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Developmental Biology

मानव स्टेम कोशिकाओं के निलंबन के आधार पर भेदभाव के लिए कार्डिएक microwells में कुल आकार अनुकूलन

Published: September 25, 2016 doi: 10.3791/54308
Automatic Translation
*1, *2, 2
1Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, 2Department of Comparative Biology and Experimental Medicine, University of Calgary
* These authors contributed equally

Summary

परम्परागत तरीकों मानव pluripotent के निलंबन कुल आधारित भेदभाव हृदय कोशिकाओं (hPSCs) कुल आकार और आकृति के संबंध में संस्कृति विविधता से त्रस्त हैं उपजी आरंभ करने के लिए। यहाँ, हम हृदय भेदभाव microwells रोजगार उत्पन्न करने के लिए आकार नियंत्रित hPSC हृदय को बढ़ावा देने की शर्तों के तहत सुसंस्कृत समुच्चय के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन है।

Introduction

इन विट्रो सेल संस्कृति में तौर तरीकों की एक संख्या के तहत किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर या तो दो-आयामी पक्षपाती की स्थिति में या तीन आयामी निलंबन की स्थिति है कि पूरी तरह से अधिक विवो प्रणालियों में पुनरावृत्ति में किया जाता है। नतीजतन वहां अनुसंधान के कई क्षेत्रों में एक प्रवृत्ति बढ़ रही तीन आयामी ऊतक निर्माणों पैदा करने के लिए मजबूत तरीकों को विकसित करने के लिए है। परिदृश्यों जहां प्रकार की कोशिकाओं और प्रक्रियाओं के एक सहायक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सतह और आसंजन संकेतों की आवश्यकता होती है, तीन आयामी संस्कृति scaffolded निर्माणों, जहां कोशिकाओं पर या एक exogenous मैट्रिक्स 1 समर्थन में सुसंस्कृत हैं के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है। प्रकोष्ठों और प्रक्रियाओं है कि एक सहायक मैट्रिक्स के लिए आसंजन की आवश्यकता नहीं है, मुख्य रूप से या कोशिकाओं 2,3 (जो तब अपने स्वयं के अंतर्जात matrices उत्पन्न करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं) की विशेष रूप से बना unscaffolded सिस्टम के रूप में निलंबन में बाहर किया जा सकता है। यहाँ, हम हृदय भेदभाव ओ के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुतएफ मानव स्टेम कोशिकाओं - आकार नियंत्रित, वर्दी, unscaffolded समुच्चय में (hPSCs भ्रूण या अन्य स्रोतों से शरीर में किसी भी प्रकार की कोशिका बनने के काबिल कोशिकाओं, चाहे स्टेम)।

निलंबन समुच्चय के रूप में hPSCs के भेदभाव कुल आकार में बड़े बदलाव दोनों एक रन के भीतर और रन के बीच से ग्रस्त है। इस परिवर्तनशीलता विधि आम तौर पर इन समुच्चय उत्पन्न करने के लिए कार्यरत हैं, जो सेल कालोनियों के यांत्रिक हदबंदी शामिल है का परिणाम है। इस परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, दृष्टिकोण के एक नंबर कुल प्रति कोशिकाओं की संख्या के साथ ही कुल व्यास और एकरूपता को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण microcentrifuge ट्यूबों 4 में समुच्चय के गठन शामिल है या फांसी बूंदों के रूप में 5, micropatterning दो आयामी hPSC कालोनियों 6, या यू या वि नीचे बहु अच्छी तरह प्लेटें 7.8 में कोशिकाओं के centrifugation जो फिर निलंबन को हस्तांतरित किया जा सकता है परिभाषित 9। हालांकि, इन सभी approaches कुल पीढ़ी के अपने कम throughput द्वारा सीमित हैं। खैर आधारित प्रणाली वी के नीचे प्लेट सिस्टम के लिए एक समान दृष्टिकोण है, तथापि microwells के छोटे आकार को रोजगार (इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक 400 माइक्रोन की चौड़ाई वाले) अच्छी तरह से एक ही संस्कृति-थाली से वर्दी समुच्चय की बड़ी संख्या की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है की तुलना में एक पूरी वी के नीचे प्लेट 10 से उत्पन्न हो जाएगा (~ 15.5 मिमी युक्त ~ 1,200 microwells के मानक व्यास)। खैर आधारित कुल गठन 11, endodermal 12, 13 और mesodermal extraembryonic 14 भाग्य बहिर्जनस्तरीय को hPSCs के भेदभाव सहित सेटिंग्स की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है; mesenchymal स्टेम सेल 15 से उपास्थिजनन; विषाक्तता स्क्रीनिंग 16 के लिए वर्दी substrates की पीढ़ी; और mechanobiology 17 की जांच।

hPSC व्युत्पन्न cardiom के उत्पादन के लिए मजबूत विनिर्माण प्रोटोकॉल के विकास में एक बड़ी चुनौतीyocytes रन के बीच हृदय भेदभाव दक्षता में reproducibility की कमी की गई है। हम पहले से दिखा दिया है कि इस परिवर्तनशीलता शुरू hPSC आबादी है, जो दोनों स्वयं renewing hPSCs और फर्क कोशिकाओं है कि एण्डोडर्म और तंत्रिका भेदभाव 6,18 के साथ जुड़े जीन का इजहार शामिल हैं में विविधता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इन फर्क कोशिकाओं द्वारा स्रावित सिग्नल हृदय प्रेरण प्रभाव। विशेष रूप से, extraembryonic एण्डोडर्म, हृदय प्रेरण को बढ़ावा देता है, जबकि तंत्रिका progenitors हृदय प्रेरण रोकना। HPSC एकत्रीकरण पर, कुल अंतर के भीतर कोशिकाओं और व्यवस्थित है कि अविभाजित hPSCs extraembryonic एण्डोडर्म कोशिकाओं है कि कुल सतह 13 पर विकसित की एक परत से घिरे हैं। कुल आकार को नियंत्रित करके, हम अविभाजित hPSCs (मात्रा के अनुपात में सतह क्षेत्र) को हृदय उत्प्रेरण एण्डोडर्म कोशिकाओं के अनुपात से मिलाना कर सकते हैं और अधिकतम हृदय की प्रेरण 13 के लिए इस अनुपात का अनुकूलन।

Protocol

1. मध्यम अवयव की तैयारी

  1. धो मध्यम तैयार। DMEM / F12 के 100 मिलीलीटर प्रति, 100x पेनिसिलीन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पेन / Strep) के 1 मिलीलीटर, 100x एल glutamine के 1 मिलीलीटर, और सीरम रिप्लेसमेंट के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार रासायनिक परिभाषित बेसल कार्डिएक प्रेरण मध्यम तैयार।
  3. कि इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जाएगा मीडिया के लिए निम्नलिखित शेयर अभिकर्मकों तैयार करें।
    1. एल-एस्कॉर्बिक एसिड: एक शंक्वाकार ट्यूब में 4 डिग्री सेल्सियस, बाँझ अति शुद्ध आसुत जल में प्रति मिलीलीटर 5 मिलीग्राम के एक शेयर समाधान तैयार है।
      1. बर्फ पर इस समाधान को छोड़ दें और समय समय पर ट्यूब भंवर तक घुला हुआ पदार्थ पूरी तरह से भंग कर रहा है। फिल्टर बाँझ 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग एस्कॉर्बिक एसिड समाधान।
      2. एस्कॉर्बिक एसिड समाधान के 1 मिलीलीटर aliquots तैयार है और -20 डिग्री सेल्सियस पर इन aliquots की दुकान। एक हौसले thawed विभाज्य हर बार मध्यम तैयार किया जाता है का प्रयोग करें।
    2. मध्यम तैयारी के दिन, बेसल कार्डिएक प्रेरण के माध्यम से 1 मिलीलीटर में monothioglycerol (MTG) के 13 μl पतला। अप्रयुक्त, पतला MTG त्यागें।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए Transferrin (30 मिलीग्राम / एमएल) के 1 मिलीलीटर aliquots तैयार करें। स्टोर अप करने के लिए 3 महीने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर thawed aliquots।
    4. 4 मिमी हाइड्रोक्लोरिक एसिड (एचसीएल) युक्त 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) तैयार करें। एक धूआं हुड में, अति शुद्ध आसुत जल का 50 मिलीलीटर के लिए 6.0 एन एचसीएल समाधान के 30 μl जोड़ें। फिल्टर बाँझ 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान। 50 मिलीलीटर एचसीएल समाधान करने के लिए 25% बीएसए समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें।
    5. फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) 0.1% BSA युक्त तैयार करें। मिलीलीटर पीबीएस प्रति 25% बीएसए समाधान के 20 μl जोड़ें।
    6. मानव अस्थि Morphogenetic प्रोटीन 4 (बीएमपी 4) शेयर समाधान (10 एनजी / μl) तैयार करें। 4 मिमी एचसीएल बफर 0.1% बीएसए युक्त समाधान के 1 मिलीलीटर में 10 माइक्रोग्राम lyophilized बीएमपी -4 भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 50 μl aliquots तैयार करें।
    7. मानव fibroblast वृद्धि कारक 2 (bFGF) शेयर समाधान तैयार(10 एनजी / μl)। (पीबीएस) फॉस्फेट खारा बफर के 1 मिलीलीटर 0.1% BSA युक्त में 10 माइक्रोग्राम lyophilized bFGF भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 50 μl aliquots तैयार करें।
    8. मानव संवहनी endothelial वृद्धि कारक (VEGF) शेयर समाधान (5 एनजी / μl) तैयार करें। 0.1% BSA युक्त पीबीएस के 1 मिलीलीटर में 5 माइक्रोग्राम lyophilized वीईजीएफ़ भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 50 μl aliquots तैयार करें।
    9. Activin एक शेयर समाधान (10 एनजी / μl) तैयार करें। 10 पीबीएस के 1 मिलीलीटर में Activin एक lyophilized माइक्रोग्राम युक्त 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) भंग। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 50 μl aliquots तैयार करें।
    10. Wnt उत्पादन -2 (आईडब्ल्यूपी -2) शेयर समाधान (10 मिमी) का अवरोध करनेवाला तैयार करें। 429 μl डाइमिथाइल sulfoxide (DMSO) में 2 मिलीग्राम आईडब्ल्यूपी -2 भंग। -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करने के लिए 10 μl aliquots तैयार करें।
  4. पूरा कार्डिएक प्रेरण मध्यम तैयार। बेसल कार्डिएक प्रेरण माध्यम के 100 मिलीलीटर के लिए, 100x पेन / Strep के 1 मिलीलीटर, 100x एल glutamine के 1 मिलीलीटर, Transferrin के 500 μl, 1 जोड़नेहौसले thawed एस्कॉर्बिक एसिड की मिलीलीटर, और MTG के 300 μl। अप्रयुक्त मध्यम त्यागें।

2. microwell प्लेट की तैयारी

नोट: सभी चरणों का एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।

  1. प्रत्येक अच्छी तरह से है कि प्लेट पर इस्तेमाल किया जाएगा करने के लिए 0.5 मिलीलीटर Rinsing समाधान (किट घटक) जोड़ें। यह सुनिश्चित करने के लिए कि समाधान संपर्कों प्रत्येक microwell अंदर पूरी सतह, 2 मिनट के लिए 840 XG पर थाली अपकेंद्रित्र।
  2. आरटी पर 30 से 60 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  3. कुओं से Rinsing समाधान Aspirate। 2 मिनट के लिए 840 XG पर प्लेट में अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पीबीएस के 1 मिलीलीटर जोड़ें, सेंट्रीफ्यूज, और फिर पीबीएस aspirate: प्रत्येक अच्छी तरह से दो बार के रूप में निम्नानुसार धो लें।

3. hPSC का गठन microwell प्लेट में समुच्चय

नोट: सभी चरणों का एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट में किया जाना चाहिए।

  1. एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में धो मीडियम रखें।
    नोट: मात्रा आवश्यक हिमाचल प्रदेश के कुओं के = 1 मिलीलीटर एक्स संख्याअनुसूचित जाति कि अलग कर दिया जाएगा।
  2. एकल कक्षों के लिए hPSCs अलग कर देना
    नोट: ये कदम 6 अच्छी तरह से प्लेटों पर संवर्धित कोशिकाओं की हदबंदी का वर्णन - अभिकर्मक की मात्रा अलग संस्कृति प्रारूपों के लिए आनुपातिक बढ़ाया जा सकता है।
    1. प्रत्येक hPSC संस्कृति से अच्छी तरह से हदबंदी के लिए संस्कृति के माध्यम aspirate। हदबंदी एंजाइम के 1 मिलीलीटर के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला, और फिर तुरंत प्रत्येक से हदबंदी एंजाइम अच्छी तरह से aspirate।
      ध्यान दें: अवशिष्ट हदबंदी एंजाइम कोशिकाओं को अलग कर देना करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।
    2. 3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
    3. प्रत्येक अच्छी तरह से धो माध्यम के 1 मिलीलीटर जोड़ें और यंत्रवत् टिशू कल्चर सतह पर एक P1000 micropipettor साथ धो माध्यम pipetting द्वारा टिशू कल्चर सतह से कोशिकाओं को अलग कर देना। हदबंदी होने की अधूरी और सेल झुरमुटों रहने प्रकट होता है, इस बिंदु पर एक झरनी के माध्यम से निलंबन से गुजरती हैं।
    4. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और स्टोर करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरणइनक्यूबेटर में ट्यूब जबकि सेल गिनती अगले चरण में किया जाता है।
    5. एक कोशिका गिनती प्रदर्शन:
      1. पिछले चरण में एकत्र सेल निलंबन के एक 10 μl नमूना ले लो। Trypan ब्लू के 30 μl जोड़ें और pipetting द्वारा अच्छी तरह से निलंबन मिश्रण।
      2. एक hemocytometer के प्रत्येक कक्ष के लिए Trypan ब्लू-दाग कोशिकाओं के 10 μl स्थानांतरण और 10x उद्देश्य के साथ उलटा माइक्रोस्कोप के तहत कल्पना। कोशिकाओं की गणना।
    6. कोशिका गिनती परिणामों से, गणना कितने कुओं microwell प्लेट की अच्छी तरह से प्रति 1.2 x 10 6 कोशिकाओं पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। गणना एकत्रीकरण माध्यम अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को बीज के लिए जरूरी है।
    7. एकत्रीकरण के माध्यम से तैयार। प्रति पूरा कार्डिएक प्रेरण माध्यम के 10 मिलीलीटर, BMP4 शेयर समाधान के 0.5 μl (अंतिम एकाग्रता = 0.5 एनजी / एमएल) और वाई 27,632 रॉक अवरोध करनेवाला (अंतिम एकाग्रता = 10 माइक्रोन) के जोड़ें।
    8. इनक्यूबेटर और Centrifu से hPSCs युक्त शंक्वाकार ट्यूब निकालेंजीई 5 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब। धोने मध्यम Aspirate और मिलीलीटर प्रति 1.2 x 10 6 कोशिकाओं के घनत्व पर एकत्रीकरण माध्यम में कोशिकाओं resuspend।
    9. microwell प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से पीबीएस धोने समाधान aspirate। एक P1000 micropipettor का उपयोग करना, समान रूप से वितरित करने और अच्छी तरह से microwell प्लेट पर प्रत्येक सेल निलंबन के बीज 1 मिलीलीटर। कुओं की एक बड़ी संख्या वंश को समय समय पर बसने से रोकने के लिए सेल निलंबन भंवर।
    10. 5 मिनट के लिए 200 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। खुर्दबीन के नीचे प्लेट का निरीक्षण पुष्टि करने के लिए कोशिकाओं प्रत्येक microwell की तह तक घूमती है।
    11. एक 5% सीओ 2, 5% 2 हे (hypoxic) इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए थाली सेते हैं।

4. कार्डिएक प्रेरण चरण 1

  1. एक दिन एकत्रीकरण निम्नलिखित (1 दिन), स्टेज 1 प्रेरण मध्यम के लिए आवश्यक मात्रा (एक 24 अच्छी तरह से थाली के लिए, मात्रा = 1 मिलीलीटर कुओं की संख्या एक्स) तैयार करें। पूरा का 1 मिलीलीटर के लिएहृदय की प्रेरण मध्यम, BMP4 शेयर समाधान (अंतिम एकाग्रता = 10 एनजी / एमएल) के 1 μl, bFGF शेयर समाधान (अंतिम एकाग्रता = 5 एनजी / एमएल) के 0.5 μl, और Activin ए के 0.6 μl जोड़ने (अंतिम एकाग्रता = 6 एनजी / एमएल)। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में मध्यम कम से कम 15 मिनट के लिए रखें।
  2. इनक्यूबेटर से microwell थाली निकालें। खुर्दबीन के नीचे समुच्चय का निरीक्षण किया। तुरंत बाद के सेंट्रीफ्यूज एकत्रीकरण की तुलना में, वे चिकनी किनारों (अधिक गोल और पिछले दिन की तुलना में कम वर्ग) के साथ बरकरार दिखाई देनी चाहिए।
  3. microwells अंदर समुच्चय परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें:
    1. क्षैतिज स्तर microwell थाली पकड़ (यानी।, यह झुकाव नहीं है)। प्रत्येक अच्छी तरह से microwell प्लेट पर के लिए, संस्कृति के माध्यम से सतह पर और अच्छी तरह से किनारे के खिलाफ एक P1000 micropipettor की नोक जगह है।
    2. धीरे धीरे मध्यम हटाने, microwells के तल पर समुच्चय को परेशान करने के लिए नहीं सावधान किया जा रहा। टी को कम करने के बादवह बनावट microwell सतह से लगभग 1 से 2 मिमी के लिए मध्यम स्तर, धीरे धीरे प्लेट अच्छी तरह से (के एक पक्ष में मध्यम इकट्ठा करने के लिए एक बार झुकाव मात्रा पर्याप्त रूप से कम है, द्रव गति बहुत कम हो जाता है और यह समुच्चय से बचने के लिए आसान उठाया हो रही है अपनी व्यक्तिगत microwells में से)। धीरे-धीरे कुएं में शेष मध्यम बाहर पिपेट।
  4. ताजा चरण 1 प्रेरण मध्यम जोड़ने के लिए सुनिश्चित करते हुए समुच्चय अपनी व्यक्तिगत microwells में बने हुए हैं: एक P1000 micropipettor के साथ ड्रा स्टेज 1 प्रेरण के माध्यम से 1 मिलीलीटर। अच्छी तरह के अंदर किनारे के खिलाफ विंदुक टिप पकड़ो और बहुत धीरे-धीरे अच्छी तरह से अंदर दीवार के खिलाफ मध्यम बांटना। शेष कुओं के लिए दोहराएँ।
  5. 3 दिन के लिए hypoxic शर्तों के तहत इनक्यूबेटर थाली लौटें।

5. कार्डिएक प्रेरण स्टेज 2

  1. 4 दिन, जगह 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए धोने के माध्यम के एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में (मात्रा = कुओं की संख्या एक्स 2 मिलीलीटर)।
  2. प्रति पूरा कार्डिएक प्रेरण माध्यम से मिलीलीटर, और वीईजीएफ़ शेयर समाधान के 2 μl जोड़ने (अंतिम एकाग्रता = 10 एनजी / एमएल) के 0.5 μl आईडब्ल्यूपी-2: स्टेज 2 प्रेरण मध्यम (मात्रा = कुओं एक्स 1 मिलीलीटर की संख्या) की आवश्यक मात्रा को तैयार शेयर समाधान (अंतिम एकाग्रता = 5 माइक्रोन) के। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तैयार स्टेज 2 प्रेरण मध्यम 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए रखें।
  3. एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, microwell प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से समुच्चय फसल और एक 15 मिलीलीटर में कुल निलंबन शंक्वाकार ट्यूब (प्रति 15 मिलीलीटर ट्यूब 10 कुओं करने के लिए जमा) इकट्ठा।
  4. समुच्चय एक hypoxic इनक्यूबेटर में 15 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें।
    नोट: यह कदम बरकरार समुच्चय से एकल कक्षों और सेलुलर मलबे को अलग करने के लिए महत्वपूर्ण है।
  5. सतह पर तैरनेवाला ध्यान Aspirate और पूर्व गर्म धो माध्यम के 10 मिलीलीटर में समुच्चय resuspend अवशिष्ट प्रेरक साइटोकिन्स दूर करने के लिए (जैसे, Activin एक भी बहुत कम सह पर एक शक्तिशाली संकेत अणु हैncentrations)।
  6. 2 मिनट के लिए 50 XG पर समुच्चय अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला aspirate। पूर्व गर्म प्रेरण 2 मध्यम में pelleted समुच्चय Resuspend।
  7. अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर में 24 अच्छी तरह से अल्ट्रा कम लगाव (यूएलए) थाली करने के लिए कुल निलंबन स्थानांतरण। वर्दी, तंग सेल समूहों के रूप में माइक्रोस्कोप के तहत समुच्चय का निरीक्षण करें। 6 दिन तक hypoxic शर्तों के तहत सेते हैं।

6. कार्डिएक प्रेरण स्टेज 3

  1. 6 दिन, स्टेज 3 प्रेरण मध्यम (मात्रा = कुओं एक्स 1 मिलीलीटर की संख्या) की आवश्यक मात्रा तैयार करते हैं। पूरा कार्डिएक प्रेरण के माध्यम से 1 मिलीलीटर के लिए, 2 μl वीईजीएफ़ शेयर समाधान (अंतिम एकाग्रता = 10 एनजी / एमएल), और bFGF शेयर समाधान (अंतिम एकाग्रता = 5 एनजी / एमएल) के 0.5 μl जोड़ें। एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तैयार स्टेज 3 प्रेरण मध्यम 15 मिनट की एक न्यूनतम के लिए रखें।
  2. शंक्वाकार ट्यूबों 15 मिलीलीटर समुच्चय हस्तांतरण करने के लिए, कुल के 10 मिलीलीटर तक की पूलिंग एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करेंट्यूब प्रति एस।
  3. समुच्चय को व्यवस्थित करने के लिए 10 मिनट की अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पूर्व गर्म स्टेज 3 प्रेरण मध्यम में समुच्चय resuspend। एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर में 24 अच्छी तरह से थाली में ULA समुच्चय फिर से विभाजित।
  4. 10 दिन पर, स्टेज 3 प्रेरण माध्यम प्रति चरण 6.1 के रूप में (मात्रा = कुओं एक्स 1 मिलीलीटर की संख्या) की आवश्यक मात्रा तैयार करते हैं।
  5. एक 5 मिलीलीटर, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए समुच्चय हस्तांतरण करने के लिए ट्यूब प्रति समुच्चय के 10 मिलीलीटर तक की पूलिंग सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें।
  6. समुच्चय को व्यवस्थित करने के लिए 10 मिनट की अनुमति दें। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और स्टेज 3 प्रेरण मध्यम में समुच्चय resuspend। एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर में 24 अच्छी तरह से थाली में ULA समुच्चय फिर से विभाजित।
  7. दो दिनों के लिए hypoxic शर्तों के तहत सेते हैं। 12 दिन, संस्कृति अवधि के शेष (37 डिग्री सेल्सियस, 20% ओ 2, 5% सीओ 2) के लिए normoxic ऑक्सीजन के स्तर पर कोशिकाओं incubating शुरू करते हैं।
    ध्यान दें:इस समय बिंदु के बाद, कोशिकाओं अब कोई कमी वाली स्थिति के तहत सुसंस्कृत हैं।
  8. इस पूरा मध्यम विनिमय दोहराएँ हर 4 दिन, 14 दिन की शुरुआत सेल फसल तक (6.2 और 6.3 कदम) (आमतौर पर, शिखर cardiomyocyte सांद्रता भेदभाव के 14 दिन बाद मनाया जाता है)।

7. से फ्लो कार्डिएक ट्रोपोनिन टी (cTnT) microwell संस्कृति आउटपुट की अभिव्यक्ति फ्रीक्वेंसी का विश्लेषण

  1. इस प्रकार के रूप समुच्चय अलग कर देना:
    1. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब समुच्चय के 1 अच्छी तरह हस्तांतरण करने के लिए एक 5 मिलीलीटर सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें। 2 मिनट के लिए 50 XG पर समुच्चय अपकेंद्रित्र और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला aspirate।
    2. समुच्चय को हौसले से भंग कर दिया 1 मिलीग्राम / एमएल कोलेजिनेस प्रकार द्वितीय समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब कुल निलंबन स्थानांतरण। रात भर कमरे के तापमान पर कोलेजिनेस प्रकार द्वितीय में समुच्चय सेते हैं।
    3. अगले दिन, एक P1000 micropipettor का उपयोग धीरे समुच्चय को अलग कर देनाएक समरूप एकल कक्ष निलंबन में। समुच्चय आसानी से अलग कर देना नहीं है, तो, समुच्चय बसा सतह पर तैरनेवाला aspirate, और आरटी पर 1 से 2 मिनट के लिए हदबंदी एंजाइम के 700 μl में समुच्चय सेते हैं। धीरे एक P1000 micropipettor अलग कर देना साथ समुच्चय 1 से 2 बार पिपेट।
    4. पतला हदबंदी एंजाइम: 1 मिलीग्राम / एमएल DNase स्टॉक समाधान के 14 μl युक्त धो माध्यम के 700 μl जोड़ें। 2 मिनट के लिए 300 XG पर एक बेंच शीर्ष microcentrifuge का उपयोग कर शेष निलंबन एक कोशिका गिनती प्रदर्शन, और सेंट्रीफ्यूज के लिए एक 10 μl नमूना ले लो।
  2. एक कोशिका गिनती प्रदर्शन: Trypan ब्लू के एक बराबर मात्रा के साथ 10 μl गिनती नमूना दाग और एक hemocytometer का उपयोग गिनती।
  3. 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge microcentrifuge से शेष कोशिकाओं से युक्त ट्यूब निकालें। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और युक्त कोशिकाओं resuspend हैंक्स बैलेंस्ड नमक के घोल में 100 μl प्रति 200,000 500,000 कोशिकाओं की एकाग्रता में,2% भ्रूण गोजातीय सीरम (एचएफ)।
  4. हर हालत के लिए, सेल निलंबन के 100 μl प्रति अच्छी तरह से करने के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली (एक अच्छी तरह से cTnT एंटीबॉडी के साथ दाग हो जाएगा और अन्य माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण हो जाएगा) के 2 कुओं हस्तांतरण।
  5. 2 मिनट के लिए 300 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। एक मल्टीचैनल micropipettor साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें।
  6. कोशिकाओं को ठीक करें: निर्धारण समाधान (किट घटक) अच्छी तरह से प्रति के 200 μl जोड़ें और आरटी पर 15 मिनट के लिए थाली सेते हैं।
  7. 2 मिनट के लिए 300 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। एक मल्टीचैनल micropipettor का प्रयोग सावधानी से कुओं से सतह पर तैरनेवाला वापस लेने के लिए। एक paraformaldehyde अपशिष्ट कंटेनर में सतह पर तैरनेवाला फेकें।
  8. तय कोशिकाओं दो बार धो: अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए एचएफ के 200 μl जोड़ें। 2 मिनट के लिए 300 XG पर थाली अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate, और एक बार फिर धोने कदम दोहराएँ। फिक्स्ड कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर एचएफ में अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए भंडारित किया जा सकता है।
  9. कोशिकाओं Permeabilize:
    1. 300 पर थाली अपकेंद्रित्र2 मिनट के लिए XG।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से Permeabilization समाधान (किट घटक) के 100 μl जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर थाली सेते हैं।
    3. 2 मिनट के लिए 300 XG पर थाली अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला aspirate।
  10. यह देखते हुए बहुत संख्या के लिए इष्टतम एकाग्रता में एचएफ में विरोधी cTnT के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें (2,000 इष्टतम कमजोर पड़ने अनुमापन द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए और आम तौर पर 1 से चलता है: 500 1 के लिए)।
  11. प्रत्येक हालत (हालत प्रति 2 कुओं) के लिए, एक अच्छी तरह से (दाग नमूना) और अन्य अच्छी तरह से (माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण) के लिए सादे एचएफ के 100 μl करने के लिए मास्टर मिश्रण के 100 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
  12. 2 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और अच्छी तरह से प्रति एचएफ के 200 μl जोड़ें। इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
  13. माध्यमिक एंटीबॉडी के एक मास्टर मिश्रण तैयार करें। एचएफ के एक खंड है कि हर अच्छी तरह से करने के लिए 100 μl से मेल खाती है (माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण हस्तांतरण औरcTnT से सना हुआ) का इलाज किया जा रहा है। (: 200 कमजोर पड़ने 1) बकरी विरोधी माउस एपीसी एचएफ के 200 μl प्रति माध्यमिक एंटीबॉडी के 1 μl जोड़ें।
  14. नमूने दाग। (दोनों माध्यमिक एंटीबॉडी नियंत्रण और विरोधी cTnT से सना हुआ कुओं) प्रत्येक अच्छी तरह से धुंधला समाधान के 100 μl जोड़ें। 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (फ्लोरोसेंट माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने के बाद प्लेट कवर या अंधेरे में रखने के photobleaching से बचने के लिए) पर अंधेरे में कोशिकाओं को सेते हैं।
  15. 2 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और अच्छी तरह से प्रति एचएफ के 200 μl जोड़ें। इस धोने कदम एक बार और दोहराएँ।
  16. विश्लेषण नलियों कोशिकामापी 5 मिलीलीटर दौर नीचे प्रवाह करने के लिए नमूने स्थानांतरण और प्रवाह साधन 19 के लिए मानक प्रोटोकॉल का उपयोग एपीसी चैनल में संकेत के लिए cytometry प्रदर्शन करते हैं।

Representative Results

hPSCs का आकार नियंत्रित समुच्चय को प्रभावी ढंग से microwell प्रणाली, केवल कोशिकाओं की एकाग्रता और microwell सतह क्षेत्र पर निर्भर का उपयोग का गठन किया जा सकता है। एक छोटी centrifugation के बाद, कोशिकाओं की उचित संख्या (इस प्रोटोकॉल में 1,000) प्रत्येक microwell (चित्रा 1 ए) में एक साथ लाया जाता है। महत्वपूर्ण बात है, इन कोशिकाओं को 24 घंटा के भीतर intracellular कनेक्शन पैर जमाने, और अब अच्छी तरह से भरना चाहिए, लेकिन चिकनी किनारों (चित्रा 1 बी) के साथ कॉम्पैक्ट समुच्चय के रूप में दिखाई देते हैं। इन समुच्चय एक हृदय भाग्य की दिशा में आगे भेदभाव के लिए शुरू सामग्री प्रदान करते हैं। कोशिकाओं तंग समूहों के रूप में करने के लिए असफल हो, तो यह संभव कोशिका मृत्यु हदबंदी और reaggregation के बाद, और एक विशेष सेल लाइन के लिए एकल कक्ष passaging और रॉक अवरोध सांद्रता की उपयुक्तता की जांच की जानी चाहिए पता चलता है। microwells में निम्नलिखित तीन दिन कुल Morpho में थोड़ा परिवर्तन दिखानेसना हुआ है, हालांकि कुछ वृद्धि से स्पष्ट है। जब microwells से हटा दिया, समुच्चय अपने दौर, कसकर बांध आकृति विज्ञान को बनाए रखने और एक दूसरे (चित्रा 1 सी) के लिए एक समान आकार का होना चाहिए। ULA 24 अच्छी तरह प्लेटें में संस्कृति आगे सेल विस्तार और विकास की अनुमति होगी।

8 दिन तक, पहली Activin संकेतन, और Wnt निषेध करने के लिए प्रदर्शन के बाद, समुच्चय बड़ा और उज्जवल समुच्चय (चित्रा -1) के रूप में प्रकट करने के लिए शुरू हो जाएगा। इस अवधि के दौरान काफी सेलुलर मलबे प्रत्येक कुएं के तल पर स्पष्ट हो जाएगा और समुच्चय मीडिया को हटाने से पहले व्यवस्थित करने की अनुमति देकर हटा दिया जाना चाहिए। कभी कभी, कई समुच्चय एक साथ फ्यूज होगा। यह अच्छी तरह से अन्य समुच्चय के भेदभाव को बाधित नहीं होगा, हालांकि इन "सुपर समुच्चय" छोटे समुच्चय के साथ देखा morphological परिवर्तन का प्रदर्शन नहीं करते हैं और कम पूरा भेदभाव से गुजरना की संभावना है।

fo "jove_content": रख-together.within-पेज = "1"> एक वृद्धि आकार और संगठित रेशेदार क्षेत्रों की उपस्थिति के साथ समुच्चय को उल्लेखनीय morphological परिवर्तन में निरंतर भेदभाव का परिणाम है। 12 दिन तक, करार समुच्चय मनाया जा सकता है। ये हमेशा बड़े, पारदर्शी कोशिकाओं के ऊपर बनाया जाएगा और अक्सर कुल (चित्रा 2) के बाहर व्यापक बाह्य मैट्रिक्स में शामिल हैं। जबकि कुल चौड़ा संकुचन एक सफल भेदभाव से संकेत मिलता है, हृदय मार्कर अभिव्यक्ति भी समुच्चय है कि अनुबंध करने के लिए प्रकट नहीं है में मनाया जा सकता है। समुच्चय और immunolabeling की हदबंदी के बाद, कोशिकाओं के बहुमत से फ्लो द्वारा cardiomyocyte मार्कर cTnT (चित्रा 3) के लिए सकारात्मक हो जाएगा। इस मार्कर की अभिव्यक्ति की कोशिकाओं में स्थिर है और जितनी देर भेदभाव के 19 दिन के रूप में समुच्चय में मनाया जा सकता है।

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चित्रा 1: hPSC के समय एक हृदय भाग्य के प्रति भेदभाव तुरंत एकत्रीकरण के बाद, कोशिकाओं लगभग प्रत्येक microwell (ए) भरें।। एक दिन बाद, समुच्चय सघन दिखाई देते हैं और चिकनी (बी)। इस आकृति विज्ञान भी जब समुच्चय microwells से हटा दिया है और अच्छी तरह से प्लेट (सी) में चढ़ाया जाता बनी रहती है। 8 दिन तक, समुच्चय का विस्तार करने के लिए शुरू और रंग (डी) में हल्का दिखाई देते हैं। स्केल पट्टी:। 250 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: समुच्चय दिवस के भेदभाव के 12 से ठेका शुरू होने के बाद कार्डिएक प्रेरण स्टेज 3 मध्यम में छह दिन, सशक्त कुल चौड़ा संकुचन मनाया गया (शीर्ष पैनल:। आराम करोसमझना, मध्यम पैनल: संकुचन)। कम पैनल उच्च और मध्यम पैनलों घटाकर से ली गई है, सबसे महत्वपूर्ण काला या सफेद (तीर) के रूप में प्रदर्शित मतभेदों के साथ। स्केल पट्टी:। 250 माइक्रोन यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। विभेदित hPSCs में कार्डिएक ट्रोपोनिन टी के लिए immunolabeling 17 दिन में, कोशिकाओं के सबसे से फ्लो (भरा हिस्टोग्राम) द्वारा हृदय ट्रोपोनिन टी के लिए सकारात्मक रहे हैं। यह भी पता चला अकेले माध्यमिक एंटीबॉडी (रिक्त हिस्टोग्राम) के साथ दाग कोशिकाओं रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

यह देखा गया है कि स्टेम कोशिकाओं के कुशल हृदय भेदभाव एक अत्यधिक चर प्रक्रिया है। हालांकि यह आश्चर्य की बात नहीं है कि अलग-अलग सेल लाइनों विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को भेदभाव क्षमता के लिए अलग-अलग प्रवृत्तियों का प्रदर्शन, यह देखा गया है कि हृदय भेदभाव दक्षता को दोहराने के बीच नाटकीय रूप से बदलता रहता है एक ही सेल लाइन 6 का उपयोग कर चलाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीधे कुल प्रति इनपुट कक्ष संख्या को नियंत्रित करने के द्वारा इस परिवर्तनशीलता का एक प्रमुख स्रोत संबोधित करते हैं। आगे रन के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, यह सिफारिश की है कि hPSC लाइनों एकल कक्ष passaging के लिए अनुकूलित pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति आवृत्तियों (जैसे, Oct4, Nanog के लिए सम्मान के साथ और अधिक सुसंगत pluripotent आबादी में hPSC विस्तार और रखरखाव के परिणामों के इस फार्म के रूप में उपयोग किया जाता है, ट्रा-1-60, आदि।)।

प्रोटोकॉल के रूप में यहाँ लिखा ओ के लिए 1,000 कोशिकाओं की कुल आकार को निर्दिष्टHES -2 भ्रूण स्टेम सेल लाइन से ptimal हृदय प्रेरण। अलग सेल लाइनों के लिए इस प्रोटोकॉल लागू करने के लिए, यह है कि एक प्रारंभिक कुल आकार स्क्रीन सेल लाइन-विशिष्ट इष्टतम कुल आकार का निर्धारण किया जाना महत्वपूर्ण है। यह सीधे प्रक्रियाओं को प्रभावित नहीं करता है, जबकि यहाँ का पालन किया जाना है, हम पाठक है कि कुल आकार और कुल मिलाकर सेल घनत्व में परिवर्तन ऑक्सीजन वितरण को प्रभावित करने की उम्मीद कर रहे हैं याद आती है। यह बहाव के अनुप्रयोगों में एक प्रासंगिक विचार हो सकता है। इसके अतिरिक्त, apoptotic कोशिका मृत्यु एकल कक्षों के लिए hPSCs की हदबंदी के दौरान एक चिंता का विषय है। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि रॉक अवरोध microwells में मजबूर सेल एकत्रीकरण के दौरान मौजूद है महत्वपूर्ण है। अंत में, यह है कि भेदभाव के 4 दिन पर समुच्चय में अच्छी तरह से पता लगाने Activin ए, प्रेरण 1 मीडियम में मौजूद है, को दूर करने के लिए प्रेरण 2 मध्यम में मेजबान से पहले धो रहे हैं महत्वपूर्ण है। भेदभाव के 4 दिन बाद, Activin एक मेसो की कीमत पर एण्डोडर्म भेदभाव को बढ़ावा देता हैकेंचुल प्रेरण 20।

इस तकनीक का मुख्य आवेदन कुल आकार है कि कुशल हृदय भेदभाव को बढ़ावा देने स्क्रीन है। हालांकि, मौजूदा तकनीक की सीमाओं में से एक यह है कि यह microwell प्लेट का उपयोग कर चिकित्सकीय प्रासंगिक स्तर तक हृदय उत्पादन पैमाने पर करने के चुनौतीपूर्ण है। हृदय भेदभाव के पैमाने को आम तौर पर उभारा निलंबन बायोरिएक्टर 21 में थोक संस्कृति की स्थिति में किया जाता है। इसलिए, एक बार microwell प्रणाली कुशल हृदय शामिल करने के लिए कुल आकार की स्वीकार्य सीमाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ऊपर पैमाने पर करने के लिए अगले कदम बायोरिएक्टर प्ररित करनेवाला गति है कि वांछित सेल कुल आकार उत्पन्न कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए है।

कुल आधारित हृदय भेदभाव के लिए अन्य तरीकों के संबंध में इस तकनीक का महत्वपूर्ण अंतर यह है कि यह समुच्चय में अंतर्जात संकेतन के प्रभाव के नियमन में साथ ही प्रत्यक्ष जांच के लिए सक्षम बनाता हैकुल 13 में hPSCs साथ प्रेरक / निरोधात्मक प्रकार के ऊतकों के सह संस्कृति। जांच के इन प्रकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन की प्रक्रिया हृदय विकास को सूचित कर सकते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Biological safety cabinet
Pipette aid
Serological pipettes (5 to 25 ml) 
Aspirator
Aspirator or Pasteur pipettes
15 and 50 ml conical tubes
Fume hood
0.22 µm syringe filter
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator  Hypoxic (low oxygen) incubator
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator 
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder 
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips 
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives 
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates  Corning/Costar 3473
1.5 ml microcentrifuge tubes
Bench-top microcentrifuge
L-Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A4403
Sterile Ultrapure distilled water Sigma-Aldrich W3500
Vortex
Ice
-20 °C freezer
Monothioglycerol Sigma-Aldrich M6145 Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage.
StemPro-34 Medium Thermo Fisher Scientific 10639-011 Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C.
Transferrin Roche 10652202001
BMP-4 R&D Technologies 314-BP
bFGF R&D Technologies 233-FB
VEGF R&D Technologies 293-VE
Activin A R&D Technologies 338-AC
IWP-2 Reagents Direct 57-G89
Phosphate buffered saline (PBS) Thermo Fisher Scientific 14190
Bovine Serum Albumin (BSA) Thermo Fisher Scientific 15561
Hydrochloric acid  Sigma-Aldrich 258148 Corrosive
Dimethylsulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650
DMEM/F-12 Thermo Fisher Scientific 12660
100x Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140
100x L-glutamine Thermo Fisher Scientific 25030
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher Scientific 10828010
TrypLE Select Thermo Fisher Scientific 12563 Dissociation enzyme
Hemocytometer
Trypan Blue
Aggrewell 400 plates StemCell Technologies 27845 Microwell Plates
Aggrewell Rinsing Solution StemCell Technologies 7010 Microwell Rinsing Solution
Y-27632 ROCK Inhibitor Tocris 1254
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6885 
Hank's Balanced Salt Solution Thermo Fisher Scientific 14025092
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher Scientific 12483
96 well plate (for FACS staining)
Intraprep Permeabilization Reagent Beckman Coulter IM2389 Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic
cTnT antibody Neomarkers  MS-295
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher Molecular Probes A865
5 ml round bottom flow cytometry tubes FACS machine dependent

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक 115 हृदय भेदभाव microwells मानव स्टेम कोशिकाओं कोशिका जीव विज्ञान आकार नियंत्रित सेल समुच्चय मजबूर सेल एकत्रीकरण स्टेम सेल कुल आकार अनुकूलन
मानव स्टेम कोशिकाओं के निलंबन के आधार पर भेदभाव के लिए कार्डिएक microwells में कुल आकार अनुकूलन
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Bauwens, C. L., Toms, D., Ungrin, M. … More

Bauwens, C. L., Toms, D., Ungrin, M. Aggregate Size Optimization in Microwells for Suspension-based Cardiac Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (115), e54308, doi:10.3791/54308 (2016).

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