Summary
En hög genomströmning, automatiserad produktion och omvandling tobaksprotoplast metod beskrivs. Robotsystemet möjliggör massivt parallell genuttryck och upptäckter i modellen BY-2-systemet som ska kunna översättas till icke-modellgrödor.
Abstract
Under det senaste årtiondet har det skett ett uppsving i användningen av växtprotoplaster som sträcker sig från modellarter att beskära arter, för analys av signaltransduktionsvägar, transkriptionella regulatoriska nätverk, genuttryck, genomet redigering och gen-tyst. Dessutom har betydande framsteg gjorts när det gäller förnyelse av växter från protoplaster, som har genererat ännu mer intresse för användningen av dessa system för växtgenomik. I detta arbete har ett protokoll utvecklats för automatisering av protoplastisolering och omvandling från en "Bright Yellow '2 (BY-2) tobakssuspensionskultur med hjälp av en robot plattform. De transformationsförfaranden validerades med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) under kontroll av blomkålsmosaikvirus 35S-promotor (35S). OFP uttryck i protoplaster bekräftades av epifluorescensmikroskopi. Analyser ingår också protoplastproduktionseffektivitet metoder med användning propidium jodid. Slutligen var låga livsmedelskvalitet enzymer som används för protoplastisoleringsproceduren, kringgår behovet av labbkvalitet enzymer som är för dyra i hög genomströmning automatiserad protoplastisolering och analys. Baserat på protokoll som utvecklats i detta arbete, kan hela förfarandet från protoplastisolering transformation utföras i enlighet med 4 timmar, utan någon input från operatören. Medan protokoll som utvecklats i detta arbete har validerats med BY-2 cellkultur, bör de förfaranden och metoder kunna översättas till alla växter suspensionskultur / protoplastsystem, som skulle göra det möjligt acceleration av skörde genforskningen.
Introduction
Under de senaste åren har det skett en betydande drivkraft placeras på utformningen av genmodifierade grödor för att övervinna olika sjukdomar 1, förse herbicidresistens 2, ger torka 3,4 och salttolerans 5, förhindra herbivori 6, öka biomassa avkastning 7, och minska cellväggen motspänstighet 8. Denna trend har med hjälp av utveckling av nya molekylära verktyg för att generera transgena växter, inklusive genomet redigering med hjälp av crispr och Talens 9, och genen tysta genom dsRNA 10, miRNA 11, och siRNA 12. Medan dessa tekniker har förenklat generering av transgena växter, har de också skapat en flaskhals, där det stora antalet transgena växter som genereras inte kan screenas med användning av traditionella system som är beroende av växtregenerering. Relaterat till denna flaskhals, medan tysta och genomet-redigerings konstruktioner kan snabbt införas i växter, många av deriktade drag inte ger önskad effekt, som ofta inte upptäcks förrän växter analyseras i växthuset. I detta arbete har vi utvecklat en metod för snabb, automatiserad, high-throughput screening av växtprotoplaster, särskilt för att ta itu med den nuvarande flaskhalsen i början av screening av ett stort antal genomet redigering och geners uttryck mål.
Användning av protoplaster, i motsats till intakta växtceller, har flera fördelar för utveckling av en automatiserad plattform. Först är protoplaster isolerades efter digerering av växtcellväggen, och med denna barriär inte längre är närvarande, är transformationseffektiviteten ökas 13. I intakta växtceller finns det bara två väl etablerade metoder för transformation, biolistik 14 och Agrobacterium-medierad transformation 15. Ingen av dessa metoder kan lätt översättas till flytande plattformar hantering, som biolistik kräver specialutrustning för Transformation, medan Agrobacterium-medierad transformation kräver co-kultur och efterföljande avlägsnande av bakterierna. Varken är mottagliga för hög genomströmning metoder. I fallet med protoplaster, är transformation rutinmässigt användning av polyetylenglykol (PEG) -medierad transfektion 16, som endast kräver flera lösning utbyte, och är idealisk för flytande plattformar hantering. För det andra, protoplaster, per definition, är encelliga kulturer, och därmed de problem som är förknippade med klumpar och kedja bildning i växtcellodlingar, inte observeras i protoplaster. I termer av snabb screening med användning av en plattbaserad spektrofotometer, hopklumpning av celler, eller celler i flera plan kommer att leda till svårigheter i att förvärva konsekventa mätningar. Eftersom protoplaster är också tätare än deras odlingsmedier, de sedimenterar till botten av brunnar, som bildar ett monoskikt, vilket är gynnsamt för plattbaserad spektrofotometri. Slutligen medan växtcellsuspensionsodlingar är Primarily härrör från callus 17, kan protoplaster skördas från ett antal växtvävnader, vilket leder till förmågan att identifiera vävnadsspecifika uttryck. Till exempel, förmågan att analysera rot- eller bladspecifik expression av en gen kan vara mycket viktigt att fenotyp förutsägelse. Av dessa skäl har de protokoll som utvecklats i detta arbete valideras med hjälp av protoplaster isolerade från utbredda tobak (Nicotiana tabacum L.) Bright Yellow "2 (BY-2) suspensionskultur.
BY-2 suspensionskultur har beskrivits som den "HeLa" cell av högre växter, på grund av dess allmänt utbredda användning i molekylär analys av växtceller 18. Nyligen BY-2-celler har använts för att studera effekterna av växtstress 19-22, intracellulär proteinlokalisering 23,24, och grundläggande cellbiologi 25-27 visar den breda användbarheten av dessa kulturer i växtbiologi. En ytterligare fördel med med-2-odlingar är denmöjligheten att synkronisera kulturerna med afidikolin, vilket kan leda till ökad reproducerbarhet för genuttryck studerar 28. Vidare har metoder utvecklats för utvinning av BY-2 protoplasts använder låga enzymer 29,30, som enzymer som traditionellt används för att generera protoplaster är kostnadseffektiva oöverkomliga för hög genomströmning system. Som sådan har det protokoll som beskrivs nedan validerats med användning av BY-2 suspensionskultur, men det bör vara möjligt att ändra till någon växtcellsuspensionskultur. Proof-of-concept experiment utförs med en orange fluorescerande protein (OFP) reportergen (pporRFP) från de hårda korall porites porites 31 under kontroll av CaMV 35S-promotorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fastställande av Suspension cellkulturer
- Förbereda flytande BY-2 media genom att tillsätta 4,43 g Linsmaier & Skoog basala medier, 30 g sackaros, 200 mg KH 2 PO 4, och 200 | j, g av 2,4-diklorfenoxiättiksyra (2,4-D) till 900 ml destillerat vatten och pH-värdet till 5,8 med 0,1 M KOH. Efter justering av pH, justera slutvolymen till 1000 ml med destillerat vatten och autoklav. Media kan lagras upp till 2 veckor vid 4 ° C.
- Inokulera en 250 ml Erlenmeyer-kolv med 100 ml flytande BY-2 media och ett enda stycke av BY-2 callus (> 1 cm i diameter) som odlas på fast substans genom-två medier (vätska BY-2-medium med tillsats av 1% agar) och täta med aluminiumfolie. Inkubera kulturen vid 28-30 ° C med skakning i 5 dagar.
OBS: BY-2 callus upprätthålls på fasta medier för långtidsförvaring, som flytande kulturer snabbt växa över. kan justeras efter behov odlingsvolymen, typiskt en 100 ml kultur kommer att vara i stånd att lastning trettiotre 6-well plattor. - Överföring 2 ml logfas BY-2 kultur till 98 ml av färska biprodukter två media och inkubera under 5-7 dagar vid 28-30 ° C med skakning.
OBS: Under odling av etablerade vätskekulturer kan utföras regelbundet med 1: 100 spädningar av 5-7 dagar gamla kulturer, snarare än inokulering med callus. - Blanda kulturen grundligt, eftersom cellerna kommer att snabbt sedimentera, och överför 6 ml cellkulturen till en 15 ml konisk botten centrifugrör och låt cellerna sedimentera under minst 10 min. Justera den packade cellvolymen till 50% av den totala volymen genom att avlägsna supernatanten.
- Skaka röret genom invertering och pipett 500 pl i varje brunn i en 6-brunnsplatta för matsmältningen. Använd bred borrade pipetter för att överföra cellerna i detta skede, eftersom de är täta och kommer att täppa vanliga pipettspetsar.
2. Protoplast Isolering
- Slå på alla komponenter i robotsystem (Figur 1A) och öppna plattan mover uppgiften schemaläggning mjukvara. Uppgiften schemaläggningsprogram integrerar mikro mover med annan utrustning för att möjliggöra överföring av plattor mellan varje del av utrustningen.
- Före experiment, definiera de tekniska specifikationerna för laboratorie (t.ex. plattor, lock) som används i protokollet, samt start- och slutpositionerna för varje del av laboratorie, i plattan mover programvara, enligt följande:
- Klicka Inställningar i huvudverktygsraden i plattan mover programvara och välj Container kommandot Hantera typer.
- Om typ av container som anges i den befintliga container typbiblioteket, välj sedan lämplig behållare.
- Om den typ av container inte finns med i den befintliga container typbiblioteket klicka på Lägg till ange en ny behållare typ.
- Efter att ha lagt en ny container typ sätter dimensionerna på ny container (höjd, bredd, stapling dimensioner, och grip offset) i lämpliga flikar och klicka på Spara.
- Om rätt mått är inte tillgängliga från tillverkaren, sedan exakt fastställa alla dimensioner till närmaste millimeter med hjälp av skjutmått. Fel i mätning av containerdimensioner kommer att resultera i ett misslyckande av plattan mover.
- Upprepa steg 2.2.2 till 2.2.4.1 för alla typer av behållare som plattan mover kommer att stöta på. Efter slutförandet av detta steg för alla laboratorie, är det nödvändigt att definiera start- och slutposition för varje behållare (steg 2.2.6).
OBS: För denna protokollet laboratorie omfattar 6-brunnar, den djupa brunnar och 96 brunnar fluorescerande silplåt. - För att definiera start- och slutposition för varje behållare, klicka på fliken Start / Slut i ett särskilt protokoll. Först väljer startposition i varje container. Därefter markera rutan för Lidded / Unlidded både start- och slutpositionen. Upprepa för alla behållare.
OBS: Om behållaren lämnas på en annan bit av utrustnipment (i stället för plattan mover) slut plats kan lämnas tomt.
- I detta skede manuellt ladda alla plåtar i utgångsläget för hela arbetsflödet. Ladda de 96-brunnars fluorescerande silplattorna in i Hotel 2, 6-brunnars plattor med med-2-celler i Hotel 3, en 96 djupbrunnsplatta som kommer att användas för transformation på plattvärmaren / kylaren nest 2, och ett 50 ml koniskt röret med enzymlösningen (se Kompletterande fil, avsnitt 1.2.2) på multi-mode dispenser.
- Om omvandlingen kommer att genomföras i protokollet, förladda 96 djupbrunnsplatta med 10 pl av plasmid-DNA per brunn (1 mikrogram / l, A 260/280> 1,8) innehållande OFP reporterkonstruktion och inkubera på plattan värmare / kylaren vid 4 ° C. Varje brunn kommer att användas för en enda transformation, alltså antalet brunnar fyllda beror på försöksuppställningen.
- Ladda alla leveranser och plattor på automatiserad flytande plattform hantering på anvisade platser och definiera positionen för varje objekt i automation programvara (Figur 1B).
- Ladda en 96-brunnars platta förladdad med 200 | il av 40% PEG i MMG (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl2, 4 mM MES, pH 5,7) i kolumn 1, 200 pl propidiumjodid (PI, 1 pg / ml) i kolumn 2, och 200 pl etanol i kolumn 3 (boet 2), och en låda med pipettspetsar i boet 8.
- För att definiera platsen för laboratorie i den automatiserade vätskehanteringsplattform programvara, välj Verktyg från menyn och klicka på Labware Editor.
- Välj typ av laboratorie i rullgardinsmenyn eller definiera en ny labware typ med hjälp av nya Labware knappen.
- Definierar positionen för varje bit av laboratorie väljs genom att välja fliken Huvud protokollet och klicka på Konfigurera Labware. Se till att varje del av laboratorie placeras på automatiserade vätskehanteringsplattform ärdefinierat innan du kör protokollet.
- Att utlösa automatiserade protokoll klickar fönstret profil Explorer och välj namnet på det protokoll som ska köras (Protoplast Isolering, celltal, och PEG-medierad transformation).
- Klicka på Kör för att initiera alla enheter som kommer att användas i protokollet.
- Slutligen, i fönstret Work Explorer, klicka på Lägg till arbetsenhet för att kontrollera alla behållare / laboratorie i systemet och börja automatiserade protokoll.
OBS: Fullständiga beskrivningar av automatiserade protokoll finns i Supple File.
3. Upprätta standardkurva för celltal
- Manuellt koncentrera protoplaster vid en koncentration av 1 x 10 6 protoplaster / ml i en volym av 1 ml. Centrifugera protoplaster vid 1000 xg under 10 min och avlägsna supernatanten.
- Manuellt lägga 900 | il av 70% etanol (som hölls vid 4 ° C) till protoplast-pellettenoch återsuspendera pelleten. Inkubera i 10 minuter på is för att fixera celler.
- Tillsätt 100 pl av PI (1 | j, g / ml) till protoplasterna att märka kärnorna och tillåta detektering genom den plattläsare.
- Belastning 80 | il vätska BY-2-mediet i varje kolumn och rad i den 96-brunnars fluorescerande silplåt med början vid kolumn 2.
- I kolumn 1 i en 96-brunnars fluorescerande silplåt, tillsätt 70 | il av protoplaster och 50 fil med-2-media till varje brunn i kolumnen.
- Placera plattan i boet 6 av automatiserad vätskehantering plattform, och köra en två-faldig seriespädning.
- Att genomföra en serieutspädning på automatiserad vätskehantering plattform, klicka Starta Serial Wizard Utspädning och justera överföringsvolymen (60 ^ il), antal blandningar och volym (2, 70 l), initialt brunnar (kolumn 1, rader AF), utspädning brunnar (kolumner 2-11, rader AF), och aspirera och dispensera fastigheter (0,5 mm från brunnsbotten).
- Efter inställning av parametrar, spara end köra protokollet.
OBS: Eftersom alla protoplaster är märkta med PI (på grund av fixering av celler), är fluorescens proportion till protoplastkoncentrationen. - Efter seriespäd är klar, ta bort plattan från boet 9 och sätt in i plattläsaren och kör standardkurvan protokollet i plattan läsarprogrammet.
OBS: En standardkurva kommer då att genereras genom att jämföra fluorescens från PI (excitation 536 nm / emission 620 nm) i varje brunn med den kända protoplastkoncentration.
- Efter avslutad plattläsaren protokollet, ta bort plattan och samla in några transgena celler för autoklavering eller andra de-vitalisering förfaranden såsom de definieras i biosäkerhet protokoll ".
4. mikroskopisk analys av Transformation
- Ta bort plattan med transformerade protoplaster (produkten av Automated protokoll 3, Supplemental File) från Hotel ett av robotsystemet.
- Svängpå inverterat mikroskop, kamera och lysrör.
- Välj 10X objektivet för initial fokus på protoplastema, slå på halogenlampan och stänga slutaren för lysrör.
- Lastskylten på mikroskopisk systemet och fokus på protoplastema använder bright.
- Efter fokusering på protoplaster, stänga av halogenlampan och öppna luckan för lysrör.
- Välj CY3 / TRITC filtersats för visualisering av pporRFP protein som uttrycks av de transgena protoplaster.
- Skanna varje brunn för att bestämma antalet protoplaster som uttrycker pporRFP fluorescerande markör.
- Beräkna transformationseffektiviteten som det totala antalet protoplaster som uttrycker den fluorescerande markören det totala antalet protoplaster.
- Samla några plattor som innehåller transgena celler i godkända biosäkerhet påsar för autoklavering eller andra de-vitalisering förfaranden såsom de definieras i biosäkerhet protokoll ".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I den aktuella studien, dubbleringshastighet av BY-2 varierade från 14 till 18 h beroende av den temperatur vid vilken kulturerna inkuberades, i överensstämmelse med tidigare rapporter om en medelcellcykellängd av 15 h. Med denna fördubbling takt, en 1: var 100 börjar inokulum användes för att initiera kulturer, vilket leder till odlingar med en packad cellvolym (PCV) av 50% i 5-7 dagar. I det nuvarande protokollet, där kulturer odlades i 200 ml av media, var en PCV av 100 ml genereras i 7 dagar, som gav tillräckligt med celler för att fylla 33 6-brunnsplattor. När det gäller protoplast avkastning, matsmältning på de villkor som anges i protokollet genererade 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplaster per brunn, vilket resulterar i 2,82 x 10 6 protoplaster per 6-brunnar (Figur 2A). Baserat på dessa data, kan 214 96 brunnar (70 | il protoplaster per brunn) laddas från en enda 6-brunnar matsmältningen, med potential for två 6-brunnars plattor som skall bearbetas samtidigt, med användning av de två plattvärmaren / kylaren stationer. Således är det maximala antalet protoplaster som kan genereras under en enda tre-timmars matsmältningen protokollet 5,64 x 10 6.
Medan det totala antalet protoplaster som genereras per matsmältningen protokollet ger ett mått för systemet, är det också nödvändigt att utvärdera förlusten i protoplastkoncentration som protoplasterna överförs genom de olika stegen i protokollet. Som sådan var koncentrationen av protoplaster utvärderades efter varje överföringssteg i protokollet. Efter uppslutningen protokollet fick 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplaster överfördes till varje brunn i de 96 djupbrunnplattor, om utförande av transformationsprotokollet, eller 96-brunnars fluorescerande skärmplåt (figur 2B). När omvandlingen protokollet avslutats, 1,23 x 10 3 ± 4,66 x10 en protoplaster överfördes till 96-brunns fluorescerande skärmplåt (figur 2C). Förutom antalet protoplaster som överförs, var det viktigt att bestämma lönsamheten av protoplasterna för att säkerställa att flera pipetteringssteg inte skada protoplaster.
Baserat på resultaten från viabilitetsanalys, 95,1 ± 0,04% av protoplaster var livskraftiga efter matsmältning, 92,1 ± 0,06% efter överföring till 96 brunnar fluorescerande silplåt, och 91,7 ± 16,67% efter transformationsprotokoll. Trots flera pipetteringssteg, fanns det ingen signifikant skillnad (p> 0,44) mellan något av proven. Utöver detta mått på lönsamheten, var ett protokoll som utvecklats för bestämning av koncentrationen av protoplaster i något skede av förfarandet genom att mäta det totala antalet protoplaster färgades med PI. Såsom visas i figur 3, en standardkurva var geneed genom att mäta fluorescensintensiteten för kända koncentrationer av protoplaster från systemet. Standardkurvan var en bra passform (R 2 = 0,967) med det totala antalet protoplaster som spänner över området från 0 till 30000 protoplaster per brunn. För att validera standardkurvan, fluorescensintensiteten hos prover med ett känt antal protoplaster (8125 och 24.375 beräknas med hjälp av en hemocytometer) erhölls och antalet protoplaster beräknas från ekvationen för standardkurvan. Baserat på dessa resultat, förutspådde standardkurvan 9,560 och 28,200 protoplaster i varje brunn, en 15 och 14% fel. Med tanke på att det också finns variabilitet i mätning av cellantal med användning av en hemocytometer, var detta felet anses vara acceptabelt.
Utöver resultaten av antalet celler och livsduglighet, omvandlingen Protokollet var framgångsrik i att alstra transgena celler som uttrycker OFP (figur 2D - F). Tyvärr det protokoll som används resulterade i låg, ~ 2%, omvandlingseffektiviteten, på grund av den stora 16028 bp binär plasmid som används i denna studie och eftersom protokollet var inte optimerad specifikt för BY-2 protoplaster. Optimering av transformationsprotokollet, i termer av reagens och betingelser speciellt för biprodukter två protoplaster, förväntas öka omvandlingseffektiviteten, som belyses i diskussionen. När det gäller detta protokoll, var omvandlingen förfarande för att visa att proof-of-concept väg från protoplastisolering till omvandling, och var framgångsrika i att uppnå detta mål.
Efter att framgångsrikt validera alla enskilda förfaranden, var mätvärden erhålls för tidsförloppet av protokollet från protoplastisolering till transformation. Som visas i figur 4, är den stora investeringen i tid under koksteg, där tre timmar krävdes for fullständig digerering av cellväggen och frisättning av protoplasterna. Under detta förfarande är 18 slingor körs mellan plattan shaker och plattvärmaren / kylaren en inkubation station, med plattan mover flytta plattan mellan de båda stationerna. Överföringstiden mellan plattan shaker och plattvärmaren / kylaren 1 tar bara 8,9 sekunder, och ser till att majoriteten av uppslutning går åt inkubation och skakning. Den totala tiden från inledandet av förfarandet för att slutföra lastningen av enzymerna med multi-mode dispenser är 2,2 minuter. Sammantaget är det kompletta protoplastisoleringsprotokoll avslutades i tre timmar och 22,8 min. Baserat på dessa resultat, är 88% av protoplastisoleringsprotokoll bringade smälta. Efter slutförandet av protoplastisoleringsprotokollet omvandlings protokollet initieras och slutföras inom 27,5 minuter. Liknande den protoplastisoleringsprotokoll, är 72% av transformationsförfarandet använt inkubera reaktionen. Den enda andra steget i protokolletsom har en betydande tidskomponent (> 10% av den totala proceduren tid) är initiering av protokollet från den automatiserade vätskehanteringsplattform, som står för 14% av den totala tiden i förfarandet. På detta sätt, är 86% av det protokoll som tillbringas i initiering och inkubation med endast 14% av tiden spenderas på pipettering och överföringssteg. Den kompletta varaktighet protoplastisolering och transformation var 3 timmar, 50 minuter och 53 sekunder, utan extern ingång krävs från operatören.
Figur 1:. Schematisk bild av robot plattform och konfiguration av automatiserade vätskehanteringsplattform under protokollet (A) robotsystem består av 3 plattstaplar / hotell som kan nås av plåt mover. Hotel 1 är den utsedda lock / delidding station, Hotel 2 är den 96-håls fluorescerandeplattstapeln, och Hotel 3 är 6-brunnar stack. Systemet har två flytande hanterare, en automatiserad vätskehantering plattform, och ett munstycke-baserade multi-mode dispenser. För uppvärmning / kylning av robot plattformen har två platt värme / kylning enheter, tillsammans med en plattskakanordning för blandning plattan. Slutligen har systemet en monokromator baserad plattavläsare för mätning av fluorescens. Alla komponenter är inrymda i en specialbyggd biosäkerhet kabinett. (B) Start konfiguration av automatiserade plattform vätskehantering med boet 2 upptas av reagensplattan och spetsen rutan placerad på boet 8. (C) Konfiguration av hanteringsplattform automatiserade vätska innan du ringer ett försöksprotokoll. En djup brunnar ligger på boet 4, är en 96-håls fluorescerande screening skylten på boet 6, och 6-brunnar innehåller protoplaster ligger på boet 5. Klicka här för att v isa b en större version av denna siffra.
Figur 2: Representant bilder av AV-2 protoplasts efter varje överföring och efter transformation med den orange fluorescerande protein reportergenen (A - C) mikrofoton av BY-2 protoplasttäthet i 6-brunnar, 96 brunnar efter överföring av 70. il från 6-brunnar, och 96-brunnars fluorescerande silplåt post-transformation. (D) Bright mikroskop av BY-2 protoplasts efter transformation. (E) Lysrör BY-2 protoplast uttrycker OFP genen visualiseras med hjälp av en Cy3 / TRITC filteruppsättningen. (F) överlagring av bright och fluorescerande mikrografer som visar den låga effektiviteten av transformation. Skalstreck = 50 | im. target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3:. Standardkurva för beräkning av antalet protoplaster Antalet protoplaster i en given väl kan beräknas genom att jämföra fluorescensintensiteten, i godtyckliga enheter (AU), att ekvationen för standardkurvan. Validering av protoplastnummer jämfördes mellan standardkurvan och hemocytometer vid den punkt som anges i diagrammet, med 9,561 protoplaster som identifierats från plattläsaren, och 8125 räknade på hemocytometer. Sammantaget var ett fel på 15% finns mellan de två teknikerna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
re 4 "src =" / filer / ftp_upload / 54300 / 54300fig4.jpg "/>
Figur 4:. Ganttdiagram för det beskrivna förfarandet för framställning av BY-2 protoplaster och genetisk transformation Majoriteten av protokollet, ~ 3 tim, går åt till digerering av BY-2-celler för att generera de protoplaster. Lastning av enzymlösningen och inaktivering kräver endast 12% av den totala proceduren tiden. På liknande sätt, inkubering av transformationsreaktion på plattskak står för 72% av det transformationsprotokoll. Sammantaget proceduren från protoplastisolering tills genetisk transformation uppnås är under 4 timmar (3 tim, 50 min och 53 sek). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande fil: Automatiserade protokoll för protoplastisolering, cellräkning, och PEG-medierad transformation <./ strong> Kompletta protokoll som utvecklats för användning i robot plattform för att utföra var och en av de uppgifter som anges ovan ingår i denna fil. Klicka här för att ladda ner filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs ovan har framgångsrikt validerats för protoplastisolering, uppräkning, och transformation med hjälp av BY-2 tobakssuspensionscellkultur; kunde dock protokollet lätt utökas till alla växter suspensionskultur. För närvarande har protoplastisolering och omvandling uppnåtts i många växter, inklusive majs (Zea mays) 10, morot (Daucus carota) 32, poppel (Populus euphratica) 33, druva (Vitis vinifera) 34, oljepalm (Elaeis guineensis) 35 , sallat (Lactuca sativa) 36, senap (Brassica juncea) 37, ris (Oryza sativa) 38, och switch (rödhirs) 39,40. Medan variation i kultur- och matsmältningen inträffar från art till art, i termer av protokoll som utvecklats i detta arbete, som ersätter odlingsmedia eller ändra villkoren för grävaestion bör inte ändra den grundläggande protokollet. Att anpassa sig till olika arter, odlingsmedia och enzymer som krävs för matsmältningen lastas av operatören före initiering av protokollet, därför att byta dessa komponenter är trivialt. Som en extra fördel, är protokollet kan ändras till screening flera rötnings villkor utbytet av protoplaster som mäts av systemet. Detta är en väsentlig komponent, eftersom användningen av billiga enzymer är nödvändiga för hög genomströmning tillämpningar, därför är det viktigt att minimera mängden av enzymer som används i matsmältningen.
I likhet med kultur och matsmältning, skulle modifieringar av transformationsprotokollet krävas vid antagandet av system för omvandling av protoplaster isolerade från olika växtarter. Betydande arbete har utförts på optimering av PEG-förmedlad transformation i växtprotoplaster 16,35, med ett stort antal faktorer som påverkar effektiviteten av transformation. I den aktuella work en begränsande faktor som påverkar omvandlingseffektiviteten var den stora storleken på den binära testplasmiden, 16.028 bp, som användes i syfte att modellera en genomet redigering plasmid storlek. I tidigare studier på PEG-medierad transformation av BY-2 protoplaster, har 40-60% omvandling uppnåtts; Men dessa studier använde små 5000 bp plasmider 41,42. De primära modifikationer av PEG-förmedlad transformation mellan arter inkluderar koncentrationen av PEG och MgCl2, mängden och koncentrationen av DNA och reaktionstiden. Såsom PEG och MgCl2-lösningar införs i systemet på reagensplattan, och DNA: t är förinstallerad i det djupa-brunnar, kan dessa villkor lätt modifieras i protokollet beskrivet ovan. Dessutom, att öka eller minska inkuberingstiden, tillsammans med modifieringen av blandningshastigheter, kan styras exakt av robotplattform. Den nuvarande begränsningen av transformationsprotokollet är bristenför säkerhetskontroll med plattläsaren för att detektera den fluorescerande reporter, på grund av den låga effektiviteten av PEG-förmedlad transformation i BY-2 protoplaster. I andra arter, såsom Arabidopsis thaliana och majs 16, är PEG-förmedlad transformation 40-90% effektiv. I sådana system transformanter snabbt skulle kunna karakteriseras med användning av plattläsaren på roboten. Sålunda skulle det vara möjligt att identifiera brunnar med positiva transformanter, och även kvantifiera nivån av uttryck. För tillämpningar, såsom promotor screening, skulle denna funktion ökar användbarheten av det nuvarande protokollet, och kommer att läggas i senare iterationer av systemet.
Förutom optimering av omvandlingseffektiviteten för PER-2 protoplaster, kan flera modifieringar öka effektiviteten och den totala genomströmningen hos systemet. Tidigare studier av automatisering av protoplasttransformation tillåts protoplaster för att sedimentera till botten av brunnar, före tillsatsen av varh lösningar 43. I det nuvarande protokollet, var protoplaster blandades på plattan shaker för att förhindra sedimentering och hålla protoplasterna i suspension med hjälp av flatbottnade brunnsplattor. Dessutom under transformation, protoplaster fick inte bosätta sig i djupbrunnsplattor, för att minska exponeringen för PEG, som kan vara giftiga över långvarig exponering. Som sådana var protoplasterna utspäddes ~ 10-faldigt med W5-lösning när den överförs från den djupa-brunnar till 96-brunnars fluorescerande silplåt, vilket resulterar i 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 ett protoplaster per brunn. I syfte att öka antalet protoplaster som överförs efter transformation, kan ett inkubationssteg tillsättas för att göra det möjligt för protoplaster sedimentera, och supernatanten avlägsnas följt av tillsats av en mindre volym av vätska genom-2 media. Dessutom, om en plattbaserad centrifug tillsattes till systemet, detta steg skulle kunna uppnås snabbare. En annan ändring som skulle kunna lägga till funktioner för att than system skulle vara att använda en levande / död fluorescens analys för att bestämma livskraften hos de isolerade protoplaster före transformation. I det nuvarande protokollet, var fluoresceindiacetat (FDA) testas som en levande färgämne; Men, fördunklat BY-2 protoplast bakgrundsfluorescens FDA-signalen. Om en mer stabil viabilitet färgämne användes, då protoplast viabilitet skulle kunna bestämmas som förhållandet mellan röda (PI) till grönt (Calcein AM, etc.) fluorescens, och standardiserad liknar den cellräkning protokollet. Dessa ändringar skulle lägga ytterligare funktionalitet till systemet, och kommer att ingå i framtida protokoll.
När det gäller det nuvarande protokollet, det finns flera viktiga steg som måste följas för att säkerställa framgång för protokollet. För det första är viktigt ålder / hälsa BY-2 kulturer för att säkerställa att livskraftiga protoplaster kan isoleras för efterföljande steg. Som förklaras i steg 1,3, genom att överföra en logfas kultur till en ny kolv vid en01:50 förhållande av celler till färskt medium, och tillåta odlingen att växa under 5-7 dagar, kan det maximala antalet viabla protoplaster kan isoleras. Att låta kulturerna att växa under längre eller kortare löptider som använder den angivna inokulatet kommer att minska protoplast avkastning, och orsaka fel på efterföljande protokoll. Ett andra viktigt steg är steg 1,5, eftersom användningen av standard pipettspetsar, i stället för de breda borrade pipettspetsar anges, kommer att orsaka tips för att täppa och leda till felaktiga volymer som överförs. När det gäller installationen av robotsystem, arrangemanget av plattorna på automatiserade vätskehanteringsplattform, steg 2,4, är kritisk, med en modifierad inställning förhindrar huvudet av flytande hanterare från att nå alla brunnar på 6-brunnar. På grund av utformningen av den automatiserade vätskehanteringsplattform måste 6-brunnar placeras i boet 5, eller protokoll som valts för detta instrument kommer att misslyckas. På samma sätt, underlåtenhet att korrekt definiera laboratorie i plattanmover programvara, steg 2,2, gör att instrumentet inte greppa eller släppa laboratorieresulterar i uppsägning av protokollet. För cellräkningsprotokoll, innefattar det kritiska steget fixering av cellerna med etanol, steg 3,2. Om cellerna inte är fasta före märkning med PI, endast icke-livsdugliga celler skall märkas, i stället för hela befolkningen i protoplaster, och det kommer inte att vara möjligt att räkna antalet protoplaster isolerade. Den slutliga kritiska steget, steg 4,6, involverar val av de fluorescerande filter för mikroskopisk analys av expressionen av den pporRFP fluorescerande markör. Användningen av andra "röda" filteruppsättningar möjliggör bakgrundsfluorescens från klorofyll, avsevärt öka signalen i alla kloroplast innehåller protoplaster, förhindra beräkning av transformationseffektiviteten. Noggrant följa specifikationerna i dessa kritiska steg garanterar den största möjligheten för framgång och generering av de mest reproducerbara dataset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har någon konkurrerande ekonomiska intressen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
- Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
- Duke, S. O. Perspectives on transgenic, herbicide-resistant crops in the United States almost 20 years after introduction. Pest Manag. Sci. 71 (5), 652-657 (2015).
- Mir, R., Zaman-Allah, M., Sreenivasulu, N., Trethowan, R., Varshney, R. Integrated genomics, physiology and breeding approaches for improving drought tolerance in crops. Theor. Appl. Genet. 125 (4), 625-645 (2012).
- Hu, H., Xiong, L. Genetic engineering and breeding of drought-resistant crops. Annu. Rev. Plant Bio. 65, 715-741 (2014).
- Marco, F., et al. Plant Biology and Biotechnology. , Springer. 579-609 (2015).
- Edgerton, M. D., et al. Transgenic insect resistance traits increase corn yield and yield stability. Nat. Biotechnol. 30 (6), 493-496 (2012).
- Vanhercke, T., et al. Metabolic engineering of biomass for high energy density: oilseed-like triacylglycerol yields from plant leaves. Plant Biotech. J. 12 (2), 231-239 (2014).
- Baxter, H. L., et al. Two-year field analysis of reduced recalcitrance transgenic switchgrass. Plant Biotech. J. 12 (7), 914-924 (2014).
- Xing, H. L., et al. A CRISPR/Cas9 toolkit for multiplex genome editing in plants. BMC Plant Biol. 14 (1), 327 (2014).
- Cao, J., Yao, D., Lin, F., Jiang, M. PEG-mediated transient gene expression and silencing system in maize mesophyll protoplasts: a valuable tool for signal transduction study in maize. Acta Physio. Plant. 36 (5), 1271-1281 (2014).
- Martinho, C., et al. Dissection of miRNA pathways using Arabidopsis mesophyll protoplasts. Mol. Plant. 8 (2), 261-275 (2015).
- Bart, R., Chern, M., Park, C. J., Bartley, L., Ronald, P. C. A novel system for gene silencing using siRNAs in rice leaf and stem-derived protoplasts. Plant Methods. 2 (1), 13 (2006).
- Jiang, F., Zhu, J., Liu, H. -L. Protoplasts: a useful research system for plant cell biology, especially dedifferentiation. Protoplasma. 250 (6), 1231-1238 (2013).
- Martin-Ortigosa, S., Valenstein, J. S., Lin, V. S. Y., Trewyn, B. G., Wang, K. Nanotechnology meets plant sciences: Gold functionalized mesoporous silica nanoparticle mediated protein and DNA codelivery to plant cells via the biolistic method. Adv. Funct. Mater. 22 (17), 3529-3529 (2012).
- Křenek, P., et al. Transient plant transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens: Principles, methods and applications. Biotechnol. Adv. , (2015).
- Yoo, S. D., Cho, Y. H., Sheen, J. Arabidopsis mesophyll protoplasts: a versatile cell system for transient gene expression analysis. Nat. Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).
- Mustafa, N. R., de Winter, W., van Iren, F., Verpoorte, R. Initiation, growth and cryopreservation of plant cell suspension cultures. Nat. Protoc. 6 (6), 715-742 (2011).
- Nagata, T., Nemoto, Y., Hasezawa, S. Tobacco BY-2 cell line as the "HeLa" cell in the cell biology of higher plants. Int. Rev. Cytol. 132 (1), 1-30 (1992).
- Centomani, I., et al. Involvement of DNA methylation in the control of cell growth during heat stress in tobacco BY-2 cells. Protoplasma. , 1-9 (2015).
- Sgobba, A., et al. Cyclic AMP deficiency stimulates a stress condition in tobacco BY-2 cells. BioTechnologia. 94 (2), (2013).
- Väisänen, E. E., et al. Coniferyl alcohol hinders the growth of tobacco BY-2 cells and Nicotiana benthamiana seedlings. Planta. 242 (3), 747-760 (2015).
- Ortiz-Espìn, A., et al. Over-expression of Trxo1 increases the viability of tobacco BY-2 cells under H2O2 treatment. Ann. Botany. 116 (4), 571-582 (2015).
- Ito, Y., et al. cis-Golgi proteins accumulate near the ER exit sites and act as the scaffold for Golgi regeneration after brefeldin A treatment in tobacco BY-2 cells. Mol. Bio. Cell. 23 (16), 3203-3214 (2012).
- Madison, S. L., Nebenführ, A. Live-cell imaging of dual-labeled Golgi stacks in tobacco BY-2 cells reveals similar behaviors for different cisternae during movement and brefeldin A treatment. Mol. Plant. 4 (5), 896-908 (2011).
- de Pinto, M. C., et al. S-nitrosylation of ascorbate peroxidase is part of programmed cell death signaling in tobacco Bright Yellow-2 cells. Plant Physiol. 163 (4), 1766-1775 (2013).
- Hanamata, S., et al. In vivo imaging and quantitative monitoring of autophagic flux in tobacco BY-2 cells. Plant Signa. Behav. 8 (1), 22510 (2013).
- Sakai, A., Takusagawa, M., Nio, A., Sawai, Y. Cytological Studies on proliferation, differentiation, and death of BY-2 cultured tobacco cells. Cytologia. 80 (2), 133-141 (2015).
- Yasuhara, H., Kitamoto, K. Aphidicolin-induced nuclear elongation in tobacco BY-2 cells. Plant Cell Physiol. 55 (5), 913-927 (2014).
- Buntru, M., Vogel, S., Stoff, K., Spiegel, H., Schillberg, S. A versatile coupled cell-free transcription-translation system based on tobacco BY-2 cell lysates. Biotechnol. Bioeng. 112 (5), 867-878 (2015).
- Buntru, M., Vogel, S., Spiegel, H., Schillberg, S. Tobacco BY-2 cell-free lysate: an alternative and highly-productive plant-based in vitro translation system. BMC Biotechnol. 14 (1), 37 (2014).
- Alieva, N. O., et al. Diversity and evolution of coral fluorescent proteins. PLoS ONE. 3 (7), 2680 (2008).
- Maćkowska, K., Jarosz, A., Grzebelus, E. Plant regeneration from leaf-derived protoplasts within the Daucus genus: effect of different conditions in alginate embedding and phytosulfokine application. Plant Cell Tiss. Org. 117 (2), 241-252 (2014).
- Guo, Y., Song, X., Zhao, S., Lv, J., Lu, M. A transient gene expression system in Populus euphratica Oliv. protoplasts prepared from suspension cultured cells. Acta Physio. Plant. 37 (8), 1-8 (2015).
- Wang, H., Wang, W., Zhan, J., Huang, W., Xu, H. An efficient PEG-mediated transient gene expression system in grape protoplasts and its application in subcellular localization studies of flavonoids biosynthesis enzymes. Sci. Hort. 191, 82-89 (2015).
- Masani, M. Y. A., Noll, G. A., Parveez, G. K. A., Sambanthamurthi, R., Pruefer, D. Efficient transformation of oil palm protoplasts by PEG-mediated transfection and DNA microinjection. PLoS One. 9 (5), 96831 (2014).
- Sasamoto, H., Ashihara, H. Effect of nicotinic acid, nicotinamide and trigonelline on the proliferation of lettuce cells derived from protoplasts. Phytochem. Lett. 7, 38-41 (2014).
- Uddin, M. J., Robin, A. H. K., Raffiand, S., Afrin, S. Somatic embryo formation from co-cultivated protoplasts of Brassica rapa & B. juncea. Am. J. Exp. Ag. 8 (6), 342-349 (2015).
- Hayashimoto, A., Li, Z., Murai, N. A polyethylene glycol-mediated protoplast transformation system for production of fertile transgenic rice plants. Plant Physiol. 93 (3), 857-863 (1990).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Stewart, C. N. Protoplast isolation and transient gene expression in switchgrass, Panicum virgatum L. Biotechnol. J. 3 (3), 354-359 (2008).
- Mazarei, M., Al-Ahmad, H., Rudis, M. R., Joyce, B. L., Stewart, C. N. Switchgrass (Panicum virgatum L.) cell suspension cultures: Establishment, characterization, and application. Plant Sci. 181 (6), 712-715 (2011).
- Locatelli, F., Vannini, C., Magnani, E., Coraggio, I., Bracale, M. Efficiency of transient transformation in tobacco protoplasts is independent of plasmid amount. Plant Cell Rep. 21 (9), 865-871 (2003).
- Di Sansebastiano, G. P., Paris, N., Marc-Martin, S., Neuhaus, J. M. Specific accumulation of GFP in a non-acididc vacuolar compartment via a C-terminal propeptide-mediated sorting pathway. Plant J. 15 (4), 449-457 (1998).
- De Sutter, V., et al. Exploration of jasmonate signalling via automated and standardized transient expression assays in tobacco cells. Plant J. 44 (6), 1065-1076 (2005).
