Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Utarbeidelse av formalinfiksert parafin-innebygde Tissue-kjerner for både RNA og DNA Extraction

Published: August 21, 2016 doi: 10.3791/54299
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3, 3, 4, 3, 1, 1,2, 1,2
1Department of Pathology & Molecular Medicine, Queen's University, 2Division of Cancer Biology & Genetics, Queen's Cancer Research Institute, Queen's University, 3Department of Surgery, Division of Urology, McGill University, 4Transformative Pathology Program, Ontario Institute for Cancer Research (OICR)

Summary

Denne modifiserte utvinning protokollen forbedrer RNA og DNA-utbytte fra en mer målrettet regioner av interesse i histopatologiske vevsblokker.

Introduction

Genomisk biomarkør forskning søker å identifisere molekylære korrelater som nøyaktig og pålitelig reflekterer sykdomsstatus, og gjøre det i en klinisk nyttig måte. 1 Biomarker utvikling er avhengig av retrospektiv analyse av godt kommenterte vevsprøver. Syke og normale vevsprøver lagres enten som fersk frosset vev i spesialiserte biobanker eller som formalinfiksert parafin-embedded tissue (FFPET) blokker i kliniske arkiver. Fersk frosset vev åpner for utvinning av høykvalitets nukleinsyrer og har vært mye brukt i genomisk biomarkører studier. 2,3 Men færre vevsprøver er tilgjengelig i biobanker og studere slikt vev introduserer en bias mot større prøver, uvanlige kategorier av sykdom, og pasienter sett på spesialiserte sentre med større evner til bank vev. 4 FFPET, i kontrast, er standard lagringsmetode for syke mennesker og dyr vev. Mens FFPET blokkene opprettholde cellulære morphology, fiksering prosess kryssbindinger andre cellulære bestanddeler til nukleinsyrer. Tverrbundet RNA og DNA er gjenvinnbart, men bare i degraderte, sterkt fragmenterte former. 5,6 Imidlertid er disse DNA- og RNA-fragmenter er mottagelig for analyse av en voksende rekke analyser, inkludert mRNA-ekspresjon, DNA hypermethylation, og målrettet sekvensering. 7,8 for å utnytte denne muligheten i den store mengde og utvalg av FFPET tilgjengelig for forskning, er det behov for en effektiv og pålitelig utvinning protokollen.

En stor andel av biomarkør forskning i vev fokuserer på kreft. I likhet med andre typer sykt vev, viser kreftvev ofte betydelig regional heterogenitet i celle bevaring og celletype. Etter biomarkør forskning avhengig av evnen til å korrelere bestanddeler av sykt vev med molekylære egenskaper, et kritisk trinn i denne prosessen er den presise høsting av vev som er godt bevart og anriket på disease under studien. I FFPET er to berikelse teknikker ofte benyttet: laser capture mikrodisseksjon (LCM), og mikrotom snitting. LCM muliggjør sterkt fokusert vev høsting og kan brukes til å isolere bestemte og godt bevarte celletyper i heterogene vev. 9,10 Imidlertid krever LCM kostbart utstyr og uforholdsmessig tidkrevende for et stort antall prøver. Mikrotom seksjonering er et mer allment brukt prosess hvor tynne snitt er kuttet fra FFPET blokker. 11,12 mikrotom-kutt seksjoner ofte inkluderer vev som er heterogene i celle bevaring (f.eks nekrotisk vs. godt bevart) og sammensetning (f.eks kreft vs benign parenchyma), og kan følgelig føre til homogenisering av molekylære egenskaper beste undersøkt hver for seg. Det er således et behov for en høy gjennomstrømning metode som beriker for celler av interesse. En tredje metode, isolering av nukleinsyrer fra FFPET kjerner, dette berikelse, er egnet for høy throughput protokoller, og har blitt brukt av andre til å isolere RNA eller DNA fra forskjellige vev kjerner. 7,13,14

Et antall publiserte protokoller spesifiserer fremgangsmåter for ekstrahering av nukleinsyrer fra FFPET (tabell 1). Men protokoller hvor RNA og DNA er hentet fra samme vev har blitt optimalisert for mikrotom vevssnitt, men ikke for vev kjerner. 15,16 Tilsvarende publiserte protokoller som gir økt vev spesifisitet, enten gjennom vev kjerner eller lysbilde microdissections, angir prosedyrer for ekstraksjon av DNA, men ikke RNA. 7,17 her, en optimalisert protokoll for dual ekstraksjon av både DNA og RNA fra samme vev kjernen er demonstrert. Tissue kjerner høstes ved å sette inn vev microarray (TMA) stempel inn i regioner av interesse kartlagt på FFPET blokker. Kartleggingen utføres ved å annotere et objektglass med en merkepenn og overføring av anmerkningen til overflaten av den tilsvarende FFPET blokken (figur 1).

Tidligere arbeid som førte til utviklingen av denne protokollen, inkludert en sammenligning av flere kommersielt tilgjengelige nukleinsyre utvinning systemer. I denne sammenligningen modifikasjoner til kommersielle protokoller, slik det er beskrevet nedenfor gitt den høyeste DNA- og RNA-avkastning og kvalitet (Selvarajah et al., In prep). Tissue kjerner er tykkere enn 5-10 um micron seksjoner som vanligvis brukes i FFPET ekstraksjonsmetoder 11,12,14,18 - 20, og kan inneholde flere variable mengder parafin. For å kompensere for dette, deparaffinization ble forbedret ved å gjenta xylen og etanol behandlinger, og ved å innføre en motorisert homogenisering trinn (figur 1). Videre ble proteinase K fordøyelsen ganger forlenget for å øke DNA utbytte. Totalt sett er denne protokollen kostnadseffektiv og muliggjør etablering av sammenhengene mellom molekylære og histopatologiske trekk ved sykdom i large, godt karakteriserte populasjoner. Protokollen som i sin helhet kan utføres på en pålitelig måte i løpet av 2 dager, inkludert 3 timer av praktisk tid, med lite behov for spesialisert eller kostbart utstyr.

Trinn-for-trinn-protokollen er heretter som en modifisert versjon av produsentens protokoll. 21 Vennligst se tabell for material / Utstyr for spesifikke reagenser, utstyr og produsenter.

Protocol

1. Tissue Kjerneboring

  1. Gjennomgå objektglass og skissere regionen (e) av interesse med en fin-punkts permanent markør. Klipp ut en del av parafin film stort nok til å dekke den regionen av interesse på objektglass. Plasser film fast på lysbildet og sjal film over kantene for å holde filmen fra å skli. Ved hjelp av en fin-punkt permanent markør, skissere hele vev og regionen (e) av interesse i vevet, holder oversikten rørende - men utenfor - regionen (e).
  2. Fjerne filmen og overføre den til den tilsvarende vev blokken. Orientere filmen ved å vippe eller dreie den slik at omrisset av det hele vev stemmer overens med observerte form av vevet i blokken (figur 1). Trykk på den delen av filmen fast til overflaten på blokken for å hindre glidning.
  3. Ved hjelp av tuppen av permanent markør, gjør grunne men synlige (~ 0,2 mm) fordypninger langs konturen av området (e) iinteresse, deretter fjerne filmen. Laste 1 ml blekemiddel, 70% etanol og vann i separate 1,5 eller 2,0 ml mikrosentrifugerør.
  4. Rens reseptor (rød) slag fra 0,6 mm hull innstilt ved å skyve stempelet opp og ned flere ganger mens tuppen neddykkes i røret inneholdende blekemiddel. Gjenta trinnet ovenfor med 70% etanol og deretter vann (kritisk for å sikre at blekemiddel er fjernet).
  5. Trykk punch inn i vevet, inne i regionen av interesse for en dybde på 3 mm og trekke punch. Slipp kjernen i en lav bindende 1,5 eller 2 ml tube ved å skyve den ut av punsj med pennen. Oppbevar kjernene ved -20 ° C (langsiktig) eller 4 ° C for kortsiktig bruk.
  6. Rengjør slag i henhold til punkt 1.4 og fortsette med de neste regioner eller prøve.

2. Deparaffinize de FFPE- Tissue kjerner

  1. Carryout deparaffinization i 1,5 eller 2 ml rør ved tilsetning av 1 ml xylen til vevet kjerne og vortex kraftig i 10 sek. Heat i 3 minutter ved 50 ° C.
  2. Sentrifuge i 2 minutter ved romtemperatur (RT) og maksimal hastighet (21130 x g) og plasser røret på is i 5 min (lar det voksaktige rest størkner på toppen).
  3. Fjern forsiktig parafin samlet seg rundt menisken med supernatanten ved hjelp av en pipette og gjenta xylen behandling (trinn 2,1-2,2).
  4. Tilsett 1 ml etanol (100%) og vortex kraftig i 10 sek. Sentrifuger i 2 minutter ved RT (maksimal hastighet), og forsiktig kast etanol. Gjenta trinnet ovenfor en gang.

3. homogenisering av Deparaffinized Cores

  1. Resuspender kjerner i 700 ul etanol (100%) før homogenisering. Ved hjelp av en motorisert vevshomogenisator, slipe kjernene i fine vev partikler (~ 1 min på middels innstilling). Rengjør homogenisator sonde mellom hver prøve å minimere carry-over forurensning.
    1. Fyll 15 ml rør med ~ 10 ml blekemiddel, RNase-nøytraliserende oppløsning og 70% etanol. Etter prøven homogenization, vaske homogenisatoren sonde i hvert av rengjøringsmidlene i den rekkefølgen angitt ovenfor. Kjør homogenisatoren på høyeste hastighet under vasketrinnet.
    2. Tørk av sonden med vev og la sonde tørke helt før homogenisering neste prøve. Inspiser visuelt sonde blader for rest vev stykker. Hvis funnet, rense sonden igjen. Endre rengjøringsmidlene (blekemiddel, etanol og RNase nøytraliserende løsning) daglig.
  2. Etter homogeniseringen, bringe prøvevolumet til 1 ml ved å tilsette mer 100% etanol (~ 300 ul). Sentrifuge ved maksimal hastighet i 15 minutter, forsiktig Aspirer etanol og lufttørk pellet i ca. 15-20 min før fortsetter med RNA-ekstraksjon.

4. Fordøyelse med proteinase K

  1. Resuspender pelleten i 150 pl proteinase K-fordøyelse buffer og flick røret for å løsne pelleten. Tilsett 10 mL av temperatur stabil proteinase K og bland ved å flikke (ikkevortex røret). Inkuber innholdet i røret ved 56 ° C i 15 minutter med svak omrøring.
  2. Tillate rør å inkubere på is i 3 min. Komplett avkjøling er viktig for effektiv utfelling i det følgende trinn. Sentrifuger i 15 minutter ved maksimal hastighet.

5. Separat RNA fra DNA

  1. overføre nøye supernatanten uten å forstyrre pelleten, til et nytt 1,5 ml for RNA-rensing.
  2. Hold pellet for DNA-rensing (pellet kan oppbevares i 2 timer ved RT, i opp til 1 dag ved 2-8 ° C, eller for lengre perioder ved -20 ° C).

6. RNA Purification

  1. Inkuber RNA-inneholdende supernatant ved 80 ° C i 15 min (ikke overstiger denne tid). Deretter sentrifuger kort rør for å samle dråper fra innsiden av lokket.
  2. Legg 320 mL buffer RLT å justere bindingsforhold, og blandes ved pipettering. Deretter legger 720 mL etanol (100%), og vortex.
  3. overføring 600 mL av prøven, inkludert eventuelle bunnfall som kan ha dannet, til RNA spin kolonne (følger med i settet) plassert i et 2 ml samling rør og sette de resterende innhold. -Sentrifuge i 15 sek ved ≥8,000 xg, forkaste gjennomstrømnings og gjenbruke oppsamlingsrør.
  4. Overføre gjenværende prøve på en kolonne, herunder dråper som kan ha samlet seg i lokket av røret, sentrifuger i 15 sekunder ved ≥8,000 xg, og forkaste den gjennomstrømning.
  5. Legg 350 mL buffer FRN til spinnkolonne og sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg, forkaste gjennomstrømning og gjenbruk oppsamlingsrør.
  6. Bland forsiktig 10 mL DNase I stamløsningen med 70 ul buffer RDD, tilsett direkte til spinnkolonne membranen, og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
  7. Legg 500 mL buffer FRN til spinnkolonne, sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg og lagre gjennomstrømnings for bruk i det neste trinn. For å øke utvinningen av små RNA, plasserer spin kolonne i ennye 2 ml oppsamlingsrøret og anvende gjennomstrømning fra det foregående trinn til spinnkolonne.
  8. -Sentrifuge i 15 sek ved ≥8,000 xg, forkaste gjennomstrømnings og gjenbruke oppsamlingsrøret i neste trinn. Tilsett 500 ul Buffer RPE til spinnkolonne og sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg, forkaste gjennomstrømnings og gjenbruke oppsamlingsrøret i det neste trinnet.
  9. Tilsett 500 ul Buffer RPE til spinnkolonne og sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg og kast oppsamlingsrøret med gjennomstrømning.
  10. Plasser spin kolonne i en ny 2 ml samling rør, åpne lokket og sentrifuger ved maksimal hastighet i 5 min. Kast oppsamlingsrøret med gjennomstrømning.
  11. Plasser spinnkolonne i et nytt 1,5 ml samling, tilsett 20 ul RNase-fritt vann direkte på spinnkolonne membranen, og inkuber røret i 1 min ved RT. Sentrifuge ved maksimal hastighet i 1 min for å eluere RNA. Oppbevar det eluerte RNA-prøven ved -80 ° C.

  1. Resuspender pelleten oppnådd i løpet av RNA-ekstraksjon ved trinnvis tilsetning av 45 ul proteinase K-buffer (400 mM Tris 7,5, 400 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 4% SDS); 45 ul H2O; og 400 mikrogram av høy potens Proteinase K.
  2. Inkuber de ovenfor angitte løsning ved 56 ° C i 24 timer (anbefales) eller over natten. Performincubation ved 90 ° C i 2 timer uten omrøring, og kort sentrifuger mikrosentrifugerør å samle dråper fra innsiden av lokket.
  3. Tillat prøven å avkjøles til romtemperatur og deretter legge til 4 pl RNase A (100 mg / ml). Inkuber prøven i 2 minutter ved RT.
  4. Tilsett 200 ul buffer AL til prøven, og bland ved virvling. Deretter legger 200 mL av 100% etanol, og bland godt av virvling. Overføre hele prøven til den medfølgende spinnkolonne, sted i en 2 ml samling rør, og sentrifuger i 1 min ved ≥8,000 x g.
  5. Kast oppsamlingsrøret med dengjennomstrømning og plasser spinnkolonne i en ny 2 ml samling rør. Legg 700 mL buffer AW1 til spinnkolonne, sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg, forkaste gjennomstrømnings og gjenbruke oppsamlingsrør.
  6. Legg 700 mL buffer AW2 til spinnkolonne, sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg, forkaste gjennomstrømnings og gjenbruke oppsamlingsrør. Tilsett deretter 700 pl 100% etanol til spinnkolonne, sentrifuger i 15 sek ved ≥8,000 xg og kast oppsamlingsrøret med gjennomstrømning.
  7. Plasser spinnkolonne i en ny 2 ml oppsamlingsrøret ved å åpne lokket til spinnkolonne, og sentrifuger ved full hastighet i 5 min. Kast oppsamlingsrøret med gjennomstrømning.
  8. Plasser spinnkolonne i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør og tilsett 25 ul av oppvarmet nuklease-fri vann (50 ° C). Inkuber kolonne og rør ved 50 ° C i 10 min. Sentrifuger i 1 min ved maksimal hastighet, tilsett 25 ul av nuklease-fri vann (RT) til kolonnen og inkuberes i1 min ved RT.
  9. Sentrifuger i 1 min ved maksimal hastighet (21 130 xg) og høst gjennomstrømning inneholder genomisk DNA (ca. 50 ul DNA totalt). Oppbevar kolonnen ved -20 ° C (i tilfelle en annen eluering er nødvendig senere).

Representative Results

Denne protokollen representerer en optimalisert fremgangsmåte for utvinning av DNA og RNA fra vev kjerner, ved hjelp av modifikasjoner av et kommersielt utvinningssystem beregnet for vevssnitt. Optimalisering inkludert innføring av vev homogenisering, bruk av mer potent Proteinase K for DNA-ekstraksjon, og forlengelse av vev koketiden. Grafer og statistiske analyser inkludert to-veis ANOVA, lineær regresjon og korrelasjon.

Optimaliseringer av Proteinase Fordøyelse
Den kommersielle kit inkludert et romtemperatur stabil proteinase K-løsning som ble erstattet med en mer potent proteinase K, noe som gir høyere utbytte DNA (figur 2A). For ytterligere å øke DNA-utbyttene, fordøyelse ble utvidet 2-24 timer. Ingen signifikante forskjeller ble sett mellom de to tidspunktene, men 24-timers fordøyelsen ut til å gi mer konsistente avlinger over hele SAmples. Men ytterligere inkubasjon i 48 timer ikke ytterligere forbedre DNA utvinning (figur 2B; p = 0,74).

Typisk DNA Recovery fra FFPE Prostate Cancer vevsprøver

Bruke den optimaliserte protokollen, RNA og DNA var co-utvunnet fra 333 prostata kreft FFPET prøver fra 3 til 14 år i utvalget alder. Fra hver prøve, ble 3 vev kjerner (gjennomsnittlig samlet vev volum på 0,95 ± 0,13 mm 3) brukes som input. Mens det finnes andre microfluidic baserte gel-elektroforese metoder som kan beregne konsentrasjoner og gir evalueringer av størrelsesfordelingen av nukleinsyrer molekyler, har slike fremgangsmåter ikke gi reproduserbare nukleinsyrer kvantifisering, og kan ikke skille mellom RNA og DNA som flourometrically-baserte analyser gjør. 22 Og fordi microfluidic basert gel-elektroforese resultatene ikke er pålitelig for fragmentertnukleinsyrer avledet fra FFPET, ble 23 nukleinsyre avkastning målt fluorometrisk (se reagenslisten for detaljer). Den gjennomsnittlige avkastningen var 2270 ng av RNA og 820 ng DNA (figur 3A). Omtrent 90% av alle FFPET prøvene analysert i denne studien ga ≥100 ng av DNA og ≥ 500 ng av RNA. Interessant nok var det ingen signifikant korrelasjon mellom en alder av FFPET prøven og nukleinsyre gjenvinning (figur 3B). Totalt sett, RNA og DNA-utbyttene var korrelert på tvers prøver (R2 = 0,39; p <0,0001), selv om mer enn to ganger så mye RNA enn DNA ble isolert fra hver prøve (figur 3C).

Som pilot og optimalisering arbeid ble utført på prostata vev, neste trinn var å undersøke resultatene av denne protokollen på noen andre typer arkiv vev. Fra og med kirurgisk fjernet og obduksjons FFPET prøvene representerer væreNign leveren (en prøve fra ett tilfelle), kreft i hjernen (8 prøver fra ett tilfelle), urinblære (2 prøver fra 2 tilfeller), og bryst (3 prøver fra 3 tilfeller), protokollen gitt> 100 ng DNA og RNA fra 90% av prøvene (figur 3D). Mens nukleinsyre-utbyttene var lavere i obduksjons vev enn i kirurgiske vev, representative resultater indikerer at protokollen gir lignende utbytter på tvers av cancere avledet fra forskjellige steder.

Vurdering av RNA og DNA integritet og deres representant Ytelse i Nedstrøms Analysis

RNA-ekspresjon analyse av 47 gener i 8 utvalgte FFPET prostatakreftprøver og en frisk PC-3 prostata cancer cellelinje prøven (som en positiv kontroll) ble utført ved anvendelse av et kommersielt multianalyte genekspresjon plattform som er optimalisert for FFPET. De mRNA teller i PC3 var vanligvis høyere enn de fra FFPET samples (figur 4A). Imidlertid, å sammenligne relative ekspresjon av alle gener, FFPET prostatakreft prøvene viste tilsvar ekspresjonsprofiler til PC-3 RNA, noe som indikerer at begge kilder til RNA er egnet for RNA-ekspresjon profilering.

For å demonstrere ytelsen av genomisk DNA ekstrahert med denne protokollen ble bisulfitt-konverterte DNA-ekstrakter fra FFPET prøver forsterket ved metylering spesifikk PCR (MSP). 24 MSP analyse av ALU repeterende elementer, svært denaturert regioner stede i millioner av eksemplarer i det menneskelige genom, 25 ble brukt som en genomisk metylering kontroll, og forventet å vise minimale variasjoner mellom prøvene. Som vist i figur 4B, var det liten eller ingen variasjon sett mellom forskjellige prøver i ALU MSP metylering nivåer. Videre MSP analyser basert på GSTP1, et gen som er kjent for å være hypermethylated i prostata cancer, men ikke i benigne prøver, 26 viste ingen påvisbar forsterker;ications i DNA fra godartede prøver. Som forventet ble lavere qPCR sykkelterskelverdier oppdaget i DNA fra kreft vev, noe som indikerer berikelse av denaturert GSTP1 eksemplarer. Nytten av nukleinsyrer utvinnes av denne protokollen ble videre testet i typiske nedstrøms analyser ved hjelp av nukleinsyrer utvinnes fra godartet lever og fra en hjerne (post mortem) og fra to kirurgisk fjernet brystkreftprøver. Både RT-qPCR basert uttrykk og MSP analyser utført godt på brystkreft og lever FFPET, men RT-PCR-analyse ikke klarte å forsterke et sterkt uttrykt mRNA fra post-mortem hjernesvulst prøve (figur 4C), noe som tyder på at RNA hadde degradert, sannsynligvis på grunn av forsinket vev fiksering.

Figur 1
Fig. 1: Oversikt over ekstraksjonsprosedyren for FFPET Prøver Figuren illustrerer hvordan et område av interesse i envevsblokk er kartlagt basert på histopatologiske utvalg fra et objektglass. Tre 0,6 mm vev kjerner blir deretter hentet fra hvert vev området ved hjelp av biopsi slag, homogenisert sammen og deretter utsatt for utvinning av både RNA og DNA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: nukleinsyrer (DNA og RNA) gir i ng / mm 3 av FFPET fra to proteinase K (Temperatur Stabil og høy styrke enzymer), og testet på en rekke Inkubasjon Times for sistnevnte (A) Utførelse av proteinase K. fra ulike leverandører. DNA-ekstraksjoner ble utført på et representativt FFPET prøve ved anvendelse av temperaturstabile enzym som følger med kdet versus en mer potent enzym fra en annen produsent. (B) Bestemmelse av optimal Proteinase K inkubasjonstid for å maksimalisere DNA-utbytte. Utførelse av høy konsentrasjon Proteinase K fordøyelse ble evaluert ved tre forskjellige inkubasjonsperioder ved anvendelse av 3 FFPET prøver. Feilfelt representerer standardfeilen for gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3:. Nukleinsyrer (DNA og RNA) gir i ng / mm 3 av FFPET i Total, på tvers Eksempel År og Representative vevstyper (A) Totalt gjenvinnes nukleinsyrer fra formalinfiksert parafin-embedded tissue. Nukleinsyrene mengder som presenteres er basert på uttak av 333 FFPET prøver usynge den optimaliserte protokollen. (B) Korrelasjon tomten mellom gjenvunnet total DNA og RNA og fylte FFPET prøver. De ekstraherte FFPET prøvene som ble brukt var hentet fra årene 2000 til 2012. (C) Sammenheng mellom renten fra samtidig hentet DNA og RNA fra 333 prostata prøver. Det er en positiv sammenheng mellom DNA og RNA avkastning. (D) Demonstrasjon av protokollen ved hjelp av flere arkiverings vevstyper. Den optimaliserte protokoll ble anvendt for å ekstrahere nukleinsyre fra 14 kreft (bryst, blære og hjerne) og normale (lever) prøver. Feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: Utførelse av RNA og DNA Co-utvunnet fra TissuE-kjerner i nedstrømsapplikasjoner. (A) mRNA teller FFPE prostata kreft vev og for fersk PC-tre cellelinje kontroll. Hvert punkt representerer gjennomsnittet av 3 tekniske replikater hentet separat. Fresh PC-tre cellelinje RNA-verdier er illustrert av gule barer og vev verdier FFPET vises med fargede prikker. (B) metylering spesifikke PCR-analyser på DNA av FFPET prostatakreft prøver. Syklus terskelverdier ble oppnådd for 10 prøver utført som forventet anvendelse av 50 ng / reaksjon mellom bisulfitt konvertert DNA. ALU MSP analyser fra alle FFPET prøvene hadde lignende syklus terskelverdier (p> 0,67). GSTP1 MSP-analyser viste høyere metylering (lavere syklus terskel) nivåer i prostatakreft enn i benign prostata. (C) Bestemmelse av DNA og RNA kvalitet fra andre typer vev. HPRT1 genuttrykk og Alu genet metylering analysene ble utført på nukleinsyrer (henholdsvis RNA og DNA) hentet fra ellermal leveren (obduksjon), og hjernen (obduksjon) og brystkreft (alle FFPET). Resultater fra prostata er vist for sammenligning. Merk: Lignende resultater ble observert fra hver vevstype, med unntak av harde mRNA forsterkning fra en obduksjon prøven. Hvert punkt eller stolpe representerer en prøve, og feilfelt representerer SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

tissue kjerner
Tissue Input (mm3) Trukket ut Nucleic Acid Validering Kvalitetssjekk: DNA Kvalitetssjekk: RNA
(# Av prøver) Age of Sample (år) Total kapasitet (ng) Fragment størrelse (bp) PCR Total kapasitet (ng) Fragment størrelse (bp) PCR NanoString
Pikor et al. 43-129 DNA Ingen data Ingen data Ingen data Ingen data
Montaser-Kouhsari et al. 18 til 29,5 RNA 763 0-25 843 Ingen data
Dette papiret 1.71 DNA og RNA > 350 3-12 820 100-500 Hake 2270 100-500 Hake/ftp_upload/54299/check_mark.jpg "/>
vevsdelene
tissue Input Trukket ut Nucleic Acid Validering Kvalitetssjekk: DNA Kvalitetssjekk: RNA
(# Av prøver) Age of Sample (år) Total kapasitet (ng) Fragment størrelse (bp) PCR Total kapasitet (ng) Fragment størrelse (bp) PCR NanoString
Heikal et al. 5 x 5 mikrometer DNA 12 7-22 88-300 103-351 Hake
Chung et al. 1 x 20 um RNA 9 > 5 16,000- 23000 100-200 Hake
Antica et al. 2 x 4 um RNA 18 Ingen data Ukjent (621 ng / mL) 80-202 + Hake
Ghatak et al. 5 x 5 mikrometer DNA og RNA 5 1 14 256 <1030 Hake 16 000 109-400 + Hake
Hennig et al. 1 x 10 mikrometer DNA og RNA 210 1-25 Ingen data Ingen data Hake Ingen data Ingen data Hake
Laser Capture mikrodisseksjon
Tissue Input (mm2) Trukket ut Nucleic Acid Validering Kvalitetssjekk: DNA Kvalitetssjekk: RNA
(# Av prøver) Age of Sample (år) Total kapasitet (ng) Fragment størrelse (bp) PCR Total kapasitet (ng) Fragment størrelse (bp) PCR NanoString Snø et al. 1-2 DNA 110 0-2 430 Ingen data Hake

Tabell 1:. En sammenligning av publiserte DNA og RNA ekstraksjon protokoller for vev kjerner, seksjoner og laser capture microdissections finnes også flere molekylære endepunkter vurdering av disse metoder ved hjelp av PCR og Nanostring analyser.

Discussion

For vellykket utvinning av DNA og RNA fra vev regioner av interesse, er nøyaktig kjerneboring kritisk. Denne protokollen beskriver bruk av en vev slag for å isolere 0,6 mm diameter kjerne og en oversikt over prosessen for overføring av notasjoner fra objektglass til tilsvarende FFPET blokker. Modifikasjoner til produsentens protokoll ble pålagt å effektivt pakke nukleinsyrer fra kjerner, som er ca 50 ganger tykkere enn mikrotom seksjoner som protokollen ble beregnet. Ettersom kjernene kan inneholde mer parafinvoks i forhold til vevssnitt, effektiv deparaffinization ledere gjennom gjentatte xylen og etanol behandlingstrinn var nødvendig. Suksessen til etter deparaffinization trinn avhengig av riktig mekanisk vev kjerner homogenisering og effektiv proteinase K fordøyelsen. Ytterligere optimalisering av proteinase K-fordøyelse kan utføres.

Det er verdt å nevne at denne metoden identifisertfies områder av interesse på overflaten av blokken, som er identifisert på tilsvarende histopatologiske lysbilder. Som kjerne avlinger vev som kan være 3 eller 4 mm dypt, kan brukere av denne protokollen være bekymret for hva celler eller vev lå under blokken overflaten. Selv om dette er en gyldig bekymring, har flere studier (anmeldt i referanse 27) viste at vevet kjerner trofast representerer histologisk og molekylære funksjoner av patologiske vevsblokker, spesielt når duplikat eller tredoble kjerner er samplet fra området av interesse.

Som det modifiserte kommersiell utvinning kit innført i denne protokollen muliggjør samtidig ekstraksjon av både DNA og RNA fra samme vev, lagrer protokollen verdifulle biologiske materialet og tillater en direkte sammenligning mellom de to resulterende nukleinsyrene fra den samme prøven. Samtidig utvinning av RNA og DNA kutter ned arbeidskraft og vev utarming til det halve, og gjør det mulig presis integrert analyse av gen expression, samt epigenetiske og genetiske egenskaper som finnes i DNA. Da utbyttene av både RNA og DNA fra disse representative vev kjernene typisk overstige 600 og 300 ng, henholdsvis, og siden de fleste aktuelle PCR og sekvense neste generasjon anvendelser krever typisk 10-100 ng, bør de fleste prøvene renset ved denne protokollen gir tilstrekkelig materiale for flere nedstrøms analyser. Denne protokollen har vist seg å være reproduserbar på tvers av uavhengige laboratorier (Selvarajah et al., In prep.). RNA fra denne protokollen var av tilstrekkelig kvalitet for analyse av genuttrykk ved hjelp av enten RT-PCR eller en populær multianalyte plattform, og DNA resultater i metylering spesifikke PCR-analyser. Fremtidige studier med sikte på å vurdere nytten av gjenopprettede nukleinsyrer i neste generasjons sekvensering er garantert.

Dermed ble flere endringer gjort til en kommersielt tilgjengelig protokoll, beregnet for tynne FFPET seksjoner, som gjør det egnet for co-ekstrahering av RNA og DNA fra 0,6 mm FFPET kjerner. Protokollen tydelig vist høye utbytter i en stor kohort av prostatakreft prøver og i et begrenset sett av prøver fra kreft i bryst, hjerne og blære. Samlet sett protokollen bør det mulig for brukere å utføre målrettede gen-baserte analyser av store godt kommenterte vev samlinger. Det viktigste er at protokollen effektiv fokusert prøvetaking av regioner av interesse i FFPET, relativt lite hands-on tid, og høy nok avkastning for de fleste nedstrømsapplikasjoner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic paraffin film, "Parafilm 'M'" Bemis  RK-06720-40 Any generic paraffin film will work as a substitute
Sodium Hypochlorite, "Ultra Bleach" Likewise 53-2879-2 Any generic bleach will work as a substitute. Hazardous material that can cause burns on contact.
Molecular biology grade absolute ethanol Fisher BioReagents BP2818-500 Sigma-Aldrich E7023 suffices as a substitute
Molecular Grade H2O G-Biosciences 786-293 Sigma W4502 suffices, as well as any other brand of molecular grade H2O
0.6 mm Punch Set for Beecher Instruments  Estigen MPO6[Yellow] Make sure to use the red receiver punch from the set
Fine point permanent marker Sharpie 10365796S Using the marker on FFPE tissues causes it to dry out quickly, so several may be required
FFPE tissue block
Stained tissue slide corresponding to FFPE block
1.5 ml Micro-Centrifuge Tubes Fisher BioReagents 05-408-137
2.0 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) Eppendorf 22431048
1.5 ml Low binding tubes (LoBind Micro-Centrifuge Tubes) Eppendorf 22431021
Histology Xylene VWR CA 95057-822 Fisher Scientific X5-500 suffices as a substitute
Molecular Biology Grade 2-Propanol Sigma I9516
AllPrep FFPE DNA/RNA Kit  Qiagen 80234 Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Buffers: RLT, FRN, RPE, ATL, AL, AW1, AW2, DNaseI solution Qiagen 80234 Prepare buffers accodring to the AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook21
Temperature stable proteinase K Qiagen 80234
High potency proteinase K Invitrogen 25530-049 Invitrogen 25530-015 suffices as a substitute
RNAse neutralizing solution (Rnase AWAY) Molecular BioProducts 7003
RNaseA 100 mg/ml Qiagen 19101
BD Integra Syringe 3 ml 21G x 1/2 BD  305274
Motorized tissue homogenizer (TissueRuptor) Qiagen  9001271 Fisher Scientific 14-261-29 suffices as a substitute
-20 °C and -80 °C Laboratory Freezer  
Micro-Centrifuge with rotor for 2 ml tubes
Digital Vortex Mixer
Pipettes and filter tips
Heating blocks or water baths
Tris Hydrochloride  Amresco 0234
Sodium Chloride  Amresco 0241
Anhydrous Magnesium Chloride Sigma M8266
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma L4509
Acrodisc 25 mm syring filters with 0.45 µm Supor membrane Pall PN 4614
Syringe with retracting BD PrecisionGlide needle 3 ml BD Integra 305274
Hydrochloric Acid BDH 3026
Multianalyte gene expression platfrom (nCounter ® CAE codeset and Nanostring nCounter platform) Nanostring nCounter platform, Nanostring
Fluorometric nucleic acid quantification (Qubit dsDNA HS Assay Kit and Qubit® RNA BR Assay Kit) Invitrogen

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kern, S. E. Why your new cancer biomarker may never work: recurrent patterns and remarkable diversity in biomarker failures. Cancer Res. 72 (23), 6097-6101 (2012).
  2. Klopfleisch, R., Weiss, A. T. A., Gruber, A. D. Excavation of a buried treasure--DNA, mRNA, miRNA and protein analysis in formalin fixed, paraffin embedded tissues. Histol. Histopathol. 26 (6), 797-810 (2011).
  3. Beltran, H., et al. Targeted Next-generation Sequencing of Advanced Prostate Cancer Identifies Potential Therapeutic Targets and Disease Heterogeneity. Eur. Urol. 63 (5), 920-926 (2013).
  4. Hoppin, J. A., Tolbert, P. E., Taylor, J. A., Schroeder, J. C., Holly, E. A. Potential for selection bias with tumor tissue retrieval in molecular epidemiology studies. Ann. Epidemiol. 12 (1), 1-6 (2002).
  5. von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. Determinants of RNA quality from FFPE samples. PLOS ONE. 2 (12), e1261 (2007).
  6. Masuda, N., Ohnishi, T., Kawamoto, S., Monden, M., Okubo, K. Analysis of chemical modification of RNA from formalin-fixed samples and optimization of molecular biology applications for such samples. Nucleic Acids Res. 27 (22), 4436-4443 (1999).
  7. Pikor, L. A., Enfield, K. S. S., Cameron, H., Lam, W. L. DNA extraction from paraffin embedded material for genetic and epigenetic analyses. J. Vis. Exp. (49), (2011).
  8. Turashvili, G., et al. Nucleic acid quantity and quality from paraffin blocks: defining optimal fixation, processing and DNA/RNA extraction techniques. Exp. Mol. Pathol. 92 (1), 33-43 (2012).
  9. Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nat. Protoc. 1 (2), 586-603 (2006).
  10. Hackler, L., Masuda, T., Oliver, V. F., Merbs, S. L., Zack, D. J. Use of laser capture microdissection for analysis of retinal mRNA/miRNA expression and DNA methylation. Methods Mol. Biol. 884, 289-304 (2012).
  11. Bonin, S., Stanta, G. Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics. Expert Rev. Mol. Diagn. 13 (3), 271-282 (2013).
  12. Bonin, S., et al. Multicentre validation study of nucleic acids extraction from FFPE tissues. Virchows Archiv. 457 (3), 309-317 (2010).
  13. Montaser-Kouhsari, L., et al. Image-guided Coring for Large-scale Studies in Molecular Pathology. Appl. Immunohistochem. Mol. Morphol. , (2015).
  14. van Eijk, R., Stevens, L., Morreau, H., van Wezel, T. Assessment of a fully automated high-throughput DNA extraction method from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue for KRAS, and BRAF somatic mutation analysis. Exp. Mol. Pathol. 94 (1), 121-125 (2013).
  15. Ghatak, S., Sanga, Z., Pautu, J. L., Kumar, N. S. Coextraction and PCR Based Analysis of Nucleic Acids From Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Specimens. J. Clin. Lab. Anal. , (2014).
  16. Hennig, G., et al. Automated extraction of DNA and RNA from a single formalin-fixed paraffin-embedded tissue section for analysis of both single-nucleotide polymorphisms and mRNA expression. Clin. Chem. 56 (12), 1845-1853 (2010).
  17. Snow, A. N., Stence, A. A., Pruessner, J. A., Bossler, A. D., Ma, D. A simple and cost-effective method of DNA extraction from small formalin-fixed paraffin-embedded tissue for molecular oncologic testing. BMC Clin. Pathol. 14 (1), 30 (2014).
  18. Torrente, M. C., et al. DNA extraction from formalin-fixed laryngeal biopsies: Comparison of techniques. Acta Otolaryngol. 131 (3), 330-333 (2011).
  19. Okello, J. B. A., et al. Comparison of methods in the recovery of nucleic acids from archival formalin-fixed paraffin-embedded autopsy tissues. Anal. Bochem. 400 (1), 110-117 (2010).
  20. Abramovitz, M., et al. Optimization of RNA extraction from FFPE tissues for expression profiling in the DASL assay. BioTechniques. 44 (3), 417-423 (2008).
  21. AllPrep DNA/RNA FFPE Handbook. , (2012).
  22. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. Journal of Extracell. Vesicles. 4, (2015).
  23. Wieczorek, D., Delauriere, L., Schagat, T. Methods of RNA Quality Assessment. , Available from: https://www.promega.ca/resources/pubhub/methods-of-rna-quality-assessment (2012).
  24. Herman, J. G., Graff, J. R., Myohanen, S., Nelkin, B. D., Baylin, S. B. Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93 (18), 9821-9826 (1996).
  25. Weisenberger, D. J., Campan, M., et al. Analysis of repetitive element DNA methylation by MethyLight. Nucleic acids research. 33 (21), 6823-6836 (2005).
  26. Yegnasubramanian, S. Hypermethylation of CpG Islands in Primary and Metastatic Human Prostate Cancer. Cancer Res. 64 (6), 1975-1986 (2004).
  27. Parsons, M., Grabsch, H. How to make tissue microarrays. Diagn. Histopathol. 15 (3), 142-150 (2009).

Tags

Grunnleggende Protocol Utvinning FFPE nukleinsyrer (DNA og RNA) Prostate Cancer Deparaffinization Archival patologi Tissue kjerner
Utarbeidelse av formalinfiksert parafin-innebygde Tissue-kjerner for både RNA og DNA Extraction
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Patel, P. G., Selvarajah, S.,… More

Patel, P. G., Selvarajah, S., Boursalie, S., How, N. E., Ejdelman, J., Guerard, K. P., Bartlett, J. M., Lapointe, J., Park, P. C., Okello, J. B. A., Berman, D. M. Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction. J. Vis. Exp. (114), e54299, doi:10.3791/54299 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter