Summary
En høj-throughput, automatiseret, tobak protoplast produktion og transformation metodik er beskrevet. Det robotsystem giver massivt parallelle genekspression og opdagelse i modellen BY-2-systemet, der bør være oversættes til ikke-model afgrøder.
Abstract
I det sidste årti har der været en genopblussen i brugen af planteprotoplaster, der spænder fra modelarter at beskære arter, til analyse af signaltransduktionsveje, transkriptionelle regulatoriske netværk, genekspression, genom-redigering og gendæmpning. Endvidere er der gjort betydelige fremskridt i regenerering af planter fra protoplaster, der har genereret endnu mere interesse for brugen af disse systemer til plantegenomik. I dette arbejde har en protokol udviklet til automatisering af protoplast isolation og transformation fra en 'Bright Yellow »2 (BY-2) suspension tobak kultur ved hjælp af en robot platform. De transformationsprocedurer valideret ved anvendelse af en orange fluorescerende protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontrol af blomkålsmosaikvirus 35S-promotoren (35S). OFP ekspression i protoplaster blev bekræftet ved epifluorescens-mikroskopi. Analyser omfattede også protoplast produktion effektivitet metoder ved hjælp propidium iodid. Endelig blev lavpris fødevarekvalitet enzymer anvendes til protoplastisolering procedure, omgår behovet for lab-grade enzymer, som er omkostnings-prohibitivt i high-throughput automatiseret protoplastisolering og analyse. Baseret på den protokol udviklet i dette arbejde, kan udføres hele proceduren fra protoplast isolation til transformation i under 4 timer, uden input fra operatøren. Mens den protokol udviklet i dette arbejde blev valideret med BY-2 cellekultur, bør de procedurer og metoder være oversættes til enhver plante suspension kultur / protoplast system, som skal gøre det muligt acceleration afgrøde genomforskning af.
Introduction
I de senere år har der været en betydelig drivkraft placeret på udformningen af transgene afgrøder til at overvinde forskellige sygdomme 1, udstyre herbicidresistens 2, tillægger tørke 3,4 og salt tolerance 5, forebygge herbivory 6, øge biomasse udbytte 7, og mindske cellevæg vrangvillighed 8. Denne tendens er blevet hjulpet på vej af udviklingen af nye molekylære værktøjer til at generere transgene planter, herunder genom-redigering ved hjælp CRISPR og Talens 9, og gen silencing gennem dsRNA 10, miRNA 11, og siRNA 12. Mens disse teknologier har forenklet frembringelsen af transgene planter, har de også skabt en flaskehals, hvor der genereres ikke kan screenes under anvendelse af traditionelle systemer, der er afhængige af planteregenerering det store antal af transgene planter. Relateret til dette flaskehals, mens silencing og genom-redigering konstruktioner kan indføres hurtigt i planter, mange af demålrettede træk undlader at frembringe den ønskede virkning, som ofte først opdages planter analyseres i drivhuset. I dette arbejde har vi udviklet en metode til hurtig, automatiseret, high-throughput screening af planteprotoplaster, specifikt at afhjælpe den nuværende flaskehals i tidlig screening af store antal af genom-redigering og gene silencing mål.
Anvendelsen af protoplaster, i modsætning til intakte planteceller, har flere fordele for udviklingen af en automatiseret platform. Først protoplaster isoleret efter fordøjelse af plantecellevægge, og med dette ikke længere til stede barriere, er transformationseffektivitet steg 13. I intakte planteceller er der kun to veletablerede fremgangsmåder til transformation, biolistics 14 og Agrobacterium-medieret transformation 15. Ingen af disse metoder kan let oversættes til flydende håndtering platforme, som biolistik kræver specialudstyr til transfoinger, hvorimod Agrobacterium-medieret transformation kræver co-kultur og efterfølgende fjernelse af bakterierne. Hverken er modtagelige for høj kapacitet metoder. I tilfælde af protoplaster, er transformation rutinemæssigt udført under anvendelse af polyethylenglycol (PEG) -medieret transfektion 16, som kun kræver flere løsning udvekslinger, og er ideelt egnet til håndtering af flydende platforme. For det andet, protoplaster, per definition, er single-cellekulturer, og dermed problemerne med sammenklumpning og kæde-dannelse i plantecellekulturer er ikke observeret i protoplaster. Med hensyn til hurtig screening under anvendelse af en plade-baseret spektrofotometer, sammenklumpning af celler, eller celler i flere planer vil føre til vanskeligheder med at erhverve konsekvente målinger. Da protoplaster er også tættere end deres dyrkningsmedier, de sedimentere til bunden af brøndene, der danner et monolag, der er befordrende for plade-baseret spektrofotometri. Endelig mens plantecelle suspensionskulturer er Primarily afledt af callus 17, kan protoplaster høstes fra en række plantevæv, hvilket fører til muligheden for at identificere vævsspecifik ekspression. For eksempel, evnen til at analysere rod- eller blad-specifik ekspression af et gen kan være meget vigtigt at fænotype forudsigelse. Af disse grunde blev de protokoller, der er udviklet i dette arbejde valideret ved hjælp af protoplaster isoleret fra den udbredte tobak (Nicotiana tabacum L.) 'Bright Yellow »2 (BY-2) suspension kultur.
BY-2 suspensionskultur er blevet beskrevet som "HeLa" celle af højere planter, på grund af sin allestedsnærværende anvendelse i molekylær analyse af planteceller 18. For nylig, AF-2-celler er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af plante stressfaktorer 19-22, intracellulært protein lokalisering 23,24, og grundlæggende cellebiologi 25-27 demonstrerer den brede anvendelighed af disse kulturer i plantebiologi. En yderligere fordel ved BY-2-kulturer ermulighed for at synkronisere kulturerne med aphidicolin, hvilket kan føre til øget reproducerbarhed for genekspressionsstudier 28. Endvidere er der udviklet metoder til udvinding af BY-2 protoplaster ved anvendelse lavpris enzymer 29,30, som enzymer, der traditionelt anvendes til generering af protoplaster er omkostningseffektive uoverkommelige for højt gennemløb systemer. Som sådan har den nedenfor beskrevne protokol blevet valideret ved anvendelse af BY-2 suspensionskultur, men det bør kunne ændres til en celle suspension plante kultur. Proof-of-concept eksperimenter udføres under anvendelse af en orange fluorescens protein (OFP) reportergen (pporRFP) fra de hårde koraller Porites porites 31 under styring af CaMV 35S-promotoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering af Suspension Cell Cultures
- Forbered væske BY-2-medier ved tilsætning 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal medier, 30 g saccharose, 200 mg KH 2 PO 4, og 200 ug af 2,4-D (2,4-D) til 900 ml destilleret vand og pH til 5,8 med 0,1 M KOH. Efter indstilling af pH, justere slutvolumen til 1000 ml med destilleret vand og autoklave. Medier kan opbevares op til 2 uger ved 4 ° C.
- Inokulere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml flydende BY-2-medier og et enkelt stykke BY-2 callus (> 1 cm i diameter) dyrket på faststof ved-2-medier (flydende BY-2-medier med tilsætning af 1% agar) og forsegle med aluminiumsfolie. Inkuber kulturen ved 28-30 ° C under omrystning i 5 dage.
BEMÆRK: BY-2 callus fastholdes på faste medier til langtidsopbevaring, som flydende kulturer hurtigt vil overgrow. Kultur volumen kan justeres efter behov, typisk vil en 100 ml kultur være i stand til at indlæse treogtredive 6-well plader. - Transfer 2 ml log-fase BY-2 kultur til 98 ml frisk ved-2 medier og inkuberes i 5-7 dage ved 28-30 ° C under omrystning.
BEMÆRK: Sub-dyrkning af etablerede flydende kulturer kan udføres jævnligt med 1: 100 fortyndinger af 5-7 dage gamle kulturer, snarere end podning med callus. - Bland kulturen grundigt, som celler hurtigt vil slå sig ned, og overførsel 6 ml cellekulturen til et 15 ml konisk bund centrifugerør og lad cellerne nøjes med mindst 10 min. Juster pakkede cellevolumen til 50% af det samlede volumen ved at fjerne supernatant.
- Ryst rør ved at vende og pipette 500 pi i hver brønd i en 6-brønds plade for fordøjelsen. Brug stor indvendig diameter pipetter til at overføre cellerne på nuværende tidspunkt, da de er tætte og vil tilstoppe standard pipettespidser.
2. protoplastisolering
- Tænd alle komponenter i robotsystem (figur 1A) og åbn pladen mover opgave planlægning blødware. Opgaven planlægning program integrerer mikropladen mover med andet udstyr for at muliggøre overførsel af plader mellem hvert stykke udstyr.
- Forud for eksperimenter, definere de tekniske specifikationer for laboratorieudstyr (f.eks plader, låg), der anvendes i protokollen, samt start og slut positioner i hvert enkelt stykke laboratorieudstyr, i pladen mover software, som følger:
- Klik på Opsætning fra det vigtigste redskab bar i pladen mover software og vælg Administrer Container Typer kommando.
- Hvis beholderen type er angivet i den eksisterende beholder typen bibliotek, og vælg derefter egnet beholder.
- Hvis beholderen typen ikke er angivet i den eksisterende beholder typebiblioteket klik derefter på Tilføj for at angive en ny container type.
- Efter tilføjelse af en ny container type, indsætte dimensioner ny container (højde, bredde, stabling dimensioner, og griber offset) i de relevante faner og klik på Gem.
- Hvis de korrekte dimensioner er ikke tilgængelige fra producenten, så nøjagtigt at bestemme alle dimensioner til nærmeste millimeter ved hjælp calipre. Fejl i måling beholderen dimensioner vil resultere i svigt af pladen mover.
- Gentag trin 2.2.2 gennem 2.2.4.1 for alle container typer, som pladen mover vil støde på. Efter afslutningen af dette trin for alle laboratorieudstyr, er det nødvendigt at definere start og slut placering for hver beholder (trin 2.2.6).
BEMÆRK: For denne protokol for laboratorieudstyr omfatter 6-brønds plade, pladen dybe brønd, og den 96-godt fluorescerende screening plade. - For at definere start og slut position for hver container, skal du klikke på fanen Start / End i en særlig protokol. Vælg først startpositionen for hver beholder. Dernæst markere feltet for Lågkrukke / Unlidded ved både start og slutposition. Gentag for alle containere.
BEMÆRK: Hvis beholderen vil blive efterladt på et andet stykke udstyr;ipment (i stedet for pladen mover) enden placering kan efterlades tomt.
- På dette stadium manuelt indlæse alle plader i udgangspositionen for hele arbejdsgangen. Indlæse de 96 brønde fluorescerende screening plader i Hotel 2, 6-brønds plader med BY-2-celler i Hotel 3, en dyb-plade med 96 brønde, som vil blive anvendt til transformation på plade varmelegeme / køler reden 2, og en 50 ml konisk rør indeholdende enzymopløsningen (se Supplemental File, Section 1.2.2) på multi-mode dispenser.
- Hvis transformation vil blive udført i protokollen, præ-loade 96 dybe brønde med 10 pi plasmid-DNA pr brønd (1 pg / pl, A 260/280> 1.8) indeholdende OFP reporter konstrukt og inkuberes på pladen varmelegeme / køler ved 4 ° C. Hver brønd vil blive anvendt til en enkelt transformation, således at antallet af brønde fyldt afhænger forsøgsopstillingen.
- Læg alle forsyninger og plader på automatisered væskehåndtering platform i de udpegede steder og definere positionen for hvert element i automation kontrol software (figur 1B).
- Indlæse en 96-brønds plade indlæst med 200 pi 40% PEG i MMG (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) i kolonne 1, 200 pi propidiumiodid (PI, 1 ug / ml) i kolonne 2, og 200 pi ethanol i kolonne 3 (reden 2), og en æske pipettespidser i reden 8.
- For at definere placeringen af laboratorieudstyr i automatiserede håndtering platformens flydende software, vælge Værktøjer fra menuen, og klik Labware Editor.
- Vælg typen af laboratorieudstyr fra rullemenuen eller definere en ny labware typen ved hjælp af knappen Ny Labware.
- Definer placeringen af hvert stykke laboratorieudstyr valgt ved at vælge fanen Main-protokollen og klikke på Konfigurer Labware. Sørg for, at hvert stykke laboratorieudstyr placeret på automatiserede væskehåndtering platform erdefineret inden du kører protokollen.
- For at udløse de automatiserede protokoller, skal du klikke på Profil Explorer-vinduet, og vælg navnet på den protokol, der skal køres (protoplastisolering, celletal, og PEG-medieret transformation).
- Klik på Kør for at initialisere alle enheder, der vil blive anvendt i protokollen.
- Endelig i vinduet Work Explorer, skal du klikke på Tilføj Work Unit at kontrollere alle containere / laboratorieudstyr i systemet og begynde den automatiske protokol.
BEMÆRK: Fuld beskrivelser af de automatiserede protokoller er indeholdt i Supplemental File.
3. Etablere standardkurve for celletal
- Manuelt koncentrere protoplaster ved en koncentration på 1 x 10 6 protoplaster / ml i et volumen på 1 ml. Centrifuge protoplaster ved 1000 xg i 10 minutter, og fjern supernatanten.
- Manuelt tilføje 900 pi 70% ethanol (holdt ved 4 ° C) til protoplast pelletog re-suspendere pillen. Der inkuberes i 10 min på is for at fastsætte celler.
- Tilsæt 100 pi PI (1 ug / ml) til protoplasterne at mærke kernerne og muliggøre detektion af pladelæseren.
- Load 80 pi væske BY-2 medier i hver søjle og række i 96-brønds fluorescerende screening plade begyndende ved kolonne 2.
- I kolonne 1 i en 96-brønds fluorescerende screening plade, tilsættes 70 pi protoplaster og 50 pi BY-2-medier til hver brønd i kolonnen.
- Pladen anbringes i reden 6 i den automatiserede væskehåndterende platform, og køre en 2-fold seriefortynding.
- At gennemføre en seriel fortynding på automatiserede væskehåndtering platform, skal du klikke på Start Guiden seriel fortynding og justere lydstyrken overførsel (60 pi), antal blandinger og volumen (2, 70 pi), indledende boringer (kolonne 1, Rækker AF), fortynding Wells (Kolonner 2-11, rækker aF), og aspirat og dispensere ejendomme (0,5 mm fra godt bund).
- Efter indstilling af parametrene, gemme etd køre protokollen.
BEMÆRK: Eftersom alle protoplaster er mærket med PI (på grund af fiksering af celler), fluorescensen er proportional med protoplast fusion. - Efter den serielle fortynding er afsluttet, fjernes pladen fra reden 9 og indsætte i pladelæseren og køre standardkurven protokol i pladelæser software.
BEMÆRK: En standardkurve Derefter genereres ved at sammenligne fluorescensen fra PI (excitation 536 nm / emission 620 nm) i hver brønd med den kendte protoplast fusion.
- Ved afslutningen af pladelæser protokollen, fjerne pladen og indsamle eventuelle transgene celler til autoklavering eller andre de-vitalisering procedurer som defineret i biosikkerhed protokoller ".
4. Mikroskopisk Analyse af Transformation
- Fjern plade med transformerede protoplaster (produktet af Automated protokol 3, Supplerende fil) fra Hotel 1 af robotsystem.
- Turom omvendt mikroskop, kamera, og lysstofrør.
- Vælg 10X målsætning for første fokusere på protoplasterne tænde halogenlampe, og lukke lukkeren for lysstofrør.
- Load plade på mikroskopisk system, og fokus på protoplasterne hjælp lysfelt.
- Efter at fokusere på protoplaster, slukke for halogen pære og åbn lukkeren for lysstofrør.
- Vælg CY3 / TRITC filter indstillet til visualisering af pporRFP proteinet udtrykkes af de transgene protoplaster.
- Scan hver brønd for at bestemme antallet af protoplaster udtrykker pporRFP fluorescerende markør.
- Beregn transformationseffektivitet som det samlede antal protoplaster udtrykker fluorescerende markør det samlede antal protoplaster.
- Saml alle plader, der indeholder transgene celler i godkendte biosikkerhed poser til autoklavering eller andre de-vitalisering procedurer som defineret i biosikkerhed protokoller ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuelle undersøgelse, den fordobling på BY-2 varierede fra 14-18 timer afhængig af temperaturen, hvorved kulturerne blev inkuberet, i overensstemmelse med tidligere rapporter om en gennemsnitlig cellecykluslængden af 15 timer. Med denne fordobling sats, en 1: blev 100 startende inokulum anvendes til at initiere kulturer, hvilket fører til kulturer med en pakket cellevolumen (PCV) på 50% i 5-7 dage. I den nuværende protokol, hvori kulturer blev dyrket i 200 ml medium, blev en hæmatokrit på 100 ml genereret i 7 dage, som gav nok celler til at fylde 33 6-brønds plader. Med hensyn til protoplast udbytte, fordøjelse på de betingelser, der er anført i forsøgsprotokollen genererede 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplaster per brønd, hvilket resulterer i 2,82 x 10 6 protoplaster pr 6-brønds plade (figur 2A). Baseret på disse data, kunne 214 plader med 96 brønde (70 pi protoplaster per brønd) indlæses fra en enkelt plade med 6 brønde fordøjelse med mulighed for to plader med 6 brønde, der skal nedbrydes samtidigt under udnyttelse af de to plade varmer / køler stationer. Således er det maksimale antal af protoplaster, der kan genereres i løbet af en enkelt tre-timers fordøjelse protokollen er 5,64 x 10 6.
Mens det samlede antal protoplaster genereret pr fordøjelse protokol giver en metrik for systemet, er det også nødvendigt at vurdere tabet i protoplast koncentration som protoplasterne overføres gennem de forskellige trin i protokollen. Som sådan blev koncentrationen af protoplaster evalueret efter hver overførsel trin i protokollen. Efter fordøjelsen protokollen blev 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplaster overført til hver brønd af de 96 dybe brønde, hvis udførelse af transformation protokollen eller 96 brønde fluorescerende screening plade (figur 2B). Når omdannelsen protokollen blev afsluttet, 1,23 x 10 3 ± 4,66 x10 1 protoplaster blev overført til 96-brønds fluorescerende screening plade (figur 2C). Ud over antallet af protoplaster overførte, var det vigtigt at bestemme levedygtigheden af protoplasterne at sikre, at flere pipetteringstrin stadier ikke beskadige protoplasterne.
Baseret på resultaterne fra levedygtighedsassayet, 95,1 ± 0,04% af protoplaster var levedygtige efter fordøjelse, 92,1 ± 0,06% efter overførsel til 96-brønds fluorescerende screening plade, og 91,7 ± 16,67% efter omdannelsen protokollen. På trods af flere pipetteringstrin, var der ingen signifikant forskel (p> 0,44) mellem nogen af prøverne. Ud over denne foranstaltning af rentabiliteten, blev en protokol udviklet til bestemmelse af koncentrationen af protoplaster på ethvert tidspunkt i proceduren ved at måle det samlede antal protoplaster farvet med PI. Som vist i figur 3, en standardkurve var generated ved måling af fluorescensintensiteten for kendte koncentrationer af protoplaster fra systemet. Standardkurven var en god pasform (R 2 = 0,967) med det samlede antal protoplaster spænder intervallet fra 0 til 30.000 protoplaster per brønd. For at validere standardkurven, fluorescensintensiteten af prøver med et kendt antal protoplaster (8,125 og 24.375 beregnet ved anvendelse af et hæmocytometer) blev opnået, og antallet af protoplaster beregnet ud fra ligningen for standardkurven. Baseret på disse resultater, standardkurven forudsagte 9,560 og 28,200 protoplaster i hver brønd, 15 og 14% fejl. I betragtning af at der også variabilitet i måling af celleantallet ved anvendelse af et hæmocytometer, blev fejlen fundet acceptable.
Ud over resultaterne af celletallet og levedygtighed, omdannelsen protokol var vellykket til at generere transgene celler, der udtrykker OFP (figur 2D - F). Desværre den anvendte protokol resulterede i lav, ~ 2%, transformationseffektivitet på grund af den store 16.028 bp binære plasmid anvendt i denne undersøgelse, og da protokollen blev ikke optimeret specielt til BY-2 protoplaster. Optimering af omdannelsen protokol, i form af reagenser og betingelser specifikt for BY-2 protoplaster, forventes at øge omdannelsen effektivitet, som belyst i diskussionen. Med hensyn til denne protokol, blev proceduren transformation designet til at demonstrere proof-of-concept sti fra protoplast isolation til transformation, og var en succes med at nå dette mål.
Efter en vellykket validering alle de enkelte procedurer, blev målinger opnået for tidsforløbet af protokollen fra protoplast isolation til transformation. Som vist i figur 4, er den store investering af tid, der under fordøjelsen fase, hvori 3 timer var påkrævet for fuldstændig fordøjelse af cellevæggen og frigivelse af protoplaster. Under denne procedure er 18 løkker køre mellem pladeryster og pladeopvarmningsindretning / køleren 1 inkubation station, med pladen mover bevæge pladen mellem de to stationer. Køretiden mellem pladen shaker og plade varmer / køler 1 tager kun 8,9 sekunder, og sikrer, at størstedelen af fordøjelsen procedure er brugt inkubere og ryste. Den samlede tid fra indledningen af proceduren til at fuldføre belastning af enzymer ved multi-mode dispenser er 2,2 min. Samlet set er fuldstændig protoplastisolering protokol afsluttet i 3 timer og 22,8 min. Baseret på disse resultater, er 88% af protoplastisolering protokol brugt fordøje. Efter afslutning af protoplastisolering protokollen, er omdannelsen protokollen indledes og afsluttes inden for 27,5 min. Svarende til protoplastisolering protokollen, er 72% af transformation procedure brugt inkubere reaktionen. Den eneste anden trin i protokollender har en betydelig tid komponent (> 10% af den samlede procedure tid) er initialisering af protokollen af det automatiske væskehåndterende platform, som tegner sig for 14% af den samlede tid i proceduren. På denne måde er 86% af den protokol tilbragt i initialisering og inkubering med kun 14% af tiden brugt på pipettering og overførsel trin. Den komplette varighed protoplastisolering og transformation var 3 timer, 50 minutter og 53 sekunder, uden ekstern indgang kræves fra operatøren.
Figur 1:. Skematisk af robot platform og konfiguration af automatiserede væskehåndtering platform under protokol (A) robotsystem er sammensat af 3 plade stakke / hoteller, der kan tilgås af pladen mover. Hotel 1 er den udpegede låg / delidding station, Hotel 2 er den 96-brønd fluorescerendepladestabelen, og Hotel 3 er den 6-brønds plade stack. Systemet har to væskehåndteringsudstyr, en automatiseret væskehåndtering platform, og en dyse-baserede multi-mode dispenser. Til opvarmning / afkøling af robot platform har to plade opvarmning / nedkøling enheder, sammen med en pladeryster til blanding pladen. Endelig har systemet en monochromator-baserede pladelæser til måling af fluorescens. Alle komponenter er anbragt i en specialbygget biosikkerhed kabinet. (B) Start konfiguration af automatiserede håndtering platform væske med reden 2 besat af reagenset pladen og spidsen boksen placeret på reden 8. (C) Konfiguration af håndtering platform automatiseret væske før kalde en forsøgsprotokol. En dyb brønde ligger på reden 4, er en 96-brønds fluorescerende screening plade placeret på reden 6, og den 6-brønds plade indeholdende protoplaster ligger på reden 5. Klik her for at v iew en større version af dette tal.
Figur 2: Repræsentative billeder af BY-2 protoplaster efter hver overførsel og efter transformation med den orange fluorescerende protein reporter gen (A - C) mikrografier af BY-2 protoplast densitet i 6-brønds plade, plade med 96 brønde efter overførsel af 70. pi fra 6-brønds plade, og 96-brønds fluorescerende screening plade post-transformation. (D) Lysfelt mikrograf af BY-2 protoplaster efter transformation. (E) Fluorescerende BY-2 protoplast udtrykker OFP genet visualiseret under anvendelse af et Cy3 / TRITC filtersæt. (F) Overlay af lysfelt og fluorescerende mikrofotografier demonstrerer den lave transformationseffektivitet. Scale bar = 50 um. target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Standardkurve for at beregne antallet af protoplaster Antallet af protoplaster i en given brønd kan beregnes ved at sammenligne den fluorescensintensitet, i arbitrære enheder (AU), til ligningen for standardkurven. Validering af protoplast tal blev sammenlignet mellem standardkurven og hæmocytometer på det angivne sted på grafen, med 9,561 protoplaster identificeret fra pladen læseren og 8125 optalt på hæmocytometeret. Samlet set blev der fundet en fejl på 15% mellem de to teknikker. Klik her for at se en større version af dette tal.
re 4 "src =" / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Figur 4:. Gantt-diagram for den beskrevne procedure for produktion af BY-2 protoplaster og genetisk transformation Hovedparten af protokollen, ~ 3 timer, bliver brugt på fordøjelse af BY-2-celler til at generere protoplasterne. Lastning af enzymopløsningen og inaktivering kræver kun 12% af den samlede procedure tid. Tilsvarende inkubation af omdannelsen reaktion på pladeryster står for 72% af omdannelsen protokollen. Samlet set proceduren fra protoplast isolation indtil genetisk transformation er opnået er under 4 timer (3 timer, 50 minutter og 53 sekunder). Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Fil: Automatiserede protokoller til protoplastisolering, celletælling, og PEG-medieret transformation <./ strong> Komplette protokoller udviklet til brug i den robot platform til at udføre hver af de opgaver, der er anført ovenfor, er inkluderet i denne fil. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den ovenfor beskrevne protokol er blevet valideret for protoplast isolation, tælling, og transformation ved hjælp af BY-2 tobak suspension cellekultur; kunne dog protokollen let udvides til enhver plante suspension kultur. På nuværende tidspunkt har protoplast isolation og transformation er opnået i en lang række planter, herunder majs (Zea mays) 10, gulerod (Daucus carota) 32, poppel (Populus euphratica) 33, drue (Vitis vinifera) 34, oliepalmer (Elaeis guineensis) 35 , salat (Lactuca sativa) 36, sennep (Brassica juncea) 37, ris (Oryza sativa) 38, og præriegræs (prærie-hirse) 39,40. Mens variation i kultur og fordøjelse forhold forekommer fra art til art, med hensyn til protokol udviklet i dette arbejde, der erstatter dyrkningsmedier eller ændre betingelserne for gravekombination af ovenstående bør ikke ændre den grundlæggende protokol. For at tilpasse sig forskellige arter, dyrkningsmedier og enzymer, der er nødvendige for fordøjelsen er indlæst af operatøren før initialisering af protokollen, således at bytte disse komponenter er trivielt. Som en ekstra fordel, er protokollen amendable at screene adskillige spaltningsbetingelser med udbyttet af protoplaster målt af systemet. Dette er et væsentligt element, som brugen af billige enzymer er nødvendige for high-throughput applikationer, derfor er det vigtigt at minimere mængden af enzymer anvendt i fordøjelsen.
Svarende til kultur og fordøjelse, vil ændringer af transformation protokollen kræves ved vedtagelsen af det system til transformation af protoplaster isoleret fra forskellige plantearter. Stort arbejde er blevet udført på optimering af PEG-medieret transformation i planteprotoplaster 16,35, med mange faktorer, der påvirker effektiviteten af transformation. I den nuværende work en begrænsende faktor, der påvirker transformationseffektivitet var den store størrelse af det binære test plasmid, 16.028 bp, som blev anvendt med henblik på at modellere et genom-redigering plasmid størrelse. I tidligere undersøgelser af PEG-medieret transformation af BY-2 protoplaster, der er opnået 40-60% omdannelse; Men disse undersøgelser anvendte små 5.000 bp plasmider 41,42. De primære ændringer PEG-medieret transformation blandt arter omfatter koncentrationen af PEG og MgCl2, mængde og koncentration af DNA, og reaktionen varighed. Som PEG og MgCl2 opløsninger indføres i systemet på reagenset plade, og DNA'et er forinstalleret i den dybe brønde, kan disse betingelser let modificeres i protokollen beskrevet ovenfor. Derudover forøgelse eller formindskelse af inkubationstiden, sammen med modifikation af blandingszoner hastigheder, kan styres præcist ved robotic platform. Den nuværende begrænsning af transformationsprotokol er manglentil screening ved anvendelse pladelæseren at detektere fluorescerende reporter, på grund af den lave effektivitet af PEG-medieret transformation i BY-2 protoplaster. I andre arter, såsom Arabidopsis thaliana og majs 16, PEG-medieret transformation er 40-90% effektiv. I sådanne systemer transformanter hurtigt kan karakteriseres ved anvendelse pladelæseren på robotten. Det ville således være muligt at identificere brønde med positive transformanter, og også kvantificere niveauet af ekspression. For applikationer, såsom promotor screening, vil denne funktion øger anvendeligheden af den nuværende protokol, og vil blive tilføjet i senere gentagelser af systemet.
Udover optimering af transformationseffektivitet for BY-2 protoplaster kan adskillige modifikationer øge effektiviteten og den samlede gennemløb af systemet. Tidligere undersøgelser af automatisering af protoplasttransformation tilladt protoplaster at sedimentere til bunden af brøndene, før tilsætningen af varh løsninger 43. I den nuværende protokol, blev protoplaster blandet på pladen shaker at forhindre bundfældning og holde protoplasterne i suspension ved hjælp fladbundede brønde. Desuden skal der ved transformation, protoplaster fik ikke lov til at bosætte sig i de dybe brønde, for at reducere eksponeringen for PEG, som kan være giftige i længere tids påvirkning. Som sådan blev protoplasterne fortyndet ~ 10 fold med W5-opløsning, når de overføres fra den dybe brønd pladen til 96-brønds fluorescerende screening plade, hvilket resulterer i 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 1 protoplaster per brønd. For at øge antallet af protoplaster overført efter transformation, kunne tilføjes et inkubationstrin at tillade protoplasterne sætter sig, og supernatanten blev fjernet efterfulgt af tilsætning af et mindre volumen af væske ved-2-medier. Desuden, hvis en plade-baseret centrifuge blev tilsat til systemet, dette trin kunne opnås hurtigere. En anden ændring, der kan tilføje funktionalitet til than system ville være anvendelsen af en levende / død fluorescens assay til bestemmelse af levedygtigheden af de isolerede protoplaster før transformation. I den nuværende protokol blev fluoresceindiacetat (FDA) testet som en levende farvestof; imidlertid protoplast baggrundsfluorescens BY-2 tilsløret FDA signal. Hvis der blev anvendt en mere stabil levedygtighed farvestof, så protoplast levedygtighed kunne bestemmes som forholdet mellem rød (PI) til grøn (Calcein AM, etc.) fluorescens, og standardiseret ligner celletælling protokollen den. Disse ændringer vil tilføje yderligere funktionalitet til systemet, og vil indgå i fremtidige protokoller.
Med hensyn til den nuværende protokol, der er flere kritiske trin, der skal følges for at sikre en vellykket gennemførelse af protokollen. Først alder / sundhed BY-2 kulturer er afgørende for at sikre, at levedygtige protoplaster kan isoleres til efterfølgende trin. Som forklaret i trin 1.3, ved at overføre en log fase kultur til en frisk kolbe ved en01:50 forhold mellem celler til frisk medium, og tillade kulturen at vokse i 5-7 dage, kan det maksimale antal af levedygtige protoplaster isoleres. Tillade kulturerne til at vokse i kortere eller længere varighed ved hjælp af den angivne inokulum vil reducere protoplast udbytte, og forårsage svigt af efterfølgende protokoller. Et andet afgørende skridt er trin 1.5, da brugen af standard pipettespidser, i stedet for de brede boring pipettespidser angivne vil få tips til at tilstoppe og føre til de forkerte mængder bliver overført. Med hensyn til opsætning af robotsystemet, arrangementet af plader på automatiseret håndtering platform væske, trin 2.4, er kritisk, med en modificeret opstilling forhindrer hovedet af den flydende handleren i at nå alle brønde på 6-brønds plade. Som følge af udformningen af det automatiserede væskehåndterende platform, skal pladen 6-brønds placeres i nest 5 eller protokoller udvalgt til dette instrument vil mislykkes. Tilsvarende vil en manglende definere laboratorieudstyr korrekt i pladenmover software, trin 2.2, vil medføre, at instrumentet til at mislykkes at få fat i, eller tabe laboratorieudstyr resulterer i opsigelse af protokollen. For celletal protokollen, det kritiske trin involverer fiksering af cellerne med ethanol, trin 3.2. Hvis cellerne ikke er faste før mærkning med PI, kun ikke-levedygtige celler vil blive mærket, i stedet for hele befolkningen i protoplaster, og det vil ikke være muligt at tælle antallet af protoplaster isolerede. Det endelige kritiske trin, trin 4.6, involverer udvælgelse af de fluorescerende filtre til mikroskopisk analyse af ekspressionen af pporRFP fluorescerende markør. Anvendelse af andre "røde" filtersæt muliggør baggrundsfluorescens fra klorofyl, en væsentlig forøgelse af signalet i alle chloroplastholdige protoplaster, forhindrer beregning af transformationseffektiviteten. Omhyggeligt overholde specifikationerne i disse kritiske trin garanterer den største mulighed for succes og generering af de mest reproducerbare dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
