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Biology

दोनों आरएनए और डीएनए निष्कर्षण के लिए formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक कोर की तैयारी

Published: August 21, 2016 doi: 10.3791/54299
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 3, 4, 3, 1, 1,2, 1,2
1Department of Pathology & Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology & Genetics, Queen's Cancer Research Institute, Queen's University, 3Department of Surgery, Division of Urology, McGill University, 4Transformative Pathology Program, Ontario Institute for Cancer Research (OICR)

Summary

इस संशोधित निकासी प्रोटोकॉल histopathologic ऊतक ब्लॉक में ब्याज की अधिक ठीक लक्षित क्षेत्रों से आरएनए और डीएनए की पैदावार में सुधार।

Introduction

जीनोमिक बायोमार्कर अनुसंधान आणविक संबद्ध है कि सही और मज़बूती से रोग की स्थिति को दर्शाते हैं, और एक चिकित्सकीय उपयोगी तरीके से ऐसा करते हैं। 1 Biomarker विकास अच्छी तरह से एनोटेट ऊतकों के नमूनों की पूर्वव्यापी विश्लेषण पर निर्भर है की पहचान करने का प्रयास है। रोगग्रस्त और सामान्य ऊतकों के नमूनों या तो विशेष biobanks में के रूप में ताजा जमी ऊतक या नैदानिक ​​अभिलेखागार में formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक (FFPET) ब्लॉक के रूप में जमा हो जाती है। ताजा जमी ऊतक उच्च गुणवत्ता वाले न्यूक्लिक एसिड की निकासी के लिए अनुमति देता है और व्यापक रूप से जीनोमिक बायोमार्कर की खोज के अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। 2,3 हालांकि, कम ऊतकों के नमूनों biobanks में उपलब्ध हैं और इस तरह के ऊतकों का अध्ययन बड़े नमूनों, असामान्य श्रेणियों की दिशा में एक पूर्वाग्रह का परिचय रोग, और रोगियों बैंक के ऊतकों को अधिक से अधिक क्षमता के साथ विशेष केन्द्रों पर देखा की। 4 FFPET, इसके विपरीत, रोगग्रस्त मानव और जानवरों के ऊतकों के लिए डिफ़ॉल्ट भंडारण विधि है। FFPET ब्लॉकों सेलुलर मीटर बनाए रखने के समयorphology, निर्धारण प्रक्रिया पार लिंक न्यूक्लिक एसिड करने के लिए अन्य सेलुलर घटक। क्रॉस से जुड़े आरएनए और डीएनए वसूली कर रहे हैं, लेकिन केवल अपमानित, उच्च खंडित रूपों में। 5,6 हालांकि, इन डीएनए और आरएनए टुकड़े assays की एक विस्तृत सरणी, mRNA अभिव्यक्ति, डीएनए hypermethylation, और लक्षित अनुक्रमण सहित द्वारा विश्लेषण के लिए उत्तरदायी हैं। 7.8 बड़ी मात्रा में और अनुसंधान के लिए उपलब्ध FFPET की विविधता में इस अवसर का फायदा उठाने के लिए, एक कुशल और विश्वसनीय निकासी प्रोटोकॉल के लिए एक की जरूरत है।

ऊतक में बायोमार्कर अनुसंधान का एक बड़ा हिस्सा कैंसर पर केंद्रित है। रोगग्रस्त ऊतक के अन्य प्रकार की तरह, कैंसर के ऊतकों अक्सर सेल संरक्षण और सेल प्रकार में महत्वपूर्ण क्षेत्रीय विविधता से पता चलता है। चूंकि बायोमार्कर अनुसंधान आणविक सुविधाओं के साथ रोगग्रस्त ऊतक के घटक सहसंबंधी करने की क्षमता पर निर्भर करता है, इस प्रक्रिया का एक महत्वपूर्ण कदम है कि अच्छी तरह से संरक्षित और डी के लिए समृद्ध है ऊतक की सटीक कटाई हैअध्ययन के तहत isease। FFPET में, दो संवर्धन तकनीक अक्सर उपयोग किया जाता है: लेजर कब्जा microdissection (एलसीएम), और microtome सेक्शनिंग। एलसीएम अत्यधिक ऊतक कटाई ध्यान केंद्रित सक्षम बनाता है और विशिष्ट, अच्छी तरह से संरक्षित प्रकार की कोशिकाओं को अलग-थलग करने के लिए विषम ऊतकों में इस्तेमाल किया जा सकता है। 9,10 हालांकि, एलसीएम नमूनों की बड़ी संख्या के लिए काफ़ी महंगे उपकरण की आवश्यकता है और बेहद समय है। Microtome सेक्शनिंग एक अधिक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया प्रक्रिया है जहाँ पतली वर्गों FFPET ब्लॉक से काट रहे है। 11,12 microtome-वर्गों में कटौती अक्सर ऊतक है कि सेल संरक्षण में विषम है शामिल हैं (जैसे, परिगलित बनाम अच्छी तरह से संरक्षित) और रचना (जैसे, कैंसर बनाम सौम्य पैरेन्काइमा), और इसलिए आणविक सुविधाओं सबसे अच्छा अलग से जांच के homogenization को जन्म दे सकती। इस प्रकार, वहाँ एक उच्च throughput विधि है कि ब्याज की कोशिकाओं के लिए समृद्ध करती लिए एक की जरूरत है। एक तीसरा तरीका, FFPET कोर से न्यूक्लिक एसिड के अलगाव, इस संवर्धन प्रदान करता है उच्च throug के लिए उपयुक्त हैप्रोटोकॉल hput, और अलग ऊतक कोर से शाही सेना या डीएनए को अलग-थलग करने के लिए दूसरों के द्वारा इस्तेमाल किया गया है। 7,13,14

प्रकाशित प्रोटोकॉल के एक नंबर FFPET (तालिका 1) से न्यूक्लिक एसिड निकालने के तरीकों निर्दिष्ट करें। , या तो ऊतक कोर या स्लाइड के माध्यम से microdissections हालांकि, प्रोटोकॉल जहां आरएनए और डीएनए एक ही ऊतक से निकाले जाते हैं microtome ऊतक वर्गों के लिए अनुकूलित किया गया है, लेकिन ऊतक कोर के लिए नहीं। 15,16 इसी तरह, प्रकाशित प्रोटोकॉल जो ऊतक विशिष्टता वृद्धि की पेशकश करते हैं, प्रक्रियाओं निर्दिष्ट डीएनए की निकासी, लेकिन आरएनए नहीं। 7,17 इधर, दोनों डीएनए और एक ही ऊतक कोर से शाही सेना की दोहरी निकासी के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए प्रदर्शन किया है। ऊतक कोर हित के क्षेत्रों FFPET ब्लॉकों पर मैप में ऊतक माइक्रोएरे (टीएमए) घूंसे डालने से काटा जाता है। मानचित्रण एक मार्कर पेन के साथ एक खुर्दबीन स्लाइड व्याख्या और इसी FFPE की सतह के लिए एनोटेशन स्थानांतरित द्वारा किया जाता हैटी ब्लॉक (चित्रा 1)।

पहले काम है कि इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए नेतृत्व कई व्यावसायिक रूप से उपलब्ध न्यूक्लिक एसिड निकासी प्रणाली की तुलना शामिल थे। इस तुलना में, वाणिज्यिक प्रोटोकॉल के लिए संशोधन, के रूप में नीचे वर्णित उच्चतम डीएनए और आरएनए की पैदावार और गुणवत्ता (Selvarajah एट अल।, तैयारी में) प्रदान की है। ऊतक कोर 5-10 माइक्रोन माइक्रोन वर्गों आमतौर पर FFPET निकासी प्रोटोकॉल 11,12,14,18 में इस्तेमाल की तुलना में गहरा हो रहे हैं - 20, और आयल के अधिक चर मात्रा में हो सकती है। इस के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, deparaffinization xylene और इथेनॉल उपचार दोहरा द्वारा और एक मोटर चालित homogenization कदम (चित्रा 1) को शुरू करने से बढ़ाया गया था। इसके अलावा, proteinase कश्मीर पाचन बार डीएनए उपज बढ़ाने के लिए लम्बे थे। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल लागत प्रभावी है और ला में रोग के आणविक और histopathologic सुविधाओं के बीच संबंधों की स्थापना के लिए सक्षम बनाता हैrge, अच्छी तरह से विशेषता आबादी। अपनी संपूर्णता में प्रोटोकॉल 2 दिनों के भीतर मज़बूती से बाहर किया जा सकता, हाथों पर समय की 3 घंटा, विशेष या महंगे उपकरण के लिए बहुत कम जरूरत के साथ शामिल है।

कदम-दर-कदम प्रोटोकॉल निर्माता प्रोटोकॉल का एक संशोधित संस्करण के रूप में इसके बाद है। 21 कृपया विशिष्ट अभिकर्मकों, उपकरण, और निर्माताओं के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें।

Protocol

1. ऊतक Coring

  1. खुर्दबीन स्लाइड की समीक्षा करें और एक ठीक बिंदु स्थायी मार्कर का उपयोग ब्याज की क्षेत्र (ओं) की रूपरेखा तैयार। आयल फिल्म काफी बड़े खुर्दबीन स्लाइड पर ब्याज के क्षेत्र को कवर करने के एक वर्ग से बाहर कट। फिल्म मजबूती से स्लाइड पर रखें और किनारों पर फिल्म को कपड़े में लपेटकर फिसल से फिल्म बनाए रखने के लिए। एक ठीक बिंदु स्थायी मार्कर का उपयोग करना, पूरे ऊतक और ऊतक के भीतर ब्याज के क्षेत्र (ओं) की रूपरेखा, रूपरेखा छू रखते हुए - लेकिन के बाहर - क्षेत्र (s)।
  2. फिल्म निकालें और इसी ऊतक ब्लॉक को हस्तांतरण। Flipping या (चित्रा 1) तो पूरे ऊतक की रूपरेखा ब्लॉक में ऊतक के मनाया आकार से मेल खाता है कि यह घूर्णन द्वारा फिल्म ओरिएंट। मजबूती से फिसलन को रोकने के लिए ब्लॉक की सतह के लिए फिल्म की धारा दबाएँ।
  3. स्थायी मार्कर की नोक का उपयोग करना, में क्षेत्र (एस) की रूपरेखा के साथ उथले लेकिन दिखाई (~ 0.2 मिमी) indentations बनानाब्याज, तो फिल्म को हटा दें। लोड अलग 1.5 या 2.0 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में ब्लीच, 70% इथेनॉल और पानी की 1 मिलीलीटर।
  4. साफ 0.6 मिमी पंच ऊपर और नीचे कई बार पंच रपट जबकि टिप युक्त ट्यूब ब्लीच में डूबे हुए है द्वारा निर्धारित से रिसेप्टर (लाल) पंच। 70% इथेनॉल और फिर पानी से ऊपर चरण को दोहराएँ (कि ब्लीच सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण निकाल दिया जाता है)।
  5. पंच 3 मिमी की गहराई तक ब्याज के क्षेत्र के अंदर है, ऊतक में प्रेस और पंच वापस ले लें। एक कम यह स्टाइलस के साथ पंच से बाहर धक्का द्वारा 1.5 या 2 मिलीलीटर ट्यूब बाध्यकारी में कोर रिलीज। -20 डिग्री सेल्सियस (दीर्घावधि) या अल्पकालिक उपयोग के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोर स्टोर।
  6. 1.4 कदम है और अगले क्षेत्रों या नमूना के साथ जारी रखने के अनुसार पंच साफ करें।

2. FFPE ऊतक कोर Deparaffinize

  1. ऊतक कोर करने के लिए 1 मिलीलीटर xylene जोड़ने और 10 सेकंड के लिए सख्ती vortexing 1.5 या 2 मिलीलीटर ट्यूब में कैरीआउट deparaffinization। hea50 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए टी।
  2. कमरे के तापमान (आरटी) और अधिकतम गति (21,130 XG) और जगह ट्यूब 5 मिनट के लिए बर्फ पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र (मोमी अवशेषों शीर्ष पर जमना की अनुमति देता है)।
  3. ध्यान से एक विंदुक टिप का उपयोग कर सतह पर तैरनेवाला साथ meniscus के आसपास जमा हो पैराफिन हटाने और xylene उपचार दोहराने (2.1-2.2 कदम)।
  4. 10 सेकंड के लिए सख्ती इथेनॉल (100%) और भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। आर टी (अधिकतम गति) पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, और ध्यान से इथेनॉल त्यागें। ऊपर चरण एक बार दोहराएँ।

3. Deparaffinized कोर के homogenization

  1. इथेनॉल (100%) homogenization के लिए पहले के 700 μl में कोर Resuspend। एक मोटर चालित ऊतक homogenizer का उपयोग ठीक ऊतक कणों में कोर पीसने (~ मध्यम सेटिंग पर 1 मिनट)। प्रत्येक नमूने के बीच homogenizer जांच को साफ कैरी ओवर के प्रदूषण को कम करने के लिए।
    1. के साथ 15 मिलीलीटर ट्यूबों ब्लीच, RNase निष्क्रिय समाधान और 70% इथेनॉल के 10 मिलीलीटर भरें ~। नमूना होमो के बादgenization, ऊपर कहा गया है क्रम में सफाई समाधान में से प्रत्येक में homogenizer जांच धो लें। कपड़े धोने चरण के दौरान उच्चतम गति पर homogenizer चलाएँ।
    2. ऊतक के साथ जांच को साफ कर लें और जांच अगले नमूना homogenizing से पहले पूरी तरह से सूखे के लिए अनुमति देते हैं। दिखने में अवशिष्ट ऊतक के टुकड़े के लिए जांच ब्लेड का निरीक्षण किया। तो पाया, जांच फिर से साफ। सफाई समाधान (ब्लीच, इथेनॉल, और RNase निष्क्रिय समाधान) दैनिक परिवर्तन।
  2. homogenization के बाद, अधिक 100% इथेनॉल (~ 300 μl) जोड़कर 1 मिलीलीटर के लिए नमूना मात्रा लाने के लिए। 15 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र, ध्यान से शाही सेना निष्कर्षण के साथ आगे बढ़ने से पहले लगभग 15-20 मिनट के लिए इथेनॉल और शुष्क हवा गोली aspirate।

4. proteinase कश्मीर के साथ पाचन

  1. 150 μl proteinase कश्मीर पाचन बफर में गोली और झटका ट्यूब गोली ढीला करने के लिए Resuspend। के तापमान को स्थिर proteinase कश्मीर में 10 μl जोड़ें और flicking द्वारा मिश्रण (मतट्यूब भंवर)। हल्के आंदोलन के साथ 15 मिनट के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब में सामग्री सेते हैं।
  2. ट्यूब 3 मिनट के लिए बर्फ पर सेते दें। पूरा ठंडा निम्न चरण में कुशल वर्षा के लिए महत्वपूर्ण है। अधिकतम गति से 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।

5. डीएनए से अलग आरएनए

  1. ध्यान से सतह पर तैरनेवाला, गोली परेशान बिना, शाही सेना शुद्धि के लिए एक नया 1.5 मिलीलीटर के लिए स्थानांतरण।
  2. डीएनए शुद्धि के लिए गोली (गोली -20 डिग्री सेल्सियस पर आरटी पर 2 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है 1 दिन तक 2-8 डिग्री सेल्सियस पर, या लंबी अवधि के लिए के लिए) रखें।

6. शाही सेना शुद्धि

  1. 15 मिनट के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर शाही सेना युक्त सतह पर तैरनेवाला सेते हैं (इस बार से अधिक नहीं है)। अगले, संक्षिप्त ट्यूब ढक्कन के अंदर से बूँदें इकट्ठा करने के लिए अपकेंद्रित्र।
  2. 320 μl बफर RLT बाध्यकारी शर्तों को समायोजित, और pipetting द्वारा मिश्रण करने के लिए जोड़ें। अगले, 720 μl इथेनॉल (100%), और भंवर जोड़ें।
  3. स्थानांतरण 6नमूने के 00 μl, किसी भी वेग कि शाही सेना स्पिन स्तंभ (किट में आपूर्ति) एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में रखा गठन हो सकता है, और एक तरफ शेष सामग्री सेट भी शामिल है। ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और पुन: उपयोग संग्रह ट्यूब।
  4. स्थानांतरण एक स्तंभ पर नमूना शेष, ≥8,000 XG पर बूंदों कि ट्यूब के ढक्कन में जमा कर सकते हैं, 15 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज सहित, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें।
  5. ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए 350 μl बफर FRN जोड़ें, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और संग्रह ट्यूब पुन: उपयोग।
  6. धीरे, 70 μl बफर RDD के साथ 10 μl DNase मैं शेयर समाधान मिश्रण स्पिन स्तंभ झिल्ली को सीधे जोड़ने के लिए, और 15 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
  7. ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ के लिए 500 μl बफर FRN जोड़ें, सेंट्रीफ्यूज और अगले चरण में उपयोग के लिए प्रवाह के माध्यम से बचाने के लिए। छोटे RNAs की वसूली बढ़ाने के लिए, एक में स्पिन स्तंभ जगहनई 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब और स्पिन स्तंभ के लिए पिछले चरण से प्रवाह के माध्यम से लागू होते हैं।
  8. ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और पुन: उपयोग अगले चरण में संग्रह ट्यूब। ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए 500 μl बफर RPE जोड़ें, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और पुन: उपयोग अगले चरण में संग्रह ट्यूब।
  9. ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ और सेंट्रीफ्यूज के लिए 500 μl बफर RPE जोड़ें और त्यागने के माध्यम से प्रवाह के साथ संग्रह ट्यूब।
  10. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ प्लेस, 5 मिनट के लिए अधिकतम गति पर ढक्कन और सेंट्रीफ्यूज खुला। त्यागें प्रवाह के माध्यम से संग्रह ट्यूब।
  11. , एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह में स्पिन स्तंभ की जगह सीधे स्पिन स्तंभ झिल्ली पर RNase मुक्त पानी के 20 μl जोड़ने के लिए, और आरटी पर 1 मिनट के लिए ट्यूब सेते हैं। 1 मिनट के लिए अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र आरएनए elute करने के लिए। -80 डिग्री सेल्सियस पर eluted शाही सेना के नमूने संग्रहित करें।

  1. गोली proteinase कश्मीर बफर के 45 μl की चरणबद्ध इसके द्वारा शाही सेना निकासी के दौरान प्राप्त Resuspend (400 मिमी Tris 7.5, 400 मिमी NaCl, 3 मिमी MgCl 2, 4% एसडीएस); 45 μl एच 2 ओ; और उच्च शक्ति proteinase लालकृष्ण के 400 माइक्रोग्राम
  2. 24 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर ऊपर समाधान सेते हैं (अनुशंसित) या रात। आंदोलन के बिना 2 घंटा और संक्षिप्त के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर Performincubation ढक्कन के अंदर से बूंदों को इकट्ठा करने के microcentrifuge ट्यूब अपकेंद्रित्र।
  3. नमूना आरटी को शांत करने के लिए और फिर 4 μl RNase एक (100 मिलीग्राम / एमएल) जोड़ने की अनुमति दें। आरटी पर 2 मिनट के लिए नमूना सेते हैं।
  4. नमूने के लिए 200 μl बफर अल जोड़ें, और vortexing द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से। अगले, 100% इथेनॉल के 200 μl जोड़ने के लिए, और vortexing द्वारा अच्छी तरह मिला लें। पर ≥8,000 x जी 1 मिनट के लिए प्रदान की स्पिन स्तंभ, एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में जगह है, और सेंट्रीफ्यूज के लिए पूरे नमूना हस्तांतरण।
  5. त्यागें साथ संग्रह ट्यूबप्रवाह के माध्यम से और एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ जगह है। ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ के लिए 700 μl बफर AW1 जोड़ें, सेंट्रीफ्यूज, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और पुन: उपयोग संग्रह ट्यूब।
  6. ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ के लिए 700 μl बफर AW2 जोड़ें, सेंट्रीफ्यूज, प्रवाह के माध्यम से त्यागें और पुन: उपयोग संग्रह ट्यूब। अगले, ≥8,000 XG पर 15 सेकंड के लिए स्पिन स्तंभ, सेंट्रीफ्यूज के लिए 100% इथेनॉल के 700 μl जोड़ें और त्यागने के माध्यम से प्रवाह के साथ संग्रह ट्यूब।
  7. एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ प्लेस, 5 मिनट के लिए पूरी गति से स्पिन स्तंभ के ढक्कन, और सेंट्रीफ्यूज खुला। त्यागें प्रवाह के माध्यम से संग्रह ट्यूब।
  8. एक नया 1.5 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में स्पिन स्तंभ रखें और गर्म nuclease मुक्त पानी (50 डिग्री सेल्सियस) के 25 μl जोड़ें। 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ और ट्यूब सेते हैं। अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र, स्तंभ के लिए nuclease मुक्त पानी (आरटी) का 25 μl जोड़ें और के लिए सेतेआरटी पर 1 मिनट।
  9. अधिकतम गति (21,130 XG) और फसल प्रवाह के माध्यम से जीनोमिक डीएनए (कुल डीएनए के लगभग 50 μl) युक्त पर 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्तंभ स्टोर (मामले में एक और क्षालन बाद में आवश्यक है)।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल ऊतक कोर से डीएनए और आरएनए उबरने, ऊतक वर्गों के लिए बनाया गया एक वाणिज्यिक निकासी प्रणाली का उपयोग करते हुए संशोधनों के लिए एक अनुकूलित विधि का प्रतिनिधित्व करता है। अनुकूलन ऊतक homogenization की शुरूआत, डीएनए निष्कर्षण के लिए अधिक शक्तिशाली proteinase कश्मीर उपयोग, और ऊतक पाचन समय का विस्तार भी शामिल है। रेखांकन और सांख्यिकीय विश्लेषण 2 तरह से एनोवा, रेखीय प्रतिगमन और सहसंबंध शामिल थे।

Proteinase पाचन के अनुकूलन
वाणिज्यिक किट एक कमरे के तापमान स्थिर proteinase कश्मीर समाधान है जो एक अधिक शक्तिशाली proteinase कश्मीर के साथ प्रतिस्थापित किया गया था, उच्च डीएनए उपज (2A चित्रा) में जिसके परिणामस्वरूप शामिल थे। आगे डीएनए की पैदावार बढ़ाने के लिए, पाचन 2 से 24 घंटा के लिए बढ़ा दिया गया था। कोई महत्वपूर्ण मतभेद दो समय बिंदुओं के बीच में देखा गया था, लेकिन 24 घंटा पाचन SA भर में और अधिक सुसंगत पैदावार प्रदान करने के लिए दिखाई दियाmples। हालांकि, आगे ऊष्मायन के लिए 48 घंटा आगे डीएनए वसूली में सुधार नहीं किया (चित्रा 2 बी, पी = 0.74)।

FFPE प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों के नमूनों से विशिष्ट डीएनए वसूली

अनुकूलित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, आरएनए और डीएनए सह निकाले 333 प्रोस्टेट कैंसर FFPET 3 से 14 वर्ष से नमूना उम्र में लेकर नमूनों से थे। प्रत्येक नमूने से, 3 ऊतक कोर (0.95 ± 0.13 मिमी 3 की औसत कुल ऊतक मात्रा) इनपुट के रूप में इस्तेमाल किया गया। जबकि वहाँ अन्य microfluidic आधारित जेल वैद्युतकणसंचलन तरीकों जो सांद्रता का अनुमान है और न्यूक्लिक एसिड अणुओं के आकार के वितरण का मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं, इस तरह के तरीकों प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य न्यूक्लिक एसिड मात्रा का ठहराव प्रदान नहीं करते हैं, और आरएनए और डीएनए के बीच भेद नहीं कर सकते हैं के रूप में flourometrically आधारित assays से करते हैं। 22 और, क्योंकि microfluidic आधारित जेल वैद्युतकणसंचलन परिणाम खंडित के लिए विश्वसनीय नहीं हैंFFPET से निकाली गई न्यूक्लिक एसिड, 23 न्यूक्लिक एसिड की पैदावार fluorometrically मापा गया (विवरण के लिए अभिकर्मक सूची देखें)। औसत उपज शाही सेना के 2,270 एनजी और डीएनए (चित्रा 3 ए) के 820 एनजी था। इस अध्ययन में विश्लेषण सभी FFPET नमूने का लगभग 90% डीएनए के ≥100 एनजी और ≥ 500 शाही सेना के एनजी झुकेंगे। दिलचस्प है, वहाँ FFPET नमूना और न्यूक्लिक एसिड वसूली (चित्रा 3 बी) की उम्र के बीच कोई महत्वपूर्ण संबंध था। कुल मिलाकर, आरएनए और डीएनए पैदावार भर नमूने सहसंबद्ध थे (2 आर = 0.39; पी <0.0001), हालांकि डीएनए की तुलना में दो बार से अधिक ज्यादा आरएनए प्रत्येक नमूना (चित्रा 3 सी) से बरामद किया गया था।

के रूप में पायलट और अनुकूलन काम प्रोस्टेट ऊतकों पर प्रदर्शन किया गया था, अगले कदम के अभिलेखीय ऊतक के कुछ अतिरिक्त प्रकार पर इस प्रोटोकॉल के प्रदर्शन की जांच करने के लिए किया गया था। के साथ शुरू शल्य चिकित्सा द्वारा हटा और शव को FFPET नमूने का प्रतिनिधित्व होnign जिगर (1 से नमूना 1 मामले), मस्तिष्क (1 मामले से 8 नमूने), मूत्राशय (2 मामलों से 2 नमूने), और स्तन (3 मामलों से 3 नमूने) का कैंसर, प्रोटोकॉल झुकेंगे डीएनए के> 100 एनजी और आरएनए 90% से नमूनों की चित्रा (3 डी)। जबकि न्यूक्लिक एसिड की पैदावार शल्य ऊतकों की तुलना में शव परीक्षण के ऊतकों में कम थे, प्रतिनिधि परिणामों से संकेत मिलता है कि प्रोटोकॉल अलग अलग साइटों से निकाली गई कैंसरों भर में इसी तरह की पैदावार पैदा करता है।

शाही सेना के आकलन और डीएनए वफ़ादारी और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उनके प्रतिनिधि प्रदर्शन

8 में चयनित FFPET प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों में 47 जीन और (एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में) एक ताजा पीसी 3 प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन नमूना की शाही सेना अभिव्यक्ति विश्लेषण है कि FFPET के लिए अनुकूलित है कि एक वाणिज्यिक multianalyte जीन अभिव्यक्ति मंच का उपयोग किया गया था। PC3 में mRNA मायने रखता है आम तौर पर FFPET SA से उन लोगों की तुलना में अधिक थेmples (चित्रा 4 क)। हालांकि, सभी जीनों के रिश्तेदार अभिव्यक्ति की तुलना, FFPET प्रोस्टेट कैंसर के नमूने समान अभिव्यक्ति प्रोफाइल के लिए पीसी-3 आरएनए से पता चला है, यह दर्शाता है कि शाही सेना के दोनों स्रोतों आरएनए अभिव्यक्ति की रूपरेखा के लिए उपयुक्त हैं।

इस प्रोटोकॉल के साथ निकाली गई जीनोमिक डीएनए के प्रदर्शन का प्रदर्शन करने के लिए, bisulfite परिवर्तित FFPET नमूनों से डीएनए मेथिलिकरण अर्क से परिलक्षित थे विशिष्ट पीसीआर (एमएसपी)। 24 ALU दोहराए तत्वों, अत्यधिक methylated क्षेत्रों की लाखों प्रतियाँ में मौजूद मानव जीनोम में से न्यूनतम समर्थन मूल्य विश्लेषण, 25 एक जीनोमिक मेथिलिकरण नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था, और नमूनों के बीच कम से कम रूपों को दिखाने के लिए उम्मीद है। जैसा कि चित्र 4 बी में दिखाया गया है, वहाँ कोई बदलाव ALU एमएसपी मेथिलिकरण स्तरों में विभिन्न नमूनों के बीच देखा करने के लिए छोटा था। इसके अलावा, GSTP1, एक जीन प्रोस्टेट कैंसर में लेकिन सौम्य नमूनों में नहीं hypermethylated जा करने के लिए जाना जाता है के आधार पर न्यूनतम समर्थन मूल्य assays, 26 नहीं detectable amplif दिखायासौम्य नमूनों से डीएनए में ications। जैसी कि उम्मीद थी, कम qPCR चक्र दहलीज मूल्यों कैंसर के ऊतकों से डीएनए में पता चला रहे थे, methylated GSTP1 प्रतियों के संवर्धन का संकेत है। इस प्रोटोकॉल के द्वारा बरामद न्यूक्लिक एसिड की उपयोगिता आगे, ठेठ नीचे की ओर assays में परीक्षण किया गया था एक मस्तिष्क (पोस्टमार्टम) सौम्य जिगर से और से बरामद न्यूक्लिक एसिड और दो शल्य चिकित्सा द्वारा हटा स्तन कैंसर के नमूनों से इस्तेमाल करते हैं। दोनों RT-qPCR आधारित अभिव्यक्ति और एमएसपी assays स्तन कैंसर और लीवर FFPET पर अच्छा प्रदर्शन किया है, लेकिन आरटी पीसीआर परख पोस्टमार्टम ब्रेन ट्यूमर के नमूने से एक अत्यधिक व्यक्त mRNA (चित्रा 4C) बढ़ाना करने में विफल रहा है, सुझाव है कि शाही सेना अपमानित किया था, देरी ऊतक निर्धारण के कारण होने की संभावना है।

आकृति 1
चित्रा 1:। FFPET नमूने के लिए निष्कर्षण प्रक्रिया का अवलोकन आंकड़ा एक में ब्याज की कैसे एक क्षेत्र को दिखाता हैऊतक ब्लॉक एक खुर्दबीन स्लाइड से histopathologic चयन के आधार पर मैप किया गया है। तीन 0.6 मिमी ऊतक कोर तो बायोप्सी घूंसे का उपयोग कर, एक साथ homogenized और फिर दोनों आरएनए और डीएनए की निकासी के अधीन द्वारा प्रत्येक ऊतक क्षेत्र से प्राप्त कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) एनजी में पैदावार / मिमी FFPET के 3 दो proteinase कश्मीर (तापमान स्थिर और उच्च शक्ति एंजाइमों), और बाद के लिए ऊष्मायन समय की एक सीमा के पार का परीक्षण (ए) proteinase कश्मीर के प्रदर्शन से। विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं से। डीएनए एक्सट्रेक्शन तापमान स्थिर एंजाइम कश्मीर के साथ आपूर्ति का उपयोग कर एक प्रतिनिधि FFPET नमूना पर प्रदर्शन किया गयायह एक और निर्माता से एक अधिक शक्तिशाली एंजाइम बनाम। (बी) इष्टतम proteinase कश्मीर ऊष्मायन समय डीएनए उपज को अधिकतम करने के निर्धारण। उच्च एकाग्रता proteinase कश्मीर पाचन के प्रदर्शन तीन अलग-अलग ऊष्मायन 3 FFPET नमूने का उपयोग कर समय पर मूल्यांकन किया गया था। त्रुटि सलाखों मतलब (SEM) के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) कुल में / मिमी FFPET के 3 एनजी, नमूना साल और प्रतिनिधि प्रकार के ऊतकों भर में पैदावार (ए) कुल formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतकों से न्यूक्लिक एसिड बरामद किया। प्रस्तुत न्यूक्लिक एसिड की मात्रा 333 FFPET नमूनों की एक्सट्रेक्शन पर आधारित हैं Uअनुकूलित प्रोटोकॉल गाते हैं। (बी) बरामद की कुल डीएनए और आरएनए और FFPET नमूनों की उम्र के बीच सहसंबंध साजिश है। इस्तेमाल किया निकाले FFPET नमूने समवर्ती निकाले डीएनए और 333 प्रोस्टेट नमूनों से शाही सेना से पैदावार के बीच 2012 (सी) सहसंबंध वर्ष 2000 से प्राप्त किया गया। वहाँ डीएनए और आरएनए पैदावार के बीच एक सकारात्मक संबंध है। (डी) प्रोटोकॉल अतिरिक्त अभिलेखीय प्रकार के ऊतकों का उपयोग करने का प्रदर्शन। अनुकूलित प्रोटोकॉल 14 कैंसर (स्तन, मूत्राशय और मस्तिष्क) और सामान्य (यकृत) के नमूनों से न्यूक्लिक एसिड निकालने के लिए इस्तेमाल किया गया था। त्रुटि सलाखों प्रतिनिधित्व SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: आरएनए और डीएनए के प्रदर्शन Tissu से सह-निकालीबहाव के अनुप्रयोगों में ई कोर। (ए) mRNA FFPE प्रोस्टेट कैंसर के ऊतकों के लिए और नए सिरे से पीसी-3 सेल लाइन पर नियंत्रण के लिए मायने रखता है। प्रत्येक बिंदु 3 तकनीकी अलग से निकाले प्रतिकृति की औसत प्रतिनिधित्व करता है। ताजा पीसी-3 सेल लाइन आरएनए मूल्यों पीला सलाखों और FFPET ऊतक मूल्यों से यह साफ कर रहे हैं रंग का डॉट्स द्वारा प्रतिनिधित्व कर रहे हैं। (बी) मेथिलिकरण FFPET प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों की डीएनए पर विशिष्ट पीसीआर assays। साइकिल दहलीज मूल्यों के रूप में 10 से 50 एनजी / bisulfite परिवर्तित डीएनए की प्रतिक्रिया का उपयोग उम्मीद प्रदर्शन के नमूने के लिए प्राप्त किया गया। सभी FFPET नमूनों से ALU एमएसपी assays के समान चक्र दहलीज मूल्यों (p> 0.67) था। GSTP1 एमएसपी assays उच्च मेथिलिकरण (कम चक्र दहलीज) सौम्य प्रोस्टेट की तुलना में प्रोस्टेट कैंसर में स्तर से पता चला। (सी) अतिरिक्त प्रकार के ऊतकों से डीएनए और आरएनए की गुणवत्ता का आकलन। HPRT1 जीन अभिव्यक्ति और Alu जीन मेथिलिकरण assays न्यूक्लिक एसिड (आरएनए और डीएनए क्रमशः) से निकाले गए पर प्रदर्शन किया गया और न हीमल जिगर (ऑटोप्सी), और मस्तिष्क (ऑटोप्सी) और स्तन कैंसर (सभी FFPET)। प्रोस्टेट परिणाम से तुलना करने के लिए दिखाए जाते हैं। नोट: इसी तरह के परिणाम, प्रत्येक ऊतक प्रकार से मनाया गया एक शव परीक्षण के नमूने से विफल रहा है mRNA प्रवर्धन के लिए छोड़कर। प्रत्येक बिंदु या बार एक नमूना का प्रतिनिधित्व करता है, और त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ऊतक कोर
ऊतक इनपुट (mm3) निकाले न्यूक्लिक एसिड मान्यकरण गुणवत्ता की जांच: डीएनए गुणवत्ता की जांच: शाही सेना
(नमूनों की #) नमूना की आयु (वर्ष) कुल उपज (एनजी) टुकड़ा आकार (बीपी) पीसीआर कुल उपज (एनजी) टुकड़ा आकार (बीपी) पीसीआर NanoString
Pikor एट अल। 43 - 129 डीएनए कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है
Montaser-Kouhsari एट अल। 18 - में 29.5 आरएनए 763 0-25 843 कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है
यह कागज़ 1.71 डीएनए और आरएनए > 350 3-12 820 100 - 500 सही का निशान 2270 100-500 सही का निशान/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
ऊतक वर्गों
ऊतक इनपुट निकाले न्यूक्लिक एसिड मान्यकरण गुणवत्ता की जांच: डीएनए गुणवत्ता की जांच: शाही सेना
(नमूनों की #) नमूना की आयु (वर्ष) कुल उपज (एनजी) टुकड़ा आकार (बीपी) पीसीआर कुल उपज (एनजी) टुकड़ा आकार (बीपी) पीसीआर NanoString
Heikal एट अल। 5 एक्स 5 माइक्रोन डीएनए 12 7-22 88-300 103-351 सही का निशान
चुंग एट अल। 1 एक्स 20 उम आरएनए 9 > 5 16,000- 23,000 100-200 सही का निशान
Antica एट अल। 2 x 4 माइक्रोन आरएनए 18 कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है अज्ञात (621 एनजी / μl) 80-202 + सही का निशान
घटक एट अल। 5 एक्स 5 माइक्रोन डीएनए और आरएनए 5 1 14 256 <1030 सही का निशान 16 000 109-400 + सही का निशान
Hennig एट अल। 1 एक्स 10 माइक्रोन डीएनए और आरएनए 210 1-25 कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है सही का निशान कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है सही का निशान
लेजर कैद Microdissection
ऊतक इनपुट (मिमी 2) निकाले न्यूक्लिक एसिड मान्यकरण गुणवत्ता की जांच: डीएनए गुणवत्ता की जांच: शाही सेना
(नमूनों की #) नमूना की आयु (वर्ष) कुल उपज (एनजी) टुकड़ा आकार (बीपी) पीसीआर कुल उपज (एनजी) टुकड़ा आकार (बीपी) पीसीआर NanoString बर्फ एट अल। 1-2 डीएनए 110 0-2 430 कोई आकड़ा उपलब्ध नहीं है सही का निशान

तालिका 1:। ऊतक कोर, वर्गों और लेजर कब्जा microdissections के लिए प्रकाशित डीएनए और आरएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल की तुलना भी शामिल इन पीसीआर और Nanostring assays का उपयोग तरीकों के कई आणविक समापन मूल्यांकन कर रहे हैं।

Discussion

ब्याज के ऊतकों क्षेत्रों से डीएनए और आरएनए के सफल निकासी के लिए, सटीक coring महत्वपूर्ण है। इस प्रोटोकॉल एक ऊतक पंच का उपयोग 0.6 मिमी व्यास कोर अलग-थलग करने का वर्णन करता है और इसी FFPET ब्लॉक करने के लिए स्लाइड माइक्रोस्कोप से अंकन स्थानांतरित करने के लिए प्रक्रिया की रूपरेखा। निर्माता प्रोटोकॉल के लिए संशोधन कुशलता कोर से न्यूक्लिक एसिड होता है, जो लगभग 50 गुना microtome वर्गों के लिए जो प्रोटोकॉल का इरादा था की तुलना में गहरा हो रहे हैं निकालने के लिए आवश्यक थे। चूंकि कोर ऊतक वर्गों के लिए और अधिक पैराफिन मोम रिश्तेदार, दोहराया xylene और इथेनॉल उपचार कदम के माध्यम से कोर के प्रभावी deparaffinization हो सकती है आवश्यक थे। पोस्ट-deparaffinization कदम की सफलता के लिए उचित यांत्रिक ऊतक कोर homogenization और कुशल proteinase कश्मीर पाचन पर निर्भर करता था। proteinase कश्मीर पाचन के आगे अनुकूलन किया जा सकता है।

यह उल्लेखनीय है कि इस विधि की पहचानब्लॉक की सतह पर ब्याज की Fies क्षेत्रों, इसी ऊतकविकृतिविज्ञानी स्लाइड्स में पहचान के रूप में। कोर फसल ऊतक है कि 3 या 4 मिमी गहरी हो सकता है, इस प्रोटोकॉल के उपयोगकर्ताओं क्या कोशिकाओं या ऊतकों ब्लॉक सतह के नीचे रखना बारे में चिंतित हो सकता है। हालांकि यह एक वैध चिंता का विषय है, कई अध्ययनों (संदर्भ 27 में समीक्षा) दिखा दिया है कि ऊतक कोर ईमानदारी histologic और वैकृत ऊतक ब्लॉक की आणविक सुविधाओं का प्रतिनिधित्व करते हैं, खासकर जब डुप्लिकेट या तीन प्रतियों कोर हित के क्षेत्र से जांचा जाता है।

संशोधित वाणिज्यिक निकासी किट इस प्रोटोकॉल में अपनाया दोनों डीएनए और एक ही ऊतक से शाही सेना की समवर्ती निकासी के लिए सक्षम बनाता है के रूप में, प्रोटोकॉल कीमती जैविक सामग्री की बचत होती है और एक ही नमूना से दो परिणामस्वरूप न्यूक्लिक एसिड के बीच एक प्रत्यक्ष तुलना की अनुमति देता है। आरएनए और डीएनए की समवर्ती निकासी के आधे से श्रम और ऊतक कमी नीचे कटौती, और जीन expr की सटीक एकीकृत विश्लेषण में सक्षम बनाता हैession, साथ ही epigenetic और आनुवंशिक सुविधाओं डीएनए में पाया। दोनों शाही सेना और ये प्रतिनिधि ऊतक कोर से डीएनए की पैदावार के बाद आम तौर पर 600 और 300 एनजी, क्रमशः से अधिक है, और के बाद से सबसे वर्तमान पीसीआर और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण अनुप्रयोगों आम तौर पर 10-100 एनजी की आवश्यकता होती है, इस प्रोटोकॉल के द्वारा शुद्ध नमूनों की सबसे पर्याप्त प्रदान करना चाहिए कई नीचे की ओर assays के लिए सामग्री। इस प्रोटोकॉल स्वतंत्र प्रयोगशालाओं भर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य होना दिखाया गया है (Selvarajah एट अल।, प्रस्तुत करने में।)। इस प्रोटोकॉल से शाही सेना या तो आरटी पीसीआर या एक लोकप्रिय multianalyte मंच का उपयोग जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए पर्याप्त गुणवत्ता की थी, और डीएनए मेथिलिकरण विशिष्ट पीसीआर assays में अच्छा प्रदर्शन किया। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण में बरामद न्यूक्लिक एसिड की उपयोगिता का आकलन करने के उद्देश्य से भविष्य के अध्ययन warranted रहे हैं।

इस प्रकार, कई संशोधनों के एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटोकॉल, पतली FFPET वर्गों के लिए तैयार करने के लिए किए गए थे, इसके लिए उपयुक्त प्रतिपादनआर 0.6 मिमी FFPET कोर से आरएनए और डीएनए के सह-निष्कर्षण। प्रोटोकॉल प्रोस्टेट कैंसर के नमूनों की एक बड़ी पलटन में और स्तन, मस्तिष्क और मूत्राशय के कैंसर से नमूने की एक सीमित सेट में लगातार उच्च पैदावार का प्रदर्शन किया। कुल मिलाकर, प्रोटोकॉल बड़ी अच्छी तरह से एनोटेट ऊतक संग्रह के लक्षित जीन के आधार पर विश्लेषण के लिए बाहर ले जाने के लिए उपयोगकर्ताओं को सक्षम होना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, प्रोटोकॉल कुशल ध्यान केंद्रित सबसे बहाव के अनुप्रयोगों के लिए FFPET में हित के क्षेत्रों के नमूने, अपेक्षाकृत छोटे हाथों पर समय है, और उच्च पर्याप्त पैदावार सक्षम बनाता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" Bemis  RK-06720-40 Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" Likewise 53-2879-2 Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanol Fisher BioReagents BP2818-500 Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2O G-Biosciences 786-293 Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments  Estigen MPO6[Yellow] Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent marker Sharpie 10365796S Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes Fisher BioReagents 05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) Eppendorf 22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) Eppendorf 22431021
Histology Xylene VWR CA 95057-822 Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-Propanol Sigma I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit  Qiagen 80234 Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution Qiagen 80234 Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K Qiagen 80234
High potency proteinase K Invitrogen 25530-049 Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) Molecular BioProducts 7003
RNaseA 100 mg/ml Qiagen 19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2 BD  305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) Qiagen  9001271 Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer  
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride  Amresco 0234
Sodium Chloride  Amresco 0241
Anhydrous Magnesium Chloride Sigma M8266
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane Pall PN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml BD Integra 305274
Hydrochloric Acid BDH 3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) Invitrogen

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References

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बुनियादी प्रोटोकॉल अंक 114 निष्कर्षण FFPE न्यूक्लिक एसिड (डीएनए और आरएनए) प्रोस्टेट कर्क Deparaffinization अभिलेखीय पैथोलॉजी ऊतक कोर
दोनों आरएनए और डीएनए निष्कर्षण के लिए formalin तय आयल एम्बेडेड ऊतक कोर की तैयारी
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Patel, P. G., Selvarajah, S.,… More

Patel, P. G., Selvarajah, S., Boursalie, S., How, N. E., Ejdelman, J., Guerard, K. P., Bartlett, J. M., Lapointe, J., Park, P. C., Okello, J. B. A., Berman, D. M. Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction. J. Vis. Exp. (114), e54299, doi:10.3791/54299 (2016).

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