Protocol
所有动物研究已经批准了机构动物护理和德州理工大学健康科学中心使用委员会，并遵循“指南实验动物的护理和使用”由美国国立卫生研究院发表在列出的各项规定。用八到十二周龄的雌性BALB / c小鼠是市售的。注射1×10 5个 4T1或1×10 5个 4T1细胞表达GFP，可从不同的供应商处购买，到乳腺脂肪垫。
1. 4T1文化和4T1-GFP的细胞和肿瘤细胞悬浮用于注射14准备
- 4T1和4T1-GFP细胞培养
注：除非另有规定执行在层流（LAF）生物安全柜使用无菌溶液的所有步骤。- 保持4T1和4T1-GFP细胞中的RPMI培养基中补充有10％热灭活胎牛血清和100U / ml青霉素G和100微克/ ml硫酸链霉素。
注：由细胞的每一个胰蛋白酶和电镀计算确定的通道数。使用的细胞具有相同的通道编号，以所有小鼠实验中是重要的，因为通道的数目影响细胞的致瘤性和转移潜能。 - 在此之前细胞注射去除T75厘米2瓶，含有肿瘤细胞在80％汇合，从孵化器和吸出网上平台。加入10毫升的PBS并轻轻旋转烧瓶洗出剩余的培养基中，然后吸PBS中。
- 用EDTA加2ml的0.25％胰蛋白酶的烧瓶中并倾斜它均匀地在表面上，在37℃，5％CO 2的分发溶液孵育在湿润的培养箱中3分钟。
- 点击烧瓶，以促进细胞的分离和加入8毫升新鲜培养基。移液器上下数次破坏团块，并获得单细胞悬浮液。
- 离心细胞5分钟。在室温500 XG。吸出上清液并洗涤细胞在10ml PBS中。
- 移液器上下数次破坏团块，并获得单细胞悬浮液。取100微升细胞悬浮液，并使用细胞活力分析仪按照制造商的说明计数细胞。
- 计算公式使用所有注射所需的细胞数量：每个实验中使用的小鼠的鼠X＃10 5个细胞（总是准备好备用电池是在安全方面）。
- 离心机的细胞在1.1.5。除去通过在新鲜的PBS的量抽吸和悬浮细胞上清液需取得的1×10 6个细胞/ ml的最终细胞浓度。保持冰细胞悬液，直到准备注射。
- 保持4T1和4T1-GFP细胞中的RPMI培养基中补充有10％热灭活胎牛血清和100U / ml青霉素G和100微克/ ml硫酸链霉素。
- 4T1或4T1-GFP细胞注射鼠程序
- 肿瘤细胞注射前一天，麻醉小鼠，用3％异氟醚的感应腔室。一旦老鼠是睡着了，经常呼吸，地方Ť他鼠标上的手术垫与鼻锥内鼻，并把它连接到异氟烷蒸发器。保持用2.5％异氟烷麻醉。捏住鼠标脚趾以确保该鼠标被麻醉。
- 用棉签将注射部位（右胸部乳房脂肪垫）应用脱毛膏，等待2分钟。清洁用的湿纸巾的网站，将鼠标放回笼子里，直到它重新获得足够的意识，以保持胸骨斜卧监视动物。
- 上注射当天，麻醉小鼠为在1.2.2和放置在手术垫。
- 涡含有肿瘤细胞以获得均匀的细胞悬浮液的管中。抽吸100微升细胞悬浮液，含有1×10 5个肿瘤细胞，成0.5 ml胰岛素注射器（29克，12.7mmol毫米针长度）。
- 解除用拇指和手指指数靠近第2 次和第3 次乳头的皮肤，将注射器的针头插入mammarŸ脂肪垫只是手指之间的皮肤下的第三个乳头下方，并注入细胞慢慢形成泡沫（皮下注射）。
- 将鼠标放回注射后的笼子和监测在1.2.2。
- 监测肿瘤生长
- 卡尺测量14
注：注入4T1或4T1-GFP细胞形成积极的乳腺肿瘤。细胞接种后5 - 通常情况下，可触及的肿瘤在第4天出现〜。 4T1-GFP的细胞形成生长速度慢，后来给转移瘤。测量肿瘤，每周二至三次。如果动物的临床状况恶化时，动物损失超过10％的体重，肿瘤超过体重的10％或变得溃烂，立即安乐死的小鼠。- 麻醉小鼠如在1.2.1。，称重，放置在手术垫和湿用70％乙醇的区域。
- （ - 5天后细胞接种4）在注射部位的触诊肿瘤。 <利>测量的最大直径（D）和更小的直径（d1）的带厚度。
- 使用式体积=（DX D1点¯xD1）/ 2 mm 3的计算肿瘤体积。监控麻醉小鼠恢复为1.2.2。
- 卡尺测量14
- 成像（仅适用于4T1 GFP的细胞）
- 麻醉小鼠为1.2.1。将鼠标在成像仪器内部的可动阶段。保持通过鼻锥麻醉。
- 打开显像仪和光源按照制造商的说明。
- 在标签“收购”到“照明”，并切换到白光空位置（没有过滤器）。确保光引擎为ON，并在光表中选择“跨”。
- 在标签“显微镜”，选择“清除”排放过滤器和0.5X放大倍率。在“摄像头”选项卡上，确保分档捕获为1×1“和预览”4×4“。 点击预览来定位白光肿瘤，着力得到清晰的图像，然后单击捕获。
- 进入“采集”选项卡并更改灯光过滤1（过滤器GFP按照制造商的说明）。在“显微镜”选项卡中，发射滤光片变更为“广发二十零分之五百三十○”。预览和捕捉图像中的绿色通道。调整曝光时间来获得合适的亮度。
- 应用伪彩色的图像，并保存在相应的文件夹（ 图1）。
2.脂质体的10鼻腔给药
注：除非另有规定执行在层流（LAF）生物安全柜使用无菌溶液的所有步骤。
- 在肿瘤细胞注射后6天麻醉小鼠为1.2.1。
- VORTEX从制造商获得的氯膦酸盐或控制（PBS）脂质体悬浮液。取60微升脂质体小号uspension使用无菌枪头。
- 缓慢释放的脂质体溶液（每次5微升）鼻孔允许鼠标在溶液中呼吸附近，重复直到60微升整个剂量给药。
- 让鼠标把它放回笼子前恢复知觉。
- 重复脂质体给药，每3天，直到处死小鼠。不要牺牲的日子管理脂质体。
3.鼠标牺牲和组织收集
注：使用高压灭菌和鼠标清扫消毒器械。安乐死而下，通过重要器官的放血和去除小鼠麻醉。
- 在第22天 （为4T1细胞）或第26天（对于4T1-GFP细胞）的肿瘤细胞注射后麻醉小鼠如在1.2.1。和放置在手术垫与连接到汽化器鼻锥，维持麻醉如在1.2.1。捏脚趾之一，以确保第m乌斯是无意识的。
- 针用针给的夹层板的脚趾。喷雾小鼠皮肤上乙醇。
- 使用镊子提起皮肤做一个切口用手术剪。慢慢地露出腹膜，并继续通过胸部切皮，直到脖子。
- 用手术剪使腹膜切口，并用棉技巧避免对血管的损害仔细暴露器官。
- 移动器官一边，露出了下腔静脉。穿刺静脉采血与29克的胰岛素注射器。放置收集血液到管中，并在冰上进一步处理离开。
- 切割膜片露出肋骨，肺和心脏。慢慢地切断两侧使用骨刀两肋骨和解除胸腔的顶部。抓住用钳子心脏和削减结缔组织心脏和肺连接到胸腔。
- 放置在PBS少量肺部在60毫米冰皮氏培养皿，直到准备成像和进一步加工成冰冻切片的免疫荧光或常规组织学[包括伊红（H＆E）染色。
4.肺转移瘤的评价
- 计数和评分表面转移
- 放置培养皿用解剖显微镜下肺部。重点以获得肺表面的一个明确的说法。
- 使用解剖显微镜观察肺表面。指望两肺的前部和后部侧转移。
注：正常肺是白色或粉红色和多孔，具有结构类似海绵。 4T1转移是固体和无孔，有时会出现为类似于液体（ 图2A）的下降。
- 龙成像
- 放置培养皿在成像仪器内部的可移动台肺部。
- 打开仪器和biolite多光谱源。打开软件。在该选项卡，“收购”，进入“照明”，并切换到白光空位置（没有过滤器）。光引擎 - > ON，轻表 - >外延。在标签“显微镜”选择“清除”的发射滤波器和1.66X的放大倍率。在“摄像头”选项卡上，确保分档捕获为1×1“和预览”4×4“。
- 点击预览和重点得到肺部白光清晰的画面，然后单击捕获。
- 进入“采集”选项卡，并更改过滤器1（过滤器GFP按照制造商的说明）。在“显微镜”选项卡中，发射滤光片变更为“广发二十零分之五百三十○”。预览和捕捉图像中的绿色通道。调整曝光时间来获得合适的亮度。
- 适用伪的图像并保存在相应的文件夹。
- 翻转肺部得到对方的图像以类似的方式。这PROCedure生成可使用适当的软件（ 图2B）14被进一步定量GFP阳性转移图像。
- 免疫荧光
- 固定在4％低聚甲醛的肺，在4℃在黑暗4小时。
- 用10毫升的PBS洗两次组织了5分钟后，完全去除固定液。转移到18％蔗糖的PBS中并在4℃下孵育O / N。
- 从蔗糖中取出组织和轻拍多余。
- 以一个cryomold，覆盖华侨城介质底层。放置OCT介质上的组织。填写与华侨城中等模具完全覆盖干冰组织和地点。
- 在-80°C，直到切片存储块。
- 准备5微米与带电幻灯片低温恒温器和地点厚的部分。
- 在-80°C，直到进一步使用存放不用的幻灯片。
- 空气干燥的幻灯片7分钟。并用PBS洗涤以除去倍频程WIPe为薄纸或纸巾滑动以除去过量的水，装入盖玻片带安装含有DAPI培养基并用显微镜下的GFP滤波器可视化。
- 量化的GFP转移（ 图3A）与使用适当的软件14。
- 组织学和数字病理学
- 点击手动加载按钮的开始选项卡下，等待滑动保持架从扫描器弹出。
- 拿H＆E染色的组织切片，用纸巾擦拭，除去灰尘，并安全地将其放置在滑动保持架。
- 请在弹出的窗口中幻灯片描述。
- 选择SS成像控制台窗口中的扫描区域选项卡并调整绿化广场来定义感兴趣区域（ROI）的区域进行扫描。
- 蓝色校准金刚石拖至幻灯片，其中，组织为不存在，但是，在ROI内的一个透明部分。
- 接下来，选择焦点Points选项卡，并单击在ROI组织自动选择按钮来获得几个焦点（黄色加号）。
- 如果有必要，手动将额外的焦点由ROI内双击。
- 继续执行校准选项卡并选择校准按钮蓝色钻石校准点开始幻灯片校准。校准完成后，将显示从校准点的图像。
- 检查这一形象，以确保它是明确的，无污垢或文物。
- 继续扫描选项卡，选择开始扫描开始ROI的扫描。扫描组织切片被转换为数字滑动（ 图3B和图4A）
- 如前所述（ 图4B）14量化转移性负担。
5.流式细胞仪（FACS）肺泡巨噬细胞在肺内分析
- 单细胞Suspensi的制备上
- 成像和转移的数量后，洗肺用无菌PBS和放置在培养皿中。使1 - 2毫米使用手术剪刀和镊子肺部件。
- 转移肺件15毫升锥形管用3ml含有1mg / ml胶原酶P，为0.04mg / ml的DNA酶I消化缓冲液中，10微克/ ml胰蛋白酶抑制剂溶于RPMI培养基（无菌）。
- 孵育在孵化器的旋转摇动器的锥形管在37℃下40分钟。
- 从培养箱中取出管锥和吸取的溶液上下离解组织。
- 通过40微米的过滤器，以避免团块，并获得单细胞悬浮液的溶液。如果需要的话，崩解更好的消化的组织按组织针对与针筒柱塞的帮助下细胞过滤。
- 当一个单细胞悬浮液已经实现了，通过离心收集细胞并裂解红血细胞与加入2mL ACK缓冲液中，在室温10分钟。然后，洗颗粒两次于8ml RPMI中。
- 在3ml的完全RPMI培养基和悬浮细胞进行细胞使用细胞活力分析仪按照制造商的说明计数。
- 肺细胞染色表面标志
注：在4℃执行所有孵化。在500 XG和4℃离心平板。- 吸管1×10 6个细胞在100μlFACS缓冲液（PBS中的1％FBS）中，以V型底96孔板的各个孔中的。使用V型底96孔板便于多个样品的装卸。
- 预孵育用1μg小鼠Fc块的细胞悬浮液纯化的抗小鼠CD16 / CD32在100μlFACS缓冲液中15分钟。离心V型底96孔板以沉淀细胞并通过翻转板并让溶液漏极去除上清。
- 用于表面染色，在预先稀释的抗体murin在一个管（预混）电子抗原：BV605 CD45（30-F11），PE的CD11b（M1 / 70），PE / Cy7的F4 / 80（BM8），APC / Cy7的表面CD11c（N418），PerCPCy5.5 I A / I E（MHCII）（M5 / 114.152），PE CD80（16-10A1），AF 647 CD86（GL-1）至在FACS缓冲液含有10微克/毫升的Fc块CD16的2.5微克/ ml的终浓度/ CD32抗体。
注意：此组的抗体是用于识别和肺泡巨噬细胞和树突状细胞的功能状态的评估是有用的。 - 加入100μl稀释抗体（母液）与V型底96孔板的孔中并在4℃温育30分钟。
- 离心板沉淀细胞并去除上清5.2.2。洗涤细胞用200μlFACS缓冲液中，离心以500g 5分钟。除去上清液为5.2.2。和悬浮细胞在200微升的PBS。
- 离心板以沉淀细胞，并添加在PBS中（1：1000）稀释活力染料。孵育在4℃20分钟。</ LI>
- 离心板沉淀细胞，去除上清为5.2.2。用200微升PBS洗，并再次离心板。
- 悬浮细胞在4℃下加入100μl的1％多聚甲醛和存储的，直到获得通过FACS仪器。此前收购转移细胞悬液的聚丙烯流式细胞仪管。
6. FACS数据分析：门控策略及细胞亚群的鉴定
- 如先前报道10进行FACS分析。门收购了基于前向（FSC）（SSC）细胞/事件和侧散射;然后门生活和CD45 +细胞。对于肺泡巨噬细胞识别，门的CD11b阴性，然后CD11c的+ F4 / 80 +细胞。 （ 图5A）。
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Representative Results
4T1-GFP肿瘤细胞注射到乳腺脂肪垫导致了概括人乳腺癌的转移扩散小鼠肿瘤（ 图1A）的形成，如转移灶在肺中（ 图2），肝脏，骨骼迅速地形成和老鼠11大脑。 4T1细胞用GFP稳定转染促进肿瘤生长的监测（ 图1B），跟踪转移性肿瘤细胞和定量转移负担（ 图2B，3B）。另外，肿瘤的成像提供关于几种病理特征如肿瘤细胞死亡和肿瘤脉管系统的其他信息。明亮的绿色荧光（ 图1B-中间面板 ）表示高GFP表达，这通常与可行肿瘤实质关联。而在某些肿瘤地区缺乏的GFP可以指示肿瘤细胞死亡（
由于大多数肺转移位于肺表面上，它们可以在常规解剖显微镜下观察。的转移病灶通常是显然从周围薄壁（ 图 2A）是不同的。为了验证大体观察和评估是肺实质内更深转移，可以进行肺的荧光成像（ 图2B）中，如果表达GFP的细胞用于注射。虽然自体荧光肺是图像清晰可见，明亮的绿色荧光蛋白来源的荧光有利于从周围的肺实质区别的转移。或者，在数字病理学算法结合常规组织学（ 图3A和图4A）（ 多色FACS提供机会通过使用多极细胞表面和/或同时细胞质标记来表征甚至稀有细胞群。肺泡巨噬细胞是由缺乏F4 / 80的CD11b表达和表达和CD11c的（ 图5）的表征。典型的方式来确定这些细胞通过流式细胞术包括：细胞群体的基础上通过前向和侧向散射属性描绘形态（ⅰ）选择，（ⅱ）的活的CD45 +细胞，随后通过（ⅲ）的CD11b 阴性细胞的门控的选择，和（iv）细胞共表达F4 / 80和CD11c的的门控（ 图5A，B）。 
图1. 监测肿瘤生长Ťhrough动物成像（A）用GFP表达细胞成肿瘤细胞注射后的不同时间点的乳腺脂肪垫中喷射出的小鼠的白光图像。（B）的通讯通过使用GFP过滤器的得到的荧光图像。虚线标记肿瘤区。注意，在26日一天，一些肿瘤领域，可能会导致组织坏死或开发新血管系统缺乏明亮的绿色荧光。比例尺10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图2. 肺评估转移负担。（A）的小鼠与4T1细胞注射入与表面转移（箭头）的乳腺脂肪垫肺部图像。（B）GFP +肺转移（亮绿色荧光）图像通过使用成像显微镜获得的。比例尺10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图3.数字病理学和共聚焦显微镜在肺转移瘤的影像。（A）和4T1细胞注射到乳腺脂肪垫小鼠苏木和伊红（H＆E）染色肺段扫描（深蓝组织转移）。比例尺，4毫米。 （B）GFP +肺转移的共聚焦显微镜（亮绿色荧光）比例尺，200微米。 请点击此处查看大versio这个数字的n个。 
图4. 定量由数字病理学肺转移举证责任。（A）伊红（H＆E）染色肺段（深蓝色组织转移）的扫描。（B）在（A）中所示的肺部图像所产生的可训练的组织形态学图像分析工具（软件 - “精灵”）。红色表示的“精灵”确定为转移肺区。比例尺5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 
图5. 流式细胞仪应用蟑螂在识别肺部肺泡巨噬细胞。（A）cytometrydot plotsillustrating浇注战略，以确定CD45 + CD11b的负面 F4 / 80 +的CD11c +肺泡巨噬细胞的representativeflow。 （B）代表流式细胞仪 点对肺肺泡巨噬细胞控制或氯膦酸盐脂质体plotsillustrating效果。在图中的数字代表门控细胞的百分比。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Disclosures
作者宣称，他们没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项研究是由美国国防部支持的授予TSA 140010到MK和BC 111038到MMM由作者本人观点和意见，推荐并不会反映这些美国陆军和国防部的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
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