddele til nukleinsyrer. Tværbundet RNA og DNA, kan erstattes, men kun i beskadigede, stærkt fragmenterede former. 5,6 Disse DNA- og RNA-fragmenter er, modtagelige for analyse ved en ekspanderende række af assays, herunder mRNA-ekspression, DNA hypermethylering, og målrettet sekventering. 7,8 for at udnytte denne mulighed i den store mængde og variation af FFPET rådighed for forskning, er der behov for en effektiv og pålidelig udvinding protokol.

En stor del af biomarkør forskning i væv fokuserer på cancer. Ligesom andre typer af sygt væv, kræftvæv viser ofte betydelige regionale heterogenitet i celle bevaring og celletype. Da biomarkør forskning er afhængig af evnen til at korrelere bestanddele af sygt væv med molekylære funktioner, et kritisk trin i denne proces er den præcise høst af væv, er velbevaret og beriget for disease under undersøgelse. I FFPET er to berigelse teknikker ofte brugt: laser capture mikrodissektion (LCM), og mikrotom sektionering. LCM muliggør meget fokuseret vævshøst og kan anvendes til at isolere specifikke, velbevarede celletyper i heterogene væv. 9,10 LCM kræver dog, dyrt udstyr og er uoverkommeligt tidskrævende for et stort antal prøver. Mikrotom sektionering er en mere udbredt proces, hvor tynde sektioner skæres fra FFPET blokke. 11,12 mikrotom-cut sektioner indeholder ofte væv, der er heterogen i celle konservering (f.eks nekrotisk vs. velbevaret) og sammensætning (fx kræft vs godartet parenchym), og dermed kan føre til homogenisering af molekylære funktioner bedst undersøgt separat. Således er der et behov for en high throughput metode, der beriger for celler af interesse. En tredje fremgangsmåde, isolering af nukleinsyrer fra FFPET kerner, tilvejebringer denne tilsætning, er egnet til høj throughput protokoller, og har været anvendt af andre til at isolere RNA eller DNA fra separate vævskerner. 7,13,14

En række offentliggjorte protokoller angiver fremgangsmåder til ekstraktion af nukleinsyrer fra FFPET (tabel 1). Imidlertid har protokoller hvor RNA og DNA er ekstraheret fra det samme væv blevet optimeret til mikrotomknive vævssnit, men ikke for væv kerner. 15,16 Tilsvarende offentliggjorte protokoller, der tilbyder øget vævsspecificitet, enten gennem væv fyldning eller slide microdissections, angiver procedurer til ekstraktion af DNA, men ikke RNA. 7,17 Her en optimeret protokol til dobbelt ekstraktion af både DNA og RNA fra det samme væv kerne påvises. Tissue kerner høstes ved at indsætte væv microarray (TMA) slag i regioner af interesse kortlagt på FFPET blokke. Kortlægningen udføres ved udfyldelse af et objektglas med en tusch og overføre annotation til overfladen af ​​det tilsvarende FFPET-blok (figur 1).

Tidligere arbejde, der førte til udviklingen af ​​denne protokol omfattede en sammenligning af flere kommercielt tilgængelige nukleinsyre udsugningsanlæg. I denne sammenligning modifikationer kommercielle protokoller, som beskrevet nedenfor tilvejebragt de højeste DNA- og RNA udbyttet og kvaliteten (Selvarajah et al., In prep). Vævskerner er tykkere end 5-10 um micron sektioner typisk anvendes i FFPET ekstraktionsprotokoller 11,12,14,18 - 20, og kan indeholde mere variable mængder af paraffin. For at kompensere for dette, blev afparaffinering forstærket ved at gentage xylen og ethanol behandlinger og ved at indføre en motoriseret homogeniseringstrin (figur 1). Endvidere blev proteinase K-fordøjelse gange forlænget for at øge DNA udbytte. Samlet set er denne protokol er omkostningseffektiv og muliggør etablering af forbindelser mellem molekylære og histopatologiske træk af sygdom i laRGE, godt karakteriserede populationer. Protokollen i sin helhed kan gennemføres pålideligt inden for 2 dage, herunder 3 timer af hands-on tid, med lille behov for specialiseret eller dyrt udstyr.

Trin-for-trin-protokollen er herefter som en modificeret version af producentens protokol. 21 Se Tabel Materialer / Udstyr til specifikke reagenser, udstyr og producenter.

Protocol

1. Tissue Coring

  1. Gennemgå objektglasset og skitsere regionen (r) af interesse med en fin-punkts permanent markør. Klip et afsnit af paraffin film stort nok til at dække området af interesse på objektglasset. Placer film fast på dias og wrap film over kanter for at holde filmen glider. Ved hjælp af en fin-punkts permanent markør, skitsere hele væv og regionen (r) af interesse i vævet, holder omridset rørende - men uden for - regionen (r).
  2. Fjern filmen og overføre den til den tilsvarende væv blok. Orientere filmen ved at vippe eller dreje den, således at omridset af hele væv matcher den observerede form af vævet i blokken (figur 1). Tryk sektion af folien fast til overfladen af ​​blokken for at forhindre glidning.
  3. Brug spidsen af ​​den permanente markør, gøre overfladisk, men synlige (~ 0,2 mm) fordybninger langs omridset af regionen (r) iresse, og fjern filmen. Load 1 ml blegemiddel, 70% ethanol, og vand i separate 1,5 eller 2,0 ml mikrocentrifugerør.
  4. Rengør receptoren (rød) dorn fra 0,6 mm dorn indstillet ved at skubbe stemplet op og ned flere gange, mens spidsen er nedsænket i røret indeholdende blegemiddel. Gentag ovenstående trin med 70% ethanol og derefter vand (kritisk at sikre, at blegemiddel er fjernet).
  5. Tryk dornen ind i vævet, indenfor området af interesse til en dybde på 3 mm og trække punch. Slip kernen i en lav binding 1,5 eller 2 ml rør ved at skubbe det ud af stemplet med pennen. Opbevar kernerne ved -20 ° C (langvarig) eller 4 ° C til kortvarig brug.
  6. Rengør punch i overensstemmelse med trin 1.4 og fortsætte med de næste regioner eller prøve.

2. afparaffiniser FFPE Tissue Cores

  1. Foretagerdetkompetentetoldsted afparaffinering i 1,5 eller 2 ml rør ved tilsætning af 1 ml xylen til vævet kerne og vortexbehandling kraftigt i 10 sek. Heat i 3 min ved 50 ° C.
  2. Centrifuger i 2 minutter ved stuetemperatur (RT) og maksimal hastighed (21.130 x g) og anbring røret på is i 5 min (tillader den voksagtige remanens størkner på toppen).
  3. Fjern forsigtigt paraffin akkumuleret omkring menisken med supernatant ved hjælp af en pipettespids og gentag xylen behandling (trin 2,1-2,2).
  4. Der tilsættes 1 ml ethanol (100%) og vortex kraftigt i 10 sek. Centrifuger i 2 minutter ved RT (maksimal hastighed), og omhyggeligt kasseres ethanol. Gentag ovenstående trin en gang.

3. Homogenisering af afparaffineres kerner

  1. Resuspendere kerner i 700 pi ethanol (100%) før homogenisering. Anvendelse af en motoriseret vævshomogenisator, male kernerne til fine væv partikler (~ 1 min på medium indstilling). Rengør homogenisatoren sonde mellem hver prøve for at minimere overførsel forurening.
    1. Fyld 15 ml rør med ~ 10 ml blegemiddel, RNase neutraliserende opløsning og 70% ethanol. Efter prøven homogenization vaskes homogenisatoren probe i hver af rengøringsmidler i anført ovenfor rækkefølge. Kør homogenisatoren på den højeste hastighed under vasketrinet.
    2. Tør sonden med væv og tillade sonde tørre helt, før homogenisering den næste prøve. Efterse sonden klinger til resterende væv stykker. Hvis fundet, rense sonden igen. Skift rengøringsmidler (blegemiddel, ethanol, og RNase neutraliserende opløsning) dagligt.
  2. Efter homogenisering bringe prøven fortyndes til 1 ml ved tilsætning af mere 100% ethanol (~ 300 pi). Centrifugeres ved maksimal hastighed i 15 min, omhyggeligt opsug ethanol og lufttørre pellet i ca. 15-20 min før man går videre med RNA ekstraktion.

4. Spaltning med proteinase K

  1. Pellet resuspenderes i 150 pi proteinase K-fordøjelse Buffer og flick rør for at løsne pelleten. Tilsæt 10 pi temperatur-stabilt proteinase K og bland ved at svirpe (ikkevortexes tube). Inkubér indholdet i røret ved 56 ° C i 15 minutter med mild omrøring.
  2. Tillad rør inkubere på is i 3 min. Fuldstændig afkøling er vigtig for effektiv udfældning i det følgende trin. Centrifuger i 15 min ved maksimal hastighed.

5. Separat RNA fra DNA

  1. overføre omhyggeligt supernatanten uden at forstyrre pelleten, til et nyt 1,5 ml for RNA oprensning.
  2. Hold pelleten for DNA oprensning (pellet kan opbevares i 2 timer ved stuetemperatur, i op til 1 dag ved 2-8 ° C, eller i længere perioder ved -20 ° C).

6. RNA Purification

  1. Inkubér RNA-holdige supernatant ved 80 ° C i 15 minutter (ikke overskrider denne gang). Dernæst kortvarigt centrifugeres røret til at indsamle dråber fra indersiden af ​​låget.
  2. Tilføj 320 pi Buffer RLT at justere bindingsbetingelser, og bland ved pipettering. Dernæst tilsættes 720 ul ethanol (100%), og vortex.
  3. Transfer 600 pi af prøven, herunder eventuelt bundfald, som kan have dannet, til RNA spin-kolonne (leveret i sættet) placeret i et 2 ml opsamlingsrør og der er afsat det resterende indhold. Centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, kasseres gennemstrømning og genbruge opsamlingsrøret.
  4. Overførsel resterende prøve på en søjle, herunder dråber, der kan have akkumuleret i låget af røret, centrifuge til 15 sek ved ≥8,000 xg, og kassér gennemstrømning.
  5. Tilføj 350 pi Buffer FRN til spin kolonnen og centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, kasseres gennemstrømning og genbruge indsamlingen rør.
  6. Bland forsigtigt 10 pi DNase I stamopløsning med 70 pi Buffer RDD, tilsættes direkte til spinkolonne membran og inkuberes ved stuetemperatur i 15 minutter.
  7. Tilføj 500 pi Buffer FRN til spinkolonne centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg og gemme gennemløbet til anvendelse i det næste trin. At øge indvindingen af ​​små RNA'er, placere spin søjle i enny 2 ml opsamlingsrør og anvende gennemløbet fra det foregående trin til spin-søjle.
  8. Centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, kasseres gennemløbet og genbruge opsamlingsrøret i næste trin. Tilføj 500 pi Buffer RPE til spin kolonne og centrifugeres i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, kasseres gennemløbet og genbruge opsamlingsrøret i det næste trin.
  9. Tilføj 500 pi Buffer RPE til spin kolonne og centrifugeres i 15 sekunder ved ≥8,000 xg og kassér opsamlingsrøret med gennemstrømningen.
  10. Placer spin kolonne i et nyt 2 ml opsamlingsrør, åbne låget og centrifuger ved maksimal hastighed i 5 min. Kassér opsamlingsrøret med gennemstrømningen.
  11. Placer spin søjle i en ny 1,5 ml indsamling, tilsættes 20 pi RNase-frit vand direkte på spinkolonne membran og inkuberes røret i 1 min ved stuetemperatur. Centrifuge ved maksimal hastighed i 1 min til eluering af RNA. Opbevar den eluerede RNA-prøven ved -80 ° C.

  1. Pellet resuspenderes opnået under RNA-ekstraktion ved trinvis tilsætning af 45 pi proteinase K-buffer (400 mM Tris 7,5, 400 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 4% SDS); 45 pi H2O; og 400 ug af høj styrke Proteinase K.
  2. Inkubér den ovennævnte opløsning ved 56 ° C i 24 timer (anbefales) eller natten over. Performincubation ved 90 ° C i 2 timer uden omrøring og kortvarigt centrifugeres mikrocentrifugerøret at indsamle dråber fra indersiden af ​​låget.
  3. Lad prøven afkøle til stuetemperatur og derefter tilsættes 4 pi RNase A (100 mg / ml). Prøven inkuberes i 2 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilsæt 200 pi Buffer AL til prøven, og bland grundigt ved hvirvelblanding. Dernæst tilsættes 200 ul 100% ethanol, og bland grundigt ved hvirvelblanding. Overføre hele prøven til billede spinkolonne sted i en 2 ml opsamlingsrør, og centrifugeres i 1 minut ved ≥8,000 x g.
  5. Kassér opsamlingsrøret medflow-through og placere spin søjle i en ny 2 ml opsamlingsrør. Tilføj 700 pi Buffer AW1 til spin kolonnen, centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, kasseres gennemstrømning og genbruge opsamlingsrøret.
  6. Tilføj 700 pi Buffer AW2 til spin kolonnen, centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, kasseres gennemstrømning og genbruge opsamlingsrøret. Dernæst tilsættes 700 pi 100% ethanol til spin-søjle, centrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg og kassér opsamlingsrøret med gennemstrømningen.
  7. Placer spinkolonne i et nyt 2 ml opsamlingsrør, åbnes låget af spin-søjle, og der centrifugeres ved fuld hastighed i 5 minutter. Kassér opsamlingsrøret med gennemstrømningen.
  8. Placer spin søjle i en ny 1,5 ml opsamlingsrør, og der tilsættes 25 pi opvarmet nuklease-frit vand (50 ° C). Inkuber søjle og rør ved 50 ° C i 10 minutter. Centrifuge i 1 min ved maksimal hastighed, tilsættes 25 pi nuclease-frit vand (RT) til søjle og inkuberes i1 min ved stuetemperatur.
  9. Centrifuge i 1 min ved maksimal hastighed (21.130 x g) og høst gennemstrømning indeholdende genomisk DNA (ca. 50 pi DNA i alt). Opbevar søjlen ved -20 ° C (i tilfælde anden eluering kræves senere).

Representative Results

Denne protokol er en optimeret fremgangsmåde til udvinding af DNA og RNA fra væv kerner, ved hjælp af modifikationer af et kommercielt ekstraktionssystem designet til vævssnit. Optimering omfattede indførelse af væv homogenisering, anvendelse af mere potente proteinase K til DNA-ekstraktion, og udvidelse af vævsfordøjelse tid. Grafer og statistiske analyser omfattede 2-vejs ANOVA, lineær regression og korrelation.

Optimeringer af proteinasefordøjelse
Den kommercielle medfølger en stuetemperatur stabilt proteinase K løsning, som blev erstattet med en mere potent proteinase K, hvilket resulterer i højere DNA udbytte (figur 2A). For yderligere at øge DNA-udbytter blev fordøjelse forlænget fra 2 til 24 timer. Ingen signifikante forskelle blev set mellem de to tidspunkter, men den 24 timers fordøjelse syntes at give mere konsekvente udbytter tværs samples. Men yderligere inkubation til 48 timer ikke yderligere at forbedre DNA recovery (figur 2B; p = 0,74).

Typisk DNA Recovery fra FFPE Prostata Cancer vævsprøver

Brug af den optimerede protokol, RNA og DNA blev co-ekstraheret fra 333 prostatakræft FFPET prøver i området fra 3 til 14 år i prøve alder. Fra hver prøve blev 3 vævskerner (gennemsnitlige samlede væv volumen på 0,95 ± 0,13 mm 3), der anvendes som input. Mens der er andre mikrofluide baserede gel-elektroforese metoder, som kan estimere koncentrationerne og forelægger evalueringer af størrelsesfordelingen af ​​nukleinsyrer molekyler, behøver sådanne metoder ikke giver reproducerbar nukleinsyrer kvantificering, og kan ikke skelne mellem RNA og DNA som flourometrically-baserede assays gør. 22 Og fordi mikrofluide baserede gel-elektroforese resultaterne ikke pålidelige til fragmenteretnucleinsyrer afledt fra FFPET blev 23 nukleinsyre-udbytter målt fluorometrisk (se listen reagens for detaljer). Det gennemsnitlige udbytte var 2.270 ng RNA og 820 ng DNA (figur 3A). Ca. 90% af alle FFPET analyserede prøver i denne undersøgelse gav ≥100 ng DNA og ≥ 500 ng RNA. Interessant var der ingen signifikant korrelation mellem alder FFPET prøven og nukleinsyre gendannelse (figur 3B). Generelt blev RNA- og DNA udbytter korreleret tværs prøver (R2 = 0,39, p <0,0001), men mere end dobbelt så meget RNA end DNA blev udvundet fra hver prøve (figur 3C).

Som pilot og optimering arbejde blev udført på prostata væv, det næste skridt var at undersøge effektiviteten af ​​denne protokol på et par ekstra typer af arkivering væv. Startende med kirurgisk fjernet og obduktion FFPET prøver repræsenterer væregunstige, lever (1 prøve fra 1 tilfælde), cancere i hjernen (8 prøver fra 1 tilfælde), urinblære (2 prøver fra 2 tilfælde), og bryst (3 prøver fra 3 tilfælde), den protokol gav> 100 ng DNA og RNA fra 90% af prøverne (figur 3D). Mens nucleinsyre udbyttet var lavere i obduktion væv end i kirurgiske væv, repræsentative resultater indikerer, at protokollen frembringer lignende udbytter tværs cancere stammer fra forskellige steder.

Vurdering af RNA og DNA Integritet og deres repræsentant Performance i Downstream Analysis

RNA-ekspression analyse af 47 gener i 8 udvalgte FFPET prostatakræft prøver og en frisk PC-3 prostatacancer-cellelinie prøve (som en positiv kontrol) blev udført under anvendelse af en kommerciel multianalyte genekspression platform, der er optimeret til FFPET. De mRNA tæller i PC3 var typisk højere end dem fra FFPET samples (figur 4A). Imidlertid sammenligne relative ekspression af alle generne, viste, FFPET prostatakræft prøver lignende udtryk profiler til PC-3 RNA, hvilket indikerer, at begge kilder til RNA er egnede til RNA-ekspression profilering.

For at demonstrere udførelsen af genomisk DNA ekstraheret med denne protokol, blev bisulfit-konverterede DNA ekstrakter fra FFPET prøver forstærkes af methylering specifik PCR (MSP). 24. MSP-analyse af ALU repetitive elementer, meget denatureret regioner til stede i millioner af eksemplarer i det menneskelige genom, 25 blev anvendt som en genomisk kontrol methylering, og forventes at vise minimale variationer mellem prøver. Som vist i figur 4B, der var lidt at ingen variation ses mellem forskellige prøver i ALU MSP methylering niveauer. Endvidere MSP assays baseret på GSTP1, et gen vides at blive hypermethyleret i prostatacancer, men ikke i godartede prøver, 26 viste ingen påviselig amplifaf tekniske data i DNA fra godartede prøver. Som forventet blev der påvist lavere qPCR cyklus grænseværdier i DNA fra kræft væv, hvilket indikerer berigelse af methylerede GSTP1 kopier. Nytten af ​​nukleinsyrer inddrives af denne protokol blev yderligere testet i typiske efterfølgende analyser, ved hjælp af nukleinsyrer genvundet fra godartet lever og fra en hjerne (post mortem) og fra to kirurgisk fjernet brystkræft prøver. Både RT-qPCR baseret ekspressions- og MSP-assays udføres godt på brystkræft og lever FFPET, men RT-PCR-assayet blev ikke amplificeret et højt udtrykt mRNA fra hjernen tumorprøven efter slagtning (figur 4C), hvilket antyder, at RNA var nedbrudt, sandsynligvis på grund af forsinket vævsfiksering.

figur 1
Figur 1:. Oversigt over Extraction Procedure for FFPET Prøver Figuren illustrerer, hvordan et område af interesse i envæv blok er kortlagt baseret på histopatologisk valg fra et objektglas. Tre 0,6 mm væv kerner fås derefter fra hvert væv område ved hjælp af biopsi slag, homogeniseres sammen og derefter udsat for ekstraktion af både RNA og DNA. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Nucleic Acids (DNA og RNA) udbytter i ng / mm 3 af FFPET fra to proteinase K (Temperatur Stabil og høj potens Enzymes), og Testet på en række inkubationstider for de sidste (A) Udførelse af proteinase K. fra forskellige leverandører. DNA ekstraktioner blev udført på en repræsentativ prøve ved hjælp FFPET temperatur stabil enzym følger med kdet versus en mere potent enzym fra en anden producent. (B) bestemmelse optimal proteinase K inkuberingstid at maksimere DNA udbytte. Udførelse af høj koncentration proteinase K fordøjelse blev evalueret på tre forskellige inkubationsperioder bruger 3 FFPET prøver. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3:. Nukleinsyrer (DNA og RNA) udbytter i ng / mm 3 i FFPET i alt, på tværs Sample År og Repræsentative vævstyper (A) Samlet inddrevet nukleinsyrer fra formalin-fikseret paraffinindlejret væv. De nukleinsyrer mængder, der præsenteres, er baseret på udvinding af 333 FFPET prøver usynge den optimerede protokol. (B) korrelationskurve mellem genvundet totalt DNA og RNA og alder FFPET prøver. De udtrukne FFPET anvendte prøver blev opnået fra årene 2000 til 2012. (C) Sammenhæng mellem udbyttet fra samtidigt ekstraherede DNA og RNA fra 333 prostata prøver. Der er en positiv korrelation mellem DNA og RNA udbytter. (D) Demonstration af protokollen ved brug af yderligere arkivers vævstyper. Den optimerede protokol blev anvendt til at ekstrahere nukleinsyrer fra 14 cancer (bryst, blære og hjerne) og normale (lever) prøver. Fejl søjler repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Udførelse af RNA og DNA Co-udvundet fra Tissue Cores i Downstream Applications. (A) mRNA tæller for FFPE prostatakræft væv og for frisk PC-3 cellelinie kontrol. Hvert punkt repræsenterer gennemsnittet af 3 tekniske replikater ekstraheret separat. Frisk PC-3 cellelinie RNA værdier er illustreret ved gule søjler og FFPET væv værdier er repræsenteret ved farvede prikker. (B) methylering specifikke PCR-assays på DNA af FFPET prostatacancer prøver. Cycle tærskelværdier blev opnået for 10 prøver som forventet anvendelse af 50 ng / reaktion af bisulfit omdannede DNA. ALU MSP analyser fra alle FFPET prøver havde lignende tærskelværdier cyklus værdier (p> 0,67). GSTP1 MSP analyser viste højere methylering (lavere tærskel cyklus) niveauer i prostatakræft end i godartet prostata. (C) Vurdering af DNA og RNA kvalitet fra yderligere typer væv. HPRT1 genekspression og Alu gen methylering assays blev udført på nukleinsyrer (RNA og DNA henholdsvis) hentet fra ellermal leveren (obduktion), og hjerne (obduktion) og brystkræft (alle FFPET). Resultater fra prostata er vist til sammenligning. Bemærk: lignende resultater blev observeret fra hver vævstype, bortset mislykkedes mRNA amplifikation fra en obduktion prøve. Hvert punkt eller bar repræsenterer en stikprøve, og fejl søjler repræsenterer SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

tissue kerner
Tissue Input (mm3) Ekstraherede Nucleic Acid Validering Kvalitet kontrol: DNA Kvalitet kontrol: RNA
(# Af prøver) Age of Sample (år) Totalt udbytte (ng) Fragmentstørrelse (bp) PCR Totalt udbytte (ng) Fragmentstørrelse (bp) PCR NanoString
Pikor et al. 43 - 129 DNA Ingen data Ingen data Ingen data Ingen data
Montaser-Kouhsari et al. 18-29,5 RNA 763 0-25 843 Ingen data
dette papir 1,71 DNA og RNA > 350 3-12 820 100-500 Afkrydsning 2270 100-500 Afkrydsning/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
vævssnit
tissue Input Ekstraherede Nucleic Acid Validering Kvalitet kontrol: DNA Kvalitet kontrol: RNA
(# Af prøver) Age of Sample (år) Totalt udbytte (ng) Fragmentstørrelse (bp) PCR Totalt udbytte (ng) Fragmentstørrelse (bp) PCR NanoString
Heikal et al. 5 x 5 um DNA 12 7-22 88-300 103-351 Afkrydsning
Chung et al. 1 x 20 um RNA 9 > 5 16,000- 23.000 100-200 Afkrydsning
Antica et al. 2 x 4 um RNA 18 Ingen data Ukendt (621 ng / pl) 80-202 + Afkrydsning
Ghatak et al. 5 x 5 um DNA og RNA 5 1 14 256 <1030 Afkrydsning 16 000 109-400 + Afkrydsning
Hennig et al. 1 x 10 um DNA og RNA 210 1-25 Ingen data Ingen data Afkrydsning Ingen data Ingen data Afkrydsning
Laser Capture mikrodissektion
Tissue Input (mm2) Ekstraherede Nucleic Acid Validering Kvalitet kontrol: DNA Kvalitet kontrol: RNA
(# Af prøver) Age of Sample (år) Totalt udbytte (ng) Fragmentstørrelse (bp) PCR Totalt udbytte (ng) Fragmentstørrelse (bp) PCR NanoString Snow et al. 1-2 DNA 110 0-2 430 Ingen data Afkrydsning

Tabel 1:. En sammenligning af offentliggjorte DNA og RNA ekstraktion protokoller for væv kerner, sektioner og laser capture microdissections Også inkluderet er flere molekylære endpoints vurdering af disse metoder ved hjælp af PCR og Nanostring assays.

Discussion

For vellykkede ekstraktion af DNA og RNA fra væv regioner af interesse, nøjagtig udkerning er kritisk. Denne protokol beskriver anvendelsen af ​​et væv patrice til isolering 0,6 mm diameter kerner og beskriver processen til overførsel notationer fra objektglas til tilsvarende FFPET blokke. Modifikationer fabrikantens protokol skulle effektivt ekstrahere nukleinsyrer fra kerner, som er ca. 50 gange tykkere end mikrotomen afsnit, for hvilke protokollen var hensigten. Da kernerne kan indeholde mere paraffin forhold til vævssnit, effektiv afparaffinering af kerner gennem gentagne xylen og ethanol behandlingstrin var påkrævet. Succesen af ​​de post-Afparaffinering trin afhang ordentlig mekanisk væv kerner homogenisering og effektiv proteinase K-fordøjelse. kan udføres yderligere optimering af proteinase K-fordøjelse.

Det er værd at nævne, at denne metode identiFIES områder af interesse på overfladen af ​​blokken, som er identificeret i tilsvarende histopatologi dias. Som centrale høst væv, der kan være 3 eller 4 mm dyb, kan brugere af denne protokol være bekymret over, hvad celler eller væv lå under blokken overflade. Selvom dette er en velbegrundet bekymring, har flere undersøgelser (anmeldt i henvisning 27) viste, at væv kerner korrekt billede af den histologiske og molekylære egenskaber af patologiske væv blokke, især når dobbelt eller tredobbelt kerner udtages fra området af interesse.

Som det modificerede kommercielle ekstraktion kit vedtaget i denne protokol muliggør samtidig ekstraktion af både DNA og RNA fra det samme væv, protokollen sparer kostbar biologisk materiale og tillader en direkte sammenligning mellem de to resulterende nukleinsyrer fra den samme prøve. Samtidig ekstraktion af RNA og DNA skærer ned arbejdskraft og væv udtynding halve, og muliggør præcis integreret analyse af gen-expression, samt epigenetiske og genetiske funktioner, der findes i DNA. Da udbyttet af både RNA og DNA fra disse repræsentative væv kerner typisk overstige 600 og 300 ng henholdsvis, og siden de fleste nuværende PCR og næste generation sekventering applikationer kræver typisk 10-100 ng, bør de fleste af prøverne oprenses ved denne protokol giver tilstrækkelig materiale til flere downstream assays. Denne protokol er blevet vist at være reproducerbar tværs uafhængige laboratorier (Selvarajah et al., In prep.). RNA fra denne protokol var af tilstrækkelig kvalitet til genekspression analyse ved hjælp af enten RT-PCR eller en populær multianalyte platform, og DNA klaret sig godt i methylering specifikke PCR-analyser. Fremtidige undersøgelser med henblik på at vurdere nytten af ​​genvundne nukleinsyrer i næste generation sekventering er berettiget.

Således blev flere ændringer foretaget til en kommercielt tilgængelig protokol, der er designet til tynde FFPET sektioner, hvilket gør den velegnet for co-ekstraktion af RNA og DNA fra 0,6 mm FFPET kerner. Protokollen demonstrerede konsekvent høje udbytter i en stor gruppe af prostatacancer prøver og i et begrænset sæt af prøver fra bryst-, hjerne og blære. Alt i alt bør protokollen gør det muligt for brugerne at foretage målrettede genbaserede analyser af store godt annoterede væv samlinger. Vigtigt er det, protokollen muliggør effektiv fokuseret sampling af områder af interesse i FFPET, relativt små hands-on tid, og høje nok udbytter for de fleste efterfølgende anvendelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" Bemis  RK-06720-40 Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" Likewise 53-2879-2 Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanol Fisher BioReagents BP2818-500 Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2O G-Biosciences 786-293 Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments  Estigen MPO6[Yellow] Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent marker Sharpie 10365796S Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes Fisher BioReagents 05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) Eppendorf 22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) Eppendorf 22431021
Histology Xylene VWR CA 95057-822 Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-Propanol Sigma I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit  Qiagen 80234 Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution Qiagen 80234 Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K Qiagen 80234
High potency proteinase K Invitrogen 25530-049 Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) Molecular BioProducts 7003
RNaseA 100 mg/ml Qiagen 19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2 BD  305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) Qiagen  9001271 Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer  
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride  Amresco 0234
Sodium Chloride  Amresco 0241
Anhydrous Magnesium Chloride Sigma M8266
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane Pall PN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml BD Integra 305274
Hydrochloric Acid BDH 3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kern, S. E. Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures. Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).
  3. Beltran, H., et al. Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity. Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).
  4. Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies. Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).
  5. von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).
  6. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  7. Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  8. Turashvili, G., et al. Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques. Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).
  9. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  10. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).
  11. Bonin, S., Stanta, G. Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics. Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).
  12. Bonin, S., et al. Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).
  13. Montaser-Kouhsari, L., et al. Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).
  14. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).
  15. Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens. J. Clin. Lab. Anal. , (2014).
  16. Hennig, G., et al. Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression. Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).
  17. Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing. BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).
  18. Torrente, M. C., et al. DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques. Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).
  19. Okello, J. B. A., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).
  20. Abramovitz, M., et al. Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay. BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).
  21. AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).
  23. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment (2012).
  24. Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).
  25. Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).
  26. Yegnasubramanian, S. Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer. Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).
  27. Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).

Tags

Grundlæggende protokol Extraction FFPE nukleinsyrer (DNA og RNA) Prostata Cancer Afparaffinering arkivering Patologi Tissue Cores
Fremstilling af formalin-fikseret paraffinindlejret væv borekerner til både RNA og DNA ekstraktion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, P. G., Selvarajah, S.,… More

Patel, P. G., Selvarajah, S., Boursalie, S., How, N. E., Ejdelman, J., Guerard, K. P., Bartlett, J. M., Lapointe, J., Park, P. C., Okello, J. B. A., Berman, D. M. Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction. J. Vis. Exp. (114), e54299, doi:10.3791/54299 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter