Summary
Une méthode à haut débit automatisée, la production de tabac en protoplastes et la transformation est décrite. Le système robotisé permet l'expression du gène massivement parallèle et de découverte dans le système modèle BY-2 qui devrait être traduisible aux cultures non-modèle.
Abstract
Au cours de la dernière décennie, il y a eu une résurgence de l'utilisation des protoplastes végétaux qui vont des espèces modèles pour recadrer les espèces, pour l'analyse des voies de signalisation de la transduction, les réseaux de régulation transcriptionnelle, l'expression des gènes, génome d'édition, et la neutralisation des gènes. En outre, des progrès significatifs ont été réalisés dans la régénération des plantes à partir de protoplastes, qui a généré encore plus d'intérêt dans l'utilisation de ces systèmes pour la génomique végétale. Dans ce travail, un protocole a été mis au point pour l'automatisation de l'isolement de protoplastes et la transformation de 2 (PAR-2) la culture du tabac en suspension un «Bright Yellow» en utilisant une plate-forme robotique. Les procédures de transformation ont été validés à l'aide d'une protéine fluorescente orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) sous le contrôle du promoteur de chou-virus de la mosaïque 35S (35S). OFP expression dans des protoplastes a été confirmée par microscopie à épifluorescence. Les analyses comprenaient également des méthodes d'efficacité de production protoplastes utilisant propidium iodure. Enfin, les enzymes de qualité alimentaire à faible coût ont été utilisés pour la procédure d'isolement de protoplastes, de contourner la nécessité d'enzymes de laboratoire de qualité qui sont un coût prohibitif en haut débit automatisé isolement et l'analyse protoplastes. Basé sur le protocole mis au point dans ce travail, la procédure complète de l'isolement de protoplastes à la transformation peut être réalisée en moins de 4 heures, sans aucune intervention de l'opérateur. Alors que le protocole mis au point dans ce travail a été validé avec la culture cellulaire BY-2, les procédures et les méthodes doivent être traduisible à tout système de culture en suspension végétale / protoplastes, ce qui devrait permettre une accélération de la recherche en génomique des cultures.
Introduction
Ces dernières années , il y a eu une impulsion significative placé sur la conception des cultures transgéniques pour surmonter diverses maladies 1, conférer une résistance aux herbicides 2, confère la sécheresse 3,4 et la tolérance au sel 5, prévenir herbivory 6, augmenter le rendement de la biomasse 7, et de diminuer la paroi cellulaire récalcitrante 8. Cette tendance a été favorisée par le développement de nouveaux outils moléculaires pour générer des plantes transgéniques, y compris le génome d'édition en utilisant CRISPR et TALENs 9 et silençage génique par ARNdb 10, miRNA 11 et siRNA 12. Bien que ces technologies ont simplifié la génération de plantes transgéniques, ils ont également créé un goulot d'étranglement, où le grand nombre de plantes transgéniques générées ne peuvent pas être criblée en utilisant les systèmes traditionnels qui reposent sur la régénération des plantes. Associés à ce goulot d'étranglement, tout en réduisant au silence et génome édition constructions peuvent être insérés rapidement dans les plantes, un grand nombre detraits ciblés ne parviennent pas à produire l'effet désiré, qui est souvent découverte que les plantes sont analysées dans la serre. Dans ce travail, nous avons développé une méthode pour rapide automatisée, le dépistage, à haut débit de protoplastes végétaux, en particulier pour résoudre le goulot d'étranglement dans le dépistage précoce d'un grand nombre de génomes d'édition et le gène silencieux cibles.
L'utilisation de protoplastes, par opposition à des cellules végétales intactes, présente plusieurs avantages pour le développement d'une plateforme automatisée. Tout d' abord, les protoplastes sont isolés après digestion de la paroi cellulaire de la plante, et cette barrière ne présentent plus, l' efficacité de transformation 13 est augmentée. Dans les cellules végétales intactes il y a seulement deux méthodes bien établies pour la transformation, biolistique 14 et Agrobacterium transformation médiée 15. Aucune de ces méthodes peuvent être facilement convertis aux plates-formes de manipulation de liquides, comme biolistique nécessite un équipement spécialisé pour transformation, alors que Agrobacterium transformation médiée nécessite co-culture et l' élimination ultérieure des bactéries. Ni se prêtent à des procédés à haut débit. Dans le cas de protoplastes, la transformation est habituellement effectuée en utilisant le polyéthylène glycol (PEG) de transfection médiée 16, qui ne nécessite plusieurs échanges de solutions, et est idéale pour les plates - formes de manipulation de liquides. En second lieu, les protoplastes, par définition, sont des cultures monocellulaires, et donc les problèmes associés à l'agglutination et la formation chaîne dans des cultures de cellules végétales, ne sont pas observés dans les protoplastes. En termes de dépistage rapide à l'aide d'un spectrophotomètre à base de plaque, l'agglutination des cellules, ou des cellules dans plusieurs plans vont conduire à des difficultés dans l'acquisition de mesures cohérentes. Etant donné que les protoplastes sont aussi plus denses que les milieux de culture, ils sédimentent au fond du puits, la formation d'une monocouche, ce qui est favorable à la spectrophotométrie sur la base de plaque. Enfin, alors que les cultures en suspension de cellules végétales sont primarille dérivé de 17 cals, les protoplastes peuvent être récoltées à partir d' un certain nombre de tissus végétaux, conduisant à la possibilité d'identifier une expression spécifique d' un tissu. Par exemple, la capacité d'analyser root- ou une expression spécifique de feuille d'un gène peut être très important pour la prédiction du phénotype. Pour ces raisons, les protocoles mis au point dans ce travail ont été validées en utilisant des protoplastes isolés du tabac largement utilisé (Nicotiana tabacum L.) 2 (PAR-2) de culture en suspension 'Bright Yellow'.
La culture en suspension BY-2 a été décrite comme étant la cellule "Hela" des plantes supérieures, en raison de son utilisation généralisée dans l' analyse moléculaire des cellules végétales 18. Récemment, PAR-2 cellules ont été utilisées pour étudier les effets de facteurs de stress plante 19-22, protéine intracellulaire localisation 23,24, et la biologie cellulaire de base 25-27 démontrant l'utilité générale de ces cultures en biologie végétale. Un avantage supplémentaire de BY-2 est la culturepossibilité de synchroniser les cultures avec aphidicoline, ce qui peut conduire à une meilleure reproductibilité pour l' expression génique des études 28. En outre, des méthodes ont été mises au point pour l'extraction de PAR-2 protoplastes utilisant des enzymes à faible coût 29,30, comme enzymes traditionnellement utilisées pour générer des protoplastes sont des coûts prohibitifs pour les systèmes à haut débit. En tant que tel, le protocole décrit ci-dessous a été validé en utilisant la culture en suspension BY-2, mais il devrait être amendable à une culture usine de suspension cellulaire. Les expériences de validation de concept sont effectuées en utilisant une protéine de fluorescence orange (OFP) gène rapporteur (pporRFP) des Porites de coraux durs porites 31 sous le contrôle du promoteur CAMV 35S.
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Protocol
1. Mise en place de la suspension des cultures cellulaires
- Préparer liquide par 2 supports en y ajoutant 4,43 g Linsmaier & Skoog basal, 30 g de saccharose, 200 mg de KH 2 PO 4 et 200 pg d'acide 2,4-dichlorophénoxyacétique (2,4-D) à 900 ml d' eau distillée l'eau et le pH à 5,8 avec 0,1 M KOH. Après ajustement du pH, ajuster le volume final à 1000 ml avec de l'eau distillée et autoclave. Les médias peuvent être stockés jusqu'à 2 semaines à 4 ° C.
- Inoculer un flacon de 250 ml Erlenmeyer avec 100 ml de liquide BY-2 médias et une seule pièce de PAR-2 cals (> 1 cm de diamètre) cultivés sur milieu solide PAR-2 (liquide BY-2 médias avec l'ajout de 1% agar) et sceller avec du papier d'aluminium. Incuber la culture à 28-30 ° C avec agitation pendant 5 jours.
NOTE: PAR-2 cals est maintenu sur un support solide pour le stockage à long terme, comme des cultures liquides vont rapidement proliférer. le volume de la culture peut être ajusté si nécessaire, typiquement une culture de 100 ml sera capable de charger trente-trois 6-wplaques Ell. - Transfert 2 ml de phase logarithmique BY-2 culture à 98 ml de milieu frais PAR-2 et incuber pendant 5-7 jours à 28-30 ° C avec agitation.
REMARQUE: Sous-culture des cultures liquides établies peut être effectuée en utilisant régulièrement 1: 100 dilutions de 5-7 jours vieilles cultures, plutôt que l'inoculation avec des cals. - Mélanger la culture à fond, que les cellules vont rapidement s'installer, et le transfert de 6 ml de la culture de cellules dans un tube de 15 ml fond conique de centrifugeuse et laisser les cellules se déposent pendant au moins 10 min. Réglez le volume de l'hématocrite à 50% du volume total en retirant le surnageant.
- Agiter le tube par inversion et pipette 500 pi dans chaque puits d'une plaque à 6 puits pour la digestion. Utiliser des pipettes de large calibre pour transférer les cellules à ce stade, car ils sont denses et bouchent les embouts de pipettes standard.
2. protoplastes Isolation
- Allumez toutes les composantes du système robotique (figure 1A) et ouvrir la tâche plaque moteur planification soupleware. Le programme de planification de tâches intègre le moteur de microplaques avec les autres équipements pour permettre le transfert de plaques entre chaque pièce d'équipement.
- Avant l' expérimentation, définir les spécifications techniques pour labware (par exemple, des plaques, couvercles) utilisés dans le protocole, ainsi que le démarrage et les positions de fin de chaque morceau de labware, dans le logiciel plaque de moteur, comme suit:
- Cliquez sur Configuration de la barre d'outils principale dans le logiciel plaque de moteur et sélectionnez le conteneur commande Gérer les types.
- Si le type de conteneur est répertorié dans la bibliothèque de type conteneur existant, puis sélectionnez le conteneur approprié.
- Si le type de conteneur ne figure pas dans la bibliothèque de type conteneur existant puis cliquez sur Ajouter pour spécifier un nouveau type de conteneur.
- Après l' ajout d' un nouveau type de conteneur, insérer les dimensions du nouveau conteneur (hauteur, largeur, les dimensions d' empilage, et la pince de décalage) dans les onglets appropriés et cliquez sur Enregistrer.
- Si les dimensions correctes ne sont pas disponibles auprès du fabricant, puis de déterminer avec précision toutes les dimensions au millimètre près à l'aide des étriers. Des erreurs dans la mesure des dimensions de conteneurs se traduira par un échec de l'auteur de la plaque.
- Répétez les étapes 2.2.2 à 2.2.4.1 pour tous les types de conteneurs que le moteur de la plaque va rencontrer. Après l'achèvement de cette étape pour tous les labware, il est nécessaire de définir le début et l'emplacement de fin pour chaque conteneur (étape 2.2.6).
NOTE: Pour ce protocole le labware comprend la plaque de 6 puits, la plaque de puits profonds, et la plaque de criblage 96 puits fluorescent. - Pour définir la position de début et de fin de chaque conteneur, cliquez sur l'onglet Début / Fin dans un protocole spécifique. Tout d'abord, sélectionnez la position de départ de chaque conteneur. Ensuite, cochez la case Lidded / Unlidded à la fois le début et la fin de course. Répétez l'opération pour tous les conteneurs.
NOTE: Si le conteneur sera laissé sur un autre morceau de équipment (au lieu du moteur de la plaque) l'emplacement final peut être laissée en blanc.
- A ce stade, charger manuellement toutes les plaques dans la position de départ pour l'ensemble du workflow. Chargez les plaques de blindage fluorescentes 96 puits dans Hôtel 2, plaques de 6 puits avec by-2 cellules dans Hôtel 3, une assiette creuse 96 puits qui sera utilisé pour la transformation sur la plaque de chauffage / refroidisseur nid 2, et 50 ml conique tube contenant la solution d'enzyme (voir fichier supplémentaire, section 1.2.2) sur le distributeur multi-mode.
- Si la transformation sera effectuée dans le protocole, pré-charger la plaque à 96 puits profonds avec 10 pi d'ADN plasmidique par puits (1 pg / pl, A 260/280> 1,8) contenant la construction rapporteur OFP et incuber sur la plaque chauffage / refroidissement à 4 ° C. Chaque puits est utilisée pour une transformation unique, donc le nombre de puits remplis dépendra de la configuration expérimentale.
- Chargez toutes les fournitures et les plaques sur l'automated plate - forme de manipulation de liquides dans les endroits désignés et définir la position de chaque élément dans le logiciel de contrôle d'automatisation (figure 1B).
- Chargez une plaque de 96 puits préchargé avec 200 pi de 40% de PEG dans MMg (0,4 M mannitol, 100 mM MgCl 2, mM MES 4, pH 5,7) dans la colonne 1, 200 pi d'iodure de propidium (PI, 1 pg / ml) dans la colonne 2, et 200 pi d'éthanol dans la colonne 3 (nid 2), et une boîte de pointes de pipette dans le nid 8.
- Pour définir l'emplacement du labware dans le logiciel de l'automatisé liquide manutention plate - forme, sélectionnez Outils dans le menu et cliquez sur Editeur Labware.
- Sélectionnez le type de labware dans le menu déroulant ou définir un nouveau type de labware en utilisant le bouton Nouveau Labware.
- Définir la position de chaque morceau de labware sélectionné en sélectionnant l'onglet Protocole principal et cliquez sur Configurer Labware. Assurez-vous que chaque morceau de labware placé sur la plate-forme de traitement des liquides est automatisédéfini avant l'exécution du protocole.
- Pour déclencher les protocoles automatisés, cliquez sur la fenêtre de l' Explorateur de profil et sélectionnez le nom du protocole à être exécuté (protoplastes Isolation, Cell Count, et la transformation médiée par PEG).
- Cliquez sur Exécuter pour initialiser tous les périphériques qui seront utilisés dans le protocole.
- Enfin, dans la fenêtre de travail Explorer, cliquez sur Ajouter unité de travail pour vérifier tous les conteneurs / labware dans le système et commencer le protocole automatisé.
NOTE: Les descriptions complètes des protocoles automatisés sont contenus dans le fichier supplémentaire.
3. Établir la courbe standard pour le nombre de cellules
- Concentrer manuellement protoplastes à une concentration de 1 x 10 6 protoplastes / ml dans un volume de 1 ml. Centrifugeuse protoplastes à 1000 xg pendant 10 min, et retirer le surnageant.
- ajouter manuellement 900 ul d'éthanol à 70% (conservé à 4 ° C) au culot de protoplasteset remettre en suspension le culot. Incuber pendant 10 min sur la glace pour fixer les cellules.
- Ajouter 100 pi de pi (1 pg / ml) pour les protoplastes pour marquer les noyaux et permettre la détection par le lecteur de plaque.
- Charge 80 pi de liquide BY-2 médias dans chaque colonne et rangée de la plaque de criblage 96 puits fluorescent à partir de la colonne 2.
- Dans la colonne 1 d'une plaque de criblage 96 puits fluorescent, ajouter 70 pi de protoplastes et 50 ul PAR-2 médias à chaque puits dans la colonne.
- Placer la plaque dans le nid 6 de la plate-forme de traitement des liquides automatisé, et exécuter une dilution en série 2 fois.
- Pour effectuer une dilution en série sur la plate - forme de traitement des liquides automatisé, cliquez sur Lancer l' Assistant Dilution série et régler le volume de transfert (60 pi), le nombre de mélanges et volume (2, 70 pl), des puits initiaux (colonne 1, lignes AF), la dilution puits (colonnes 2-11, lignes AF), et aspiration et de distribution des biens (0,5 mm de fond de puits).
- Après avoir réglé les paramètres, enregistrer uned exécuter le protocole.
Remarque: Comme tous les protoplastes sont étiquetés avec PI (en raison de la fixation des cellules), la fluorescence est proportionnelle à la concentration de protoplastes. - Après la dilution en série est terminée, retirez la plaque du nid 9 et l'insérer dans le lecteur de plaque et exécuter le protocole de courbe standard dans le logiciel de lecteur de plaque.
NOTE: Une courbe standard sera alors généré en comparant la fluorescence de PI (excitation 536 nm / émission 620 nm) dans chaque puits avec la concentration de protoplastes connue.
- À la fin du protocole de lecteur de plaque, enlever la plaque et de recueillir toutes les cellules transgéniques pour l'autoclavage ou d'autres procédures de-vitalisation tels que définis dans les protocoles de biosécurité ».
4. Analyse microscopique de la transformation
- Retirer la plaque avec des protoplastes transformées (le produit du Protocole automatisé 3, fichier supplémentaire) de l' Hôtel 1 du système robotique.
- Toursur microscope inversé, la caméra et la lampe fluorescente.
- Sélectionnez l'objectif 10X pour initial se concentrant sur les protoplastes, allumer la lampe halogène, et fermer l'obturateur pour la lampe fluorescente.
- plaque de charge sur le système microscopique et de se concentrer sur les protoplastes utilisant fond clair.
- Après s'être concentrée sur protoplastes, éteindre l'ampoule halogène et ouvrir l'obturateur pour la lampe fluorescente.
- Sélectionnez le filtre CY3 / TRITC fixé pour la visualisation de la protéine pporRFP exprimée par les protoplastes transgéniques.
- Balayez chaque puits pour déterminer le nombre de protoplastes exprimant le pporRFP marqueur fluorescent.
- Calculer l'efficacité de transformation que le nombre total de protoplastes exprimant le marqueur fluorescent du nombre total de protoplastes.
- Collecter des plaques contenant des cellules transgéniques dans des sacs de biosécurité approuvés pour autoclavage ou d'autres procédures de-vitalisation tels que définis dans les protocoles de biosécurité ».
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Representative Results
Dans la présente étude, le taux de doublement de BY-2 a varié de 14 à 18 h dépendant de la température à laquelle les cultures ont été incubées, en accord avec les rapports précédents, d'une longueur moyenne de 15 heures du cycle cellulaire. Avec ce taux de doublement, 1: 100 à partir inoculum a été utilisé pour initier des cultures, ce qui conduit à des cultures avec un volume cellulaire tassé (CVP) de 50% en 5-7 jours. Dans le protocole actuel, dans lequel les cultures ont été cultivées dans 200 ml de milieu, un hématocrite de 100 ml a été générée en 7 jours, qui a fourni suffisamment de cellules pour remplir 33 plaques de 6 puits. En termes de rendement de protoplastes, la digestion dans les conditions spécifiées dans le protocole généré 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplastes par puits, résultant en 2,82 x 10 6 protoplastes par plaque de 6 puits (figure 2A). Sur la base de ces données, 214 plaques à 96 puits (70 pi de protoplastes par puits) peuvent être chargés à partir d'une seule digestion de plaque à 6 puits, avec le potentiel for deux plaques 6 puits à être digérées simultanément, en utilisant les deux stations de chauffage à plaque / refroidissement. Ainsi, le nombre maximum de protoplastes qui peuvent être générées au cours d' un protocole unique de digestion de trois heures est de 5,64 x 10 6.
Bien que le nombre total de protoplastes générés par le protocole de digestion fournit une métrique pour le système, il est également nécessaire d'évaluer la perte de concentration protoplaste comme les protoplastes sont transférés à travers les différentes étapes du protocole. Par conséquent, la concentration de protoplastes a été évaluée après chaque étape de transfert dans le protocole. Une fois le protocole de digestion, de 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplastes ont été transférés à chaque puits des plaques à puits profonds de 96, si la réalisation du protocole de transformation, ou la plaque de criblage 96 puits fluorescent (figure 2B). Une fois le protocole de transformation a été terminée, 1,23 x 10 3 ± 4,66 x10 1 protoplastes ont été transférés à la fluorescence plaque de blindage 96 puits (figure 2C). En plus du nombre de protoplastes transférés, il était important de déterminer la viabilité des protoplastes pour veiller à ce que plusieurs étapes de pipetage ne pas endommager les protoplastes.
Sur la base des résultats de l'essai de viabilité, 95,1 ± 0,04% des protoplastes étaient viables après digestion, 92,1 ± 0,06% après le transfert à la plaque de criblage 96 puits fluorescent et 91,7 ± 16,67% après le protocole de transformation. En dépit de multiples étapes de pipetage, il n'y avait pas de différence significative (p> 0,44) entre l'un quelconque des échantillons. En plus de cette mesure de la viabilité, un protocole a été mis au point pour déterminer la concentration de protoplastes à toute étape de la procédure en mesurant le nombre total de protoplastes colorées avec du PI. Comme on le voit sur la figure 3, une courbe standard a été generated en mesurant l'intensité de fluorescence pour des concentrations connues de protoplastes à partir du système. La courbe standard est un bon ajustement (R 2 = 0,967) avec le nombre total de protoplastes couvrant la plage de 0 à 30 000 protoplastes par puits. Pour valider la courbe standard, l'intensité de fluorescence d'échantillons avec un nombre connu de protoplastes (8125 et 24375 calculées en utilisant un hémocytomètre) a été obtenu et le nombre de protoplastes calculés à partir de l'équation de la courbe standard. Sur la base de ces résultats, la courbe standard prédit 9,560 et 28,200 protoplastes dans chaque puits, une erreur 15 et 14%. Considérant qu'il existe également une variabilité dans la mesure du nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre, cette erreur a été jugée acceptable.
En plus des résultats du nombre de cellules et la viabilité, le protocole de transformation a permis de générer des cellules transgéniques qui expriment PFO (figure 2D - F). Malheureusement, le protocole utilisé a donné lieu à basse ~ 2%, l'efficacité de transformation, en raison du grand plasmide binaire 16028 paires de bases utilisées dans cette étude et que le protocole n'a pas été optimisé spécifiquement pour BY-2 protoplastes. Optimisation du protocole de transformation, en termes de réactifs et de conditions spécifiquement pour BY-2 protoplastes, devrait augmenter l'efficacité de transformation, comme décrit dans la discussion. En termes de ce protocole, la procédure de transformation a été conçu pour démontrer le chemin de preuve de concept de l'isolement de protoplastes à la transformation, et a réussi à atteindre cet objectif.
Après avoir validé avec succès toutes les procédures individuelles, des mesures ont été obtenues pour la timecourse du protocole de l'isolement de protoplastes à la transformation. Comme le montre la figure 4, le principal investissement de temps est passé à l'étape de la digestion, dans laquelle 3 heures a été nécessaire for digestion complète de la paroi cellulaire et la libération des protoplastes. Au cours de cette procédure, 18 boucles sont exécutées entre l'agitateur de plaque et de la plaque de chauffage / refroidissement 1 station d'incubation, avec le moteur de plaque déplacer la plaque entre les deux stations. Le temps de transfert entre l'agitateur de plaque et de la plaque de chauffage / refroidissement 1 ne prend que 8,9 secondes, et veille à ce que la majorité de la procédure de digestion est passé en phase d'incubation et des tremblements. La durée totale de l'initiation de la procédure pour terminer le chargement des enzymes par le distributeur multi-mode est de 2,2 min. Dans l'ensemble, le protocole complet d'isolement de protoplastes est achevée en 3 heures et 22,8 min. Sur la base de ces résultats, 88% du protocole d'isolement de protoplastes est passé à digérer. Après l'achèvement du protocole d'isolement de protoplastes, le protocole de transformation est initiée et terminée dans 27,5 min. Similaire au protocole d'isolement de protoplastes, 72% de la procédure de transformation est passé l'incubation de la réaction. La seule autre étape dans le protocolequi a une composante significative de temps (> 10% de la durée de la procédure totale) est l'initialisation du protocole de la plate-forme de traitement des liquides automatisé, qui représente 14% du temps total de la procédure. De cette façon, 86% du protocole est consacré à l'initialisation et l'incubation, avec seulement 14% du temps passé sur pipetage et de transfert étapes. La durée totale de l'isolement de protoplastes et la transformation a été de 3 heures, 50 minutes et 53 secondes, sans apport externe requise de l'opérateur.
Figure 1:. Schématique de la plate - forme robotique et la configuration de la plate - forme de traitement des liquides automatisé pendant le protocole (A) Le système robotique est composé de 3 plaques piles / hôtels qui peuvent être accessibles par le moteur de la plaque. Hôtel 1 est la station operculage / delidding désigné, Hôtel 2 est la fluorescence de 96 puitspile de plaques, et Hôtel 3 est la plaque pile 6 puits. Le système comporte deux manipulateurs de liquide, une plate-forme de manutention de liquides automatisé, et un distributeur multi-mode à base de buse. Pour le chauffage / refroidissement de la plate-forme robotique a deux chauffage / unités de refroidissement de la plaque, avec un agitateur de plaque pour mélanger la plaque. Enfin, le système comporte un lecteur de plaques à base de monochromateur pour mesurer la fluorescence. Tous les composants sont logés dans une armoire de biosécurité construit sur mesure. (B) Lancement de la configuration de la plate - forme de traitement des liquides automatisé avec nid 2 occupée par la plaque de réactif et la boîte de pointe placée sur son nid 8. (C) Configuration de liquide automatisé plate - forme de traitement avant d'appeler un protocole expérimental. Une plaque de puits profonds est situé sur le nid 4, une plaque de criblage 96 puits fluorescent est situé sur le nid 6, et la plaque de 6 puits contenant protoplastes est situé sur le nid 5. S'il vous plaît cliquez ici pour v IEW une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Des images représentatives de PAR-2 protoplastes après chaque transfert et après transformation avec le gène de la protéine rapporteur fluorescent orange (A - C) Micrographies de PAR-2 densité de protoplastes dans 6 puits plaque, plaque de 96 puits après le transfert de 70. ul de la plaque de 6 puits et 96 puits fluorescent plaque de criblage post-transformation. (D) Brightfield micrographie de PAR-2 protoplastes après transformation. (E) Fluorescent PAR-2 protoplastes exprimant le gène OFP visualisé en utilisant un filtre du / TRITC ensemble Cy3. (F) de recouvrement de fond clair et des micrographies fluorescentes montrant la faible efficacité de la transformation. Barre d'échelle = 50 pm. target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. Courbe standard pour calculer le nombre de protoplastes Le nombre de protoplastes dans un puits donné peut être calculé en comparant l'intensité de fluorescence en unités arbitraires (UA), l'équation pour la courbe standard. Validation du nombre de protoplastes a été comparée entre la courbe standard et hémocytomètre au point indiqué sur le graphique, avec 9,561 protoplastes identifiés à partir du lecteur de plaque, et 8.125 compté sur la hémocytomètre. Dans l' ensemble, une erreur de 15% a été observée entre les deux techniques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 4:. Diagramme de Gantt pour la procédure décrite pour la production de PAR-2 protoplastes et la transformation génétique La majorité du protocole, ~ 3 h, est consacré à la digestion des cellules BY-2 pour générer les protoplastes. Chargement de la solution d'enzyme et d'inactivation nécessite seulement 12% du temps total de la procédure. De même, l'incubation de la réaction de transformation sur l'agitateur de plaque représente 72% du protocole de transformation. Dans l' ensemble, la procédure d'isolement de protoplastes jusqu'à ce que la transformation génétique est obtenue est inférieure à 4 h (3 h, 50 min et 53 sec). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Dossier supplémentaire: Les protocoles automatisés pour l' isolement de protoplastes, le comptage des cellules, et la transformation médiée par PEG <./ strong> protocoles complets développés pour une utilisation dans la plate - forme robotique pour accomplir chacune des tâches énumérées ci - dessus sont inclus dans ce fichier. S'il vous plaît cliquer ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
Le protocole décrit ci-dessus a été validé avec succès pour l'isolement de protoplastes, l'énumération et la transformation du tabac en utilisant une culture de cellules en suspension BY-2; Toutefois, le protocole pourrait facilement être étendu à toute culture de suspension de la plante. À l' heure actuelle, l' isolement de protoplastes et la transformation ont été réalisés dans de nombreuses plantes, notamment le maïs (Zea mays) 10, la carotte (Daucus carota) 32, le peuplier (Populus euphratica) 33, raisin (Vitis vinifera) 34, le palmier à huile (Elaeis guineensis) 35 , la laitue (Lactuca sativa) 36, moutarde (Brassica juncea) 37, le riz (Oryza sativa) 38, et le panic (Panicum virgatum) 39,40. Alors que la variation dans la culture et la digestion des conditions se produire d'une espèce à, en termes de protocole mis au point dans ce travail, en remplaçant les milieux de culture ou de modifier les conditions de fouilleestion ne devrait pas modifier le protocole fondamental. Pour régler à différentes espèces, les milieux de culture et les enzymes nécessaires à la digestion sont chargés par l'opérateur avant l'initialisation du protocole, ainsi la permutation de ces composants est trivial. Comme un avantage supplémentaire, le protocole est amendable au dépistage de multiples conditions de digestion avec le rendement de protoplastes mesurées par le système. Ceci est un élément essentiel, comme l'utilisation d'enzymes à faible coût sont nécessaires pour les applications à haut débit, il est donc important de réduire au minimum la quantité d'enzymes utilisés dans la digestion.
Semblable à la culture et de la digestion, les modifications du protocole de transformation seraient nécessaires lors de l'adoption du système de transformation de protoplastes isolés à partir de différentes espèces végétales. Un travail considérable a été réalisé sur l' optimisation de la transformation médiée par PEG dans des protoplastes de plantes 16,35, avec de nombreux facteurs qui influent sur l'efficacité de la transformation. Dans le courant work un facteur limitant qui affecte l'efficacité de transformation a été la grande taille du plasmide de test binaire, 16028 pb, qui a été utilisé à des fins de modélisation d'une taille de plasmide du génome d'édition. Dans des études antérieures sur la transformation médiée par PEG de protoplastes par 2, 40 à 60% de transformation a été atteint; Toutefois, ces études ont utilisé des petits plasmides 5000 pb 41,42. Les principales modifications à la transformation médiée par PEG parmi les espèces comprennent la concentration du PEG et du MgCl 2, la quantité et la concentration de l' ADN, et la durée de réaction. Comme les 2 solutions de PEG et MgCl sont introduits dans le système sur la plaque de réactif, et l'ADN est pré-chargé dans la plaque de puits profonds, ces conditions peuvent être facilement modifiés dans le protocole décrit ci - dessus. En outre, augmenter ou diminuer la durée d'incubation, ainsi que la modification des vitesses de mélange, peut être contrôlée avec précision par la plate-forme robotique. La limitation de courant du protocole de transformation est le manquede criblage en utilisant le lecteur de plaque pour détecter le rapporteur fluorescent, en raison de la faible efficacité de la transformation médiée par PEG dans des protoplastes par 2. Dans d' autres espèces, telles que Arabidopsis thaliana et le maïs 16, la transformation médiée par PEG est de 40 à 90% d' efficacité. Dans ces systèmes, les transformants peuvent être caractérisés rapidement à l'aide du lecteur de plaque sur le robot. Ainsi, il serait possible d'identifier les puits avec des transformants positifs et aussi quantifier le niveau d'expression. Pour les applications, telles que le dépistage du promoteur, cette fonctionnalité augmenterait l'utilité du protocole actuel, et sera ajouté dans les itérations ultérieures du système.
En plus de l'optimisation de l'efficacité de transformation de BY-2 protoplastes, plusieurs modifications peuvent augmenter l'efficacité et le rendement global du système. Des études antérieures sur l'automatisation de la transformation de protoplastes a permis protoplastes se déposer au fond du puits, préalablement à l'addition d'ah 43 solutions. Dans le protocole actuel, les protoplastes ont été mélangés sur l'agitateur de plaque pour empêcher la décantation et de garder les protoplastes en suspension en utilisant des plaques planes de puits à fond. En outre, lors de la transformation, les protoplastes ne sont pas autorisés à installer dans les plaques à puits profonds, pour réduire l'exposition au PEG, qui peut être toxique sur une exposition prolongée. A ce titre, les protoplastes ont été diluées ~ 10 fois avec une solution W5 lors de son transfert de la plaque de fond de puits à la plaque de criblage 96 puits fluorescent, résultant en 1,23 x 10 3 4,66 x 10 ± 1 protoplastes par puits. Afin d'augmenter le nombre de protoplastes transférés après transformation, une étape d'incubation peut être ajoutée afin de permettre protoplastes se déposer et on élimine le surnageant suivie de l'addition d'un petit volume de milieu liquide BY-2. En outre, si une centrifugeuse à base de type plaque a été ajouté au système, cette étape peut être réalisée plus rapidement. Une autre modification qui pourrait ajouter des fonctionnalités à til système serait l'utilisation d'un test en direct mort / de fluorescence pour déterminer la viabilité des protoplastes isolés avant transformation. Dans le protocole actuel, diacétate de fluorescéine (FDA) a été testé comme un colorant direct; cependant, le PAR-2 protoplastes fluorescence de fond obscurci le signal FDA. Si un colorant de viabilité plus stable a été utilisé, la viabilité des protoplastes peut être déterminé comme le rapport entre le rouge (PI) au vert (calcéine AM, etc.) , la fluorescence, et normalisée similaire au protocole de comptage cellulaire. Ces modifications ajouteraient des fonctionnalités supplémentaires au système, et seront inclus dans les futurs protocoles.
En ce qui concerne le protocole actuel, il y a plusieurs étapes critiques qui doivent être suivies pour assurer le succès du protocole. Tout d'abord, l'âge / santé des BY-2 cultures est essentielle pour garantir que les protoplastes viables peuvent être isolés pour les étapes suivantes. Comme cela est expliqué dans l'étape 1.3, en transférant une culture en phase logarithmique à une nouvelle fiole à1h50 rapport des cellules à un milieu frais, et permettant la culture se développer pendant 5-7 jours, le nombre maximal de protoplastes viables peut être isolé. Permettre aux cultures de se développer pour des durées plus ou moins longues à l'aide de l'inoculum spécifié réduira considérablement le rendement de protoplastes, et causer une défaillance des protocoles ultérieurs. Une deuxième étape critique est l'étape 1.5, car l'utilisation de embouts de pipettes standard, au lieu des embouts de pipettes de large calibre spécifiées, entraînera les conseils pour bouchent et conduisent à des volumes incorrects étant transférés. En ce qui concerne la configuration du système robotique, l'agencement des plaques sur la plate-forme de traitement des liquides automatisé, l'étape 2.4, est critique, avec une configuration modifiée empêchant la tête du manipulateur de liquide d'atteindre tous les puits sur la plaque de 6 puits. Grâce à la conception de la plate-forme de traitement de liquide automatique, la plaque de 6 puits doit être placé dans le nid 5 ou protocoles sélectionnés pour cet instrument échouera. De même, le défaut de définir correctement le labware dans la plaquelogiciel de moteur, l'étape 2.2, provoquera l'instrument ne parviennent pas à saisir, ou laisser tomber le labware aboutissant à l'arrêt du protocole. Pour le protocole de comptage de cellule, l'étape essentielle consiste à la fixation des cellules avec de l'éthanol, l'étape 3.2. Si les cellules ne sont pas fixés avant l'étiquetage avec PI, seules les cellules non viables seront marqués, au lieu de l'ensemble de la population de protoplastes, et il ne sera pas possible de compter le nombre de protoplastes isolés. L'étape critique finale, l'étape 4.6 consiste à sélectionner des filtres à fluorescence pour l'analyse microscopique de l'expression du marqueur fluorescent pporRFP. L'utilisation d'autres "rouges" jeux de filtres permet d'arrière-plan de fluorescence de la chlorophylle, ce qui augmente significativement le signal dans toutes les protoplastes contenant des chloroplastes, ce qui empêche le calcul de l'efficacité de transformation. adhérant soigneusement les spécifications de ces étapes critiques garantit la plus grande opportunité pour le succès et la génération des données les plus reproductibleset.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier en compétition.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
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