Summary
En høy gjennomstrømming, automatisert, tobakk protoplast produksjon og transformasjon metodikk er beskrevet. Den robotsystem gjør massivt parallell genekspresjon og funn i modellen BY-2 system som skal være oversettes til ikke-modellen avlinger.
Abstract
I løpet av det siste tiåret har det vært en oppblomstring i bruk av planteprotoplaster som spenner fra modellarter for å beskjære arter, for analyse av signaloverføringsveier, transkripsjonsregulerende nettverk, genekspresjon, genom-redigering, og gene-demping. Videre har betydelige fremskritt er gjort i regenerering av planter fra protoplaster, som har generert enda mer interesse i bruken av disse systemene for plantegenomforskning. I dette arbeidet har en protokoll utviklet for automatisering av protoplast isolasjon og transformasjon fra en "Bright Yellow '2 (BY-2) tobakk suspensjonskultur ved hjelp av en robot plattform. De transformasjonsprosedyrer ble validert ved bruk av et oransje fluorescerende protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) under kontroll av blomkål mosaikkvirus 35S-promotoren (35S). OFP uttrykk i protoplaster ble bekreftet av epifluorescence mikroskopi. Analyser også inkludert protoplast produksjon effektivitet metoder ved hjelp propidium jod. Til slutt ble lavkost mat-grade enzymer brukes til protoplasten isoleringsprosedyren, omgå behovet for laboratorie vurder enzymer som er kostnads uoverkommelige i high-throughput automatisert protoplast isolasjon og analyse. Basert på den protokoll som er utviklet i dette arbeidet, kan hele prosedyren fra protoplast isolasjon til transformasjon utføres i henhold til 4 timer, uten noen inndata fra operatør. Mens protokoll utviklet i dette arbeidet ble validert med BY-2 cellekultur, bør de prosedyrer og metoder være settes til alle anlegg suspensjon kultur / protoplast system, som skal gjøre det mulig akselerasjon av avlingsgenomforskning.
Introduction
I de senere årene har det vært en betydelig drivkraft plassert på utformingen av transgene avlinger til å overvinne ulike sykdommer 1, gi gave til ugressmiddel motstand 2, jf tørke 3,4 og salttoleranse 5, forhindre herbivory 6, øke biomassen utbyttet 7, og redusere celleveggen recalcitrance 8. Denne trenden har blitt hjulpet av utviklingen av nye molekylære verktøy for generering av transgene planter, inkludert genom-redigering med CRISPR og Talens 9, og genet stanse gjennom dsRNA 10, miRNA 11, og siRNA 12. Selv om disse teknologiene har forenklet generering av transgene planter, har de også opprettet en flaskehals, der det store antallet av transgene planter som genereres kan ikke bli vist ved hjelp av tradisjonelle systemer som er avhengige av plante regenerering. Relatert til dette flaskehalsen, mens tie og genom-redigering konstruksjoner kan raskt settes inn planter, mange avmålrettede egenskaper mislykkes i å gi den ønskede effekten, som ofte ikke oppdages før plantene er analysert i drivhuset. I dette arbeidet har vi utviklet en metode for rask, automatisert, high-throughput screening av planteprotoplaster, spesielt for å møte den nåværende flaskehals tidlig screening av et stort antall genom-redigering og genet Slå mål.
Bruken av protoplaster, i motsetning til intakte planteceller, har flere fordeler for utvikling av en automatisert plattform. Først blir protoplaster isoleres etter oppslutning av plantecelleveggen, og med denne barrieren ikke lenger er til stede, er transformasjonseffektiviteten økes 13. I intakte planteceller er det bare to godt etablerte metoder for transformasjon, biolistics 14 og Agrobacterium-formidlet transformasjon 15. Ingen av disse metodene kan lett oversettes til væskehåndtering plattformer, som biolistics krever spesialisert utstyr for transformation, mens Agrobacterium-formidlet transformasjon krever ko-kultur og etterfølgende fjerning av bakteriene. Verken er mottagelig for høy gjennomstrømning metoder. I tilfelle av protoplaster, blir transformasjonen rutinemessig utført ved bruk av polyetylenglykol (PEG) -mediert transfeksjon 16, som bare krever flere løsnings utveksling, og er ideelt egnet for væskehåndtering plattformer. For det andre protoplaster, ved definisjon, er enkelt-cellekulturer, og dermed de problemer som er forbundet med klumpdannelse og kjededannelse i plantecellekulturer, ikke blir observert i protoplaster. I form av rask screening ved hjelp av en plate-baserte spektrofotometer, klumper av celler eller celler i flere plan vil føre til vanskeligheter med å skaffe konsistente målinger. Siden protoplaster er også tettere enn deres kulturmedia, de sedimentere til bunnen av brønner, å danne et monolag, som er rette for platebasert spektrofotometri. Til slutt, mens plantecellesuspensjonskulturer er Primarily avledet fra callus 17, kan protoplaster høstes fra en rekke plantemateriale, som fører til evnen til å identifisere vev-spesifikk ekspresjon. For eksempel, evnen til å analysere rot-eller blad-spesifikk ekspresjon av et gen som kan være svært viktig for fenotype forutsigelse. Av disse grunner ble protokollene utviklet i dette arbeidet validert ved bruk av protoplaster isolert fra den mye brukte tobakk (Nicotiana tabacum L.) «Bright Yellow '2 (PR-2) suspensjonskultur.
Den BY-2 suspensjonskultur er blitt beskrevet som "HeLa" celle fra høyere planter, på grunn av dens utbredte anvendelse ved molekylær analyse av planteceller 18. Nylig, AV-2 celler har blitt brukt til å studere effekter av stressfaktorer 19-22, intracellulær protein lokalisering 23,24, og grunnleggende cellebiologi 25-27 demonstrere bred nytten av disse kulturene i plantebiologi. En ekstra fordel av PR-2 kulturer erevne til å synkronisere kulturene med aphidicholin, noe som kan føre til forbedret reproduserbarhet for genuttrykkstudier 28. Videre fremgangsmåter er blitt utviklet for utvinning av PR-2-protoplaster ved hjelp av rimelige enzymer 29,30, som enzymer som tradisjonelt brukes for generering av protoplaster er kostnads prohibitive for high-throughput-systemer. Som sådan har den protokoll som er beskrevet nedenfor blitt validert ved hjelp av PR-2 suspensjonskultur, men det bør være amendable til en hvilken som helst plante cellesuspensjonskultur. Proof-of-concept eksperimenter er utført ved hjelp av et oransje fluorescens protein (OFP) reporter-gen (pporRFP) fra den harde koraller Porites porites 31 under kontroll av CaMV 35S-promotoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Etablering av Suspension cellekulturer
- Fremstille flytende BY-2-medier ved tilsetning av 4,43 g Linsmaier & Skoog Basal Media, 30 g sukrose, 200 mg KH 2PO 4, og 200 ug av 2,4-diklorfenoksyeddiksyre (2,4-D) til 900 ml destillert vann og pH-verdien til 5,8 med 0,1 M KOH. Etter justering av pH-verdien, justere sluttvolumet til 1000 ml med destillert vann og autoklav. Media kan lagres opp til 2 uker ved 4 ° C.
- Inokulere en 250 ml Erlenmeyer-kolbe med 100 ml flytende PR-2-medier og et enkelt stykke PR-2 callus (> 1 cm i diameter) dyrket på fast stoff ved-2 medium (væske BY-2-medier med tilsetning av 1% agar) og forsegle med aluminiumsfolie. Inkuber kultur ved 28-30 ° C med risting i 5 dager.
MERK: BY-2 callus holdes på faste medier for langtidslagring, som flytende kulturer vil raskt overgrow. Kulturvolumet kan justeres etter behov, typisk en 100 ml kultur vil være i stand til å laste trettitre 6-well plater. - Overfør 2 ml log fase BY-2 kultur til 98 ml fersk BY-2 media og inkuber i 5-7 dager ved 28-30 ° C med risting.
MERK: Sub-dyrkning av etablerte væskekulturer kan utføres regelmessig med 1: 100 fortynninger av 5-7 dager gamle kulturer, i stedet for inokulering med callus. - Bland grundig kultur, som celler vil raskt avgjøre, og overføring 6 ml av cellekultur i et 15 ml konisk sentrifugerør bunn og la cellene slå seg i minst 10 min. Juster pakket cellevolum til 50% av det totale volum ved å fjerne supernatanten.
- Rist røret ved invertering og Pipetter 500 ul i hver brønn av en 6-brønns plate for fordøyelsen. Bruk wide-bore pipetter for å overføre cellene på dette stadiet, som de er tett og vil tette standard pipettespisser.
2. Protoplast Isolation
- Slå på alle komponentene i robotsystem (figur 1A) og åpne plate mover aktivitetsplanlegging mykware. Oppgaven planlegging program integrerer mikro mover med annet utstyr for å muliggjøre overføring av plater mellom hver del av utstyret.
- Før eksperimentering, definere de tekniske spesifikasjonene for laboratorie-utstyr (for eksempel plater, lokk) som brukes i protokollen, samt start og slutt posisjoner for hver del av laboratorie-utstyr, i platen mover programvare, som følger:
- Klikk Oppsett på hovedverktøylinjen i platen mover programvare og velg Manage Container Typer kommando.
- Hvis containertype er oppført i eksisterende containertype bibliotek, velg deretter riktig container.
- Hvis beholderen typen ikke er oppført i eksisterende containertype bibliotek klikk deretter Legg til for å angi en ny container type.
- Etter å legge en ny containertype, setter dimensjonene på den nye beholderen (høyde, bredde, stable dimensjoner, og gripe offset) i de aktuelle kategoriene og klikker på Lagre.
- Hvis de riktige dimensjoner er ikke tilgjengelig fra produsenten, så nøyaktig bestemme alle dimensjoner til nærmeste millimeter ved hjelp av målepunktene. Feil i målebeholderens dimensjoner vil resultere i svikt av platen mover.
- Gjenta trinn 2.2.2 gjennom 2.2.4.1 for alle containertyper at platen mover vil møte. Etter fullføring av dette trinn for alle laboratorie, er det nødvendig å definere start og slutt sted for hver beholder (trinn 2.2.6).
MERK: For denne protokollen labware omfatter seks-brønns plate, den dype brønnen plate, og den 96-brønnen fluorescerende screening plate. - For å definere start og sluttposisjon for hver container, klikk på fanen Start / End i en spesifikk protokoll. Først velge startposisjon for hver container. Neste, sjekk boksen for lokk / Unlidded på både start og sluttposisjon. Gjenta for alle beholdere.
MERK: Hvis beholderen vil bli liggende på en annen del av utstipment (i stedet for platen mover) slutt plassering kan stå tomt.
- På dette stadiet laste alle platene manuelt i startposisjonen for hele arbeidsflyten. Laste de 96-brønners fluoriserende avskjermingsplatene inn i Hotel 2, 6-brønns plater med PR-2-celler til 3, en 96 dyp-brønns plate som skal brukes for transformasjon på tallerkenen varme- / kjøle reir 2, og en 50 ml konisk tube som inneholder den enzymløsning (se Opplysning Fil, avsnitt 1.2.2) på flermodusdispenser.
- Dersom transformasjonen blir utført i protokollen, pre-load 96 dyp-brønners plate med 10 ul av plasmid DNA per brønn (1 ug / ul, A 260/280> 1,8) inneholdende OFP reporter-konstruksjonen og inkuber på plate varmeapparat / chiller ved 4 ° C. Hver brønn vil bli brukt for en enkelt transformasjon, og dermed antallet brønner fylt, vil avhenge av det eksperimentelle oppsett.
- Last alle forsyninger og plater på automatisered væskehåndtering plattform på anviste steder og definere posisjonen til hvert element i automatisering kontroll programvare (figur 1B).
- Laste en 96-brønns plate forhåndslastet med 200 ul 40% PEG i MMG (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) i kolonne 1, 200 ul av propidiumjodid (PI, 1 ug / ml) i kolonne 2, og 200 ul etanol i kolonne 3 (reir 2), og en boks av pipettespisser i reiret 8.
- For å definere plasseringen av laboratorie-utstyr i den automatiserte væskehåndtering plattform programvare, velger du Verktøy fra menyen og klikk laboratorium Editor.
- Velg typen laboratorie-utstyr fra nedtrekksmenyen eller definere et nytt laboratorie type ved hjelp av nye laboratorium knappen.
- Definer posisjonen til hver del av laboratorie valgt ved å velge fanen Hoved-protokollen og klikke Konfigurer laboratorium. Sørg for at hver del av laboratorie-utstyr plassert på den automatiserte væskehåndtering plattform erdefineres før du kjører protokollen.
- For å utløse automatiske protokoller, klikker du på Explorer-vinduet profil og velg navnet på protokollen som skal kjøres (Protoplast Isolation, celletall, og PEG-mediert transformasjon).
- Klikk Kjør for å initialisere alle enheter som skal brukes i protokollen.
- Til slutt, i arbeid Explorer-vinduet, klikk på Legg Work Unit for å verifisere alle beholdere / laboratorie-utstyr i systemet og begynne den automatiserte protokollen.
MERK: Full beskrivelser av automatiserte protokoller finnes i Supplemental fil.
3. Etablere standardkurve for celletall
- Manuelt konsentrere protoplaster ved en konsentrasjon på 1 x 10 6 protoplaster / ml i et volum på 1 ml. Sentrifuger protoplaster ved 1000 xg i 10 min, og fjern supernatanten.
- legge til 900 ul av 70% ethanol (holdt ved 4 ° C) manuelt til protoplasten pelletog re-suspendere pellet. Inkuber i 10 min på is for å fikse celler.
- Tilsett 100 PI (1 pg / ml) til protoplastene å merke kjerner og tillater påvisning av den plateleser.
- Load 80 mL av væske BY-2 media i hver kolonne og rad på 96-brønnen fluorescerende screening plate starter på kolonne 2.
- I kolonne 1 i en 96-brønns fluorescerende screening plate tilsettes 70 mL av protoplaster og 50 ul BY-2-medier til hver brønn i kolonnen.
- Sett platen i reiret 6 av den automatiserte væskehåndtering plattform, og kjøre en to-gangers seriell fortynning.
- For å gjennomføre en seriell fortynning på automatiserte væskehåndtering plattform, klikker du på Start Wizard Serial fortynning og justere overføringsvolum (60 mL), antall mikser og volum (2, 70 mL), innledende brønner (kolonne 1, Rader AF), fortynning brønner (Søyler 2-11, Rows AF), og aspirer og dispensere egenskaper (0,5 mm fra bunnen av brønnen).
- Etter å ha satt parametrene, lagre etd kjøre protokollen.
MERK: Ettersom alle protoplaster er merket med PI (på grunn av fiksering av celler), er fluorescens i forhold til protoplasten konsentrasjon. - Etter serie fortynning er ferdig, fjerne platen fra reiret 9 og sett inn i plateleser og kjøre standardkurven protokoll i plateleser programvare.
MERK: En standard kurve vil da bli generert ved å sammenligne fluorescensen fra PI (eksitasjon 536 nm / emisjon 620 nm) i hver brønn med den kjente protoplasten konsentrasjon.
- Ved fullførelse av plateavles protokollen, fjerne platen og samle eventuelle transgene celler for autoklavering eller andre de-vitaliserfremgangsmåter som definert i biologisk protokoller '.
4. mikroskopisk analyse av Transformation
- Fjern plate med transformerte protoplaster (produktet av Automated protokoll 3, Opplysning-fil) fra Hotel ett av robotsystemet.
- Svingpå invertert mikroskop, kamera, og lysrør.
- Velg 10X objektiv for innledende fokus på protoplaster, slå på halogenlampe, og lukke lukkeren for lysrøret.
- Load plate på mikroskopisk system og fokus på protoplaster ved hjelp av lysfelt.
- Etter å ha fokusert på protoplaster, slå av halogenpære og åpne lukkeren for lysrøret.
- Velge den Cy3 / TRITC filtersett for visualisering av pporRFP-proteinet uttrykt ved transgene protoplaster.
- Skann hver brønn for å bestemme antall protoplaster uttrykker pporRFP fluoriserende fargestoff.
- Beregn transformasjonseffektiviteten som det totale antall av protoplaster som uttrykker den fluorescerende markør det totale antall protoplaster.
- Samle noen plater som inneholder transgene celler i godkjent biologisk poser for autoklave eller andre de-vitalisering prosedyrer som er definert i biosikkerhet protokoller ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I denne studien, doblings frekvensen av PR-2 varierte 14-18 timer avhengig av temperaturen ved hvilken kulturene ble inkubert, i samsvar med tidligere rapporter om en midlere cellesykluslengde av 15 timer. Med denne dobling hastighet, en 1: Det ble 100 starter inokulum anvendt for å initiere kulturer, noe som fører til kulturene med en pakket cellevolum (PCV) av 50% i 5-7 dager. I den nåværende protokoll, i hvilket kulturer ble dyrket i 200 ml medium, ble en hematokrit på 100 ml ble generert på 7 dager, som ga nok celler til å fylle 33 6-brønns plater. I form av protoplast yield, fordøyelse på de vilkår som er angitt i protokollen genererte 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplaster per brønn, noe som resulterer i 2,82 x 10 6 protoplaster per seks-brønns plate (figur 2A). Basert på disse dataene, kan 214 96-brønners plater (70 mL av protoplaster per brønn) lastes fra en enkelt seks-brønns plate fordøyelsen, med potensial for to 6-brønns plater til å bli spaltet samtidig, ved å benytte de to platevarmer / chiller stasjoner. Dermed maksimalt antall protoplaster som kan genereres i løpet av en tre-timers fordøyelsen protokollen er 5,64 x 10 6.
Mens det totale antall protoplaster som genereres pr fordøyelse protokoll gir en beregning for systemet, er det også nødvendig å vurdere de tap i protoplasten konsentrasjon som protoplastene blir overført gjennom de forskjellige trinnene i protokollen. Som sådan, ble konsentrasjonen av protoplaster evalueres etter hvert overføringstrinn i protokollen. Etter fordøyelse protokollen, ble 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplastene overført til hver brønn i 96-brønners plater dype, hvis gjennomfører omformingen protokollen, eller 96-brønners fluorescerende screening platen (figur 2B). Når forvandlingen protokollen ble fullført, 1,23 x 10 3 ± 4.66 x10 en protoplaster ble overført til 96-brønners fluorescerende silplaten (figur 2C). I tillegg til antallet av protoplaster som overføres, var det viktig å bestemme levedyktigheten av protoplastene for å sikre at flere pipettering trinn ikke skade protoplaster.
Basert på resultatene fra analysen levedyktighet, 95,1 ± 0,04% av protoplaster var levedyktige etter fordøyelse, 92,1 ± 0,06% etter overføring til 96-brønns plate fluorescerende screening, og 91,7 ± 16,67% etter transformasjonen protokollen. Til tross for flere pipetteringstrinn, var det ingen signifikant forskjell (p> 0,44) mellom noen av prøvene. I tillegg til denne måling av levedyktighet, ble en protokoll utviklet for å bestemme konsentrasjonen av protoplaster på et hvert trinn av fremgangsmåten ved å måle det totale antall protoplaster farget med PI. Som vist i figur 3, er en standard kurve ble generated ved å måle fluorescens-intensitet for kjente konsentrasjoner av protoplaster fra systemet. Standardkurven var en god passform (R2 = 0,967) med det totale antall protoplaster som spenner over området fra 0 til 30 000 protoplaster pr brønn. For å validere standardkurven, fluorescensintensiteten av prøver med et kjent antall protoplaster (8125 og 24 375 beregnet ved hjelp av et hemocytometer) ble erholdt, og antall protoplaster beregnet fra ligningen for standardkurven. Basert på disse resultatene, spådde standardkurven 9,560 og 28,200 protoplaster i hver brønn, 15 og 14% feil. Tatt i betraktning at det også er variasjoner i måling av celletallet ved hjelp av et hemocytometer, ble dette ansett som akseptabelt feil.
I tillegg til resultatene av celletallet og levedyktigheten, transformasjonsprotokollen var vellykket i å generere transgene celler som uttrykker OFP (figur 2D - F). Dessverre er den protokoll som brukes resulterte i lav, ~ 2%, transformasjon effektivitet, på grunn av den store 16 028 bp binært plasmid anvendt i denne studien, og siden protokollen ble ikke optimalisert for PR-2-protoplaster. Optimalisering av transformasjonen protokollen, i form av reagenser og betingelser spesielt for BY-to protoplaster, er forventet å øke transformasjon effektivitet, som belyst i diskusjonen. I forhold til denne protokollen, ble transformasjon prosedyre utviklet for å demonstrere proof-of-concept banen fra protoplast isolasjon til transformasjon, og lyktes i å oppnå dette målet.
Etter vellykket validere alle de individuelle prosedyrer, ble verdier oppnådd for tidsforløpet av protokollen fra protoplast isolasjon til transformasjon. Som vist i figur 4, er den stor investering av tid brukt under fermenteringstrinnet, hvori 3 timer var nødvendig for fullstendig spaltning av celleveggen og frigjøring av protoplaster. Under denne prosedyren, er 18 løkker kjøre mellom plate shaker og platevarmer / chiller en inkubasjon stasjon, med platen mover flytte plate mellom de to stasjonene. Tiden overføring mellom plate shaker og platevarmer / chiller en tar bare 8,9 sekunder, og sørger for at flertallet av prosedyren fordøyelse er brukt ruger og risting. Den totale tid fra start av fremgangsmåten for å fullføre lasting av enzymene ved flermodus dispenseren er 2,2 min. Totalt sett er ferdig protoplast isolasjon protokollen gjennomført i tre timer og 22,8 min. Basert på disse resultatene, er 88% av det protoplasten isolasjonsprotokoll brukt fordøye. Etter fullførelse av protoplasten isolasjonsprotokoll, blir transformasjonen protokoll startet, og fullført i løpet av 27,5 min. I likhet med den protoplasten isolasjonsprotokoll, blir 72% av transformasjonsprosedyren brukt inkubering av reaksjonen. Den eneste andre trinn i protokollensom har en betydelig tid komponent (> 10% av den totale fremgangsmåte tid) er initialisering av protokollen ved automatisert væskehåndtering plattform, som står for 14% av den totale tid i prosedyren. På denne måten, blir 86% av protokollen brukt i initialisering og inkubasjon med bare 14% av tiden som brukes på pipettering og overføringstrinnene. Den fullstendige varighet av protoplast isolasjon og omdanning var 3 timer, 50 min, og 53 sek, uten ekstern inngang kreves fra operatøren.
Figur 1:. Skjematisk av robot plattformen og konfigurasjon av automatiserte væskehåndtering plattform under protokollen (A) Robotsystemet består av 3 plate stabler / hoteller som kan nås av platen mover. Hotel 1 er utpekt dekk / delidding stasjon, Hotel 2 er det 96 brønner fluorescerendeplatestabelen, og 3 er det seks-brønns plate stack. Systemet har to væskebehandlere, et automatisert væskehåndtering plattform, og en dyse-baserte multi-modus-dispenser. For oppvarming / avkjøling av robot-plattformen har to plate varme / kjøle enheter, sammen med en platerister for blanding platen. Til slutt, har systemet en monokromator basert plateleser for måling av fluorescens. Alle komponenter er plassert i en spesialbygget biosikkerhet kabinettet. (B) starter konfigurasjonen av automatiserte væskehåndtering plattform med reir to okkupert av reagens plate og spissen boksen plassert på nest 8. (C) Konfigurasjon av automatiserte væskehåndtering plattform før du ringer en forsøksprotokoll. En dyp-brønn plate ligger på reiret 4, er en 96-brønns fluorescerende screening plate ligger på reir 6, og seks-brønns plate som inneholder protoplaster ligger på reir 5. Klikk her for å v IEW en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Representative bilder av BY-2-protoplaster etter hver overføring og etter transformasjon med den oransje fluorescerende protein reporter-gen (A - C) Mikrografer av PR-2 protoplast tetthet i 6-brønns plate, 96-brønns plate etter overføring av 70. pl fra den 6-brønns plate, og 96-brønns fluorescerende silplaten post-transformasjon. (D) Lysfelt mikrograf av BY-2-protoplaster etter transformasjon. (E) Fluorescent BY-to protoplast uttrykker OFP genet visualisert ved hjelp av en Cy3 / TRITC filtersett. (F) Overlegg av lysfelt og fluorescerende mikrografer viser den lave effektiviteten av transformasjon. Scale bar = 50 mikrometer. target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 3: Standardkurve for beregning av antall protoplaster Antallet protoplaster i en gitt brønn kan beregnes ved å sammenligne den fluorescens intensitet, i vilkårlige enheter (AU), til ligningen for standardkurven. Validering av protoplasten tall ble sammenlignet mellom standardkurven og hemocytometer ved det punkt som er angitt på diagrammet, med 9,561 protoplaster som er identifisert fra de plateavleseren, og 8125 telles på hemocytometer. Overall, en feil på 15% ble funnet mellom de to teknikkene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
re 4 "src =" / files / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Fig. 4: Gantt diagram for den beskrevne fremgangsmåten for fremstilling av PR-2-protoplaster og genetisk transformasjon Majoriteten av protokollen, ~ 3 timer, blir brukt på fordøyelsen av de BY-2-celler for å generere protoplaster. Lasting av enzymoppløsningen og inaktivering kreve bare 12% av den totale fremgangsmåte tid. Tilsvarende inkubering av transformasjonen reaksjon på platerister står for 72% av transformasjonsprotokollen. Totalt sett er prosedyren fra protoplast isolasjon til genetisk transformasjon oppnås etter 4 timer (3 t, 50 min, og 53 sek). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplemental Fil: Automatiserte protokoller for protoplast isolasjon, celletelling, og PEG-mediert transformasjon <./ strong> Komplette protokoller utviklet for bruk i robot plattform for å oppnå hvert av de oppgavene som er nevnt ovenfor er inkludert i denne filen. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet ovenfor har blitt validert for protoplasten isolasjon, telling, og transformasjon ved hjelp av PR-2 tobakksuspensjonscellekultur; imidlertid protokollen kan lett utvides til en hvilken som helst plante suspensjonskultur. I dag har protoplast isolasjon og transformasjon er oppnådd i mange planter, inkludert mais (Zea mays) 10, gulrot (Daucus carota) 32, poppel (Populus Euphratica) 33, drue (Vitis vinifera) 34, oljepalme (Elaeis guineensis) 35 , salat (Lactuca sativa) 36, sennep (Brassica juncea) 37, ris (Oryza sativa) 38, og switch (Panicum virgatum) 39,40. Mens variasjon i forhold kultur og fordøyelse oppstå fra art til art, i form av protokoll utviklet i dette arbeidet, erstatte kultur media eller endre betingelsene for digestion bør ikke endre den grunnleggende protokollen. For å justere for forskjellige arter, kulturmedier og enzymer som kreves for fordøyelsen blir lastet inn av operatøren før initialisering av protokollen, således bytte disse komponentene er triviell. Som en ekstra fordel, er protokollen amendable til screening flere fordøyelsen forhold med utbyttet av protoplaster målt av systemet. Dette er en vesentlig komponent, ettersom bruk av rimelige enzymer som er nødvendige for høy gjennomstrømning, og dermed er det viktig å minimalisere mengden av enzymer som brukes i fordøyelsen.
I likhet med kultur og fordøyelsen, vil endringer i transformasjonsprotokoll være nødvendig når adoptere systemet for transformasjon av protoplaster isolert fra forskjellige plantearter. Betydelig arbeid har blitt gjennomført på optimalisering av PEG-mediert transformasjon i planteprotoplaster 16,35, med en rekke faktorer som påvirker effektiviteten av transformasjon. I dagens work en begrensende faktor som påvirker transformasjonseffektiviteten var den store størrelsen av det binære test plasmid, 16028 bp, som ble brukt i forbindelse med modellering av en genom-redigering plasmid størrelse. I tidligere studier på PEG-mediert transformasjon av BY-2 protoplaster, har 40-60% transformasjon er oppnådd; Men disse studiene brukte små 5000 bp plasmider 41,42. De primære modifikasjoner til PEG-mediert transformasjon blant artene omfatter konsentrasjonen av PEG og MgCl2, mengden og konsentrasjonen av DNA, og reaksjonsvarighet. Som PEG og MgCl2-løsninger blir innført i systemet på reagenset plate, og den DNA er forhåndslastet inn i den dype-brønns plate, kan disse forholdene enkelt endres i den protokoll som er beskrevet ovenfor. I tillegg øke eller redusere inkubasjonstiden, sammen med modifikasjonen av blandehastigheter, kan kontrolleres nøyaktig ved robot plattformen. Den nåværende begrensning av transformasjonsprotokollen er mangelenav screening ved anvendelse av plateleser til å detektere fluorescerende reporter, på grunn av den lave effektivitet av PEG-mediert transformasjon i PR-2-protoplaster. I andre arter, for eksempel Arabidopsis thaliana og mais 16, er PEG-mediert transformasjon 40-90% effektiv. I slike systemer transformantene kan bli hurtig karakteriseres ved anvendelse av plateleser på roboten. Det ville således være mulig å identifisere brønner med positive transformanter, og også kvantifisere nivået av ekspresjon. For programmer, for eksempel promoter screening, vil denne funksjonen øke nytten av den aktuelle protokollen, og vil bli lagt i senere gjentakelser av systemet.
I tillegg til optimalisering av transformasjonseffektiviteten for BY-2-protoplaster, kan flere modifikasjoner øke effektiviteten og den totale gjennomstrømning av systemet. Tidligere studier på automatisering av protoplast transformasjon lov til protoplaster for å slå seg ned til bunnen av brønner før tilsetningen av varh løsninger 43. I den aktuelle protokoll, ble protoplaster blandet på platerister for å forhindre settling og holde protoplastene i suspensjon ved hjelp av flatbunnede brønnplater. Videre under transformasjon, protoplaster fikk ikke lov til å bosette seg i de dype-brønners plater, for å redusere eksponering for PEG, som kan være giftig i løpet av langvarig eksponering. Som sådan ble protoplastene fortynnet ~ 10 ganger med W5 oppløsning når de overføres fra den dyp-brønns plate til den 96-brønns fluorescerende screening plate, noe som resulterer i 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 1-protoplaster pr brønn. For å øke antall protoplaster som overføres etter transformasjon, kan en innkuberingstrinn tilsettes for å tillate at protoplastene for å sedimentere, og supernatanten ble fjernet, etterfulgt av tilsetning av et mindre volum av væske ved to-media. I tillegg, hvis en plate basert sentrifuge ble tilsatt til systemet, dette trinnet kan oppnås hurtigere. En annen endring som kan legge til funksjonalitet til than system ville være bruk av en levende / død fluorescens-analyse for å bestemme levedyktigheten av de isolerte protoplastene før transformasjon. I dagens protokollen, ble fluorescein diacetate (FDA) testet som en levende fargestoffer; imidlertid BY-to protoplast bakgrunnsfluorescens skjult FDA signal. Dersom et mer stabilt fargestoff levedyktighet ble anvendt, så protoplast-levedyktighet kan bestemmes som forholdet av rødt (PI) til grønt (Calcein AM, etc.) fluorescens, og standardisert i likhet med celletelling protokollen. Disse endringene vil legge ytterligere funksjonalitet til systemet, og vil bli inkludert i fremtidige protokoller.
Med hensyn til den gjeldende protokollen, er det flere viktige skritt som må følges for å sikre suksess for protokollen. Først er alder / helse av BY-2 kulturer avgjørende for å garantere at levedyktige protoplaster kan isoleres for etterfølgende trinn. Som forklart i trinn 1.3, ved å overføre en log fase kultur til en ny kolbe ved en01:50 forhold av cellene til friske media, og som tillater kulturen å vokse i 5-7 dager, kan det maksimale antall levedyktige protoplaster isoleres. Tillater kulturene til å vokse for lengre eller kortere varighet med den angitte podestoff vil redusere protoplasten yield, og føre til svikt i påfølgende protokoller. Et annet kritisk punkt er steg 1,5, siden bruk av standard pipettespisser, i stedet for brede Boret pipettespisser spesifisert, vil føre til at tips å tette og føre til feil volumene blir overført. Med hensyn til oppsett av robotsystem, tilrettelegging av platene på den automatiserte væskehåndtering plattform, steg 2,4, er kritisk, med en modifisert oppsett hindre hodet av væsken handler fra å nå alle brønner på seks-brønns plate. På grunn av utformingen av automatisert væskehåndtering plattform, må den seks-brønns plate plasseres i reir 5, eller protokoller som er valgt for dette instrumentet vil mislykkes. Tilsvarende, unnlatelse av å korrekt definere laboratorie i platenmover programvare, steg 2,2, vil føre til at instrumentet ikke klarer å hente, eller slippe labware resulterer i oppsigelse av protokollen. For den celletall protokollen, innebærer det kritiske trinn fiksering av cellene med etanol, trinn 3.2. Dersom cellene ikke er festet før merking med PI, bare ikke-levedyktige celler blir merket, i stedet for hele populasjonen av protoplaster, og det vil ikke være mulig å telle antall protoplaster isoleres. Det siste kritiske trinnet, trinn 4.6, innebærer valg av de fluoriserende filtre for mikroskopisk analyse av ekspresjonen av den pporRFP fluoriserende markør. Anvendelsen av andre "røde" filtersett gjør det mulig for bakgrunnsfluorescens fra klorofyll, betydelig økning av signal i alle chloroplast inneholdende protoplastene, hindrer beregning av transformasjonseffektivitet. Nøye å følge spesifikasjonene i disse kritiske trinn garanterer størst mulighet for å lykkes og generering av de mest reproduserbare datasettet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen å konkurrere økonomisk interesse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
