Summary
Una metodología de alto rendimiento, la producción de protoplastos de tabaco automatizado y se describe la transformación. El sistema robótico permite la expresión de genes masivamente paralelo y el descubrimiento en el sistema modelo BY-2 que debe ser traducible a los cultivos no modelo.
Abstract
Durante la última década ha habido un resurgimiento en el uso de protoplastos de plantas que van desde especies modelo para recortar las especies, para el análisis de las vías de transducción de señales, redes de regulación transcripcional, la expresión de genes, genoma de edición, y el silenciamiento de genes. Por otra parte, se ha hecho un progreso significativo en la regeneración de plantas a partir de protoplastos, que ha generado aún más interés en el uso de estos sistemas para la genómica de las plantas. En este trabajo, un protocolo ha sido desarrollado para la automatización de aislamiento de protoplastos y la transformación de 2 (A-2) un cultivo en suspensión de tabaco 'amarillo brillante' usando una plataforma robótica. Los procedimientos de transformación se validaron utilizando una proteína fluorescente de color naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) bajo el control del promotor del virus del mosaico de la coliflor 35S (35S). expresión OFP en protoplastos se confirmó por microscopía de epifluorescencia. Los análisis también incluyen métodos de eficiencia de producción de protoplastos utilizando propidium yoduro. Por último, se utilizaron enzimas de grado alimenticio de bajo costo para el procedimiento de aislamiento de protoplastos, eludiendo la necesidad de enzimas de laboratorio de grado que son un costo prohibitivo en automatizada de alto rendimiento de aislamiento y análisis de protoplastos. Basado en el protocolo desarrollado en este trabajo, el procedimiento completo de aislamiento de protoplastos a la transformación puede llevarse a cabo en menos de 4 horas, sin ninguna entrada por parte del operador. Mientras que el protocolo desarrollado en este trabajo se validó con el cultivo de células BY-2, los procedimientos y métodos deben ser traducible a cualquier sistema de cultivo en suspensión planta / protoplastos, que debería permitir la aceleración de la investigación genómica de cultivos.
Introduction
En los últimos años ha habido un importante impulso colocado en el diseño de los cultivos transgénicos para superar diversas enfermedades 1, dotar de resistencia al herbicida 2, conferir sequía 3,4 y tolerancia a la sal 5, prevenir herbivoría 6, aumentar la producción de biomasa 7, y disminuir la obstinación pared celular 8. Esta tendencia se ha visto favorecido por el desarrollo de nuevas herramientas moleculares para la generación de plantas transgénicas, incluyendo genoma de edición utilizando CRISPR y Talens 9, y el silenciamiento de genes a través de dsRNA 10, 11 miRNA y siRNA 12. Si bien estas tecnologías han simplificado la generación de plantas transgénicas, también han creado un cuello de botella, donde la gran cantidad de plantas transgénicas generadas no pueden ser examinados utilizando los sistemas tradicionales que se basan en la regeneración de plantas. En relación con este cuello de botella, mientras que el silenciamiento y construcciones de edición de genoma se pueden insertar rápidamente en plantas, muchos de losrasgos específicos no producen el efecto deseado, que a menudo no se descubre hasta que las plantas se analizan en el invernadero. En este trabajo, hemos desarrollado un método para la rápida detección automatizada, y de alto rendimiento de protoplastos de plantas, específicamente para hacer frente al actual bloqueo en la detección precoz de un gran número de genoma de edición y silenciamiento de genes objetivos.
El uso de protoplastos, en oposición a las células vegetales intactas, tiene varias ventajas para el desarrollo de una plataforma automatizada. En primer lugar, los protoplastos se aislaron después de la digestión de la pared celular vegetal, y con esta barrera ya no está presente, la eficiencia de transformación se incrementa 13. En las células vegetales intactas sólo hay dos métodos bien establecidos para la transformación biolística, 14 y transformación mediada por Agrobacterium 15. Ninguno de estos métodos se puede traducir fácilmente a plataformas de manejo de líquidos, como biolística requiere equipo especializado para transfoconfirmación, mientras transformación mediada por Agrobacterium requiere co-cultivo y la posterior eliminación de las bacterias. Tampoco son susceptibles de métodos de alto rendimiento. En el caso de protoplastos, la transformación se lleva a cabo rutinariamente utilizando polietilenglicol (PEG) transfección mediada por 16, que sólo requiere varios intercambios de solución, y es ideal para las plataformas de manejo de líquidos. En segundo lugar, los protoplastos, por definición, son cultivos de una sola célula, y por lo tanto los problemas asociados con la formación de grumos y de la cadena en cultivos de células vegetales, no se observan en los protoplastos. En cuanto a la detección rápida utilizando un espectrofotómetro basado en placas, agrupación de células o células en múltiples planos dará lugar a dificultades en la adquisición de mediciones consistentes. Desde protoplastos son también más denso que su medio de cultivo, que sedimentan en el fondo de los pozos, la formación de una monocapa, que es propicio para la espectrofotometría a base de placa. Por último, mientras que los cultivos en suspensión de células vegetales son primarily derivado de callus 17, los protoplastos se pueden cosechar a partir de un número de tejidos de la planta, dando lugar a la capacidad de identificar la expresión específica de tejido. Por ejemplo, la capacidad de analizar Raíz o expresión de hoja específica de un gen puede ser muy importante a la predicción fenotipo. Por estas razones, los protocolos desarrollados en este trabajo se validaron utilizando protoplastos aislados del tabaco utilizado ampliamente (Nicotiana tabacum L.) 2 (A-2) cultivo en suspensión 'amarillo brillante'.
El cultivo en suspensión BY-2 se ha descrito como la célula "HeLa" de las plantas superiores, debido a su uso ubicuo en el análisis molecular de las células vegetales 18. Recientemente, AP-2 células se han utilizado para estudiar los efectos de los factores de estrés vegetal 19-22, intracelular localización de la proteína 23,24, y la biología celular básica 25-27 demuestra la amplia utilidad de estas culturas en biología vegetal. Una ventaja adicional de la AP-2 culturas es lacapacidad de sincronizar los cultivos con afidicolina, que puede conducir a la reproducibilidad mejorada para la expresión génica estudia 28. Además, se han desarrollado métodos para la extracción de BY-2 protoplastos usando enzimas de bajo coste 29,30, como enzimas utilizadas tradicionalmente para generar protoplastos son costo prohibitivo para los sistemas de alto rendimiento. Como tal, el protocolo descrito a continuación ha sido validado con el cultivo en suspensión BY-2, pero debe ser modificable a cualquier cultivo en suspensión de células vegetales. Experimentos de prueba de concepto se realizan utilizando una proteína de la fluorescencia naranja (OFP) gen reportero (pporRFP) de los Porites de coral Porites duros 31 bajo el control del promotor CaMV 35S.
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Protocol
1. Establecimiento de suspensión Cultivos Celulares
- Preparar líquido BY-2 medios de comunicación mediante la adición de 4,43 g Linsmaier y Skoog medios basales, 30 g de sacarosa, 200 mg de KH 2 PO 4, y 200 g de ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D) a 900 ml de agua destilada el agua y el pH a 5,8 con 0,1 M de KOH. Después de ajustar el pH, ajustar el volumen final a 1.000 ml con agua destilada y se autoclave. Los medios pueden ser almacenados hasta 2 semanas a 4 ° C.
- Inocular un matraz Erlenmeyer de 250 ml con 100 ml de líquido BY-2 medios de comunicación y una sola pieza de BY-2 del callo (> 1 cm de diámetro) cultivadas en sólidos BY-2 (del líquido BY-2 medios con la adición de 1% agar) y sellar con papel de aluminio. Incubar cultivo a 28-30 ° C con agitación durante 5 días.
NOTA: POR-2 callo se mantuvo en medio sólido para almacenamiento a largo plazo, ya que los cultivos líquidos se cubran rápidamente. volumen de cultivo se puede ajustar según sea necesario, típicamente un cultivo de 100 ml será capaz de cargar treinta y tres 6-wplacas de ELL. - Transferencia de 2 ml de la fase de registro BY-2 de cultivo a 98 ml de frescas medios BY-2 y se incuba durante 5-7 días a 28-30 ° C con agitación.
NOTA: Sub-cultivo de cultivos líquidos establecidos puede llevarse a cabo utilizando regularmente 1: 100 diluciones de las culturas antiguas 5-7 día, en lugar de la inoculación con el callo. - Mezclar a fondo la cultura, como las células se depositan rápidamente, y la transferencia de 6 ml del cultivo celular a un tubo de centrífuga de 15 ml de fondo cónico y dejar que las células se depositan durante al menos 10 min. Ajustar el volumen de células empaquetadas a 50% del volumen total mediante la eliminación de sobrenadante.
- Agitar tubo por inversión y pipeta de 500 l en cada pocillo de una placa de 6 pocillos para la digestión. Utilice pipetas de todo el taladro para transferir las células en esta etapa, ya que son densos y obstruye los puntas de pipeta estándar.
2. Aislamiento de protoplastos
- Encienda todos los componentes del sistema robótico (Figura 1) y abra la tarea de programar la placa motor suavemercancía. El programa de la programación de tareas integra el motor de microplacas con el resto del equipo para permitir la transferencia de las placas entre cada pieza del equipo.
- Antes de la experimentación, definir las especificaciones técnicas de los aparatos de laboratorio (por ejemplo, platos, tapas) utilizados en el protocolo, así como posiciones inicial y final de cada pieza de material de laboratorio, en el software de la placa de motor, de la siguiente manera:
- Haga clic en Configuración de la barra de herramientas principal en el software de la placa de motor y seleccione el contenedor de comandos Administrar tipos.
- Si el tipo de contenedor aparece en la biblioteca de tipos de contenedores existentes, a continuación, seleccione el contenedor adecuado.
- Si el tipo de envase no aparece en la biblioteca de tipos de contenedores existentes continuación, haga clic en Agregar para especificar un nuevo tipo de contenedor.
- Después de la adición de un nuevo tipo de contenedor, introduzca las dimensiones del nuevo contenedor (altura, anchura, dimensiones de apilamiento, y la pinza de compensación) en las fichas apropiadas y haga clic en Guardar.
- Si las dimensiones correctas no están disponibles por el fabricante, a continuación, determinar con precisión todas las dimensiones al milímetro más cercano usando calibres. Los errores en la medición de las dimensiones de los contenedores van a resultar en una falla del motor placa.
- Repita los pasos 2.2.2 a 2.2.4.1 para todos los tipos de contenedores que el motor placa tendrá que enfrentar. Después de la terminación de este paso para todos los aparatos de laboratorio, es necesario definir el comienzo y la ubicación final para cada contenedor (etapa 2.2.6).
NOTA: Para este protocolo incluye el material de laboratorio de la placa de 6 pocillos, la placa de pozo profundo, y la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente. - Para definir la posición de inicio y final de cada contenedor, haga clic en la pestaña de inicio / fin en un protocolo específico. En primer lugar, seleccionar la posición de inicio de cada contenedor. A continuación, marque la casilla de Lidded / Unlidded tanto en la posición inicial y final. Repita este procedimiento para todos los contenedores.
NOTA: Si el contenedor será dejado en otro pedazo de equipment (en lugar de la placa de motor) la localización final puede dejarse en blanco.
- En esta etapa cargar manualmente todas las placas en la posición de partida para todo el flujo de trabajo. Cargar las placas de detección fluorescentes de 96 pocillos en hoteles 2, placas de 6 pocillos con células BY-2 en hotel 3, una placa de 96 pozos profundos que se utiliza para la transformación en calentador de placas / enfriador nido 2, y un cónico de 50 ml tubo que contiene la solución de enzima (véase el archivo de consulta, sección 1.2.2) en el dispensador de multi-modo.
- Si la transformación se lleva a cabo en el protocolo, pre-cargar la placa de pozo profundo 96 con 10 l de plásmido de ADN por pocillo (1 mg / l, A 260/280> 1,8) que contiene el constructo indicador OFP y se incuba en la placa calentador / refrigerador a 4 ° C. Cada pozo se utiliza para una sola transformación, por lo tanto el número de pozos llenos dependerá de la configuración experimental.
- Cargar todos los suministros y placas en el automaticed plataforma de manejo de líquidos en los lugares designados y definir la posición de cada elemento en el software de control de automatización (Figura 1B).
- Cargar una placa de 96 pocillos precargada con 200 l de 40% de PEG MMG (0,4 M de manitol, 100 mM de MgCl 2, MES 4 mM, pH 5,7) en la columna 1, 200 l de yoduro de propidio (PI, 1 mg / ml) en la columna 2, y 200 l de etanol en la columna 3 (nido 2), y una caja de puntas de pipeta en el nido 8.
- Para definir la ubicación del material de laboratorio en el software de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, seleccione Herramientas en el menú y haga clic en Editor de material de laboratorio.
- Seleccione el tipo de material de laboratorio en el menú desplegable o definir un nuevo tipo de material de laboratorio utilizando el botón Nuevo material de laboratorio.
- Definir la posición de cada pieza de material de laboratorio seleccionadas mediante la selección de la ficha Protocolo principal y haciendo clic en Configurar para laboratorio. Asegúrese de que cada pieza de material de laboratorio colocado en la plataforma de manejo de líquidos automatizado esdefinir antes de ejecutar el protocolo.
- Para activar los protocolos automatizados, haga clic en la ventana del perfil Explorer y seleccione el nombre del protocolo que va a ejecutar (el aislamiento de protoplastos, recuento de células, y la transformación mediada por PEG).
- Haga clic en Ejecutar para inicializar todos los dispositivos que serán utilizados en el protocolo.
- Por último, en la ventana del Explorador de trabajo, haga clic en Agregar unidad de trabajo para verificar todos los contenedores / material de laboratorio en el sistema y comenzar el protocolo automatizado.
NOTA: Las descripciones completas de los protocolos automatizados están contenidas en el archivo suplementario.
3. Establecer curva estándar para contar las células
- Concentrar manualmente protoplastos a una concentración de 1 x 10 6 protoplastos / ml en un volumen de 1 ml. Centrifugar protoplastos a 1.000 xg durante 10 min, y eliminar el sobrenadante.
- Adición manual de 900 l de etanol al 70% (se mantiene a 4 ° C) al sedimento de protoplastosy volver a suspender el sedimento. Incubar durante 10 minutos en hielo para fijar las células.
- Añadir 100 l de PI (1 g / ml) a los protoplastos para etiquetar los núcleos y permitir la detección por el lector de placas.
- Carga de 80 l de líquido BY-2 medios en cada columna y fila de la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente a partir de la columna 2.
- En la columna 1 de una placa de cribado de 96 pocillos fluorescente, añadir 70 l de protoplastos y 50 l por 2 los medios de comunicación a cada pocillo en la columna.
- Colocar la placa en nido 6 de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, y ejecutar una serie de dilución de 2 veces.
- Para llevar a cabo una dilución en serie en la plataforma de manejo de líquidos automatizado, haga clic en Iniciar Asistente de dilución en serie y ajustar el volumen de transferencia (60 l), número de mezclas y volumen (2, 70 l), pozos iniciales (columna 1, filas AF), la dilución Wells (2-11 Columnas, Filas AF), y aspirar y dosificar propiedades (0,5 mm del fondo del pozo).
- Después de ajustar los parámetros, guardar unad ejecutar el protocolo.
NOTA: Dado que todos los protoplastos se marcan con PI (debido a la fijación de las células), la fluorescencia es proporcional a la concentración de protoplastos. - Después de que se completó la dilución en serie, retirar la placa de nido 9 y se insertan en el lector de placas y ejecutar el protocolo de curva estándar en el software lector de placas.
NOTA: una curva estándar a continuación, se genera comparando la fluorescencia de PI (excitación 536 nm / emisión 620 nm) en cada pocillo con la concentración de protoplastos conocido.
- Tras la finalización del protocolo de lector de placas, eliminar la placa y recoger las células transgénicas para la esterilización en autoclave u otros procedimientos de-vitalizar tal como se definen en los protocolos de seguridad de la biotecnología.
4. Análisis microscópico de Transformación
- Retire la placa con protoplastos transformados (el producto de Protocolo Automatizado 3, Archivo Suplementario) del Hotel 1 del sistema robótico.
- Giroen microscopio invertido, cámara, y la lámpara fluorescente.
- Seleccione el objetivo de 10X para inicial se centra en los protoplastos, encender la lámpara de halógeno, y cerrar el obturador de la lámpara fluorescente.
- Carga de placa en el sistema microscópico y se centran en los protoplastos utilizando campo claro.
- Después de centrarse en protoplastos, apague la lámpara halógena y abrir el obturador de la lámpara fluorescente.
- Seleccione el filtro CY3 / TRITC establecido para la visualización de la proteína pporRFP expresada por los protoplastos transgénicos.
- Analiza cada pocillo para determinar el número de protoplastos que expresan la pporRFP marcador fluorescente.
- Calcular la eficiencia de transformación como el número total de protoplastos que expresan el marcador fluorescente el número total de protoplastos.
- Recoger las placas que contienen células transgénicas en bolsas de bioseguridad aprobados para el tratamiento en autoclave u otros procedimientos de-vitalizar tal como se definen en los protocolos de bioseguridad '.
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Representative Results
En el estudio actual, la tasa de duplicación de BY-2 varió desde 14 hasta 18 hr depende de la temperatura a la cual se incubaron los cultivos, coherente con los informes anteriores de una longitud media del ciclo celular de 15 hr. Con esta velocidad de duplicación, un 1: se utilizó el inóculo de partida 100 para iniciar los cultivos, lo que lleva a los cultivos con un volumen de células empaquetadas (PCV) de 50% en 5-7 días. En el protocolo actual, en el que se hicieron crecer cultivos en 200 ml de medios de comunicación, un PCV de 100 ml se genera en 7 días, que proporcionaron suficientes células para llenar 33 placas de 6 pocillos. En términos de rendimiento de protoplastos, la digestión en las condiciones especificadas en el protocolo generó 4,70 x 10 5 ± 5,77 x 10 3 protoplastos por pozo, lo que resulta en 2,82 x 10 6 protoplastos por placa de 6 pocillos (Figura 2A). Basándose en estos datos, 214 placas de 96 pocillos (70 l de protoplastos por pocillo) se podrían cargar desde una única digestión placa de 6 pocillos, con el potencial for dos placas de 6 pocillos a ser digeridos de forma simultánea, utilizando las estaciones de dos calentador de placas / enfriador. Por lo tanto, el número máximo de protoplastos que se pueden generar durante un único protocolo de digestión de tres horas es 5,64 x 10 6.
Mientras que el número total de protoplastos generados por protocolo digestión proporciona una métrica para el sistema, sino que también es necesario evaluar la pérdida de la concentración de protoplastos como los protoplastos se transfieren a través de las diferentes etapas del protocolo. Como tal, se evaluó la concentración de protoplastos después de cada etapa de transferencia en el protocolo. Después de que el protocolo de la digestión, 1,15 x 10 4 ± 1,35 x 10 2 protoplastos se transfirieron a cada pocillo de las placas de 96 pocillos profundos, si la realización del protocolo de transformación, o la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente (Figura 2B). Una vez que se completó el protocolo de transformación, 1,23 x 10 x 3 ± 4,6610 1 protoplastos se transfirieron a la placa de detección fluorescente de 96 pocillos (Figura 2C). Además del número de protoplastos transferidos, era importante para determinar la viabilidad de los protoplastos para asegurar que las etapas de pipeteado múltiples no dañan los protoplastos.
Basándose en los resultados del ensayo de viabilidad, 95,1 ± 0,04% de protoplastos eran viables después de la digestión, 92,1 ± 0,06% después de la transferencia a la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente, y 91,7 ± 16,67% después de que el protocolo de transformación. A pesar de múltiples pasos de pipeteado, no hubo diferencia significativa (p> 0,44) entre cualquiera de las muestras. Además de esta medida de la viabilidad, se desarrolló un protocolo para determinar la concentración de protoplastos en cualquier etapa del procedimiento mediante la medición de la cantidad total de protoplastos teñidas con PI. Como se muestra en la Figura 3, una curva estándar fue generated mediante la medición de la intensidad de fluorescencia para concentraciones conocidas de protoplastos a partir del sistema. La curva estándar era un buen ajuste (R 2 = 0,967) con el número total de protoplastos que abarcan el intervalo de 0 a 30.000 protoplastos por pocillo. Para validar la curva estándar, la intensidad de fluorescencia de las muestras con un número conocido de protoplastos (8125 y 24375 se calculan usando un hemocitómetro) se obtuvo y el número de protoplastos calculados a partir de la ecuación de la curva estándar. Basándose en estos resultados, la curva estándar predijo 9.560 y 28.200 protoplastos en cada pocillo, un error de 15 y 14%. Teniendo en cuenta que también hay variabilidad en la medición del número de células utilizando un hemocitómetro, este error se consideró aceptable.
Además de los resultados del número de células y la viabilidad, el protocolo de transformación fue exitoso en la generación de células transgénicas que expresan OFP (Figura 2D - F). Desafortunadamente, el protocolo utilizado resultó en baja, ~ 2%, la eficiencia de transformación, debido a la gran plásmido binario 16028 pb utilizado en este estudio y ya que el protocolo no se ha optimizado específicamente para BY-2 protoplastos. , Se espera que la optimización del protocolo de transformación, en términos de reactivos y condiciones expresamente en protoplastos-2 para aumentar la eficiencia de transformación, tal como se explica en la discusión. En términos de este protocolo, el procedimiento de transformación se diseñó para demostrar la ruta de la prueba de concepto de aislamiento de protoplastos a la transformación, y fue un éxito en la consecución de este objetivo.
Después de validar con éxito todos los procedimientos individuales, se obtuvieron las métricas para el transcurso de tiempo del protocolo de aislamiento de protoplastos a la transformación. Como se demuestra en la Figura 4, la mayor inversión de tiempo que se gasta durante la etapa de digestión, en el que se requiere 3 hr for digestión completa de la pared celular y la liberación de los protoplastos. Durante este procedimiento, los bucles 18 se ejecutan entre el / refrigerador 1 estación de incubación agitador de placas y la placa de calefacción, con el motor en movimiento placa de la placa entre las dos estaciones. El tiempo de traslado entre el agitador de placas y calentador de placas / enfriador 1 tarda sólo 8,9 segundos, y asegura que la mayor parte del procedimiento de digestión se gasta la incubación y la agitación. El tiempo total desde la iniciación del procedimiento para completar la carga de las enzimas por el dispensador multi-modo es 2,2 min. En general, el protocolo completo aislamiento de protoplastos se completa en 3 horas y 22,8 min. Basándose en estos resultados, el 88% del protocolo de aislamiento de protoplastos se gasta digiriendo. Después de la terminación del protocolo de aislamiento de protoplastos, se inicia el protocolo de transformación, y completarse dentro de 27,5 min. Al igual que en el protocolo de aislamiento de protoplastos, 72% del procedimiento de transformación se gasta la incubación de la reacción. El único otro paso en el protocoloque tiene un componente significativo de tiempo (> 10% del tiempo total del procedimiento) es el protocolo de inicialización de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, lo que representa el 14% del tiempo total del procedimiento. De esta manera, el 86% del protocolo se gasta en la inicialización y la incubación, con sólo el 14% del tiempo dedicado a las pipetas de transferencia y pasos. La duración completa de aislamiento de protoplastos y la transformación fue 3 h, 50 min, y 53 seg, sin entrada externa requerida del operador.
Figura 1:. Esquema de la plataforma robótica y la configuración de la plataforma de manejo de líquidos automatizado durante el protocolo (A) El sistema robótico se compone de 3 pilas de placas / hoteles que se puede acceder por la compañía plato. Hotel 1 es la estación de tapa / delidding designado, el Hotel 2 es el fluorescente de 96 pocillospila de placas, y Hotel 3 es la pila de placas de 6 pocillos. El sistema tiene dos manejadores de líquidos, una plataforma de manejo de líquidos automatizado y basado en un surtidor de varios modos de funcionamiento. Para la calefacción / refrigeración de la plataforma robótica tiene dos unidades de placa de calefacción / refrigeración, junto con un agitador de placas para la mezcla de la placa. Finalmente, el sistema tiene un lector de placas a base de monocromador para la medición de fluorescencia. Todos los componentes están alojados en un gabinete de bioseguridad hecha a la medida. (B) A partir configuración de la plataforma de manejo de líquidos automatizado con el nido 2 ocupada por la placa de reactivos y la caja de punta colocada en el nido 8. Configuración (C) de la plataforma de manejo de líquidos automatizado antes de llamar a un protocolo experimental. Una placa de pozo profundo se encuentra en el nido 4, una placa de cribado de 96 pocillos fluorescente se encuentra en nido de 6, y la placa de 6 pocillos que contiene protoplastos se encuentra en nido 5. Por favor, haga clic aquí para v IEW una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Imágenes representativas de BY-2 protoplastos después de cada transferencia y después de la transformación con el gen reportero de la proteína fluorescente de color naranja (A - C) Las micrografías de BY-2 densidad de protoplastos en 6 pocillos de placa, placa de 96 pocillos después de la transferencia de 70. l de la placa de 6 pocillos, y fluorescentes placa protectora posterior a la transformación de 96 pocillos. (D) Micrografía de campo claro BY-2 protoplastos después de la transformación. (E) fluorescente BY-2 de protoplastos que expresa el gen OFP visualizado utilizando un conjunto / filtro TRITC Cy3. (F) Superposición de campo claro y micrografías fluorescentes que demuestra la baja eficiencia de transformación. Barra de escala = 50 micras. target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3:. Curva estándar para calcular el número de protoplastos El número de protoplastos en un pocillo dado se puede calcular mediante la comparación de la intensidad de fluorescencia en unidades arbitrarias (AU), a la ecuación de la curva estándar. Validación del número de protoplastos se comparó entre la curva estándar y hemocitómetro en el punto indicado en el gráfico, con 9,561 protoplastos identificados a partir del lector de placas, y 8.125 contados en el hemocitómetro. En general, se ha encontrado un error del 15% entre las dos técnicas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 4:. Diagrama de Gantt para el procedimiento descrito para la producción de BY-2 protoplastos y la transformación genética La mayoría del protocolo, ~ 3 h, se gasta en la digestión de las células BY-2 para generar los protoplastos. La carga de la solución de enzima y la inactivación requiere sólo el 12% del tiempo total del procedimiento. De manera similar, la incubación de la reacción de transformación en el agitador de placas representa el 72% del protocolo de transformación. En general, el procedimiento de aislamiento de protoplastos hasta que se logre la transformación genética es menor de 4 horas (3 horas, 50 minutos y 53 segundos). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo Suplementario: protocolos automatizados para el aislamiento de protoplastos, el recuento de células, y la transformación mediada por PEG <./ strong> protocolos completos desarrollados para su uso en la plataforma robótica para llevar a cabo cada una de las tareas mencionadas anteriormente están incluidos en este archivo. Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
El protocolo descrito anteriormente ha sido validado con éxito para el aislamiento de protoplastos, enumeración, y la transformación mediante el cultivo de células de tabaco suspensión BY-2; Sin embargo, el protocolo puede ampliarse fácilmente a cualquier planta de cultivo en suspensión. En la actualidad, el aislamiento de protoplastos y la transformación que se ha logrado en numerosas plantas, incluido el maíz (Zea mays) 10, la zanahoria (Daucus carota) 32, el álamo (Populus euphratica) 33, uva (Vitis vinifera) 34, la palma de aceite (Elaeis guineensis) 35 , lechuga (Lactuca sativa) 36, mostaza (Brassica juncea) 37, el arroz (Oryza sativa) 38, y el pasto varilla (Panicum virgatum) 39,40. Si bien la variación en las condiciones de cultivo y la digestión ocurrir a partir de una especie a otra, en términos del protocolo desarrollado en este trabajo, en sustitución de los medios de cultivo o alterar las condiciones de excavaciónestion no debe cambiar el protocolo fundamental. Para ajustar a diferentes especies, medios de cultivo y las enzimas necesarias para la digestión son cargados por el operador antes de la inicialización del protocolo, el intercambio de estos componentes por lo tanto es trivial. Como un beneficio adicional, el protocolo es modificable para la detección de múltiples condiciones de digestión con el rendimiento de protoplastos medidos por el sistema. Este es un componente esencial, ya que son necesarias para aplicaciones de alto rendimiento el uso de enzimas de bajo costo, por lo que es importante reducir al mínimo la cantidad de enzimas utilizadas en la digestión.
Al igual que en la cultura y la digestión, modificaciones en el protocolo de transformación serían necesarios al adoptar el sistema de transformación de protoplastos aislados de diferentes especies de plantas. Trabajo considerable se ha llevado a cabo en la optimización de la transformación mediada por PEG en protoplastos de plantas 16,35, con numerosos factores que afectan a la eficiencia de transformación. En la actual work un factor limitante que afecta a la eficiencia de transformación fue el gran tamaño de la plásmido de ensayo binario, 16.028 pb, que se utiliza para los fines de modelado de un tamaño de plásmido de edición de genoma. En estudios anteriores sobre la transformación mediada por PEG de BY-2 protoplastos, transformación 40-60% se ha logrado; Sin embargo, estos estudios utilizaron pequeños plásmidos 5.000 pb 41,42. Las modificaciones principales para la transformación mediada por PEG entre las especies incluyen la concentración de PEG y MgCl 2, la cantidad y concentración de ADN, y la duración de la reacción. Como las 2 soluciones de PEG y MgCl se introducen en el sistema en la placa de reactivo, y el ADN es pre-cargado en la placa de pozo profundo, estas condiciones pueden ser modificadas fácilmente en el protocolo descrito anteriormente. Además, aumentando o disminuyendo el tiempo de incubación, junto con la modificación de velocidades de mezcla, puede ser controlada precisamente por la plataforma robótica. La limitación actual del protocolo de transformación es la faltade control con el lector de placas para detectar el reportero fluorescente, debido a la baja eficiencia de transformación mediada por PEG en protoplastos de BY-2. En otras especies, tales como Arabidopsis thaliana y el maíz 16, transformación mediada por PEG es 40 a 90% de eficiencia. En tales sistemas transformantes se podrían caracterizar rápidamente utilizando el lector de placas en el robot. Por lo tanto, sería posible identificar los pozos con transformantes positivos, y también cuantificar el nivel de expresión. Para aplicaciones, tales como la detección promotor, esta característica podría aumentar la utilidad del protocolo actual, y será añadido en iteraciones posteriores del sistema.
Además de la optimización de la eficiencia de transformación para A-2 protoplastos, varias modificaciones pueden aumentar la eficacia y el rendimiento global del sistema. Estudios anteriores sobre la automatización de protoplastos de transformación de protoplastos permitido a depositan en el fondo de los pozos, antes de la adición de erasoluciones H 43. En el protocolo actual, los protoplastos se mezclaron en el agitador de placas para evitar la sedimentación y mantener los protoplastos en suspensión usando placas de pocillos de fondo plano. Por otra parte, durante la transformación, los protoplastos no se les permitió establecerse en las placas de pozo profundo, para reducir la exposición a PEG, que pueden ser tóxicos durante una exposición prolongada. Como tal, se diluyeron los protoplastos ~ 10 veces con solución W5 cuando se transfieren desde la placa de pozo profundo a la placa de cribado de 96 pocillos fluorescente, resultando en 1,23 x 10 3 ± 4,66 x 10 1 protoplastos por pocillo. Con el fin de aumentar el número de protoplastos transferidos después de la transformación, una etapa de incubación se podría añadir para permitir que los protoplastos se asienten, y se eliminó el sobrenadante seguido de la adición de un volumen más pequeño de líquidos medios BY-2. Además, si una centrífuga basada en la placa se añade al sistema, este paso se puede lograr más rápidamente. Otra modificación que podría agregar funcionalidad a tque el sistema sería el uso de un ensayo de fluorescencia en vivo / muerto para determinar la viabilidad de los protoplastos aislados antes de la transformación. En el protocolo actual, diacetato de fluoresceína (FDA) se ensayó como un colorante directo; Sin embargo, la AP-2 fondo de protoplastos de fluorescencia oscureció la señal de la FDA. Si se utilizó un colorante de viabilidad más estable, a continuación, la viabilidad de protoplastos se pudo determinar como la proporción de rojo (PI) a verde (calceína AM, etc.) de fluorescencia, y estandarizado similar al protocolo de recuento celular. Estas modificaciones podrían añadir más funcionalidad al sistema, y serán incluidos en futuros protocolos.
Con respecto al protocolo actual, hay varios pasos críticos que se deben seguir para asegurar el éxito del protocolo. En primer lugar, la edad / salud de las BY-2 culturas es esencial para garantizar que los protoplastos viables pueden ser aisladas para las etapas posteriores. Como se explica en el paso 1.3, mediante la transferencia de un cultivo en fase log a un matraz fresco en unarelación de 1:50 de las células a medio fresco, y permitiendo que el cultivo crezca durante 5-7 días, el número máximo de protoplastos viables se puede aislar. Permitir que los cultivos crezcan durante periodos más o menos largos utilizando el inóculo especificada reducirá significativamente el rendimiento de protoplastos, y provocar el fallo de protocolos posteriores. Un segundo paso crítico es el paso 1.5, ya que el uso de puntas de pipeta estándar, en lugar de las puntas de pipeta diámetro ancho especificados, hará que las puntas se obstruyan y conducen a los volúmenes incorrectos siendo transferidos. Con respecto a la configuración del sistema robótico, la disposición de las placas en la plataforma de manipulación de líquidos automatizado, paso 2.4, es crítica, con una configuración modificada evitar que la cabeza del manipulador de líquidos lleguen a todos los pocillos en la placa de 6 pocillos. Debido al diseño de la plataforma de manejo de líquidos automatizado, la placa de 6 pocillos se debe colocar en el nido 5, o protocolos seleccionados para este instrumento fallará. Del mismo modo, el hecho de definir correctamente el material de laboratorio en la placasoftware de motor, paso 2.2, hará que el instrumento falle para agarrar, ni deje caer el material de laboratorio produciendo la interrupción del protocolo. Para el protocolo recuento de células, el paso crítico implica la fijación de las células con etanol, paso 3.2. Si las células no son fijos antes del marcaje con PI, solamente estarán etiquetados de células no viables, en lugar de toda la población de protoplastos, y no será posible contar el número de protoplastos aislados. El paso crítico final, etapa 4.6, implica la selección de los filtros fluorescentes para el análisis microscópico de la expresión del marcador fluorescente pporRFP. El uso de otros conjuntos de filtros "rojo" permite la fluorescencia de fondo de la clorofila, aumentando significativamente la señal en todos los protoplastos del cloroplasto que contiene, evitando el cálculo de la eficiencia de transformación. Con cuidado, se adhiere a las especificaciones de estos pasos críticos garantiza la mayor oportunidad de éxito y la generación de los datos básicos más reproducibleset.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen ningún interés financiero en competencia.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Orbitor RS Microplate mover | Thermo Scientific | ||
| Bravo Liquid Handler | Agilent | ||
| Synergy H1 Multi-mode Reader | BioTek | ||
| MultiFlo FX Multi-mode Dispenser | BioTek | ||
| Teleshake | Inheco | 3800048 | |
| CPAC Ultraflat Heater/cooler | Inheco | 7000190 | |
| Vworks Automation Software | Agilent | Software used to control and write protocols for Agilent Bravo | |
| Momentum Software | Thermo Scientific | Task scheduling software for controlling Orbiter RS | |
| Liquid Handling Control 2.17 Software | Biotek | Software used to control and write protocols for MultiFlo FX | |
| IX81 Inverted Microscope | Olympus | ||
| Zyla 3-Tap microscope camera | Andor | ||
| ET-CY3/TRITC Filter Set | Chroma Technology Corp | 49004 | |
| Rohament CL | AB Enzymes | sample bottle | low-cost cellulase |
| Rohapect UF | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase |
| Rohapect 10L | AB Enzymes | sample bottle | low-cost pectinase/arabinase |
| Linsmaier & Skoog Basal Medium | Phytotechnology Laboratories | L689 | |
| 2,4-dichlorophenoxyacetic acid | Phytotechnology Laboratories | D295 | |
| propidium iodide | Sigma Aldrich | P4170 | |
| Poly(ethylene glycol) 4000 | Sigma Aldrich | 95904-250G-F | Formerly Fluka PEG |
| Propidium Iodide | Fisher Scientific | 25535-16-4 | Acros Organics |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C7902-1KG | |
| Sodium Acetate | Fisher Scientific | BP333-500 | |
| Mannitol | Sigma Aldrich | M1902-1KG | |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | AC424205000 | |
| KOH | Sigma Aldrich | P1767 | |
| Gelzan CM | Sigma Aldrich | G1910-250G | |
| 6-well plate | Thermo Scientific | 103184 | |
| 96-well 1.2 ml deep well plate | Thermo Scientific | AB-0564 | |
| 96 well optical bottom plate | Thermo Scientific | 165305 | |
| Finntip 1000 Wide bore Pipet tips | Thermo Scientific | 9405 163 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P4504-1KG | |
| MES | Fisher Scientific | AC17259-5000 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | M33-500 |
References
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