Protocol
Todos os estudos com animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care e Use Committee of Texas Tech University Health Sciences Center, e seguiu as orientações descritas no "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", publicado pelo National Institutes of Health. Use oito a 12 semanas os ratinhos BALB / c do sexo feminino de idade que se encontram comercialmente disponíveis. Injectam-se 1 x 10 5 4T1 ou 1 x 10 5 células 4T1 que expressam GFP, que podem ser adquiridos a partir de diversos fornecedores, na almofada de gordura mamaria.
1. Cultura de 4T1 e 4T1-GFP células e Preparação de Tumor suspensão de células para injectáveis 14
- 4T1 e 4T1-GFP Cultura celular
NOTA: Executar todas as etapas usando soluções estéreis num fluxo laminar (CFL) bio-segurança, a menos que especificado em contrário.- Manter as células 4T1 e 4T1-GFP em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor e 100 U / ml de penicilinaG e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina.
NOTA: Determine um número de passagens pela contagem de todos os tripsinização e revestimento das células. É importante a utilização de células com o mesmo número de passagem para todas as experiências com ratos, como o número de passagens afecta a tumorigenicidade de células e o potencial metastático. - Antes de injecções de células retirar o balão T75 cm 2, que contém as células de tumor em 80% de confluência, de um meio de incubação e aspirado. Adicionar 10 ml de PBS e girar o frasco suavemente para lavar médio restante, e depois aspirar PBS.
- Adicionar 2 ml de 0,25% de tripsina com EDTA ao balão e incliná-la para distribuir a solução uniformemente sobre a superfície e incuba-se em um incubador humidificado durante 3 min a 37 ° C com 5% de CO 2.
- Toque no balão para facilitar o desprendimento de células e adicionar 8 ml de meio fresco. Pipeta cima e para baixo várias vezes para perturbar aglomerados e obter uma suspensão única célula.
- centrifugar células por 5 min. a 500 xg à temperatura ambiente.Aspirar o sobrenadante e lava-se as células em 10 ml de PBS.
- Pipeta cima e para baixo várias vezes para perturbar aglomerados e obter uma suspensão única célula. Tome 100 ul de uma suspensão de células e contagem das células utilizando o analisador de viabilidade celular de acordo com as instruções do fabricante.
- Calcule o número de células necessárias para todas as injecções usando a fórmula: 10 5 células por rato x # de ratos utilizados em um experimento (sempre preparar células extra para estar em um lado seguro).
- centrifugar células como em 1.1.5. Retirar o sobrenadante através de células por aspiração e ressuspender na quantidade de PBS fresco necessário para se obter uma concentração celular final de 1 x 10 6 células / ml. Manter a suspensão de células em gelo até estar pronto para a injecção.
- Manter as células 4T1 e 4T1-GFP em meio RPMI suplementado com 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor e 100 U / ml de penicilinaG e 100 ug / ml de sulfato de estreptomicina.
- 4T1 ou 4T1-GFP celular Procedimentos Injection-rato
- O dia antes da injecção de células tumorais, anestesiar os ratos numa câmara de indução com 3% de isoflurano. Uma vez que os ratos estão dormindo e respirar regularmente, lugar tele mouse sobre um bloco cirúrgico com o nariz dentro do cone do nariz, e conectá-lo ao vaporizador isoflurano. Manter a anestesia com 2,5% de isoflurano. Beliscar o dedo do pé mouse para assegurar que o mouse é anestesiado.
- Aplique o creme de depilação com um cotonete para o local da injecção (peitoral almofada de gordura mamária direita) e esperar por 2 min. Limpar o local usando uma toalha de papel molhado, coloque o mouse de volta para a jaula e monitorar um animal até que ele recupera a consciência suficiente para manter o decúbito esternal.
- No dia da injecção, anestesiar os ratos como em 1.2.2 e colocar no bloco cirúrgico.
- Vortex do tubo contendo as células de tumor para obter a suspensão de célula uniforme. Aspirar 100 ul de uma suspensão de células contendo 1 x 10 5 células de tumor, para uma seringa de insulina de 0,5 mL (29 g, 12,7 mm de comprimento de agulha).
- Levante a pele usando o índice polegar eo dedo perto do 2º e 3º mamilo, inserir a agulha da seringa no MammarY almofada de gordura logo abaixo do terceiro bocal sob a pele entre os dedos e injectam células lentamente para formar uma bolha (injecção subcutânea).
- Posicione o mouse de volta para a jaula após a injeção e monitorar como em 1.2.2.
- Crescimento do tumor de monitoramento
- Medições de calibre 14
NOTA: Injetado 4T1 ou 4T1-GFP células formam tumor de mama agressivo. Normalmente, os tumores palpáveis aparecem ~ no dia 4-5 após a inoculação de células. As células 4T1-GFP formar tumores que crescem mais lentamente e dão metástases mais tarde. Medida do tumor duas ou três vezes por semana. Se o estado clínico dos animais se deteriora, animais perdem mais de 10% do peso corporal, tumores exceder 10% do peso corporal ou tornar-se ulcerada, eutanásia ratos imediatamente.- Anestesiar um rato como em 1.2.1., Pese, lugar no bloco cirúrgico e molhar a área com 70% de etanol.
- Palpe tumor no local da injecção (4 - 5 dias após a inoculação das células). <li> Medir o maior diâmetro (D) e o diâmetro mais pequeno (D1) com um compasso de calibre.
- Calcular o volume do tumor utilizando a fórmula volume = (DX D1 X d1) / 2 mm3. Monitorar a recuperação da anestesia do mouse como em 1.2.2.
- Medições de calibre 14
- Imagem (Apenas para 4T1 células GFP)
- Anestesiar o mouse como em 1.2.1. Posicione o mouse sobre um palco móvel dentro do instrumento de imagem. Manter a anestesia através do cone do nariz.
- Ligue o instrumento de imagem e a fonte de luz de acordo com as instruções do fabricante.
- Sob a "Aquisição" guia ir para a "iluminação" e mudar para a posição vazia (sem filtro) para a luz branca. Certifique-se de que o motor de luz está ligado e selecione 'Trans' na mesa de luz.
- Sob a guia "Microscópio", selecione "Clear" filtro de emissão e 0.5X ampliação. Na aba "Camera", certifique-se de que binning para captura é "1 x 1 'e preview' 4 x 4 '. Clique na visualização para localizar o tumor na luz branca, o foco para obter uma imagem clara e clique captura.
- Vá para a aba e mudança de iluminação "Aquisição" para filtrar 1 (filtro para GFP como por instruções do fabricante). Na aba "Microscópio", altere filtro de emissão para "530/20 GF". Pré-visualização e captura de imagem em um canal verde. Ajuste o tempo de exposição para obter o brilho adequado.
- Aplicar pseudo à imagem e salvar em pasta apropriada (Figura 1).
2. A administração intranasal de lipossomas 10
NOTA: Executar todas as etapas usando soluções estéreis num fluxo laminar (CFL) Bio-segurança, a menos que especificado em contrário.
- No dia 6 após a injecção das células tumorais anestesiar ratos como em 1.2.1.
- Vortex a suspensão clodronato ou o controlo de lipossoma (PBS), obtido a partir do fabricante. Tomar 60 ul de lipossomas sUSPENSÃO usando ponteira estéril.
- Liberam lentamente solução de lipossomas (5 mL de cada vez) perto das narinas, permitindo o mouse para respirar na solução, repetir até que é administrada toda a dose de 60 mL.
- Deixe o mouse recuperar a consciência antes de colocá-lo de volta na gaiola.
- administração de lipossomas Repita a cada 3 dias até os ratinhos são sacrificados. Não administrar lipossomas em um dia de sacrifício.
3. Rato Sacrifício e Recolha de Tecidos
NOTA: Use autoclavados e instrumentos esterilizados para dissecção mouse. Eutanásia ratos sob anestesia através da exsanguinação e remoção dos órgãos vitais.
- No dia 22 (Para 4T1 células) ou dia 26 (para células 4T1-GFP) após a injeção de células tumorais anestesiar o mouse como em 1.2.1. e coloque no bloco cirúrgico com um cone de nariz ligado ao vaporizador, manter a anestesia como em 1.2.1. Comprima um dos dedos do pé para garantir que o mouse está inconsciente.
- Pin os dedos usando agulhas para a placa de dissecação. Spray de etanol na pele do rato.
- Levante a pele usando uma pinça e fazer uma incisão com as tesouras cirúrgicas. Lentamente expor o peritoneu e continuar a cortar a pele através do tórax até ao pescoço.
- Usando as tesouras cirúrgicas fazer uma incisão no peritônio e expor cuidadosamente os órgãos com pontas de algodão, evitando danos aos vasos sanguíneos.
- Mover os órgãos para um lado e para expor a veia cava inferior. Punção da veia e coletar sangue com a 29 G seringa de insulina. Coloque sangue recolhido para dentro do tubo e deixar em gelo para posterior processamento.
- Cortar o diafragma para expor os Costela, pulmões e coração. Lentamente cortar a caixa torácica em ambos os lados usando o cortador de osso e levantar a parte superior da caixa torácica. Agarrar o coração com uma pinça e cortar o tecido conjuntivo que liga o coração e os pulmões para a cavidade torácica.
- Colocar os pulmões em pequena quantidade de PBS na 60 milímetrosplaca de Petri sobre gelo até estar pronto para geração de imagens e processamento adicional de cortes congelados para a microscopia de imunofluorescência ou histologia de rotina [incluindo hematoxilina e eosina (H & E) coloração].
4. Avaliação metástases pulmonares
- Contando e marcando Metástases de superfície
- Colocar a placa de Petri com os pulmões sob o microscópio de dissecação. Concentre-se para obter uma visão clara da superfície do pulmão.
- Usando um microscópio de dissecção observar a superfície do pulmão. Contagem de metástases nos lados anterior e posterior de ambos os pulmões.
NOTA: O pulmão normal é esbranquiçada ou rosada e porosa e tem uma esponja como a estrutura. Metástases 4T1 são sólidas e não porosa, por vezes, parecer ser semelhante a uma gota de líquido (Figura 2A).
- imagiologia pulmonar
- Coloque a placa de Petri com os pulmões no palco móvel dentro do instrumento de imagem.
- Ligue o instrumento eoBioLite fonte multiespectral. Abra o software. Sob a guia, "Aquisição", vá para "Iluminação", e mudar para posição vazia (sem filtro) para a luz branca. Motor Light -> ON, mesa de luz -> Epi. Sob o "microscópio" tab Escolha 'Limpar' filtro de emissão e 1.66X ampliação. Na aba "Camera", certifique-se de que binning para captura é "1 x 1 'e preview' 4 x 4 '.
- Clique em pré-visualização e foco para obter uma imagem clara dos pulmões em luz branca e clique captura.
- Vá para a aba "Aquisição" e mudança para o filtro 1 (filtro para GFP como por instruções do fabricante). Na aba "Microscópio", altere filtro de emissão para "530/20 GF". Pré-visualização e captura de imagem em um canal verde. Ajuste o tempo de exposição para obter o brilho adequado.
- Aplicar pseudo à imagem e salvar em pasta apropriada.
- Virar os pulmões para obter imagem do outro lado de uma forma semelhante. este procedure gera imagens de metástases GFP-positiva que pode ser adicionalmente quantificado utilizando software apropriado (Figura 2B) 14.
- imunofluorescência Microscopia
- Fixar os pulmões em paraformaldeído a 4%, a 4 ° C durante 4 h na escuridão.
- Lavar o tecido duas vezes com 10 ml de PBS durante 5 min para remover completamente o fixador. Transferir a 18% de sacarose em PBS e incubar O / N a 4 ° C.
- Remova o tecido da sacarose e dab qualquer excesso.
- Dê uma cryomold, cobrir a camada inferior com meio outubro Coloque o tecido em meio de outubro Encher o molde com meio OCT para cobrir completamente o tecido e colocar em gelo seco.
- bloco armazenar a -80 ° C, até o seccionamento.
- Prepare 5 mm de espessura com um criostato e local em lâminas carregadas.
- Armazenar os slides não utilizados em -80 ° C até à sua utilização.
- Air secar as lâminas durante 7 min. e lava-se com PBS para remover outubro Wipe o slide com o tecido ou papel toalha para remover o excesso de água, montagem lamelas com meio contendo DAPI de montagem e visualizar com filtro GFP sob o microscópio.
- Quantificar metástases GFP (Figura 3A) com o uso de software apropriado 14.
- Histologia e Patologia Digital
- Clique no botão de carga manual sob a guia início e esperar para o slide segurando cremalheira para ejetar a partir do scanner.
- Tome a secção de tecido H & E manchada, limpe-o com tecido para remover qualquer sujeira, e colocá-lo de forma segura no rack segurando slide.
- Insira a descrição slide na janela apareceu-up.
- Selecione a guia Área de digitalização na janela do console do imaging SS e ajustar o quadrado verde para definir a região de interesse (ROI) a ser digitalizado.
- Arrastar o diamante calibração azul a uma porção transparente da lâmina, onde o tecido é ausente, no entanto, dentro da ROI.
- Em seguida, selecione o Focus Points guia e clique no botão de selecção automática para obter vários pontos de foco (mais sinais amarelos) no tecido do ROI.
- Se necessário, coloque pontos de foco adicionais manualmente clicando duas vezes dentro do ROI.
- Prossiga para a guia de calibração e selecione o botão de calibração para iniciar a calibração corrediça no azul ponto de calibração de diamante. Após a calibração, é completada a imagem a partir do ponto de calibração será exibida.
- Inspecione esta imagem para garantir que ele é clara e livre de sujeira ou artefatos.
- Avance para o separador Verificação e selecione Start Scan para iniciar a digitalização do ROI. Secção histológica digitalizado é convertido para um slide digitais (Figura 3B e 4A)
- Quantificar carga metastática como anteriormente descrito (Figura 4B) 14.
5. Citometria de Fluxo (FACS) Análise de macrófagos alveolares nos pulmões
- Preparação de suspensi única célulaem
- Depois de imagiologia e contagem de metástases, lavar os pulmões com PBS estéril e colocar a placa de Petri. Faça 1 - 2 mm peças dos pulmões utilizando uma tesoura cirúrgica e uma pinça.
- Transferir as peças pulmão para o tubo de 15 ml com 3 ml de tampão de digestão contendo 1 mg / ml de colagenase P, 0,04 mg / ml de DNase I, e 10 ug / ml de meio RPMI inibidor de tripsina dissolvido (estéril).
- Incubar o tubo cónico num agitador rotativo na incubadora a 37 ° C durante 40 min.
- Remover o tubo cónico da incubadora e pipetar a solução cima e para baixo para dissociar o tecido.
- Filtrar a solução através do filtro de 40 um para evitar aglomerados e obter uma suspensão de células individuais. Se necessário, a desintegrar-se melhor o tecido prima tecido digerido contra o filtro de células com a ajuda de um êmbolo de seringa.
- Quando uma suspensão de células isoladas foi alcançado, recolher as células por centrifugação e lise de glóbulos vermelhos com2 ml de tampão ACK durante 10 min a RT. Em seguida, lavar uma pastilha de duas vezes em 8 ml de meio RPMI.
- Ressuspender as células em 3 ml de meio RPMI completo e proceder à célula de contagem utilizando o analisador de viabilidade celular de acordo com as instruções do fabricante.
- Coloração de células do pulmão de marcadores de superfície
Observação: executar todas as incubações a 4 ° C. Centrifugar a placa a 500 xg e 4 ° C.- Pipetar 1 X 10 6 células em 100 ul de tampão FACS (1% de FBS em PBS) aos poços individuais de uma placa de 96 poços de fundo em V. Usando uma placa de 96 poços de fundo em V facilita a entrega de múltiplas amostras.
- Pré-incubar a suspensão de células com 1 jig FC de ratinho de Bloco purificado de murganho anti-CD16 / CD32 em 100 ul de tampão de SCAF, durante 15 min. Centrifugar a placa de 96 poços de fundo em V para sedimentar as células e remover o sobrenadante por invertendo a placa e deixando que a solução de drenagem.
- Para a coloração de superfície, com antecedência, dilui-se os anticorpos para Murine antígenos em um tubo (mistura principal): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / I E (MHCII) (M5 / 114,152), CD80 PE (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) a uma concentração final de 2,5 ug / ml em tampão FACS contendo 10 ug / mL de bloco de CD16 / FC de CD32 anticorpo.
NOTA: Este conjunto de anticorpos é útil para a identificação e a avaliação de um estado funcional de macrófagos alveolares e células dendríticas. - Adicionar 100 ul de anticorpos diluídos (Master Mix) para os poços da placa de 96 poços de fundo em V e incubar a 4 ° C durante 30 min.
- Centrifugar a placa para sedimentar as células e remover o sobrenadante como em 5.2.2. Lavar as células com 200 uL de tampão de FACS, centrifugar a 500 g durante 5 min. Remover o sobrenadante como em 5.2.2. e ressuspender as células em 200 ul de PBS.
- Centrifugar a placa para sedimentar as células e adicionar corante de viabilidade diluída em PBS (1: 1000). Incubar durante 20 min a 4 ° C. </ Li>
- Centrifugar a placa para sedimentar as células e remover o sobrenadante como em 5.2.2. Lava-se com 200 ul de PBS e centrifugar novamente a placa.
- Ressuspender as células em 100 uL de paraformaldeído a 1% e armazenar a 4 ° C, até a aquisição pelo instrumento FACS. Antes de suspensões de células de transferência de aquisição para os tubos de polipropileno FACS.
6. Análise de Dados FACS: Estratégias Gating ea identificação de subpopulações de células
- Realizar análise FACS conforme relatado anteriormente 10. Portão adquiriu células / eventos com base em prospectivas (FSC) e lateral-dispersão (SSC); e, em seguida, portão vivo e CD45 + células. Para a identificação dos macrófagos alveolares, porta CD11b-negativas e, em seguida, as células CD11c + F4 / 80 +. (Figura 5A).
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Representative Results
A injecção de células de tumor 4T1-GFP para a almofada de gordura mamaria, conduz à formação de tumores de ratinho (Figura 1A) que recapitulam a disseminação metastática do cancro da mama humano, como metástases são formados rapidamente nos pulmões (Figura 2), fígado, ossos e cérebro de ratos 11. A transfecção estável de células 4T1 com GFP facilita a monitorização do crescimento do tumor (Figura 1B), localizando células tumorais metástase e quantificar a carga metastática (Figura 2B, 3B). Além disso, a imagem latente de tumores fornece as informações adicionais sobre várias características patológicas, como a morte de células tumorais e vasculatura do tumor. A fluorescência verde brilhante (Figura 1B-os painéis de média) indicam a alta expressão de GFP, que é geralmente associada com o parênquima tumor viável. Considerando a falta de GFP em algumas áreas tumorais pode indicar a morte de células tumorais (
Uma vez que a maioria das metástases pulmonares estão localizados na superfície do pulmão, que pode ser observada sob o microscópio de dissecação normal. As lesões metastáticas são geralmente claramente distinta do parênquima circundante (Figura 2A). Para verificar a observações grosseiras e avaliar as metástases que são mais profundas dentro do parênquima pulmonar, a imagiologia fluorescente dos pulmões pode ser realizada (Figura 2B), se as células que expressam GFP foram usados para injecção. Embora autofluorescência de pulmão é claramente visível nas imagens, brilhante fluorescência derivados de GFP facilita metástases distintivas de circundante parênquima pulmonar. Alternativamente, a histologia de rotina (Figura 3A e Figura 4A) em conjunto com algoritmos de patologia digitais ( Multicolor FACS proporciona oportunidade para caracterizar as populações de células raras, mesmo através da utilização de superfície celular multipolar e / ou citoplasmáticos marcadores simultaneamente. Macrófagos alveolares são caracterizados pela ausência de expressão de CD11b e expressão de F4 / 80 e CD11c (Figura 5). A abordagem típica para identificar essas células por fluxo envolve citometria de: (i) selecção de populações de células com base na morfologia representado pela frente e propriedades de dispersão lateral, (ii) selecção de CD45 viável + células, seguido por (iii) de selecção de células negativas CD11b, e (iv) de selecção de células que co-expressam F4 / 80 e CD11c (Figura 5A, B). 
Figura 1. Monitoramento Tumor Crescimento Through Imagiologia animal. (A) imagens luz branca do rato injectado com células expressando GFP na almofada de gordura mamaria com diferentes pontos de tempo após a injecção das células tumorais. (B) correspondente imagens fluorescentes obtidos através da utilização de filtro de GFP. As linhas tracejadas marcar a área do tumor. Observe a falta de fluorescência verde brilhante em algumas áreas do tumor no dia 26 que podem resultar da necrose dos tecidos ou o desenvolvimento de neovascularização. Barra de escala, 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2. Avaliação do pulmão metastático fardo. Imagens (A) dos pulmões de ratinhos injectados com células 4T1 na almofada de gordura mamaria com as metástases de superfície (setas).(B) Imagens de metástases GFP + pulmonares (brilhante fluorescência verde) obtida através do uso de microscópio de imagem. Barra de escala, 10 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3. Digital Histopatologia e microscopia confocal no Imaging de metástases pulmonares. (A) A verificação da secção de pulmão hematoxilina e eosina (H & E) manchado de camundongos injetados com 4T1 células para a almofada de gordura mamária (azul escuro tecido metástases). barra de escala, 4 mm. (B) A microscopia confocal de GFP + metástases pulmonares (brilhante fluorescência verde). Barra de escala, de 200 mm. Por favor clique aqui para ver uma versio maiorn desta figura. 
Figura 4. Quantificação de pulmão metastático Burden pela Digital Histopatologia. (A) A verificação de hematoxilina e eosina (H & E) seção do pulmão corado (azul escuro tecido metástases). (B) A imagem dos pulmões mostrados em (A) gerado pela uma ferramenta de análise de imagem treinável histomorfologia (software-"Genie"). A cor vermelha indica as áreas pulmonares identificadas por "Genie", como metástases. Barra de escala, 5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 5. Citometria de Fluxo Appbaratas para identificação de macrófagos alveolares nos pulmões. (A) O representativeflow cytometrydot plotsillustrating a estratégia gating para identificar CD45 + CD11b negativo F4 / 80 + CD11c + macrófagos alveolares. (B) a citometria de fluxo representativas dot efeito plotsillustrating de controlo ou de lipossomas clodronato em macrófagos alveolares de pulmão. Os números em parcelas representam percentagens de células fechadas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi suportada pelo Departamento de Defesa conceder TSA 140010 para MK e BC 111.038 para MMM visões e opiniões de e endossos pelo autor (es) não refletem as do Exército dos EUA ou o Departamento de Defesa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
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