Protocol
Alla djurstudier har godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén av Texas Tech University Health Sciences Center och följde de riktlinjer som anges i "Guide för vård och användning av försöksdjur", publicerad av National Institutes of Health. Använda åtta till tolv veckor gamla BALB / c-möss som är kommersiellt tillgängliga. Injicera 1 x 10 5 4T1 eller 1 x 10 5 4T1 celler som uttrycker GFP, som kan köpas från olika leverantörer, i bröstfettkudden.
1. Kultur av 4T1 och 4T1-GFP celler och beredning av tumörcell Suspension för injektionsvätskor 14
- 4T1 och 4T1-GFP Cell Culture
OBS: Utför alla steg med sterila lösningar i ett laminärt luftflöde (LAF) biosäkerhet skåp om inte annat anges.- Upprätthålla 4T1 och 4T1-GFP-celler i RPMI-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillinG och 100 | ig / ml streptomycinsulfat.
OBS: Bestäm en passage nummer genom att räkna varje trypsinisering och plätering av celler. Det är viktigt att använda celler med samma passagenummer till alla mus experiment som antalet passager påverkar cell tumorigenicitetsprov och metastatisk potential. - Före cellinjektioner bort T75 cm2 kolv, innehållande tumörceller vid 80% konfluens, från en inkubator och aspirera medium. Tillsätt 10 ml PBS och rotera kolven försiktigt för att tvätta ur kvarvarande medium och sedan aspirera PBS.
- Tillsätt 2 ml av 0,25% trypsin med EDTA till kolven och luta den för att fördela lösningen likformigt på ytan och inkubera i en fuktad inkubator under 3 minuter vid 37 C med 5% CO2.
- Tryck på kolven för att underlätta avskiljandet av celler och tillsätt 8 ml färskt medium. Pipettera upp och ned flera gånger för att störa klumpar och få en enkelcellsuspension.
- Centrifugera cellerna under 5 min. vid 500 xg vid RT.Aspirera supernatanten och tvätta cellerna i 10 ml PBS.
- Pipettera upp och ned flera gånger för att störa klumpar och få en enkelcellsuspension. Ta 100 pl av en cellsuspension och räkna cellerna med hjälp av cellviabiliteten analysatorn enligt tillverkarens instruktioner.
- Beräkna antalet celler som krävs för alla injektioner med hjälp av formeln: 10 5 celler per mus x # av möss som användes i ett experiment (alltid förbereda extra celler för att vara på en säkra sidan).
- Centrifugera cellerna som i 1.1.5. Avlägsna supernatanten genom aspiration och resuspendera cellerna i mängden färsk PBS som krävs för att erhålla en slutlig cellkoncentration av 1 x 10 6 celler / ml. Håll cellsuspensionen på is tills redo för injektion.
- Upprätthålla 4T1 och 4T1-GFP-celler i RPMI-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum och 100 U / ml penicillinG och 100 | ig / ml streptomycinsulfat.
- 4T1 eller 4T1-GFP-cellinjektion-mus Förfaranden
- Dagen före tumörcellinjektion, söva möss i en induktionskammare med 3% isofluran. När möss sover och andas regelbundet plats than muspekaren över en kirurgisk dyna med nosen i noskonen och anslut den till isofluran förångare. Upprätthålla anestesi med 2,5% isofluran. Nyp musen tån för att säkerställa att musen är sövd.
- Applicera hårborttagningskräm med en bomullspinne till injektionsstället (höger bröst bröstfettkudden) och vänta i 2 minuter. Rengör platsen med hjälp av en våt pappershandduk, placera musen tillbaka i buren och övervaka ett djur tills det återfår tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla den sternala VILA.
- På dagen för injektionen, söva möss som i 1.2.2 och placera på den kirurgiska pad.
- Vortexa röret innehållande tumörceller att få likformig cellsuspension. Aspirera 100 pl av en cellsuspension, innehållande 1 x 10 5 tumörceller, in i en spruta 0,5 ml insulin (29 g, 12,7 mm-nål längd).
- Lyft huden med hjälp av tummen och pekfingret index nära 2: a och 3: e bröstvårtan, in nålen i sprutan i mammary fett pad strax under den tredje nippel under huden mellan fingrarna och injicerar celler långsamt för att bilda en bubbla (subkutan injektion).
- Placera musen tillbaka i buren efter injektion och bildskärmen som i 1.2.2.
- Övervakning Tumörtillväxt
- Caliper Mätningar 14
OBS: Injicerad 4T1 eller 4T1-GFP celler bildar aggressiva brösttumör. Vanligtvis påtagliga tumörer visas ~ vid dag 4-5 efter cell ympning. 4T1-GFP celler bildar tumörer som växer långsammare och ge metastaser senare. Mäta tumören två till tre gånger i veckan. Om kliniska status djur försämras, djur förlorar mer än 10% av kroppsvikten, tumörer överstiga 10% av kroppsvikten eller bli såriga, avliva möss omedelbart.- Söva en mus som i 1.2.1., Väga, plats på den kirurgiska pad och våt området med 70% etanol.
- Palpera tumör i injektionsstället (4 - 5 dagar efter cellympning). <li> Mät den största diametern (D) och med mindre diameter (d1) med ett skjutmått.
- Beräkna tumörvolymen med formel Volym = (DX d1 X d1) / 2 mm 3. Övervaka musen återhämtning från anestesi som i 1.2.2.
- Caliper Mätningar 14
- Imaging (Endast för 4T1 GFP Cells)
- Söva musen som i 1.2.1. Placera musen på en rörlig scen i bild instrumentet. Upprätthålla anestesi genom noskonen.
- Slå på avbildningsinstrumentet och ljuskällan enligt tillverkarens instruktioner.
- Under fliken "Förvärv" gå till "Belysning" och växla till den tomma positionen (inget filter) för vitt ljus. Se till att ljuset motorn är igång och välj "Trans" i ljusbordet.
- Under fliken "Mikroskop", välj "Rensa" emissionsfilter och 0,5X förstoring. I "Kamera" fliken, se till att binning för infångning är "1 x 1" och förhandsgranska "4 x 4". Klicka på förhandsgranskningen för att lokalisera tumören i vitt ljus, fokus att få tydlig bild och klicka på capture.
- Gå till "Förvärv" -fliken och ändra belysning för att filtrera en (filter för GFP enligt tillverkarens anvisningar). I "Mikroskop" -fliken, ändra utsläpp filter för att "530/20 GF". Förhandsgranska och fånga bilden i en grön kanal. Justera exponeringen tid att få rätt ljusstyrka.
- Applicera pseudo bilden och spara i lämplig mapp (Figur 1).
2. Intranasal administration av liposomer 10
OBS: Utför alla steg med sterila lösningar i ett laminärt luftflöde (LAF) biosäkerhet skåp om inte annat anges.
- På dag 6 efter tumörcellinjektion söva möss som i 1.2.1.
- Virvel klodronat eller kontroll (PBS) liposomsuspensionen erhållen från tillverkaren. Ta 60 | il liposom suspension med steril pipettspets.
- Släpp långsamt liposomlösning (5 l varje gång) nära näsborrarna tillåter musen för att andas i lösningen, upprepa tills hela dosen av 60 pl administreras.
- Låt musen återfår medvetandet innan den placeras tillbaka i buren.
- Upprepa liposomer administration var 3 dagar tills mössen avlivas. Administrera inte liposomer på en dag av offer.
3. Mus Offer och Tissue Collection
OBS: Använd autoklaveras och sterila instrument för mus dissekering. Avliva möss under anestesi genom blodtömning och avlägsnande av vitala organ.
- På dag 22 (För 4T1-celler) eller dag 26 (för 4T1-GFP celler) efter tumörcellinjektion söva musen som i 1.2.1. och placera den kirurgiska pad med en noskon som är ansluten till förångaren, upprätthålla anestesi som i 1.2.1. Nypa en av tårna för att säkerställa att mOuse är medvetslös.
- Stift tårna som använder nålar för att dissekering kortet. Spraya etanol på musen huden.
- Lyft huden med pincett och gör ett snitt med kirurgiska saxar. Sakta exponera bukhinnan och fortsätter att skära huden genom bröstkorgen tills nacken.
- Med hjälp av kirurgiska saxar göra ett snitt i bukhinnan och exponera noga organ med bomulls tips undvika skador på blodkärlen.
- Flytta de organ som en sida och exponerar den nedre hålvenen. Punktera venen och samla blod med insulin sprutan 29 G. Placera insamlat blod i röret och lämna på is för vidare bearbetning.
- Skär membranet att exponera bröstkorgen, lungor och hjärta. Sakta skära bröstkorgen på båda sidor med benet saxen och lyft upp i bröstkorgen. Greppa hjärtat med pincett och skär den bindväv som förbinder hjärtat och lungorna till brösthålan.
- Placera lungorna i liten mängd PBS i 60 mmPetriskål på is tills redo för avbildning och vidare bearbetning till frysta snitt för immunofluorescerande mikroskopi eller rutin histologi [inklusive hematoxylin och eosin (H & E) färgning].
4. lungmetastaser Utvärdering
- Räkna och Scoring Surface metastaser
- Placera petriskål med lungorna under dissektion mikroskop. Fokusera för att få en klar bild av lungytan.
- Med användning av ett dissektionsmikroskop observera lungytan. Räkna metastaser på de främre och bakre sidorna av båda lungorna.
OBS: Den normala lungan är vitaktig eller rosa och porös och har en svampliknande struktur. 4T1 metastaser är fasta och icke-porös, ibland verkar likna en vätskedroppe (Figur 2A).
- lung imaging
- Placera petriskål med lungorna på den rörliga scenen inuti avbildningsinstrumentet.
- Slå på instrumentet ochBioLite multispektral källa. Öppna programmet. Under fliken "Förvärv", gå till "Ljus", och byta till tom position (inget filter) för vitt ljus. Ljus Motor -> ON, ljus bord -> Epi. Under fliken "Mikroskop" Välj "Rensa" emissionsfilter och 1.66X förstoring. I "Kamera" fliken, se till att binning för infångning är "1 x 1" och förhandsgranska "4 x 4".
- Klicka på förhandsgranska och fokus för att få en klar bild av lungorna i vitt ljus och klicka fånga.
- Gå till "Förvärv" -fliken och förändring till filtret 1 (filter för GFP enligt tillverkarens anvisningar). I "Mikroskop" -fliken, ändra utsläpp filter för att "530/20 GF". Förhandsgranska och fånga bilden i en grön kanal. Justera exponeringen tid att få rätt ljusstyrka.
- Applicera pseudo bilden och spara i lämplig mapp.
- Flip lungorna för att få bilden av den andra sidan på ett liknande sätt. denna procedure genererar bilder av GFP-positiva metastaser som kan kvantifieras ytterligare genom användning av lämplig mjukvara (Figur 2B) 14.
- immunofluorescerande mikroskopi
- Fixa lungorna i 4% paraformaldehyd, vid 4 ° C under 4 h i mörker.
- Tvätta vävnaden två gånger med 10 ml PBS under 5 min för att fullständigt avlägsna fixativet. Överföra till 18% sackaros i PBS och inkubera O / N vid 4 ° C.
- Ta bort vävnad från sackaros och badda bort eventuellt överskott.
- Ta en cryomold, täcker bottenskiktet med oktober medium. Placera vävnaden på oktober medium. Fylla formen med oktober-medium för att fullständigt täcka vävnaden och placera på torris.
- Minnesblocket vid -80 ° C fram till snittning.
- Förbered 5 um tjocka sektioner med en kryostat och plats på laddade objektglas.
- Förvara oanvända bilder i -80 ° C tills vidare användning.
- Lufttorka glasen för 7 min. och tvätta med PBS för att avlägsna oktober Wipe bilden med vävnad eller pappershandduk för att avlägsna överskott av vatten, montera täckglas med monteringsmedium innehållande DAPI och visualisera med GFP filtret under mikroskop.
- Kvantifiera GFP metastaser (Figur 3A) med hjälp av lämplig mjukvara 14.
- Histologi och digital patologi
- Klicka på knappen manuellt under fliken start och vänta på glid hålla rack att mata från skannern.
- Ta H & E färgade vävnadssnitt, rengör den med vävnad för att avlägsna all smuts, och placera den säkert i bilden håller racket.
- Ange bildbeskrivning i poppade upp fönstret.
- Välj fliken Scan Area på SS imaging konsolfönstret och justera den gröna rutan för att definiera regionen av intresse (ROI) som ska skannas.
- Dra den blå kalibrerings diamant till en tydlig del av bilden, där vävnad är frånvarande, dock inom ROI.
- Därefter väljer Focus Points flik och klicka på auto väljarknappen för att få flera fokuspunkter (gula plustecken) på vävnaden i ROI.
- Om det är nödvändigt, placera ytterligare fokuspunkter manuellt genom att dubbelklicka i ROI.
- Fortsätt till fliken kalibrera och välj kalibreringsknappen för att börja glida kalibrering vid den blå kalibreringsdiamantspets. Efter det att kalibreringen är avslutad bilden från kalibreringspunkten kommer att visas.
- Inspektera den här bilden för att se till att den är klar och fri från smuts eller artefakter.
- Fortsätt till fliken Scan och välj Starta skanning för att börja skanna av ROI. Skannade histologisk sektion omvandlas till en digital slid (figur 3B och 4A)
- Kvantifiera metastatisk börda som tidigare beskrivits (figur 4B) 14.
5. Flödescytometri (FACS) analys av alveolära makrofager i lungorna
- Framställning av Single Cell Suspensipå
- Efter bildalstring och räkning av metastaser, tvätta lungorna med steril PBS och placera till petriskål. Gör 1 - 2 mm bitar i lungorna med hjälp av kirurgisk sax och pincett.
- Överför lung bitarna till 15 ml koniska rör med 3 ml av digereringsbuffert innehållande 1 mg / ml kollagenas P, 0.04mg / ml DNas I, och 10 | ig / ml trypsininhibitor upplöst RPMI-medium (steril).
- Inkubera det koniska röret på en roterande skakanordning i inkubator vid 37 ° C under 40 min.
- Ta bort röret koniska från inkubatorn och pipet lösningen upp och ner för att dissociera vävnaden.
- Passera lösningen genom 40 pm sil för att undvika klumpar och få en enda cell suspension. Om det behövs, att upplösas bättre det digererade vävnaden pressvävnad mot cellfilter med hjälp av en sprutkolv.
- När en enkelcellsuspension har uppnåtts, samla upp cellerna genom centrifugering och lysera röda blodkroppar med2 ml ACK-buffert under 10 min vid RT. Då, tvätta en pellet två gånger i 8 ml RPMI.
- Resuspendera cellerna i 3 ml av komplett RPMI-medium och fortsätt till cellräkning med användning av cellviabiliteten analysatorn enligt tillverkarens instruktioner.
- Färgning av lungceller för ytmarkörer
OBS: Utför alla inkubationer vid 4 ° C. Centrifugera plattan vid 500 xg och 4 ° C.- Pipettera 1 x 10 6 celler i 100 pl FACS-buffert (1% FBS i PBS) till enskilda brunnar i en V-bottnad 96-brunnsplatta. Med hjälp av en V-botten 96 brunnar underlättar lämnandet av flera prover.
- Pre-inkubera cellsuspensionen med 1 | j, g mus Fc Block renad anti-mus-CD16 / CD32 i 100 pl FACS-buffert under 15 min. Centrifugera den V-botten 96 brunnars platta för att pelletera cellerna och avlägsna supernatanten genom att vända plattan och låta lösningen avloppet.
- För ytfärgning, i förväg, späd antikropparna till Murine antigener i ett rör (Master Mix): BV605 CD45 (30-F11), PE CD11b (M1 / 70), PE / Cy7 F4 / 80 (BM8), APC / Cy7 CD11c (N418), PerCPCy5.5 I A / i SV (MHCII) (M5 / 114,152), PE CD80 (16-10A1), AF 647 CD86 (GL-1) till en slutlig koncentration av 2,5 | j, g / ml i FACS-buffert innehållande 10 | j, g / ml av Fc-block CD16 / CD32 antikropp.
OBS: Denna uppsättning av antikroppar är användbar för identifiering och utvärdering av en funktionell status för alveolära makrofager och dendritiska celler. - Tillsätt 100 | il av utspädda antikroppar (huvudblandning) och brunnarna i den V-botten 96 brunnars platta och inkubera vid 4 C under 30 min.
- Centrifugera plattan till pellets celler och avlägsna supernatanten som i 5.2.2. Tvätta cellerna med 200 | il av FACS-buffert, centrifugera vid 500 g under 5 min. Avlägsna supernatanten som i 5.2.2. och återsuspendera celler i 200 pl PBS.
- Centrifugera plattan till pellets celler och lägga livskraft färgämne utspätt i PBS (1: 1000). Inkubera i 20 minuter vid 4 C. </ Li>
- Centrifugera plattan till pellets celler och avlägsna supernatanten som i 5.2.2. Tvätta med 200 pl av PBS och centrifugera plattan igen.
- Resuspendera cellerna i 100 pl 1% paraformaldehyd och förvara vid 4 ° C tills förvärvet genom FACS instrumentet. Före förvärvet överföra cellsuspensioner till polypropylen FACS rör.
6. Analys av FACS data: Gating strategier och identifiering av cellsubpopulationer
- Utför FACS-analys som tidigare rapporterats 10. Gate förvärvade celler / händelser baserat på framåt (FSC) och sidospridning (SSC); och sedan gate levande och CD45 + celler. För alveolär makrofag identifiering, grind CD11b-negativa och sedan CD11c + F4 / 80 + celler. (Figur 5A).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Injektionen av 4T1-GFP-tumörceller in i bröstfettkudden leder till bildandet av mustumörer (Figur 1A) som rekapitulera den metastatiska spridningen av human bröstcancer, eftersom metastaser snabbt bildas i lungorna (figur 2), lever, ben och hjärna hos möss 11. Den stabila transfektion av 4T1-celler med GFP underlättar övervakning av tumörtillväxt (Figur 1B), spårning metastaserande tumörceller och kvantifiera metastaserande bördan (Figur 2B, 3B). Dessutom, avbildning av tumörer ger ytterligare information om flera patologiska funktioner såsom tumör celldöd och tumörvaskulatur. Den ljusa grön fluorescens (Figur 1B-mitten paneler) visar hög GFP uttryck, som vanligtvis förknippas med livskraftig tumör parenkymet. Bristen på GFP i vissa tumör områden kan tyda på tumör celldöd (
Eftersom merparten av lungmetastaser är belägna på lungytan, kan de observeras enligt det ordinarie dissektion mikroskop. De metastaser är vanligen tydligt skiljer sig från den omgivande parenkymet (Figur 2A). För att kontrollera brutto observationer och utvärdera metastaser som är djupare inom lungparenkym, kan utföras fluorescerande avbildning av lungor (figur 2B), om GFP-uttryckande celler användes för injektion. Även lung autofluorescens är tydligt i bilderna, underlättar ljus GFP härrörande fluorescens särskiljande metastaser från omgivande lungparenkym. Alternativt rutin histologi (Figur 3A och figur 4A) i samband med digital patologi algoritmer ( Multicolor FACS erbjuder möjlighet att karakterisera även sällsynta cellpopulationer genom användning av flerpoliga cellytan och / eller cytoplasmatiska markörer samtidigt. Alveolära makrofager kännetecknas av brist på CD11b uttryck och uttryck av F4 / 80 och CD11c (Figur 5). Den typiska metod för att identifiera dessa celler genom flödescytometri innebär: (i) val av cellpopulation baserad på morfologi avbildas av framåt och sidospridningsegenskaper, (ii) val av livsdugliga CD45 + celler följt av (iii) grind av CD11b negativa celler, och (iv) gating av celler som samuttrycker F4 / 80 och CD11c (Figur 5A, B). 
Figur 1. Övervakning tumörtillväxt Through Animal Imaging. (A) Vitt ljus bilder av mus som injicerats med GFP-uttryckande celler i bröstfettkudden vid olika tidpunkter efter tumörcellinjektion. (B) Motsvarande fluorescerande bilder som erhållits genom användning av GFP filter. Streckade linjer markerar tumörområdet. Notera bristen på ljus grön fluorescens i vissa tumör områden på dag 26 som kan bli följden av vävnadsnekros eller utveckla kärlnybildningens. Skala bar, 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 2. Utvärdering av Lung Metastatisk Burden. (A) Bilder av lungorna hos möss som injicerats med 4T1 celler i bröstfettkudden med ytan metastaser (pilar).(B) Bilder av GFP + lungmetastaser (ljust grön fluorescens) som erhållits genom användning av avbildning mikroskop. Skala bar, 10 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 3. Digital Histopatologi och konfokalmikroskopi i avbildning av lungmetastaser. (A) avsökning av hematoxylin och eosin (H & E) färgade lungsektionen från möss injicerade med 4T1 celler i bröstfettkudden (mörkblå vävnad-metastaser). Skala bar, 4 mm. (B) Konfokalmikroskopi av GFP + lungmetastaser (ljust grön fluorescens). Skala bar, 200 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4. Kvantifiering av Lung Metastatisk Burden av Digital Histopatologi. (A) genomsökning av hematoxylin och eosin (H & E) färgade lungsektionen (mörkblå vävnad-metastaser). (B) Bilden av lungorna som visas i (A) som genereras av en träningsbar histomorphology bildanalysverktyget (mjukvaru- "Genie"). Röd färg indikerar lung områden som "Genie" som metastaser. Skala bar, 5 mm. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 5. Flödescytometri Appkackerlackor för att identifiera alveolära makrofager i lungorna. (A) representativeflow cytometrydot plotsillustrating grind strategi för att identifiera CD45 + CD11b negativ F4 / 80 + CD11c + alveolära makrofager. (B) representant flödescytometri dot plotsillustrating effekten av kontroll eller klodronat liposomer på lung alveolära makrofager. Siffror inom tomter representerar procentandelar av gated celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Denna forskning har stötts av försvarsdepartementet ge TSA 140.010 till MK och BC 111.038 till MMM synpunkter och åsikter, och stöd från författaren (s) inte återspeglar de den amerikanska armén eller försvarsdepartementet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4T1 cell line | American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA | CRL 2539 | Tumor cells |
| 4T1-GFP cell line | Caliper life sciences/ Perkin Elmer, Waltham, MA, USA | BW128090 | Tumor cells |
| RPMI | Corning, Corning, NY, USA | 10-040-CM | Media |
| Heat inactivated FBS | Gibco (Thermo Scientific), USA | 10082147 | Media |
| Penicillin Streptomycin | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | MT-300-02-CI | Media |
| PBS | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | BP399-20 | Dilute with distilled water |
| Trypsin 0.25% with EDTA | Hyclone, Logan, Utah, USA | SH30042.02 | Tissue culture supplies |
| T75 cm2 flask | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 12-565-32 | Tissue culture supplies |
| 15 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352096 | Tissue culture supplies |
| 50 ml conical tube | BD falcon, Franklin Lakes, NJ, USA | 352098 | Tissue culture supplies |
| 60 mm2 Petri dish | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | AS4052 | For lung imaging |
| Isoflurane (Isothesia) | Butler Schein Animal health, Dublin, OH, USA | NDC 11695-6776-2 | Mouse anesthesia |
| Clodronate liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101C-N | Macrophages depletion |
| Control liposomes | Formumax Scientific Inc, Palo Alto, CA, USA | F70101-N | Control PBS-liposomes |
| 29 gauge insulin syringes (12.7 mm and 0.5 ml capacity)- Reli-On | Walmart, Bentonville, AR, USA | For tumor cell injection | |
| Hair removal cream (Nair) | Walmart, Bentonville, AR, USA | ||
| Paraformaldehyde solution (4%) | Affymetrix, Santa Clara, CA, USA | 19943-I Lt | Dilute to 4% or 1% using 1x PBS |
| OCT compound | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 230-730-571 | For freezing tissue in cryomolds |
| Fluoro-Gel-II with DAPI | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA | 17985-51 | Mounting medium |
| Sucrose | Sigma, St. Louis, MO, USA | S-9378 | Cryopreservation |
| Collagenase P | Roche, Basel, Switzerland | 11249002001 | Components of tissue digestion buffer |
| Dnase I | Roche, Basel, Switzerland | 10104159001 | Components of tissue digestion buffer |
| Trypsin inhibitor | Sigma, St. Louis, MO, USA | T9253 | Components of tissue digestion buffer |
| 40 micron cell strainers | Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 22-363-547 | Used in tissue digestion to remove clumps |
| Trustain FcX-Fc Block (CD16/CD32) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101320 | Antibodies for flow cytometry |
| BV605 CD45 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 103139 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD11b | Biolegend, San Diego, CA, USA | 101207 | Antibodies for flow cytometry |
| PE Cy7 F4/80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 123113 | Antibodies for flow cytometry |
| APC/Cy7 CD11c | Biolegend, San Diego, CA, USA | 117323 | Antibodies for flow cytometry |
| PerCPcy5.5 IA/IE (MHCII) | Biolegend, San Diego, CA, USA | 107625 | Antibodies for flow cytometry |
| PE CD80 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 104707 | Antibodies for flow cytometry |
| AF647 CD86 | Biolegend, San Diego, CA, USA | 105019 | Antibodies for flow cytometry |
| Fixable viability Dye eflour 506 | eBioscience, San Diego, CA,USA | 65-0866 | Antibodies for flow cytometry |
| Cryostat | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | CM1850 | Cryosectioning |
| UVP iBox Explorer | UVP Inc, Upland, CA, USA | Mouse and lung fluorescent imaging | |
| Aperio Scanscope CS | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Digital pathology | |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA | Flow cytometry/data acquisition | |
| Nikon A1 confocal TE2000 microscope | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Imaging and quantifying GFP fluorescence in lung cryosections | |
| UVP visionworks software (Version 7.1RC3.38) | UVP Inc, Upland, CA, USA | Imaging software for iBOX | |
| Aperio Imagescope software (v12.1.0.5029) | Leica Biosystems, Buffalo Grove, IL, USA | Imaging software for analysis of digital slides | |
| Flow JO software (version 9.8.1) | Flow JO LLC, Ashland, OR, USA | Analysis of flow cytometric data | |
| NIS Elements AR (version 4.20.01) 64 Bit | Nikon Instruments Inc., Melville, NY 11747-3064, U.S.A. | Acquisition and analysis of lung cryosections for GFP |
References
- Sceneay, J., Smyth, M. J., Moller, A. The pre-metastatic niche: finding common ground. Cancer Metastasis Rev. , (2013).
- Fidler, I. J. The pathogenesis of cancer metastasis: the 'seed and soil' hypothesis revisited. Nat Rev Cancer. 3, 453-458 (2003).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Hiratsuka, S., et al. MMP9 induction by vascular endothelial growth factor receptor-1 is involved in lung-specific metastasis. Cancer Cell. 2, 289-300 (2002).
- Hiratsuka, S., et al. The S100A8-serum amyloid A3-TLR4 paracrine cascade establishes a pre-metastatic phase. Nat Cell Biol. 10, 1349-1355 (2008).
- Yan, H. H., et al. Gr-1+CD11b+ myeloid cells tip the balance of immune protection to tumor promotion in the premetastatic lung. Cancer Res. 70, 6139-6149 (2010).
- Gao, D., et al. Myeloid progenitor cells in the premetastatic lung promote metastases by inducing mesenchymal to epithelial transition. Cancer Res. 72, 1384-1394 (2012).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. Tissue-resident macrophages. Nat Immunol. 14, 986-995 (2013).
- Holt, P. G., Strickland, D. H., Wikstrom, M. E., Jahnsen, F. L. Regulation of immunological homeostasis in the respiratory tract. Nat Rev Immunol. 8, 142-152 (2008).
- Sharma, S. K., et al. Pulmonary alveolar macrophages contribute to the premetastatic niche by suppressing antitumor T cell responses in the lungs. J. Immunol. 194, 5529-5538 (2015).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. Coligan, J. E., et al. , Chapter 20, Unit 20 22 (2001).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Buiting, A. M., Van Rooijen, N. Liposome mediated depletion of macrophages: an approach for fundamental studies. J. Drug Target. 2, 357-362 (1994).
- Vadrevu, S. K., et al. Complement c5a receptor facilitates cancer metastasis by altering T-cell responses in the metastatic niche. Cancer Res. 74, 3454-3465 (2014).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv. Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Bosiljcic, M., et al. Myeloid suppressor cells regulate the lung environment--letter. Cancer Res. 71, author reply 5052-5053 5050-5051 (2011).
- Yan, H. H., et al. Myeloid Suppressor Cells Regulate the Lung Environment-Response. Cancer Res. 71, 5052-5053 (2011).
- Van Rooijen, N., Sanders, A. Liposome mediated depletion of macrophages: mechanism of action, preparation of liposomes and applications. J. Immunol. Methods. 174, 83-93 (1994).
