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Genetics

उच्च throughput मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन के लिए एक रोबोट मंच

Published: September 27, 2016 doi: 10.3791/54300
Automatic Translation
1, 2,3, 1
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

Summary

एक उच्च throughput, स्वचालित, तंबाकू मूलतत्त्व उत्पादन और परिवर्तन कार्यप्रणाली में वर्णित है। रोबोटिक प्रणाली मॉडल के आधार पर 2-प्रणाली है कि गैर मॉडल फसलों के लिए अनुवाद होना चाहिए में व्यापक समानांतर जीन अभिव्यक्ति और खोज के लिए सक्षम बनाता है।

Abstract

पिछले दशक के दौरान वहाँ संयंत्र protoplasts कि मॉडल प्रजातियों से लेकर प्रजातियों की फसल के लिए, संकेत पारगमन मार्ग, विनियामक नेटवर्क, जीन अभिव्यक्ति, जीनोम संपादन, और जीन मुंह बंद करने के विश्लेषण के लिए के उपयोग में एक पुनरुत्थान किया गया है। इसके अलावा, महत्वपूर्ण प्रगति protoplasts से पौधों के उत्थान, जो संयंत्र जीनोमिक्स के लिए इन प्रणालियों के उपयोग में भी अधिक रुचि उत्पन्न की है में किया गया है। इस काम में, एक प्रोटोकॉल एक रोबोट मंच का उपयोग कर एक 'चमकीले पीले' 2 (द्वारा -2) तंबाकू निलंबन संस्कृति से मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन के स्वचालन के लिए विकसित किया गया है। परिवर्तन प्रक्रियाओं नारंगी रंग का एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ओएफपी) रिपोर्टर जीन (pporRFP) फूलगोभी मोज़ेक वायरस 35S प्रमोटर (35s) ​​के नियंत्रण के अधीन का उपयोग कर मान्य किया गया। मूलतत्त्वों में ओएफपी अभिव्यक्ति epifluorescence माइक्रोस्कोपी द्वारा पुष्टि की गई। विश्लेषण भी मूलतत्त्व उत्पादन क्षमता तरीकों का उपयोग कर propidiu शामिलएम आयोडाइड। अंत में, कम लागत वाली खाद्य ग्रेड एंजाइमों मूलतत्त्व अलगाव की प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किया गया, प्रयोगशाला ग्रेड एंजाइमों कि लागत निषेधात्मक उच्च throughput स्वचालित मूलतत्त्व अलगाव और विश्लेषण में हैं के लिए जरूरत circumventing। इस काम में विकसित प्रोटोकॉल पर आधारित है, परिवर्तन करने के लिए मूलतत्त्व अलगाव से पूरी प्रक्रिया के तहत 4 घंटा में आयोजित किया जा सकता है, ऑपरेटर से कोई इनपुट के बिना। प्रोटोकॉल इस काम में विकसित द्वारा -2 सेल संस्कृति के साथ मान्य किया गया था, वहीं प्रक्रिया और तरीकों किसी भी संयंत्र निलंबन संस्कृति / मूलतत्त्व प्रणाली है, जो फसल जीनोमिक्स अनुसंधान के त्वरण के लिए सक्षम होना चाहिए करने के लिए अनुवाद किया जाना चाहिए।

Introduction

हाल के वर्षों में ट्रांसजेनिक फसलों के डिजाइन, विभिन्न रोगों 1 काबू पाने के वृत्तिदान शाक प्रतिरोध 2, सूखा 3,4 और नमक सहिष्णुता 5 प्रदान करने पर रखा महत्वपूर्ण प्रोत्साहन नहीं किया गया है, herbivory 6 रोकने बायोमास उपज 7 बढ़ाने के लिए, और सेल दीवार अवज्ञा में कमी 8। इस प्रवृत्ति को जीनोम संपादन CRISPR और TALENS 9 का उपयोग कर, और जीन dsRNA 10, miRNA 11, और 12 के माध्यम से siRNA मुंह बंद करने सहित ट्रांसजेनिक पौधों, पैदा करने के लिए नए आणविक उपकरणों के विकास के द्वारा सहायता प्राप्त किया गया है। इन प्रौद्योगिकियों ट्रांसजेनिक पौधों की पीढ़ी को सरल बनाया है, वे भी एक अड़चन है, जहां ट्रांसजेनिक पौधों की सरासर संख्या उत्पन्न पारंपरिक प्रणालियों है कि संयंत्र के उत्थान पर भरोसा नहीं किया जा सकता का उपयोग कर जांच की पैदा की है। इस अड़चन से संबंधित है, जबकि मुंह बंद करने और जीनोम संपादन निर्माणों तेजी से पौधों में डाला जा सकता है, के कईलक्षित लक्षण वांछित प्रभाव है, जो अक्सर की खोज नहीं है, जब तक पौधों ग्रीन हाउस में विश्लेषण कर रहे हैं का निर्माण करने के लिए असफल। इस काम में, हम विशेष रूप से जीनोम संपादन और जीन की बड़ी संख्या के लक्ष्यों को मुंह बंद करने की जल्दी स्क्रीनिंग में वर्तमान टोंटी संबोधित करने के लिए, तेजी से, स्वचालित, उच्च throughput संयंत्र protoplasts की स्क्रीनिंग के लिए एक तरीका विकसित किया है।

protoplasts के उपयोग, के रूप में बरकरार संयंत्र कोशिकाओं का विरोध किया, एक स्वचालित मंच के विकास के लिए कई फायदे हैं। सबसे पहले, protoplasts संयंत्र सेल की दीवार के पाचन के बाद अलग कर रहे हैं, और इस बाधा नहीं रह वर्तमान के साथ, परिवर्तन दक्षता 13 की वृद्धि हुई है। बरकरार संयंत्र कोशिकाओं में वहाँ परिवर्तन के लिए केवल दो अच्छी तरह से स्थापित विधियों, biolistics 14 और एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन 15 हैं। इन तरीकों से न तो आसानी से, तरल प्लेटफार्मों से निपटने के लिए अनुवाद किया जा सकता है, क्योंकि biolistics transfo के लिए विशेष उपकरणों की आवश्यकता हैrmation, जबकि एग्रोबैक्टीरियम मध्यस्थता परिवर्तन सह संस्कृति और बैक्टीरिया के बाद हटाने की आवश्यकता है। न तो उच्च तरीकों के लिए उत्तरदायी हैं। Protoplasts के मामले में, परिवर्तन नियमित रूप से पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) मध्यस्थता अभिकर्मक 16 है, जो केवल कई समाधान के आदान-प्रदान की आवश्यकता है, और आदर्श तरल प्लेटफार्मों से निपटने के लिए अनुकूल है का उपयोग किया जाता है। दूसरा, protoplasts, परिभाषा से, एकल कोशिका संस्कृतियों, और इस तरह के संयंत्र सेल संस्कृतियों में clumping और चेन गठन के साथ जुड़े समस्याएं हैं, मूलतत्त्वों में नहीं मनाया जाता है। एक थाली आधारित स्पेक्ट्रोफोटोमीटर, कोशिकाओं की clumping का उपयोग कर तेजी से जांच के संदर्भ में, या कई विमानों में कोशिकाओं को लगातार माप प्राप्त करने में कठिनाई को बढ़ावा मिलेगा। चूंकि protoplasts भी उनकी संस्कृति मीडिया से सघन रहे हैं, वे कुओं की तह तक तलछट, एक monolayer, जो प्लेट आधारित spectrophotometry के लिए अनुकूल है बनाने। अंत में, संयंत्र सेल निलंबन संस्कृतियों primar रहे हैं, जबकिily घट्टा 17 से निकाली गई, protoplasts संयंत्र के ऊतकों के एक नंबर से काटा जा सकता है, ऊतक विशेष अभिव्यक्ति की पहचान करने की क्षमता के लिए अग्रणी। उदाहरण के लिए, क्षमता root- या एक जीन की पत्ती विशिष्ट अभिव्यक्ति का विश्लेषण करने के phenotype भविष्यवाणी करने के लिए बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। इन कारणों के लिए, प्रोटोकॉल इस काम में विकसित व्यापक रूप से इस्तेमाल तंबाकू (निकोटियाना Tabacum एल) 'चमकीले पीले' 2 (द्वारा -2) निलंबन संस्कृति से अलग मूलतत्त्वों का उपयोग कर मान्य किया गया।

से-2 निलंबन संस्कृति उच्च पौधों की "हेला" सेल के रूप में वर्णित किया गया है, संयंत्र कोशिकाओं की आणविक 18 विश्लेषण में अपनी सर्वव्यापी उपयोग के कारण। हाल ही में, से-2 कोशिकाओं संयंत्र के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है तनाव 19-22, intracellular प्रोटीन स्थानीयकरण 23,24, और बुनियादी कोशिका जीव विज्ञान 25-27 प्लांट बायोलॉजी में इन संस्कृतियों के व्यापक उपयोगिता का प्रदर्शन है। से-2 संस्कृतियों का एक अतिरिक्त लाभ यह हैaphidicolin साथ संस्कृतियों सिंक्रनाइज़ करने के लिए है, जो जीन अभिव्यक्ति के लिए बढ़ाया reproducibility के लिए नेतृत्व कर सकते क्षमता 28 अध्ययन करता है। इसके अलावा, तरीकों कम लागत वाली एंजाइमों 29,30 का उपयोग करके -2 protoplasts की निकासी के लिए विकसित किया गया है, के रूप में एंजाइमों पारंपरिक रूप से protoplasts पैदा करने के लिए इस्तेमाल किया लागत उच्च throughput सिस्टम के लिए बैठती है। जैसे, प्रोटोकॉल नीचे वर्णित से-2 निलंबन संस्कृति का उपयोग कर पुष्टि की गई है, लेकिन यह किसी भी संयंत्र सेल निलंबन संस्कृति को संशोधनीय होना चाहिए। सबूत की अवधारणा का उपयोग कर प्रयोगों मुश्किल मूंगा Porites से एक नारंगी प्रतिदीप्ति प्रोटीन (ओएफपी) रिपोर्टर जीन (pporRFP) CAMV 35S प्रमोटर के नियंत्रण के तहत 31 porites प्रदर्शन कर रहे हैं।

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Protocol

1. निलंबन सेल संस्कृति की स्थापना

  1. और आसुत के 2,4-डाइक्लोरोफिनॉक्सीएसिटिक अम्ल (2,4-डी) के लिए 900 से 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीग्राम से-2 मीडिया 4.43 छ Linsmaier और Skoog बेसल मीडिया, सूक्रोज की 30 ग्राम, 200 मिलीग्राम 2 के.एच. जोड़ने पीओ 4 द्वारा तरल तैयार है, पानी और 0.1 एम KOH के साथ 5.8 पीएच। पीएच समायोजन करने के बाद, आसुत जल और आटोक्लेव के साथ 1000 मिलीलीटर के लिए अंतिम मात्रा समायोजित करें। मीडिया 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 सप्ताह तक संग्रहित किया जा सकता है।
  2. 1% के अलावा के साथ -2 मीडिया तरल के 100 मिलीलीटर और से-2 घट्टा का एक टुकड़ा (> व्यास में 1 सेमी) ठोस से-2 मीडिया पर हो के साथ एक 250 मिलीलीटर Erlenmeyer कुप्पी (द्वारा -2 मीडिया तरल टीका लगाना अगर) और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ सील। 5 दिनों के लिए झटकों के साथ 28-30 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति सेते हैं।
    नोट: से-2 घट्टा, लंबी अवधि के भंडारण के लिए ठोस मीडिया पर बनाए रखा है के रूप में तरल संस्कृतियों तेजी से बढ़ना होगा। संस्कृति मात्रा के रूप में आवश्यक समायोजित किया जा सकता है, आम तौर पर एक 100 मिलीलीटर संस्कृति-तीन तीस 6-W लोड करने में सक्षम हो जाएगापक्ष प्लेटें।
  3. स्थानांतरण से-2 संस्कृति ताजा से-2 मीडिया के 98 मिलीलीटर के लिए लॉग चरण के 2 मिलीलीटर और झटकों के साथ 28-30 डिग्री सेल्सियस पर 5-7 दिनों के लिए सेते हैं।
    नोट: घट्टा के साथ टीका 5-7 दिन पुरानी संस्कृतियों के 100 dilutions, बजाय: स्थापित तरल संस्कृतियों के उप-संवर्धन के लिए नियमित रूप से 1 का उपयोग किया जा सकता है।
  4. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार नीचे अपकेंद्रित्र ट्यूब को अच्छी तरह मिक्स संस्कृति, के रूप में कोशिकाओं के तेजी से निपटा जाएगा, और हस्तांतरण सेल संस्कृति के 6 मिलीलीटर और कोशिकाओं में कम से कम 10 मिनट के लिए समझौता। सतह पर तैरनेवाला हटाने के द्वारा कुल मात्रा का 50% करने के लिए पैक सेल मात्रा समायोजित करें।
  5. पाचन के लिए एक 6 अच्छी तरह से थाली के प्रत्येक कुएं में inverting और pipet 500 μl द्वारा ट्यूब हिला। के रूप में वे घने हैं, इस स्तर पर कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए विस्तृत बोर pipets का प्रयोग करें और मानक pipet सुझावों रोकना होगा।

2. मूलतत्त्व अलगाव

  1. रोबोटिक प्रणाली (चित्रा 1 ए) के सभी घटकों पर मुड़ें और मुलायम का समय निर्धारण प्लेट प्रस्तावक काम के लिए खुलाबर्तन। कार्य निर्धारण कार्यक्रम उपकरण का एक टुकड़ा के बीच प्लेटों के स्थानांतरण सक्षम करने के लिए अन्य उपकरणों के साथ microplate प्रस्तावक एकीकृत करता है।
  2. प्रयोग करने से पहले, इस प्रकार है, Labware का एक टुकड़ा, थाली प्रस्तावक सॉफ्टवेयर में लिए Labware के लिए तकनीकी विनिर्देश (जैसे, प्लेटें, पलकों) प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है, साथ ही शुरू और समाप्त होने के पदों को परिभाषित:
    1. प्लेट प्रस्तावक सॉफ्टवेयर में मुख्य उपकरण पट्टी से सेटअप क्लिक करें और प्रबंधन कंटेनर प्रकार आदेश का चयन करें।
    2. कंटेनर प्रकार मौजूदा कंटेनर प्रकार पुस्तकालय में सूचीबद्ध है, तो फिर उपयुक्त कंटेनर का चयन करें।
    3. कंटेनर प्रकार मौजूदा कंटेनर प्रकार पुस्तकालय में सूचीबद्ध नहीं है, तो फिर एक नया कंटेनर प्रकार निर्दिष्ट करने के लिए जोड़ें क्लिक करें।
    4. एक नए कंटेनर प्रकार जोड़ने के बाद, (भरपाई ऊंचाई, चौड़ाई, स्टैकिंग आयाम, और ग्रिपर) उचित टैब में नए कंटेनर के आयामों डालने और सहेजें क्लिक करें।
      1. सही आयामों निर्माता से उपलब्ध नहीं हैं, तो सही नली का व्यास का उपयोग कर निकटतम मिलीमीटर के लिए सभी आयामों का निर्धारण। कंटेनर आयाम को मापने में त्रुटियाँ प्लेट प्रस्तावक की विफलता का परिणाम देगा।
    5. दोहराएँ सभी कंटेनर प्रकार है कि प्लेट प्रस्तावक का सामना करेंगे के लिए 2.2.4.1 के माध्यम से 2.2.2 कदम। सभी Labware के लिए इस चरण के पूरा होने के बाद, यह प्रत्येक कंटेनर (कदम 2.2.6) के लिए शुरू और अंत स्थान को परिभाषित करने के लिए आवश्यक है।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए Labware 6 अच्छी तरह से थाली, गहरी अच्छी तरह से थाली, और 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग प्लेट भी शामिल है।
    6. प्रत्येक कंटेनर की शुरुआत और अंत की स्थिति को परिभाषित करने के लिए, एक विशिष्ट प्रोटोकॉल में शुरू / अंत टैब पर क्लिक करें। सबसे पहले, प्रत्येक कंटेनर की शुरुआत की स्थिति का चयन करें। फिर, दोनों के शुरू और अंत की स्थिति में lidded / Unlidded के लिए बॉक्स की जाँच करें। सभी कंटेनरों के लिए दोहराएँ।
      नोट: कंटेनर equ के एक टुकड़े पर छोड़ दिया जाएगा तोipment (प्लेट प्रस्तावक के बजाय) अंत स्थान खाली छोड़ा जा सकता है।
  3. इस स्तर पर मैन्युअल पूरे कार्यप्रवाह के लिए शुरू करने की स्थिति में सभी प्लेटों लोड। 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग प्लेटों होटल में होटल 3 में से-2 कोशिकाओं के साथ 2, 6 अच्छी तरह प्लेटें लोड, एक 96 गहरी अच्छी तरह से थाली कि प्लेट हीटर / चिलर घोंसला 2 पर परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब एंजाइम समाधान (पूरक फ़ाइल, धारा 1.2.2 देखें) बहु मोड निकालने की मशीन पर हैं।
    1. परिवर्तन प्रोटोकॉल में बाहर किया जाएगा, तो अच्छी तरह से प्रति प्लास्मिड डीएनए के 10 μl के साथ 96 गहरी अच्छी तरह से थाली पूर्व लोड (1 माइक्रोग्राम / μl, एक 260/280> 1.8) ओएफपी संवाददाता का निर्माण युक्त और थाली पर सेते 4 डिग्री सेल्सियस पर हीटर / चिलर। हर अच्छी तरह से, एक भी परिवर्तन के लिए इस्तेमाल किया जाएगा इस प्रकार भरा प्रयोगात्मक स्थापना पर निर्भर करेगा कुओं की संख्या।
  4. स्वचालित पर सभी आपूर्ति और प्लेट लोडनिर्दिष्ट स्थानों में डी तरल से निपटने के लिए मंच और स्वचालन नियंत्रण सॉफ्टवेयर (चित्रा 1 बी) में प्रत्येक आइटम की स्थिति को परिभाषित करते हैं।
    1. एक 96 अच्छी तरह से थाली 200 स्तंभ 1 में एमएमजी में 40% खूंटी के μl (0.4 मीटर mannitol, 100 मिमी MgCl 2, 4 मिमी एमईएस, पीएच 5.7), propidium आयोडाइड के 200 μl के साथ preloaded लोड (पीआई, 1 माइक्रोग्राम / एमएल) स्तंभ 2, और स्तंभ 3 (घोंसला 2) में इथेनॉल के 200 μl, और घोंसला 8 में पिपेट सुझावों की एक बॉक्स में।
    2. मेनू से स्वचालित तरल से निपटने मंच के सॉफ्टवेयर में Labware के स्थान का चयन करें उपकरण को परिभाषित करने और Labware संपादक पर क्लिक करें।
    3. लटकते मेनू से Labware के प्रकार का चयन करें या नई Labware बटन का उपयोग कर एक नया Labware प्रकार परिभाषित करते हैं।
    4. मुख्य प्रोटोकॉल टैब का चयन और कॉन्फ़िगर Labware क्लिक करके चुना Labware के एक टुकड़े की स्थिति को परिभाषित। सुनिश्चित करें कि Labware के एक टुकड़े से स्वचालित तरल से निपटने मंच पर रखा हैप्रोटोकॉल चल रहा से पहले परिभाषित किया।
    5. स्वचालित प्रोटोकॉल को गति प्रदान करने के लिए, प्रोफ़ाइल Explorer विंडो क्लिक करें और प्रोटोकॉल चलाने के लिए (मूलतत्त्व अलगाव, कोशिका गिनती, और खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन) के नाम का चयन करें।
    6. सभी उपकरणों है कि प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा प्रारंभ करने के लिए चलाएँ क्लिक करें।
    7. अंत में, काम Explorer विंडो में, सिस्टम में सभी कंटेनरों / Labware सत्यापित करने और स्वचालित प्रोटोकॉल शुरू करने के लिए जोड़े काम इकाई पर क्लिक करें।
      नोट: स्वचालित प्रोटोकॉल का पूरा विवरण के पूरक फ़ाइल में निहित हैं।

3. कोशिकाओं की गिनती के लिए मानक वक्र की स्थापना

  1. मैन्युअल 1 मिलीलीटर की मात्रा में 1 एक्स 10 6 protoplasts / एमएल की एकाग्रता में protoplasts ध्यान केंद्रित। अपकेंद्रित्र 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर Protoplasts, और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  2. मैन्युअल मूलतत्त्व गोली के लिए 70% इथेनॉल (4 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखा) के 900 μl जोड़नेऔर गोली फिर से निलंबित। बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते कोशिकाओं को ठीक करने के लिए।
  3. नाभिक लेबल और प्लेट रीडर द्वारा पता लगाने की अनुमति protoplasts गड़बड़ी के 100 μl (1 माइक्रोग्राम / एमएल) जोड़ें।
  4. लोड प्रत्येक स्तंभ और 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग प्लेट स्तंभ 2 पर शुरू की पंक्ति में से-2 मीडिया तरल के 80 μl।
  5. एक 96 अच्छी तरह फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग थाली के कॉलम 1 में, स्तंभ में प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए से-2 मीडिया protoplasts के 70 μl और 50 μl जोड़ें।
  6. स्वचालित तरल से निपटने मंच का घोंसला 6 में थाली प्लेस, और एक 2 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने से चलाते हैं।
    1. स्वचालित तरल से निपटने मंच पर एक धारावाहिक कमजोर पड़ने का संचालन करने के लिए, धारावाहिक कमजोर पड़ने विज़ार्ड शुरू क्लिक करें और हस्तांतरण की मात्रा (60 μl), घोला जा सकता है और मात्रा (2, 70 μl), प्रारंभिक कुओं की संख्या (स्तंभ 1, पंक्तियाँ वायुसेना), कमजोर पड़ने समायोजित कुओं (कॉलम 2-11, पंक्तियाँ वायुसेना), और महाप्राण और बांटना गुण (ठीक नीचे से 0.5 मिमी)।
    2. मानकों की स्थापना के बाद, एक बचाघ प्रोटोकॉल चलाते हैं।
      नोट: चूंकि सभी protoplasts (कोशिकाओं के निर्धारण के कारण) पीआई के साथ चिह्नित कर रहे हैं, प्रतिदीप्ति मूलतत्त्व एकाग्रता के अनुपात में है।
    3. धारावाहिक कमजोर पड़ने के बाद पूरा हो, घोंसला 9 से थाली निकालें और प्लेट रीडर में डालने और प्लेट रीडर सॉफ्टवेयर में मानक वक्र प्रोटोकॉल चलाते हैं।
      नोट: एक मानक वक्र तो प्रतिदीप्ति पीआई से जाना जाता मूलतत्त्व एकाग्रता के साथ प्रत्येक कुएं में (उत्तेजना 536 एनएम / उत्सर्जन 620 एनएम) की तुलना द्वारा उत्पन्न हो जाएगा।
  7. प्लेट पाठक प्रोटोकॉल के पूरा होने पर, थाली हटाने और autoclaving या अन्य de-vitalization प्रक्रियाओं के रूप में 'जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल में परिभाषित के लिए किसी भी ट्रांसजेनिक कोशिकाओं को इकट्ठा।

4. परिवर्तन का सूक्ष्म विश्लेषण

  1. बदल protoplasts रोबोट प्रणाली का Hotel 1 से (स्वचालित प्रोटोकॉल 3, पूरक फ़ाइल के उत्पाद) के साथ थाली निकालें।
  2. मोड़उलटा माइक्रोस्कोप, कैमरा, और फ्लोरोसेंट लैंप पर।
  3. , प्रारंभिक protoplasts पर ध्यान केंद्रित करने के लिए 10X उद्देश्य का चयन करें हैलोजन लैंप पर बारी है, और फ्लोरोसेंट लैंप के लिए शटर बंद कर दें।
  4. सूक्ष्म प्रणाली और brightfield का उपयोग कर protoplasts पर ध्यान केंद्रित करने पर लोड थाली।
  5. protoplasts पर ध्यान केंद्रित करने के बाद, हैलोजन बल्ब बंद कर देते हैं और फ्लोरोसेंट लैंप के लिए शटर खुला।
  6. CY3 / TRITC फिल्टर pporRFP प्रोटीन ट्रांसजेनिक protoplasts द्वारा व्यक्त के दृश्य के लिए सेट का चयन करें।
  7. pporRFP फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त protoplasts की संख्या निर्धारित करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए स्कैन।
  8. फ्लोरोसेंट मार्कर व्यक्त protoplasts की कुल संख्या protoplasts की कुल संख्या के रूप में परिवर्तन दक्षता की गणना।
  9. autoclaving या अन्य de-vitalization प्रक्रियाओं के रूप में 'जैव सुरक्षा प्रोटोकॉल में परिभाषित के लिए मंजूरी दे दी जैव सुरक्षा बैग में ट्रांसजेनिक कोशिकाओं से युक्त किसी भी प्लेटों लीजिए।

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Representative Results

वर्तमान अध्ययन में, से-2 का दोहरीकरण दर 14-18 मानव संसाधन तापमान जिस पर संस्कृतियों incubated रहे थे, 15 घंटा का एक मतलब सेल चक्र लंबाई की पिछली रिपोर्टों के साथ संगत पर निर्भर से विविध। इस दोहरीकरण दर के साथ, एक 1: 100 शुरू inoculum संस्कृतियों आरंभ करने के लिए, 5-7 दिनों में 50% की एक पैक सेल मात्रा (PCV) के साथ संस्कृतियों के लिए अग्रणी इस्तेमाल किया गया था। वर्तमान प्रोटोकॉल है, जिसमें संस्कृतियों मीडिया की 200 मिलीलीटर में बड़े हो रहे थे, 100 मिलीलीटर की एक PCV 7 दिन, जो 33 6 अच्छी तरह प्लेटें भरने के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उपलब्ध कराई में तैयार की गई थी। मूलतत्त्व उपज के मामले में, शर्तों प्रोटोकॉल में निर्दिष्ट में पाचन 4.70 x 10 5 ± 5.77 x 10 3 protoplasts अच्छी तरह से प्रति उत्पन्न प्रति 6 अच्छी तरह से थाली (2A चित्रा) 2.82 x 10 6 मूलतत्त्वों में जिसके परिणामस्वरूप। इन आंकड़ों के आधार पर, 214 96 अच्छी तरह प्लेटें (अच्छी तरह से प्रति protoplasts के 70 μl) एक एकल 6 अच्छी तरह से थाली पाचन से लोड किया जा सकता है, संभावित fo साथआर दो 6 अच्छी तरह प्लेटें एक साथ पच होने की दो प्लेट हीटर / चिलर स्टेशनों का उपयोग। इस प्रकार, protoplasts कि एक भी तीन घंटे की पाचन प्रोटोकॉल के दौरान उत्पन्न किया जा सकता है की अधिकतम संख्या 5.64 x 10 6 है।

पाचन प्रोटोकॉल प्रति उत्पन्न protoplasts की कुल संख्या प्रणाली के लिए एक मीट्रिक प्रदान करता है, यह भी मूलतत्त्व एकाग्रता में नुकसान का मूल्यांकन करने के रूप में protoplasts प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के माध्यम से स्थानांतरित कर रहे हैं आवश्यक है। जैसे, protoplasts की एकाग्रता प्रोटोकॉल में प्रत्येक हस्तांतरण कदम के बाद मूल्यांकन किया गया था। पाचन प्रोटोकॉल के बाद, 1.15 x 10 4 ± 1.35 x 10 2 protoplasts, अच्छी तरह से 96 गहरे अच्छी तरह से प्लेटों में से प्रत्येक के लिए हस्तांतरित किया गया है, तो परिवर्तन प्रोटोकॉल, या 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग प्लेट (चित्रा 2 बी) का आयोजन। एक बार परिवर्तन प्रोटोकॉल पूरा हो गया था, 1.23 x 10 3 ± 4.66 x10 1 protoplasts 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग प्लेट (चित्रा 2 सी) के लिए स्थानांतरित कर दिया गया। स्थानांतरित कर protoplasts की संख्या के अलावा, यह महत्वपूर्ण था protoplasts की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि कई pipetting चरणों मूलतत्त्वों को नुकसान नहीं किया।

व्यवहार्यता परख से परिणाम, protoplasts के 95.1 ± 0.04% पाचन के बाद व्यवहार्य थे, 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग थाली करने के लिए स्थानांतरण के बाद 92.1 ± 0.06%, और परिवर्तन प्रोटोकॉल के बाद 91.7 ± 16.67% के आधार पर। कई pipetting कदम के बावजूद, वहाँ नमूनों में से किसी के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर (p> 0.44) था। व्यवहार्यता के इस उपाय के अलावा, एक प्रोटोकॉल पीआई के साथ दाग protoplasts की कुल संख्या को मापने के द्वारा प्रक्रिया के किसी भी चरण में protoplasts की एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए विकसित किया गया था। के रूप में 3 चित्र में दिखाया, एक मानक वक्र generat थासिस्टम से protoplasts के ज्ञात सांद्रता के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता को मापने के द्वारा एड। मानक वक्र एक अच्छा फिट (2 आर = 0.967) अच्छी तरह से प्रति 0 30,000 protoplasts से लेकर फैले protoplasts की कुल संख्या के साथ था। मानक वक्र, protoplasts (8125 और 24,375 एक hemocytometer उपयोग कर की गणना) के एक ज्ञात संख्या के साथ नमूनों की प्रतिदीप्ति तीव्रता प्राप्त हुई थी और गणना मानक वक्र के समीकरण से protoplasts की संख्या मान्य करने के लिए। इन परिणामों के आधार पर मानक वक्र अच्छी तरह से प्रत्येक में 9560 और 28,200 protoplasts भविष्यवाणी की, एक 15 और 14% त्रुटि। यह देखते हुए कि वहाँ भी सेल नंबर को मापने के एक hemocytometer का उपयोग करने में परिवर्तनशीलता है कि, इस त्रुटि को स्वीकार्य समझा था।

एफ - सेल नंबर और व्यवहार्यता के परिणामों के अलावा, परिवर्तन प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक कोशिकाओं को पैदा करने में सफल रहा है कि ओएफपी (चित्रा 2 डी एक्सप्रेस थी)। दुर्भाग्य से इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल कम में हुई, ~ 2%, परिवर्तन दक्षता, बड़े 16,028 बीपी बाइनरी इस अध्ययन में और प्रोटोकॉल द्वारा -2 protoplasts के लिए विशेष रूप से अनुकूलित नहीं किया गया था के बाद से इस्तेमाल प्लाज्मिड की वजह से। से-2 protoplasts के लिए परिवर्तन प्रोटोकॉल, अभिकर्मकों और शर्तों विशेष के संदर्भ में की अनुकूलन, के रूप में चर्चा में elucidated, परिवर्तन दक्षता में वृद्धि की उम्मीद है। इस प्रोटोकॉल के संदर्भ में, परिवर्तन की प्रक्रिया के परिवर्तन करने के लिए मूलतत्त्व अलगाव से सबूत की अवधारणा पथ प्रदर्शन करने के लिए तैयार है, और इस लक्ष्य को प्राप्त करने में सफल रहा था।

सफलतापूर्वक अलग-अलग प्रक्रियाओं के सभी को मान्य करने के बाद, मैट्रिक्स परिवर्तन करने के लिए मूलतत्त्व अलगाव से प्रोटोकॉल के timecourse के लिए प्राप्त किया गया। जैसा कि चित्र 4 में प्रदर्शन, समय की प्रमुख निवेश पाचन मंच है, जिसमें 3 घंटा के लिए आवश्यक था दौरान खर्च किया जाता हैसेल की दीवार और protoplasts की रिहाई की पूरी पाचन आर। इस प्रक्रिया के दौरान, 18 छोरों प्लेट प्रस्तावक दो स्टेशनों के बीच की थाली के साथ चलती, थाली प्रकार के बरतन और प्लेट हीटर / चिलर 1 ऊष्मायन स्टेशन के बीच चलाए जा रहे हैं। थाली प्रकार के बरतन और प्लेट हीटर के बीच हस्तांतरण के समय / चिलर 1 सिर्फ 8.9 सेकंड लेता है, और यह सुनिश्चित करता है कि पाचन प्रक्रिया के बहुमत incubating खर्च किया जाता है और मिलाते हुए। प्रक्रिया की दीक्षा से कुल समय बहु मोड निकालने की मशीन द्वारा एंजाइमों की लोडिंग को पूरा करने के लिए 2.2 मिनट है। कुल मिलाकर, पूरी मूलतत्त्व अलगाव प्रोटोकॉल 3 घंटा और 22.8 मिनट में पूरा हो गया है। इन परिणामों के आधार पर, मूलतत्त्व अलगाव प्रोटोकॉल का 88% पचाने खर्च किया जाता है। मूलतत्त्व अलगाव प्रोटोकॉल के पूरा होने के बाद, परिवर्तन प्रोटोकॉल शुरू की, और 27.5 मिनट के भीतर पूरा हो गया है। मूलतत्त्व अलगाव प्रोटोकॉल के लिए इसी प्रकार, परिवर्तन की प्रक्रिया का 72% प्रतिक्रिया incubating खर्च किया जाता है। प्रोटोकॉल में केवल एक अन्य कदमकि एक महत्वपूर्ण समय घटक (> कुल प्रक्रिया समय के 10%) स्वचालित तरल से निपटने मंच है, जो प्रक्रिया में कुल समय का 14% के लिए खातों से प्रोटोकॉल का आरंभ है। इस रास्ते में, प्रोटोकॉल के 86% प्रारम्भ और ऊष्मायन में खर्च किया जाता है, समय pipetting और हस्तांतरण कदम पर खर्च का केवल 14% के साथ। मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन की पूरी अवधि कोई बाहरी ऑपरेटर से आवश्यक इनपुट के साथ, 3 घंटा, 50 मिनट, 53 सेकंड और था।

आकृति 1
चित्रा 1:। रोबोट मंच और स्वचालित तरल से निपटने मंच के विन्यास प्रोटोकॉल के दौरान की योजनाबद्ध (ए) रोबोटिक प्रणाली 3 प्लेट ढेर / होटल कि प्लेट प्रस्तावक द्वारा पहुँचा जा सकता है से बना है। Hotel 1 नामित lidding / delidding स्टेशन है, Hotel 2 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट हैप्लेट ढेर, और होटल के 3 से 6 अच्छी तरह से थाली चुकी है। प्रणाली के दो तरल संचालकों, एक स्वचालित तरल से निपटने मंच, और एक नोक-आधारित बहु मोड निकालने की मशीन है। हीटिंग / ठंडा रोबोट मंच के लिए थाली मिश्रण के लिए एक थाली प्रकार के बरतन के साथ-साथ, दो प्लेट हीटिंग / द्रुतशीतन इकाइयों है। अंत में, प्रणाली प्रतिदीप्ति मापने के लिए एक monochromator आधारित प्लेट रीडर है। सभी घटकों के लिए एक कस्टम बनाया जैव सुरक्षा कैबिनेट में रखे जाते हैं। (बी) घोंसला 2 अभिकर्मक प्लेट और टिप बॉक्स के कब्जे में साथ स्वचालित तरल से निपटने मंच पर घोंसला 8. (सी) स्वचालित तरल से निपटने मंच के विन्यास रखा विन्यास शुरू से पहले एक प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल बुला लिए। एक गहरी अच्छी तरह से थाली घोंसला 4 पर स्थित है, एक 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग थाली घोंसला 6 पर स्थित है, और 6 अच्छी तरह से थाली protoplasts युक्त घोंसला 5 पर स्थित है वी करने के लिए यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण iew।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रत्येक हस्तांतरण के बाद और नारंगी फ्लोरोसेंट प्रोटीन रिपोर्टर जीन के साथ परिवर्तन के बाद से-2 protoplasts के प्रतिनिधि छवियाँ (ए - सी) के सूक्ष्मग्राफ से-2 मूलतत्त्व घनत्व 6 अच्छी तरह से थाली, 70 के हस्तांतरण के बाद 96 अच्छी तरह से थाली में। 6 अच्छी तरह से थाली से μl, और 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट प्लेट स्क्रीनिंग के बाद परिवर्तन। (डी) Brightfield परिवर्तन के बाद से-2 protoplasts के माइक्रोग्राफ। (ई) फ्लोरोसेंट से-2 मूलतत्त्व ओएफपी जीन व्यक्त एक Cy3 / TRITC फिल्टर सेट का उपयोग कल्पना। (एफ) brightfield के ओवरले और फ्लोरोसेंट micrographs परिवर्तन की कम क्षमता का प्रदर्शन है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Protoplasts की संख्या की गणना के लिए मानक वक्र एक अच्छी तरह से दिए गए में protoplasts की संख्या प्रतिदीप्ति तीव्रता मानक वक्र के लिए, मनमाना इकाइयों (एयू) में, की तुलना करने के लिए समीकरण द्वारा गणना की जा सकती है। मूलतत्त्व नंबर के मान्यकरण मानक वक्र और बिंदु 9561 protoplasts प्लेट पाठक से पहचान की, और 8125 hemocytometer पर गिना साथ, ग्राफ पर संकेत पर hemocytometer के बीच तुलना में था। कुल मिलाकर, 15% की एक त्रुटि दो तकनीकों के बीच पाया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

फिर 4 "src =" / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
चित्रा 4:। से-2 protoplasts और आनुवंशिक परिवर्तन के उत्पादन के लिए वर्णित प्रक्रिया के लिए गैंट चार्ट प्रोटोकॉल का बहुमत है, ~ 3 घंटा, से-2 कोशिकाओं के पाचन पर खर्च किया जाता है protoplasts उत्पन्न करते हैं। एंजाइम समाधान और निष्क्रियता की लोडिंग समग्र प्रक्रिया समय का केवल 12% की आवश्यकता होती है। इसी तरह, थाली प्रकार के बरतन पर परिवर्तन प्रतिक्रिया के ऊष्मायन परिवर्तन प्रोटोकॉल का 72% के लिए खातों। कुल मिलाकर, मूलतत्त्व अलगाव से प्रक्रिया जब तक आनुवंशिक परिवर्तन हासिल की है 4 घंटा (3 घंटा, 50 मिनट, 53 सेकंड और) के अधीन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल: मूलतत्त्व अलगाव, सेल गिनती, और खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन के लिए स्वचालित प्रोटोकॉल <।/ strong> पूरा प्रोटोकॉल ऊपर सूचीबद्ध इस फाइल में शामिल किए गए हैं कार्यों में से प्रत्येक को पूरा करने के रोबोट मंच में उपयोग के लिए विकसित किया है। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक मूलतत्त्व अलगाव, गणन, और परिवर्तन से-2 तंबाकू निलंबन सेल संस्कृति प्रयोग करने के लिए मान्य किया गया है; हालांकि, प्रोटोकॉल आसानी से किसी भी संयंत्र के निलंबन संस्कृति के लिए बढ़ाया जा सकता है। वर्तमान में, मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन मक्का (Zea mays) 10, गाजर (Daucus carota) 32, चिनार (पोपुलस euphratica) 33, अंगूर (द्राक्षा) 34, ताड़ के तेल (Elaeis guineensis), 35 सहित कई पौधों में हासिल किया गया है , सलाद (Lactuca पौधा), 36, सरसों (बै्रसिका juncea) 37, चावल (धान), 38, और switchgrass (panicum virgatum) 39,40। जबकि संस्कृति और पाचन की स्थिति में बदलाव प्रजातियों से प्रजातियों के होते हैं, इस काम में विकसित प्रोटोकॉल के मामले में, संस्कृति मीडिया की जगह या खुदाई की शर्तों में फेरबदलestion मौलिक प्रोटोकॉल नहीं बदलना चाहिए। विभिन्न प्रजातियों, संस्कृति, मीडिया और एंजाइम पाचन के लिए आवश्यक प्रोटोकॉल का आरंभ करने से पहले ऑपरेटर से भरी हुई हैं को समायोजित करने के लिए, इस प्रकार इन घटकों स्वैपिंग तुच्छ है। एक अतिरिक्त लाभ के रूप में, प्रोटोकॉल सिस्टम द्वारा मापा protoplasts की उपज के साथ कई पाचन की स्थिति स्क्रीनिंग के लिए संशोधनीय है। यह एक आवश्यक घटक है, इस प्रकार यह पाचन में इस्तेमाल किया एंजाइमों की मात्रा को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में कम लागत वाली एंजाइमों का उपयोग उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हैं।

संस्कृति और पाचन के लिए इसी प्रकार, परिवर्तन प्रोटोकॉल में संशोधन जब विभिन्न प्रजातियों के पौधे से अलग protoplasts के परिवर्तन के लिए प्रणाली अपनाने की आवश्यकता होगी। काफी काम परिवर्तन की दक्षता को प्रभावित करने वाले कारकों के साथ कई संयंत्र protoplasts 16,35 में खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन के अनुकूलन पर आयोजित किया गया है। वर्तमान wo मेंआरके एक सीमित कारक परिवर्तन दक्षता को प्रभावित करने बाइनरी परीक्षण प्लाज्मिड के बड़े आकार का था, 16,028 बीपी, जो एक जीनोम संपादन प्लाज्मिड आकार मॉडलिंग के प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया गया था। से-2 protoplasts के खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन पर पिछले अध्ययनों में, 40-60% परिवर्तन हासिल किया गया है; हालांकि, इन अध्ययनों छोटे 5,000 बीपी plasmids 41,42 इस्तेमाल किया। प्रजातियों के बीच खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन करने के लिए प्राथमिक संशोधनों खूंटी और 2 MgCl, राशि और डीएनए की एकाग्रता की एकाग्रता, और प्रतिक्रिया की अवधि शामिल हैं। जैसा कि खूंटी और 2 MgCl समाधान अभिकर्मक थाली पर व्यवस्था में पेश कर रहे हैं, और डीएनए प्री-लोडेड गहरी अच्छी तरह से थाली में है, इन स्थितियों को आसानी से संशोधित किया जा सकता है में प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित है। इसके अतिरिक्त, बढ़ाने या ऊष्मायन समय कम है, मिश्रण गति के संशोधन के साथ-साथ कर सकते हैं ठीक रोबोट मंच द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। परिवर्तन प्रोटोकॉल की वर्तमान सीमा कमी हैके द्वारा -2 मूलतत्त्वों में खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन की कम क्षमता के कारण, फ्लोरोसेंट रिपोर्टर पता लगाने के लिए प्लेट रीडर का उपयोग स्क्रीनिंग। ऐसे Arabidopsis thaliana और मक्का के रूप में 16 अन्य प्रजातियों में, खूंटी की मध्यस्थता परिवर्तन 40-90% ही कुशल है। ऐसी व्यवस्था में transformants तेजी से रोबोट पर प्लेट रीडर का उपयोग लक्षण वर्णन किया जा सकता है। इस प्रकार, यह सकारात्मक transformants के साथ कुओं की पहचान करने के लिए, और यह भी अभिव्यक्ति के स्तर यों संभव हो जाएगा। इस तरह के प्रमोटर स्क्रीनिंग के रूप में आवेदन के लिए, यह सुविधा वर्तमान प्रोटोकॉल की उपयोगिता में वृद्धि होगी, और इस प्रणाली के बाद में पुनरावृत्तियों में जोड़ दिया जाएगा।

से-2 protoplasts के लिए परिवर्तन दक्षता का अनुकूलन करने के अलावा, कई संशोधनों दक्षता और प्रणाली के समग्र throughput वृद्धि हो सकती है। मूलतत्त्व परिवर्तन की अनुमति दी protoplasts के स्वचालन पर पिछले अध्ययनों कुओं की तह तक व्यवस्थित करने के लिए, पहले किया गया था के अलावाज समाधान 43। वर्तमान प्रोटोकॉल में, protoplasts थाली प्रकार के बरतन बसने से रोकने के लिए और अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट का उपयोग निलंबन में protoplasts रखने के लिए पर मिलाया गया। इसके अलावा, परिवर्तन के दौरान, protoplasts गहरी अच्छी तरह से प्लेट में व्यवस्थित करने के लिए, खूंटी के लिए जोखिम है, जो लंबे समय तक निवेश से अधिक विषाक्त हो सकता है कम करने के लिए अनुमति नहीं थी। जैसे, protoplasts, पतला थे ~ W5 समाधान के साथ 10 गुना जब गहरी अच्छी तरह से थाली से 96 अच्छी तरह से फ्लोरोसेंट स्क्रीनिंग थाली को हस्तांतरित अच्छी तरह से प्रति 1.23 x 10 3 ± 4.66 x 10 1 मूलतत्त्वों में जिसके परिणामस्वरूप। आदेश में परिवर्तन के बाद स्थानांतरित कर protoplasts की संख्या में वृद्धि करने के लिए, एक ऊष्मायन कदम protoplasts व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए जोड़ा जा सकता है, और सतह पर तैरनेवाला तरल से-2 मीडिया की एक छोटी मात्रा के अलावा द्वारा पीछा हटा दिया। इसके अलावा, यदि एक थाली आधारित सेंट्रीफ्यूज प्रणाली को जोड़ा गया है, इस कदम और अधिक तेजी से प्राप्त किया जा सकता है। एक अन्य संशोधन कि टी करने के लिए कार्यक्षमता जोड़ सकता हैवह प्रणाली एक लाइव / मृत प्रतिदीप्ति परख के उपयोग परिवर्तन करने से पहले पृथक मूलतत्त्वों की व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए किया जाएगा। वर्तमान प्रोटोकॉल में, fluorescein diacetate (एफडीए) एक लाइव डाई के रूप में परीक्षण किया गया था; हालांकि, से-2 मूलतत्त्व पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति एफडीए संकेत छिपा हुआ है। अगर एक अधिक स्थिर व्यवहार्यता डाई का इस्तेमाल किया गया था, तब मूलतत्त्व व्यवहार्यता (आदि Calcein AM,) हरे रंग के लिए लाल (पीआई) के अनुपात प्रतिदीप्ति, और सेल गिनती प्रोटोकॉल के लिए मानकीकृत समान रूप से निर्धारित किया जा सकता है। इन संशोधनों व्यवस्था करने के लिए आगे की कार्यक्षमता जोड़ना होगा, और भविष्य के प्रोटोकॉल में शामिल किया जाएगा।

साथ मौजूदा प्रोटोकॉल करने का संबंध है, वहाँ कई महत्वपूर्ण कदम है कि प्रोटोकॉल की सफलता सुनिश्चित करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए। सबसे पहले, उम्र / द्वारा 2 संस्कृतियों के स्वास्थ्य की गारंटी नहीं है कि व्यवहार्य protoplasts बाद के चरणों के लिए अलग किया जा सकता आवश्यक है। 1.3 चरण में समझाया एक पर नए सिरे से कुप्पी के लिए एक लॉग चरण संस्कृति के हस्तांतरण से,ताजा मीडिया के लिए कोशिकाओं 1:50 अनुपात, और संस्कृति 5-7 दिनों के लिए विकसित करने के लिए अनुमति देता है, व्यवहार्य protoplasts की अधिकतम संख्या अलग किया जा सकता है। अनुमति दे संस्कृतियों अब या कम durations निर्दिष्ट inoculum का उपयोग कर काफी मूलतत्त्व उपज कम हो जाएगा, और बाद में प्रोटोकॉल की विफलता का कारण के लिए विकसित करने के लिए। एक दूसरा महत्वपूर्ण कदम 1.5 कदम है, मानक pipet सुझावों का उपयोग करते हैं, बजाय विस्तृत बोर pipet निर्दिष्ट टिप्स, के बाद से सुझाव के लिए रोकना और गलत मात्रा में स्थानांतरित किया जा रहा करने के लिए नेतृत्व करने के लिए प्रेरित करेगा। रोबोटिक प्रणाली की स्थापना के संबंध में, स्वचालित तरल से निपटने मंच पर प्लेटों की व्यवस्था, 2.4 कदम, महत्वपूर्ण है, एक संशोधित 6 अच्छी तरह से थाली पर सभी कुओं तक पहुँचने से तरल हैंडलर के सिर को रोकने के सेटअप के साथ। स्वचालित तरल से निपटने मंच के डिजाइन के कारण, 6 अच्छी तरह से थाली घोंसला 5 में रखा जाना चाहिए, या इस उपकरण के लिए चयनित किया प्रोटोकॉल असफल हो जायेगी। इसी तरह, असफलता को सही ढंग से थाली में Labware परिभाषित करने के लिएप्रस्तावक सॉफ्टवेयर, 2.2 कदम, साधन हड़पने के लिए असफल हो, या Labware प्रोटोकॉल की समाप्ति में जिसके परिणामस्वरूप ड्रॉप करने के लिए कारण होगा। कोशिका गिनती प्रोटोकॉल के लिए, महत्वपूर्ण कदम इथेनॉल, 3.2 कदम के साथ कोशिकाओं के निर्धारण शामिल है। कोशिकाओं पीआई के साथ लेबलिंग करने से पहले तय नहीं कर रहे हैं, तो केवल nonviable कोशिकाओं, लेबल किया जाएगा protoplasts की पूरी आबादी के बजाय, और यह अलग-थलग protoplasts की संख्या गिनने के लिए संभव नहीं होगा। अंतिम महत्वपूर्ण कदम, कदम 4.6, pporRFP फ्लोरोसेंट मार्कर की अभिव्यक्ति का सूक्ष्म विश्लेषण के लिए फ्लोरोसेंट फिल्टर का चयन शामिल है। अन्य "लाल" फिल्टर सेट का उपयोग क्लोरोफिल से पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के लिए अनुमति देता है, काफी सभी क्लोरोप्लास्ट युक्त मूलतत्त्वों में संकेत बढ़ रही है, परिवर्तन दक्षता की गणना को रोकने। ध्यान से इन महत्वपूर्ण चरणों में विनिर्देशों का पालन सफलता के लिए सबसे बड़ा अवसर और सबसे प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य datas की पीढ़ी की गारंटीएट।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Orbitor RS Microplate mover Thermo Scientific
Bravo Liquid Handler Agilent
Synergy H1 Multi-mode Reader BioTek
MultiFlo FX Multi-mode Dispenser BioTek
Teleshake Inheco 3800048
CPAC Ultraflat Heater/cooler Inheco 7000190
Vworks Automation Software Agilent Software used to control and write protocols for Agilent Bravo
Momentum Software Thermo Scientific Task scheduling software for controlling Orbiter RS
Liquid Handling Control 2.17 Software Biotek Software used to control and write protocols for MultiFlo FX
IX81 Inverted Microscope Olympus
Zyla 3-Tap microscope camera Andor
ET-CY3/TRITC Filter Set Chroma Technology Corp 49004
Rohament CL AB Enzymes sample bottle low-cost cellulase
Rohapect UF AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase
Rohapect 10L AB Enzymes sample bottle low-cost pectinase/arabinase
Linsmaier & Skoog Basal Medium Phytotechnology Laboratories L689
2,4-dichlorophenoxyacetic acid Phytotechnology Laboratories D295
propidium iodide Sigma Aldrich P4170
Poly(ethylene glycol) 4000 Sigma Aldrich 95904-250G-F Formerly Fluka PEG
Propidium Iodide Fisher Scientific 25535-16-4 Acros Organics
CaCl2 Sigma Aldrich C7902-1KG
Sodium Acetate Fisher Scientific BP333-500
Mannitol Sigma Aldrich M1902-1KG
Sucrose Fisher Scientific S5-3
KH2PO4 Fisher Scientific AC424205000
KOH Sigma Aldrich P1767
Gelzan CM Sigma Aldrich G1910-250G
6-well plate Thermo Scientific 103184
96-well 1.2 ml deep well plate Thermo Scientific AB-0564
96 well optical bottom plate Thermo Scientific 165305
Finntip 1000 Wide bore Pipet tips Thermo Scientific 9405 163
NaCl Fisher Scientific BP358-10
KCl Sigma Aldrich P4504-1KG
MES Fisher Scientific AC17259-5000
MgCl2 Fisher Scientific M33-500

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References

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आनुवंशिकी अंक 115 तम्बाकू Protoplasts परिवर्तन enzymatic पाचन उच्च throughput स्क्रीनिंग स्वचालन रोबोटिक्स
उच्च throughput मूलतत्त्व अलगाव और परिवर्तन के लिए एक रोबोट मंच
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Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C.,… More

Dlugosz, E. M., Lenaghan, S. C., Stewart, Jr., C. N. A Robotic Platform for High-throughput Protoplast Isolation and Transformation. J. Vis. Exp. (115), e54300, doi:10.3791/54300 (2016).

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