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Medicine

L'étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase

Published: June 26, 2016 doi: 10.3791/54306

Protocol

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Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par Institutional Animal Care et l'utilisation Comité du Texas Tech University Health Sciences Center et suivi les lignes directrices énoncées dans le «Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire», publié par les National Institutes of Health. Utiliser huit à douze semaines vieilles souris BALB / c femelles qui sont disponibles dans le commerce. Injecter 1 x 10 5 4T1 ou 1 x 10 5 4T1 cellules exprimant la GFP, qui peuvent être achetés auprès de divers fournisseurs, dans le coussinet adipeux mammaire.

1. Culture de 4T1 et 4T1-GFP cellules et préparation des cellules tumorales Suspension Injections 14

  1. 4T1 et 4T1-GFP Culture cellulaire
    REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à l'aide des solutions stériles dans un flux d'air laminaire (LAF) armoire bio-sécurité, sauf indication contraire.
    1. Maintenir les cellules 4T1 et 4T1-GFP dans du milieu RPMI additionné de 10% de sérum bovin foetal inactivé à la chaleur et 100 U / ml de pénicillineG et 100 ug / ml de sulfate de streptomycine.
      REMARQUE: Déterminer un numéro de passage en comptant tous les trypsinisation et le placage des cellules. Il est important d'utiliser des cellules ayant le même nombre de passages pour toutes les expériences de la souris, comme le nombre de passages affecte la tumorigénicité des cellules et le potentiel métastatique.
    2. Avant les injections de cellules retirer le flacon T75 cm 2, contenant des cellules tumorales à 80% de confluence, à partir d' un support d'incubateur et aspirer. Ajouter 10 ml de PBS et faire tourner le flacon doucement pour laver restante moyenne, puis aspirer PBS.
    3. Ajouter 2 ml de 0,25% de trypsine avec de l' EDTA dans le flacon et l' incliner pour distribuer la solution uniformément sur ​​la surface et incuber dans un incubateur humidifié pendant 3 min à 37 ° C avec 5% de CO 2.
    4. Appuyez sur le flacon pour faciliter le détachement des cellules et ajouter 8 ml de milieu frais. Pipette monter et descendre plusieurs fois pour perturber des touffes et obtenir une suspension cellulaire unique.
    5. Centrifuger les cellules pendant 5 min. à 500 g à température ambiante.Aspirer le surnageant et laver les cellules dans 10 ml de PBS.
    6. Pipette monter et descendre plusieurs fois pour perturber des touffes et obtenir une suspension cellulaire unique. Prendre 100 ul d'une suspension de cellules et compter les cellules en utilisant l'analyseur de la viabilité des cellules selon les instructions du fabricant.
    7. Calculer le nombre de cellules nécessaires pour toutes les injections en utilisant la formule: 10 5 cellules par souris x nombre de souris utilisées dans une expérience (toujours préparer des cellules supplémentaires pour être sur un côté sûr).
    8. Centrifuger les cellules comme dans 1.1.5. Enlever le surnageant par aspiration des cellules et remettre en suspension dans la quantité de PBS frais nécessaire pour obtenir une concentration cellulaire finale de 1 x 10 6 cellules / ml. Gardez la suspension de cellules sur la glace jusqu'au moment de l'injection.
  2. Procédures souris par injection ou cellules 4T1 4T1-GFP
    1. Le jour avant l'injection des cellules tumorales, anesthésier les souris dans une chambre d'induction avec 3% d'isoflurane. Une fois que les souris dorment et respirent régulièrement, endroit til la souris sur un bloc opératoire avec le nez à l'intérieur du cône de nez, et le connecter au vaporisateur isoflurane. Maintenir l'anesthésie avec 2,5% d'isoflurane. Pincez le bout de la souris pour veiller à ce que la souris est anesthésiée.
    2. Appliquer la crème d'épilation à l'aide d'un coton-tige sur le site d'injection (à droite de coussinet adipeux mammaire pectoral) et attendre 2 min. Nettoyer le site à l'aide d'une serviette en papier humide, placer la souris dans la cage et surveiller un animal jusqu'à ce qu'il reprenne conscience suffisante pour maintenir le décubitus sternale.
    3. Le jour de l'injection, anesthésier les souris comme en 1.2.2 et placer sur le tampon chirurgical.
    4. Vortexer le tube contenant les cellules tumorales pour obtenir une suspension cellulaire uniforme. Aspirer 100 ul d'une suspension cellulaire contenant 1 x 10 cellules 5 tumorales, dans une seringue d' insuline de 0,5 ml (29 g, 12,7 mm de longueur à l' aiguille).
    5. Soulever la peau à l' aide de l'indice de pouce et à proximité de la 2 e et 3 e mamelon, insérer l'aiguille de la seringue dans le Mammary coussinet adipeux juste en dessous du troisième mamelon sous la peau entre les doigts et injecter les cellules lentement pour former une bulle (injection sous-cutanée).
    6. Placez la souris dans la cage après l'injection et surveiller comme dans 1.2.2.
  3. Surveiller la croissance de la tumeur
    1. Mesures Caliper 14
      NOTE: les cellules 4T1 Injecté ou 4T1-GFP forment une tumeur du sein agressif. Habituellement, les tumeurs palpables apparaissent ~ au jour 4 - 5 après l'inoculation des cellules. les cellules 4T1-GFP forment des tumeurs qui se développent plus lentement et donnent des métastases plus tard. Mesurer la tumeur deux à trois fois par semaine. Si l'état clinique des animaux se détériore, les animaux perdent plus de 10% du poids corporel, les tumeurs dépassent 10% du poids corporel ou deviennent ulcérées, euthanasier les souris immédiatement.
      1. Anesthetize une souris comme dans 1.2.1., Peser, place sur le pad chirurgical et mouiller la zone avec 70% d'éthanol.
      2. Palper une tumeur au site d'injection (4 - 5 jours après l'inoculation des cellules).
      3. <li> Mesurer le diamètre le plus grand (D) et le plus petit diamètre (d1) avec un pied à coulisse.
      4. Calculer le volume de la tumeur en utilisant la formule Volume = (DX X d1 d1) / 2 mm 3. Assurer le suivi de la souris de l'anesthésie comme dans 1.2.2.
    2. Imaging (Uniquement pour 4T1 cellules GFP)
      1. Anesthetize la souris comme dans 1.2.1. Placez la souris sur une scène mobile à l'intérieur de l'instrument d'imagerie. Maintenir l'anesthésie à travers le cône de nez.
      2. Allumez l'instrument d'imagerie et de la source de lumière selon les instructions du fabricant.
      3. Sous l'onglet "Acquisition" go to "Lighting" et passer à la position vide (pas de filtre) pour la lumière blanche. Assurez-vous que le moteur est allumé et sélectionnez 'Trans' dans la table lumineuse.
      4. Sous l'onglet "Microscope", sélectionnez "Effacer" filtre d'émission et 0.5X grossissement. Dans l'onglet "Caméra", assurez-vous que binning pour la capture est '1 x 1' et l '4 x 4'. Cliquez sur l'aperçu pour localiser la tumeur dans la lumière blanche, se concentrer pour obtenir une image claire, et cliquez sur la capture.
      5. Allez à l'onglet et le changement d'éclairage "Acquisition" pour filtrer 1 (filtre pour GFP selon les instructions du fabricant). Dans l'onglet "Microscope", changer le filtre d'émission à "GF 530/20". Aperçu et de capture d'image dans un canal vert. Réglez le temps d'exposition pour obtenir la luminosité appropriée.
      6. Appliquer pseudocolor à l'image et l' enregistrer dans le dossier approprié (Figure 1).

2. intranasale administration de Liposomes 10

REMARQUE: Effectuez toutes les étapes à l'aide des solutions stériles dans un flux d'air laminaire (LAF) du cabinet Bio-sécurité, sauf indication contraire.

  1. Au jour 6 après l'injection des cellules tumorales anesthésier les souris comme au point 1.2.1.
  2. Vortex la suspension de clodronate ou le contrôle (PBS) liposome obtenu auprès du fabricant. Prendre 60 pl liposome sUSPENSION en utilisant la pointe de pipette stérile.
  3. Relâchez doucement la solution de liposome (5 pi à chaque fois) à proximité des narines permettant la souris de respirer dans la solution, répéter jusqu'à ce que la totalité de la dose de 60 ul est administré.
  4. Laissez la souris reprendre conscience avant de le remettre dans la cage.
  5. l'administration de liposomes répétition tous les 3 jours jusqu'à ce que les souris sont sacrifiées. Ne pas administrer des liposomes un jour de sacrifice.

3. Sacrifice souris et Collection de tissus

REMARQUE: Utilisez autoclavé et instruments stériles pour la dissection de la souris. Euthanasier souris sous anesthésie par l'exsanguination et le retrait des organes vitaux.

  1. Au jour 22 (Pour les cellules 4T1) ou 26 jours (pour les cellules 4T1-GFP) après l'injection de cellules tumorales anesthésier la souris comme au point 1.2.1. et placer sur le pad chirurgical avec un cône de nez relié à freezer, maintenir l'anesthésie comme dans 1.2.1. Pincer une des orteils pour faire en sorte que la mouse est inconscient.
  2. Epingler les orteils à l'aide d'aiguilles à la planche à dissection. Pulvériser l'éthanol sur la peau de la souris.
  3. Soulever la peau à l'aide de pinces et faire une incision avec les ciseaux chirurgicaux. Lentement exposer le péritoine et continuer à réduire la peau à travers le thorax jusqu'à ce que le cou.
  4. À l'aide des ciseaux chirurgicaux faire une incision dans le péritoine et exposer soigneusement les organes avec des conseils de coton en évitant d'endommager les vaisseaux sanguins.
  5. Déplacer les organes d'un côté et d'exposer la veine cave inférieure. Piquer la veine et recueillir le sang avec le 29 G seringue à insuline. Placez le sang collecté dans le tube et laisser sur la glace pour un traitement ultérieur.
  6. Couper la membrane pour exposer les côtes cage, les poumons et le cœur. Lentement couper la cage thoracique des deux côtés à l'aide de l'outil de coupe d'os et de soulever la partie supérieure de la cage thoracique. Prenez le cœur avec une pince et couper le tissu conjonctif reliant le cœur et les poumons à la cavité thoracique.
  7. Placez les poumons en petite quantité de PBS dans le 60 mmboîte de Pétri sur de la glace jusqu'à ce prêt pour l'imagerie et le traitement ultérieur à des coupes congelées pour la microscopie par immunofluorescence ou histologie de routine [y compris l'hématoxyline et l'éosine (H & E) coloration].

4. Lung évaluation Métastases

  1. Comptage et Scoring Métastases Surface
    1. Placez la boîte de Pétri avec les poumons sous le microscope de dissection. Concentrez pour obtenir une vue claire de la surface du poumon.
    2. En utilisant un microscope de dissection, d'observer la surface du poumon. Comptez métastases sur les côtés antérieur et postérieur des deux poumons.
      NOTE: Le poumon normal est blanchâtre ou rosâtre et poreuse et a une structure spongieuse. Métastases 4T1 sont solides et non poreux, semblent parfois être semblable à une goutte de liquide (figure 2A).
  2. imagerie pulmonaire
    1. Placer la boîte de Petri avec des poumons à la platine mobile à l'intérieur de l'appareil d'imagerie.
    2. Allumez l'instrument et labiolite la source multispectral. Ouvrez le logiciel. Sous l'onglet "Acquisition", allez dans "éclairage", et passer à la position vide (pas de filtre) pour la lumière blanche. Light Engine -> ON, table Light -> Epi. Dans le cadre du "Microscope" tab Sélectionnez 'Clear' filtre d'émission et 1,66x grossissement. Dans l'onglet "Caméra", assurez-vous que binning pour la capture est '1 x 1' et l '4 x 4'.
    3. Cliquez sur l'aperçu et de se concentrer pour obtenir une image claire des poumons en lumière blanche et cliquez sur la capture.
    4. Allez à l'onglet "Acquisition" et le changement du filtre 1 (filtre pour GFP selon les instructions du fabricant). Dans l'onglet "Microscope", changer le filtre d'émission à "GF 530/20". Aperçu et de capture d'image dans un canal vert. Réglez le temps d'exposition pour obtenir la luminosité appropriée.
    5. Appliquer pseudocolor à l'image et l'enregistrer dans le dossier approprié.
    6. Retournez les poumons pour obtenir l'image de l'autre côté de la même manière. Ce procedure génère des images de métastases GFP-positives qui peuvent encore être quantifiés en utilisant un logiciel approprié (figure 2B) 14.
  3. immunofluorescence Microscopie
    1. Fixer les poumons dans 4% de paraformaldehyde, à 4 ° C pendant 4 heures dans l'obscurité.
    2. Laver le tissu deux fois avec 10 ml de PBS pendant 5 minutes pour éliminer complètement le fixateur. Transfert à 18% de saccharose dans du PBS et incuber O / N à 4 ° C.
    3. Retirez le tissu du saccharose et tamponner tout excès.
    4. Prenez un cryomoule, recouvrir la couche de fond avec le milieu octobre Placez le tissu sur le milieu octobre Remplissez le moule avec un milieu OPO pour couvrir complètement le tissu et le placer sur la glace sèche.
    5. bloc de magasin à -80 ° C jusqu'à sectionner.
    6. Préparer 5 um sections épaisses avec un cryostat et lieu sur des lames chargées.
    7. Stocker les diapositives inutilisés -80 ° C jusqu'à son utilisation ultérieure.
    8. Air sécher les lames pendant 7 min. et laver avec du PBS pour éliminer octobre Wipe la lame avec un tissu ou une serviette en papier pour enlever l'excès d'eau, monter des lamelles avec un milieu contenant DAPI de montage et de visualiser avec filtre GFP sous microscope.
    9. Quantifier métastases GFP (Figure 3A) avec l'utilisation d' un logiciel approprié 14.
  4. Histologie et de pathologie numérique
    1. Cliquez sur le bouton manuel de charge sous l'onglet de démarrage et d'attendre la glissière de maintien en rack pour éjecter du scanner.
    2. Prenez la section de tissu H & E taché, nettoyez-le avec un tissu pour enlever la saleté, et placez-le dans le rack de maintien de diapositive.
    3. Entrez la description de diapositives dans la fenêtre sauté-up.
    4. Sélectionnez l'onglet Zone de numérisation sur la fenêtre de la console d'imagerie SS et ajuster le carré vert pour définir la région d'intérêt (ROI) à numériser.
    5. Faites glisser le calibrage diamant bleu à une partie claire de la diapositive, où le tissu est absent, cependant, dans le ROI.
    6. Ensuite, sélectionnez le point Points onglet et cliquez sur le bouton de sélection automatique pour obtenir plusieurs points de discussion (des signes plus jaunes) sur le tissu dans le ROI.
    7. Si nécessaire, placer des points de discussion supplémentaires manuellement en double-cliquant dans le ROI.
    8. Passez à l'onglet d'étalonnage et sélectionnez le bouton d'étalonnage pour commencer l'étalonnage de glissement au niveau du point d'étalonnage de diamant bleu. Après la calibration est terminée, l'image à partir du point d'étalonnage sera affiché.
    9. Inspecter cette image pour vous assurer qu'il est clair et exempt de saleté ou des artefacts.
    10. Passez à l'onglet Analyse et sélectionnez Démarrer Numériser pour lancer la numérisation du ROI. Coupe histologique scannée est converti en un diaporama numérique (figure 3B et 4A)
    11. Quantifier le fardeau métastatique comme décrit précédemment (figure 4B) 14.

5. cytométrie de flux (FACS) Analyse des macrophages alvéolaires dans les poumons

  1. Préparation de la cellule unique suspensisur
    1. Après l'imagerie et le comptage des métastases, se laver les poumons avec du PBS stérile et placer la boîte de Pétri. Faire 1 - 2 mm pièces des poumons à l'aide de ciseaux et des pinces chirurgicales.
    2. Transférer les morceaux de poumon au tube de 15 ml conique avec 3 ml de tampon de digestion contenant 1 mg / ml de collagénase P, 0,04 mg / ml de désoxyribonucléase I, et 10 ug ml de milieu / inhibiteur de la trypsine dissoute RPMI (stérile).
    3. Incuber le tube conique sur un agitateur rotatif à l'étuve à 37 ° C pendant 40 min.
    4. Retirez le tube conique de l'incubateur et la pipette la solution de haut en bas pour dissocier le tissu.
    5. Faire passer la solution à travers le tamis de 40 um pour éviter des touffes et d'obtenir une suspension cellulaire unique. Si besoin est, pour désintégrer mieux le tissu de presse de tissu digéré contre le tamis cellulaire à l'aide d'un piston de seringue.
    6. Quand une suspension cellulaire unique a été obtenue, recueillir les cellules par centrifugation et lyser les globules rouges avec2 ml de tampon ACK pendant 10 min à température ambiante. Ensuite, lavez une pastille à deux reprises dans 8 ml de RPMI.
    7. Resuspendre les cellules dans 3 ml du milieu RPMI complet et procéder à la cellule de comptage en utilisant l'analyseur de la viabilité des cellules selon les instructions du fabricant.
  2. Coloration des cellules pulmonaires pour les marqueurs de surface
    REMARQUE: Effectuer toutes les incubations à 4 ° C. plaque Centrifugeuse à 500 g et 4 ° C.
    1. Introduire à la pipette 1 x 10 6 cellules dans 100 ul de tampon FACS (1% de FBS dans du PBS) à des puits individuels d'une plaque à 96 puits à fond en V. L'utilisation d'une plaque à 96 puits de fond en V facilite la remise d'échantillons multiples.
    2. Pré-incuber la suspension de cellules avec 1 pg de Fc de souris purifié Bloc anti-souris CD16 / CD32 dans 100 ul de tampon FACS pendant 15 min. Centrifuger la plaque à 96 puits de fond en V pour sédimenter les cellules et éliminer le surnageant en retournant la plaque et laisser le drain de la solution.
    3. Pour la coloration de surface, à l'avance, à diluer les anticorps murinse antigènes dans un tube (master mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) jusqu'à une concentration finale de 2,5 pg / ml dans un tampon FACS contenant 10 pg / ml de Fc bloc CD16 / CD32 anticorps.
      REMARQUE: L'ensemble de ces anticorps est utile pour l'identification et l'évaluation d'un état fonctionnel des macrophages alvéolaires et des cellules dendritiques.
    4. Ajouter 100 ul d'anticorps dilué (master mix) aux puits de la plaque de 96 puits de fond en V et incuber à 4 ° C pendant 30 min.
    5. Centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules et retirer le surnageant comme en 5.2.2. Laver les cellules avec 200 pi de tampon FACS, centrifuger à 500 g pendant 5 min. Retirer le surnageant comme en 5.2.2. et remettre en suspension les cellules dans 200 ul de PBS.
    6. Centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules et ajouter la viabilité colorant dilué dans du PBS (1: 1000). Incuber pendant 20 min à 4 ° C. </ Li>
    7. Centrifuger la plaque pour sédimenter les cellules et retirer le surnageant comme en 5.2.2. Laver avec 200 ul de PBS et centrifuger à nouveau la plaque.
    8. Resuspendre les cellules dans 100 pi de 1% de paraformaldéhyde et conserver à 4 ° C jusqu'à ce que l'acquisition par instrument FACS. Préalablement à des suspensions de cellules de transfert d'acquisition aux tubes en polypropylène FACS.

6. Analyse des données FACS: Stratégies Gating et l'identification des sous-populations cellulaires

  1. Effectuer une analyse FACS comme indiqué précédemment 10. Porte acquis cellules / événements basés sur prospectifs (FSC) et dispersion latérale (SSC); puis la porte en direct et CD45 + cellules. Pour l' identification des macrophages alvéolaires, porte-CD11b négatives puis CD11c + F4 / 80 + cellules. (Figure 5A).

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Representative Results

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L'injection de cellules tumorales 4T1-GFP dans le coussinet adipeux mammaire conduit à la formation de tumeurs de souris (figure 1A) qui récapitulent la propagation métastatique du cancer du sein humain, comme les métastases sont rapidement formées dans les poumons (Figure 2), le foie, les os et le cerveau de souris 11. La transfection stable de cellules 4T1 avec la GFP facilite la surveillance de la croissance tumorale (figure 1B), le suivi des cellules tumorales métastasant et la quantification de la charge métastatique (figure 2B, 3B). En outre, l'imagerie des tumeurs fournit des informations supplémentaires en ce qui concerne plusieurs caractéristiques pathologiques tels que la mort des cellules tumorales et le système vasculaire de la tumeur. La fluorescence vert vif (Figure panneaux intermédiaires les 1B) indiquent l'expression de la GFP élevée, qui est habituellement associé au parenchyme tumoral viable. Considérant que l'absence de GFP dans certaines zones tumorales peut indiquer mort des cellules tumorales ( (figure 1B-le panneau de droite).

Etant donné que la majorité des métastases pulmonaires sont situés sur la surface du poumon, elles peuvent être observées sous le microscope de dissection régulière. Les lésions métastatiques sont généralement nettement distinct du parenchyme environnant (figure 2A). Afin de vérifier les observations macroscopiques et évaluer les métastases qui sont plus profondes dans le parenchyme pulmonaire, l' imagerie de fluorescence des poumons peut être effectuée (figure 2B), si les cellules exprimant la GFP ont été utilisés pour l' injection. Bien que autofluorescence du poumon est clairement visible dans les images, lumineux fluorescence de la GFP dérivée facilite les métastases distinctives de entourant parenchyme pulmonaire. Alternativement, histologie de routine (figure 3A et la figure 4A) en conjonction avec des algorithmes de pathologie numérique (

Multicolore FACS offre la possibilité de caractériser des populations de cellules rares, même par l'utilisation de la surface cellulaire multipolaires et / ou des marqueurs cytoplasmiques simultanément. Les macrophages alvéolaires sont caractérisés par l'absence d'expression et l' expression de CD11b F4 / 80 et CD11c (figure 5). L'approche typique pour identifier ces cellules par le flux implique cytométrie: (i) la sélection de la population de cellules basée sur la morphologie décrite par l' avant et les propriétés de dispersion latérale, (ii) la sélection de CD45 viable + cellules suivies par (iii) gating des cellules CD11b négatives, et (iv) transmission sélective de cellules co - exprimant F4 / 80 et CD11c (figure 5A, B).

Figure 1
Figure croissance tumorale 1. Surveillance Through imagerie animale. (A) à lumière blanche images de la souris injectée avec la GFP exprimant des cellules dans le coussinet adipeux mammaire à différents points de temps après l' injection de cellules tumorales. (B) correspondantes des images fluorescentes obtenues grâce à l'utilisation d' un filtre à GFP. Les lignes pointillées indiquent la zone de la tumeur. Notez l'absence de fluorescence verte brillante dans certaines zones tumorales le jour 26 qui peuvent résulter de la nécrose tissulaire ou néovascularisation en développement. Barre d'échelle, 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2. Évaluation du poumon métastatique Burden. (A) Images des poumons de souris injectées avec des cellules 4T1 dans le coussinet adipeux mammaire avec les métastases de surface (flèches).(B) Images de GFP + métastases pulmonaires (fluorescence vert clair) obtenus grâce à l' utilisation de l' imagerie microscope. Barre d'échelle, 10 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. histopathologie numérique et microscopie confocale en imagerie des métastases pulmonaires. (A) L'analyse de la section du poumon hématoxyline et l' éosine (H & E) teinté de souris injectées avec 4T1 cellules dans le coussinet adipeux mammaire (bleu tissu-métastases sombres). Barre d'échelle, 4 mm. (B) de la microscopie confocale de GFP + métastases pulmonaires (fluorescence vert clair). Barre d'échelle, 200 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4. Quantification du poumon métastasé Burden par histopathologie numérique. (A) L'analyse de l' hématoxyline et l' éosine (H & E) section du poumon coloré (bleu tissu-métastases sombres). (B) L'image des poumons indiqués en (A) généré par une trainable image histomorphologie outil d'analyse (logiciel- «Genie»). La couleur rouge indique les zones pulmonaires identifiées par "Genie", comme les métastases. Barre d'échelle, 5 mm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5. cytométrie de flux Appcafards pour l' identification des macrophages alvéolaires dans les poumons. (A) Le representativeflow cytometrydot plotsillustrating la stratégie de gating pour identifier CD45 + CD11b négative F4 / 80 + CD11c + macrophages alvéolaires. (B) cytométrie de flux représentatif dot effet plotsillustrating de contrôle ou de liposomes clodronate sur les macrophages alvéolaires des poumons. Les chiffres en parcelles représentent des pourcentages de cellules gated. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Cette recherche a été soutenue par le ministère de la Défense accorde TSA 140010 à MK et BC 111038 à mmm Vues et opinions des, et des mentions de l'auteur (s) ne reflètent pas celles de l'armée américaine ou du ministère de la Défense.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4T1 cell line  American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA CRL 2539 Tumor cells
4T1-GFP cell line Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA BW128090 Tumor cells
RPMI Corning, Corning, NY, USA 10-040-CM Media
Heat inactivated FBS Gibco (Thermo Scientific), USA 10082147 Media
Penicillin Streptomycin Fisher Scientific, Waltham, MA, USA MT-300-02-CI Media
PBS Fisher Scientific, Waltham, MA, USA BP399-20 Dilute with distilled water
Trypsin 0.25% with EDTA Hyclone, Logan, Utah, USA SH30042.02 Tissue culture supplies
T75 cm2 flask Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 12-565-32 Tissue culture supplies
15 ml conical tube BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA 352096 Tissue culture supplies
50 ml conical tube BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA 352098 Tissue culture supplies
60 mm2 Petri dish Fisher Scientific, Waltham, MA, USA AS4052 For lung imaging 
Isoflurane (Isothesia) Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA NDC 11695-6776-2 Mouse anesthesia
Clodronate liposomes Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA F70101C-N Macrophages depletion
Control liposomes Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA F70101-N Control PBS-liposomes
29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On Walmart, Bentonville, AR, USA For tumor cell injection
Hair removal cream (Nair) Walmart, Bentonville, AR, USA
Paraformaldehyde solution (4%) Affymetrix, Santa Clara, CA, USA 19943-I Lt Dilute to 4% or 1% using 1x PBS
OCT compound Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 230-730-571 For freezing tissue in cryomolds
Fluoro-Gel-II with DAPI Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA 17985-51 Mounting medium
Sucrose Sigma, St. Louis, MO, USA S-9378 Cryopreservation
Collagenase P Roche, Basel, Switzerland 11249002001 Components of tissue digestion buffer
Dnase I Roche, Basel, Switzerland 10104159001 Components of tissue digestion buffer
Trypsin inhibitor Sigma, St. Louis, MO, USA T9253 Components of tissue digestion buffer
40 micron cell strainers Fisher Scientific, Waltham, MA, USA 22-363-547 Used in tissue digestion to remove clumps
Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) Biolegend, San Diego, CA, USA 101320 Antibodies for flow cytometry
BV605 CD45 Biolegend, San Diego, CA, USA 103139 Antibodies for flow cytometry
PE CD11b Biolegend, San Diego, CA, USA 101207 Antibodies for flow cytometry
PE Cy7 F4/80  Biolegend, San Diego, CA, USA 123113 Antibodies for flow cytometry
APC/Cy7 CD11c Biolegend, San Diego, CA, USA 117323 Antibodies for flow cytometry
PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII)  Biolegend, San Diego, CA, USA 107625 Antibodies for flow cytometry
PE CD80 Biolegend, San Diego, CA, USA 104707 Antibodies for flow cytometry
AF647 CD86 Biolegend, San Diego, CA, USA 105019 Antibodies for flow cytometry
Fixable viability Dye eflour 506 eBioscience, San Diego, CA,USA 65-0866 Antibodies for flow cytometry
Cryostat Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA CM1850 Cryosectioning
UVP iBox Explorer UVP Inc, Upland, CA, USA Mouse and lung fluorescent imaging
Aperio Scanscope CS Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA Digital pathology
BD LSRFortessa  BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA Flow cytometry/data acquisition
Nikon A1 confocal TE2000 microscope Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections
UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) UVP Inc, Upland, CA, USA Imaging software for iBOX
Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029)  Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA Imaging software for analysis of digital slides
Flow JO software (version 9.8.1) Flow JO LLC, Ashland, OR, USA Analysis of flow cytometric data
NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP 

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References

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L&#39;étude du rôle des macrophages alvéolaires dans le cancer du sein métastase
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Vadrevu, S. K., Sharma, S., Chintala, N., Patel, J., Karbowniczek, M., Markiewski, M. Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (112), e54306, doi:10.3791/54306 (2016).More

Vadrevu, S. K., Sharma, S., Chintala, N., Patel, J., Karbowniczek, M., Markiewski, M. Studying the Role of Alveolar Macrophages in Breast Cancer Metastasis. J. Vis. Exp. (112), e54306, doi:10.3791/54306 (2016).

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