Summary
نقدم transgenesis عابرة وإسقاط الموروثة في Ciona المعوية، وهي جماعة شقيقة حبلي إلى الفقاريات، وذلك باستخدام تقنيات Microinjection و electroporation. هذه الطرق تسهل علم الجينوم وظيفية في هذه اللافقاريات البسيطة التي تتميز خصائص بدائية من الفقاريات، بما في ذلك الحبل الظهري ورئيس ظهائر الحسية، والعديد من orthologs من الأمراض المرتبطة الجينات البشرية.
Introduction
في الآونة الأخيرة، أصبحت تسلسل الجينوم والجينات ذخيرة كتب الوصول إليها في عدد من الكائنات الحية النموذج. تحديد الروابط الوظيفية الجينات، ومع ذلك، وكيف يتم ماثلة هذه الاتصالات في الحمض النووي لتنفيذ النشاط النسخي طوال الوقت الجنينية والفضاء، تحديا كبيرا، خاصة في الفقاريات. تعقيد التفاعلات التنظيمية وتعقيد الجينوم 1،2، ولا سيما في الفقاريات، وإبطاء تحليلات وظيفية فعالة، ولا سيما على مستوى الحمض النووي في الجسم الحي. في الواقع، ويتم تحليل لا GRN حاليا من الإخصاب إلى المباراة النهائية، دولة متباينة عضال الكائن الحي النامية.
وascidian C. يمثل المعوية كائن نموذج حيث يحلل هذا GRN الكامل قد يكون ممكنا. أنه يحتوي على جينوم غير المكرر نموذجية من اللافقاريات مع التكرار الجيني قليلا. الفقاريات، في المقابل خضعت جولتين من الازدواجية الجينوم أن هفه ولدت عائلات الجينات أكبر وتنويع وظيفي ولكن أيضا التكرار بين paralogs. حزمه تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة (وحدات التحكم من GRNs) من C. المعوية، والنسب الجنينية ثابت مع خلايا قليلة تذكرنا C. ايليجانس. وعلاوة على ذلك، موقف النشوء والتطور الفريد كمجموعة شقيقة اللافقارية إلى الفقاريات داخل حبليات يسمح الملاحظة تنموية، في قرار الخلوية، من الخطة تشكيل هيئة حبلي 3-6.
القضية الأساسية التي تضمن النجاح في المستقبل من علم الجينوم وظيفية في الكائنات النموذج هو توليد أعداد كبيرة من الأجنة لالكمي في الجسم الحي الاضطرابات. تطوير تقنية حقن مكروي في البيض Ciona 7، وإمكانية الحصول بسرعة على العديد من الحيوانات المعدلة وراثيا عابر من قبل في الجسم الحي Electroporation للفي مئات Ciona بيضات ملقحة 8،9 كان انفراجة في
Protocol
1. التحضير ل microinjection و Electroporation في Ciona البيض وبيضات ملقحة
- إعداد 10 لتر مياه البحر الاصطناعي مع HEPES (ASWH) لزراعة الأجنة. حل 420 مم كلوريد الصوديوم، و 9 ملي بوكل، 10 ملي CaCl 2 · 2H 2 O، 24.5 ملي MgCl 2 · 6H 2 O، 25.5 ملي MgSO 4 · 7H 2 O، و2.15 ملم NaHCO 3 في الماء المقطر المزدوج ([ده 2 O) عن طريق اثارة بين عشية وضحاها. إضافة 5 ملي HEPES الرقم الهيدروجيني 8.0، والتحقق من / ضبط درجة الحموضة إلى 8.0. تخزين ASWH في 4 درجات مئوية. تدفئتها إلى 18 درجة مئوية، وتصفية مع ورق الترشيح قبل الاستخدام.
- إعداد 20x والمعطل حل dechorionation: 20٪ thioglycolate الصوديوم، 1٪ pronase في ASWH. تخزين 500 مكل في -20 درجة مئوية، وتمييع إلى الحجم النهائي من 10 مل ASWH قبل الاستخدام.
- إعداد 15-20 أطباق الثقافة للبيض / الأجنة. صب ذاب الاغاروز 1٪ في ASWH إلى 3.5، 5، 9 أو 15 سم أطباق بتري، طلائها بطبقة رقيقة 1-2 ملم.السماح للالاغاروز يصلب وتغطي لوحات مع ASWH. المخزون منها في 4 درجة مئوية لمدة أقصاها 1-2 أسابيع. استبدال ASWH قبل الاستخدام.
- إعداد أطباق الحقن الخاصة.
- صب طبقة سميكة 5-7 ملم من ذاب 1٪ الاغاروز إلى 5 سم طبق بتري، ووضع العفن على الاغاروز (مثل إغلاق الرمز البريدي قفل لصقها على زلة غطاء من البلاستيك) لإنتاج تسنن على التصلب من الاغاروز التي يمكن أن تعقد البيض. إعداد 4-5 أطباق الحقن، وتغطي مع ASWH. تخزين عند 4 درجات مئوية واستبدالها مع ASWH الطازجة قبل استخدامها. استخدام لوحات جديدة فقط للحقن (الحد الأقصى يوم واحد من العمر).
- إعداد بيتا غالاكتوزيداز (LacZ) تلطيخ عازلة: 1 ملي MgCl 2 · 6H 2 O، 3 ملي K 4 [الحديد (CN) 6] · 3H 2 O، 3 ملي K 3 [الحديد (CN) 6] في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع توين (PBT) (137 ملي مول كلوريد الصوديوم، 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 2 مم KH 2 PO 4، 0.05٪ توين). متجر طن الظلام في 4 درجات مئوية. إعداد LacZ الركيزة 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside (X-غال، 10 U / مل) في aliquots من 40 ملغ / مل في ثنائي ميثيل الفورماميد (DMF) وأسهم مخزن في -20 درجة مئوية حتى استعمال.
- نقع الماصات باستور في الاستفادة من الماء طوال الليل لمنع الأجنة من الالتصاق.
- إعداد إبر الحقن.
- اقامة مجتذب micropipette في ظروف مثل حرارة 425، وسحب 75 والسرعة 75 والساعة 200 (من اختبار خيوط منحدر من 415).
- سحب 4-5 الشعيرات الدموية الزجاج التي تحتوي على خيوط لإنتاج 8-10 طويلة، إبر رفيعة عادة مغلقة على الحافة. تخزين الإبر في الغبار مربع إبرة الحرة، وتعلق على مضاعفة شريط لاصق على دعم مرتفع، لتجنب كسر النصائح والذي هو مناسبة لملء الإبرة.
ملاحظة: اختبار الإبر التي تم الحصول عليها عن طريق حقن عدد قليل من البيض مع صبغ حيوي الأخضر (كما هو موضح في القسم 6) وضبط إبرة سحب الشروط للحصول على شكل طرف أن يسمح لصقل وrepetitإيف حقن كما هو موضح في 6.6.
- يعد حل الحقن. إعداد 4 ميكرولتر من محلول الحقن، وعلى سبيل المثال، يتألف من 1 ميكرولتر من 2 ملي MO، 2 ميكرولتر من 10 ميكروغرام / ميكرولتر صبغة الحيوية الأخضر و 1 ميكرولتر ده 2 O. إضافة تركيز النهائي من ،05-،5 ميكروغرام / توج ميكرولتر مرنا أو 20 نانوغرام / ميكرولتر من البلازميد وفقا لمسألة تجريبية. اخلط جيدا. الحفاظ على الجليد إذا كان هذا الحل يتضمن مرنا.
2. جمع الأمشاج
- تبريد الكبار تشريح Ciona في 18 ° C غرفة الجنين. استخدام مقص صغير ويبدأ من نهاية تعارض يمتص على جانب من الزفير (أقصر) سحارة تحت أي قناة البيض وعلى المدى الحيوانات المنوية لاصق.
- فضح قناة البيض وجعل بدقة شق في قناة البيض باستخدام غيض من مقص. إسقاط البيض متدفق مباشرة إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على ASWH عن طريق الضغط بلطف قناة البيض مع مقص مغلقة تجريد قبالة مثلع. نقل البيض المتبقية مع ماصة باستور قبل شطفها مع ASWH.
- إيداع البيض من الحيوانات المختلفة في آبار مختلفة. مراقبة جودة البيض ضمن نطاق تشريح.
ملاحظة: البيض متطورة هي جولة والوردي والأصفر قليلا في اللون. فهي محاطة معطفا المحي غير الخلوية، والمشيمه التي تشكل مساحة محيط بالمح واضحة المعالم حول البيضة. ويرتبط المشيمه مع خلايا اختبار في خلاياه بصيلات الداخل وعلى شكل نجمة في دورته خارج. بيض جودة منخفضة غالبا ما تفتقر إلى الفضاء محيط بالمح أو خلايا بصيلات. تظهر أقل الجولة، والمزيد من حبيبات أو تختلف في اللون. البويضات غير الناضجة هي أصغر ويكون لها لون الأبيض الفضي. - قطع القناة المنوية مع مقص وجمع الحيوانات المنوية المركزة في أنبوب 1.5 مل باستخدام ماصة باستير منفصلة. تجميع الحيوانات المنوية من الحيوانات المختلفة (اثنان على الأقل) في نفس الأنبوب. متجر الحيوانات المنوية عند 4 درجة مئوية لعدة أيام.
3.إخصاب
- جمع الحيوانات المنوية والبويضات عند 18 درجة مئوية كما هو موضح في الخطوة 2.
- تنشيط الحيوانات المنوية.
- إعداد 1 مل ASWH في أنبوب 1.5 مل وتخلط مع 50 ميكرولتر من 1 M تريس درجة الحموضة 9.5. ثم إضافة 20 ميكرولتر من الحيوانات المنوية المركزة وتخلط بلطف بواسطة أنبوب للقلب.
- تحقق من تنشيط الحيوانات المنوية في انخفاض الحيوانات المنوية وضعت على غطاء من طبق بيتري صغير أو شريحة زجاجية ومراقبة تحت نطاق تشريح. في الحيوانات المنوية يجب أن يسبح بشكل محموم.
- إضافة 100-200 ميكرولتر من محلول السائل المنوي تفعيلها على كل جانب من البيض (تحتوي على ما بين 100 و 1000 البيض)، مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا، وبالتالي فإن البيض تطفو على المدى المتوسط. الانتظار لمدة 10 دقيقة دون أن تتحرك الأجنة.
4. Dechorionation من البيض والأجنة
- تمييع قسامة 500 ميكرولتر من 20x وحل dechorionation إلى 10 مل في ASWH. تفعيل الحل dechorionation بإضافة قطرة من الحكمة 200 ميكرولتر من 2.5 M هيدروكسيد الصوديوم إلى حل dechorionation 10 مل 1X. وسوف يعجل حليبي تشكيل. المزيج بلطف أنبوب للقلب.
- جمع البيض أو بيضات ملقحة (بعد 10 دقيقة الانتظار في الخطوة 3.3) في أنابيب الزجاج باستخدام ماصة باستور. تجميع البيض 2-3 الحيوانات في أنبوب واحد (حوالي 1،000-5،000 البيض / أنبوب). الرواسب مع جهاز للطرد المركزي اليد عن طريق الدوران بسرعة عالية (1200 x ج) لمدة 20 ثانية لتشكيل بيليه الجنين في الجزء السفلي من الأنبوب. ببطء وقف أجهزة الطرد المركزي وإزالة ASWH مع ماصة باستور.
- إضافة 4 مل من محلول dechorionation تنشيط إلى مكعبات البيض / بيضات ملقحة في كل أنبوب. تعليق البيض / بيضات ملقحة من قبل pipetting بلطف لهم صعودا وهبوطا باستخدام ماصة باستير الصنبور المياه المعالجة وتصدرت مع الكمثرى مطاطية صغيرة. الحل يجب أن تتحول إلى الصفرة بعد 1-3 دقائق.
- اتبع dechorionation عن طريق إزالة قسامة صغيرة من dechorionating تعليق بيضة / البيضة الملقحة باستخدام ماصة باستور. إيداع انخفاض على شريحة ومراقبة تحت الصورة تشريحالتعامل. الحفاظ pipetting لبيض / بيضات ملقحة صعودا وهبوطا وتحقق من كل 20-30 ثانية.
ملاحظة: خلايا بصيلات الأولى تنفصل، ثم المشيماء يتحول إلى اللون الأصفر ومبهمة، وأخيرا يفصل من بيضات ملقحة. dechorionated الوردي البيض / بيضات ملقحة سوف تنزل الى قاع الأنبوب الزجاجي. ينبغي أن dechorionation لا يستغرق أكثر من الحد الأقصى. 5 دقائق. - ملء الأنبوب مع ASWH مرة واحدة 50٪ من البيض / وdechorionated بيضات ملقحة.
ملاحظة: جدا الطرد المركزي بلطف (8 x ج) لمدة 10-15 ثانية الموافق سرعة منخفضة جدا فقط ما يكفي لالرواسب وdechorionated البيض / الأجنة. ببطء وقف أجهزة الطرد المركزي ليست التشويش بيليه من البيض / بيضات ملقحة في الجزء السفلي من الأنبوب. - إزالة ما يقرب من جميع السائل من أنبوب زجاجي بما في ذلك المواد الطافية مع dechorionated غير كامل البيض / بيضات ملقحة واستبدالها مع ASWH. الماصة ببطء صعودا وهبوطا لغسل وأجهزة الطرد المركزي بلطف مرة أخرى كما في الخطوة 4.2. بدلا من ذلك، انتظر بيضات ملقحة ليستقر عن طريق الجاذبية. يغسل مرة أخرى حتى لا الحطام المشيمه هو لتقنية الحرية النفسية.
- البيض نقل / بيضات ملقحة إلى تشطف حديثا أطباق الثقافة باستخدام ماصة باستور. إبقاء بيضات ملقحة (وليس البيض) في كثافة منخفضة (حوالي 200 الأجنة في 10 طبق سم) لتجنب التصاق معا. ثقافة الأجنة إلى المرحلة المطلوبة في درجات حرارة تتراوح بين 13 و 20 درجة مئوية. بدلا من ذلك، electroporate للبيضات ملقحة (الخطوة 5) أو حقن بويضة غير مخصبة (الخطوة 6).
5. Electroporation لل
- يخصب البيض وdechorionate للبيضات ملقحة في 18 درجة مئوية كما في المادتين 3 و 4. توفير ما بين 50 و 400 بيضة لكل عينة Electroporation لل.
- إعداد 50 ميكرولتر DNA البلازميد في أنبوب 1.5 مل (بحد أقصى 100 ميكروغرام DNA البلازميد في ده 2 O 50 ميكرولتر) وإضافة 200 ميكرولتر 0.95 M مانيتول. مزيج جيد من قبل vortexing.
- إرسال وخطورة الرواسب وبيضات ملقحة dechorionated في صلكنزد 1.5 مل أنابيب. إزالة ASWH وصولا الى علامة 100 ميكرولتر في الأنبوب.
- المضي قدما، على التوالي، لكل أنبوب البيضة الملقحة على النحو التالي: إضافةمحلول الحمض النووي / مانيتول باستخدام ماصة باستور. المزيج بلطف مع بيضات ملقحة وعلى الفور تناول الحمض النووي / مانيتول / التعليق البيضة الملقحة ونقل إلى كفيت electroporation 4 مم.
- ضع كفيت فورا إلى صاحب Electroporation للوإعطاء نبضة واحدة من 16 مللي ثانية في 50 V.
- إزالة بيضات ملقحة من كفيت باستخدام نفس ماصة باستور وتنتشر بها على طبق الثقافة التي تحتوي على ASWH الطازجة وتصفيتها. ماصة بيضات ملقحة قبل أن يبدأ الشق حوالي 1 التسميد آخر ساعة (HPF) عند 18 درجة مئوية.
- شطف ماصة بين العينات في كوب من ASWH.
- ثقافة بيضات ملقحة في 15-20 درجة مئوية في انخفاض كثافة كافية من حوالي 200 الأجنة في صحن 10 سم لتجنب الالتصاق معا.
6. حقن مكروي
- إعداد Dechorionated البيض للحقن.
- Dechorionate البيض على حدة، 2-4 الحيوانات، كما هو موضح في القسم 4. الحفاظ على البريد غير مخصبة وdechorionatedGGS في الاغاروز صغير أطباق ثقافة المغلفة منفصلة. غسل البيض عدة مرات في أطباق لازالة الانقاض.
- اختبار تسميد دفعات صغيرة من البيض dechorionated (حوالي 50) من كل فرد. استخدام طبق منفصل 5 سم لكل دفعة وتطبيق 2 ميكرولتر الحيوانات المنوية تنشيط (الخطوة 3.2). مزيج جيد من قبل يحوم الأطباق وانتشرت البيض في طبق عن طريق تحريك أطباق جانبية. الحفاظ على الحيوانات المنوية والبيض معا لمدة 10 دقيقة دون تحريك.
- القضاء على الحد الأقصى من الحيوانات المنوية على النحو التالي: نقل البويضات المخصبة إلى طبق ثقافة جديدة أو شطف مرتين مع ASWH جديدة. ترك الأجنة الشق رابط الجأش حتى المرحلة 32 خلية (عند 18 درجة مئوية لمدة 3 ساعات بعد الإخصاب). اختيار البيض من أفضل وضع دفعة (أفضل نسبة الإخصاب، ومعظم نمط الانقسام العادية) للحقن مكروي.
- إعداد إبر الحقن.
- الردم 4 إبر الحقن في وضع عمودي للسماح لخطورة فلوريداآه على طول خيوط. إيداع 0.5 ميكرولتر حل حقن (الخطوة 1.8) التي تحتوي على صبغة حيوية خضراء على نهاية الجزء الخلفي من الإبر التي يتم وضع طرف الإبرة إلى أسفل. انتظر السائل لملء طرف الإبرة في الأسفل.
- إعادة الإبر أفقيا والردم لهم مع الزيوت المعدنية باستخدام معدن ناعم وطويل أو البلاستيك ماصة. ببطء تراكب حل حقن مع الزيوت المعدنية طرد جميع فقاعات الهواء في حين ملء الإبرة.
- إعداد Micromanipulator في 18 ° C تبريد غرفة.
- ربط الأنابيب البلاستيكية من حامل الإبرة إلى حقنة زجاج 10 مل مليئة الزيوت المعدنية. ردم الأنابيب وحامل إبرة مع النفط وطرد أي فقاعات الهواء.
- ادخال الإبرة في حامل الإبرة ووضع حامل على micromanipulator.
- ضبط الحركة حامل الإبرة على طول خط مستقيم بزاوية 45 درجة بالنسبة إلى السطح.
- توجيه dechorionaالبيض تيد على طول المسافة البادئة الأغاروس الطبق الحقن ذلك أن البيض يمكن حقن واحدا تلو الآخر تحت المجهر تشريح.
- كسر رأس الإبرة، إذا لزم الأمر، عن طريق دفع بلطف إبرة ضد الاغاروز أو ضد قطعة من غطاء زجاجي زلة وضعت على الاغاروز. الضغط قليلا على مقبض الحقنة للتحقق من أن طرف الإبرة مفتوح (ومحتويات إبرة الخضراء طرد).
- حقن بويضة غير مخصبة واحدة تلو الأخرى من خلال تقديم أول الإبرة في البيض والشفط قليلا لكسر غشاء البويضة تليها الحقن. حقن محلول الحقن الأخضر في منتصف البيض إلى حد أقصى قدره 1/3 من قطر الخلية. (وهذا يتوافق مع ما يقرب من 30 رر لقطر بيضة من 140 ميكرون).
- نقل البويضات غير المخصبة لحقن طبق ثقافة جديدة واحتضان لهم في 15-18 درجة مئوية حتى الإخصاب.
- يخصب البيض حقن الحيوانات المنوية تنشيط حديثا كما في بالتخصيب اختبار (الخطوة 6.1.2). Eliminatعصام الحد الأقصى من الحيوانات المنوية عن طريق نقل بيضات ملقحة إلى طبق ثقافة جديدة. انتشرت الأجنة ولا التشويش عليها خلال مراحل الانقسام (تصل إلى مرحلة 32 خلية).
- ثقافة الأجنة إلى المرحلة المطلوبة عند درجة حرارة تضم ما بين 13 و 20 درجة مئوية.
- جمع الأجنة عن طريق يحوم لهم في منتصف اللوحة ونقلها إلى صلكنزد 1.5 مل أنابيب. إصلاح وصمة عار، أو جبل (خطوات 7 و 8).
- مقارنة الظواهر الحصول على الأجنة السيطرة حقن.
ملاحظة: حقن ثاني غير متداخلة MO، التي تستهدف نفس نسخة للحصول على الظواهر متطابقة. إنقاذ النمط الظاهري MO معين (s) مع مرنا تعديل ترميز البروتين الخاص بك من الفائدة ولكن غير معترف بها من قبل المنظمات الأعضاء. حقن MO التحكم التي لا تعطي النمط الظاهري.
7. LacZ تلطيخ
- جمع الأجنة في مرحلة المطلوبة في صلكنزد 1.5 مل أنابيب واصلاحها في 0.2٪ غلوتارالدهيد في 1 مل ASWH ل15لمدة 30 دقيقة كحد أقصى.
- غسل 2X 10 دقيقة مع 1 مل 1X PBT.
- شطف مرة واحدة في 500 العازلة LacZ تلطيخ ميكرولتر. استبدال X-غال الركيزة تستكمل 1 مل العازلة تلطيخ (استخدام 10 ميكرولتر / مل من 40 ملغ / مل الأسهم X-غال). نقل الأجنة إلى لوحة جيدا 12 لمراقبة أفضل للتلطيخ.
- احتضان في الظلام. تختلف الحضانة من 0.5 ساعة ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية، في RT أو عند 37 درجة مئوية اعتمادا على قوة السائق معربا عن LacZ.
- غسل الأجنة تصل إلى 4 مرات في 1 مل 1X PBT لإزالة عازلة تلطيخ.
- ما بعد الإصلاح لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع 2٪ امتصاص العرق (PFA) في 1 مل 1X PBT أو 0.2٪ غلوتارالدهيد في 1 مل 1X PBT لتفسير وتصور الأجنة الملون.
8. تركيب Fluorescently صفتها Wmbryos
- إصلاح الأجنة من مرحلة التطوير المنشود لمدة 20 دقيقة في 2٪ PFA في 1 مل ASWH.
- غسل الأجنة 2X في 1 مل 1X PBT. تجنب أي المعارض ضوءلدى عودتهم عن طريق الحفاظ على الأجنة في الظروف المظلمة.
- نقل ما يصل إلى 50 الأجنة إلى شريحة واحدة. إزالة الحد الأقصى من PBT لأول مرة مع ماصة وبعناية مع منشفة ورقية.
- إضافة 20-25 ميكرولتر المتوسطة المتزايدة.
- إضافة ساترة بوضعها في زاوية (من جانب واحد لأول مرة) وببطء خفضه مع كائن مدببة (إبرة، ملقط، ماصة) تجنب الفقاعات حتى يتم تغطية العينة. إصلاح ساترة على حوافها باستخدام نقاط من طلاء الأظافر الشفاف.
- ختم ساترة كامل مع طلاء الأظافر بعد التجفيف. مخزن في الظلام عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
Representative Results
Microinjection لجين التنظيمي الدراسات الشبكة
الأجنة من ascidian المعوية Ciona هي مناسبة تماما لجين الدراسات التنظيمية وظيفية أو الجينات على مستوى الخلية النسب ولقرار الخلوية. من mRNAs، المنظمات الأعضاء أو العلامات يمكن microinjected داخل البويضة غير المخصبة أو إلى عن Blastomeres الفردية التالية الإخصاب. يوصف MO الجينات بوساطة ضربة قاضية باستخدام تقنية حقن مكروي في الخطوة 6. المنظمات الأعضاء تستهدف تحديدا مرنا من جينات منتقاة ومنع ترجمتها إلى البروتين. MO بوساطة الخسارة من وظيفة (LOF) من الجينات التنموية يغير التعبير عن مجموعة واسعة من الجينات المصب، وعموما يكشف لمحة عن الجنينية GRN 10. قدمت هذه التحليلات في Ciona أول مخطط تنظيمي الجنين كله في metazoan 11 الشكل 1 يعرض مثال عن كيفية microinjectiوقد استخدمت لدراسة تنظيم المنبع للتعبير عن الحفاظ تسى -Myelin النسخ عامل (تسى -MYT) في مرحلة المعيدة الأجنة Ciona. يرصدها في الموقع التهجين (ISH)، والتعبير الذاتية (الشكل 1A، schematized في الشكل 1A ') لوحظ في 6 الصف السلائف لوحة العصبية، من أهمها الدماغ (الصفوف الثالث / الرابع، باللون الأحمر) والحبل الشوكي ( الصف الأول، باللون الأخضر). وبالإضافة إلى ذلك، تم تحليل تسى -MYT تنظيم المنبع عن طريق الحقن MO تستهدف العديد من العوامل التي يتم التعبير عنها أو المتاخمة لالسلائف العصبية قبل تسى التعبير -MYT بداية (الشكل 1B-ز). MO ضربة قاضية من العوامل الجنينية المبكرة، مثل مربع أأ Forkhead (فوكسا-أ) عامل النسخ وعامل نمو الخلايا الليفية 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (الشكل 1B أو 1C، على التوالي) يقضي عموما تسى -MYT التعبير. عوامل النسخ الأخرىفقط تؤثر بشكل جزئي التعبير -MYT CI مما أدى إلى downregulation بوساطة MO في مجموعة فرعية من السلائف الدماغ (رؤساء السهم الأزرق في الشكل 1D، و، ز). على العكس من ذلك، يتم تنشيط تسى التعبير -MYT ectopically على downregulation من العقدية (الشكل 1E، السهم رؤساء الأحمر)، مما يوحي بأن العقدية عادة يقمع التعبير -MYT تسى في هذه السلائف الحبل العصبي الجانبية.
Electroporation للللدراسات الفنية ومحسن الجين الفعال
Electroporation للمن البلازميد إلى بيضات ملقحة Ciona هو وسيلة فعالة لtransgenesis عابرة والمراقبة اللاحقة التغيرات المظهرية في الجسم الحي. على عكس Microinjection من مرنا، Electroporation لليسمح لأنسجة overexpression محددة، والتي يتم التعبير المناطق الجين الترميز (ORFS، وفتح إطارات القراءة) تحت السيطرةمن السائقين محددة الأنسجة. تشكل هذه عادة مناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة من الجينات المعروفة (مثل محسن براتشيوري للتعبير في السلائف الحبل الظهري 8). على العكس من ذلك، Electroporation للهو فعال لتحليل كفاءة من المناطق التنظيمية الجديدة حيث الجينات مراسل (LacZ أو البروتين الفلوري الأخضر، GFP) تكشف عن نشاطها في الجسم الحي. يتم عرض العمل لتحديد ولاحق Electroporation للتحليل بوساطة من هذه المنطقة التنظيمية رواية (لتسى -MYT) في الشكل رقم 2.
وذخيرة واسعة من البيانات المجتمع Ciona، يمكن الوصول إليها بسهولة في ascidian المتصفحات الجينوم محددة 12،13، مثل شبكة Ascidian لفي التعبير الموقع وبيانات الجنينية (اليانسون) 23، ويتم تفتيش لتحديد الهوية في سيليكون والمناطق التنظيمية (الشكل 2A). لاحقا البلمرة المتسلسل (PCR) الاستنساخ على أساس من هذه المناطق إلى ناقلات التعبير يسمح ل electroporation بوساطة اختبار في الجسم الحي. (الشكل 2B). متصفح الجينوم الشاشة لقطة في الشكل 2A يظهر المنطقة المنبع من طراز نسخة KH لتسى -MYT (الإكسونات الثلاثة الأولى، في البرتقال، واثنين من إنترونات مرئية). مختلف المسارات متصفح الجينوم تعليقات إلى توقعت بيانات الجينوم وظيفية لهذه المنطقة، مثل بيانات 14 (كما هو موضح هنا لZicL، تسى -zinc إصبع من المخيخ L) مناعي لونين (رقاقة)، والحفاظ على تسلسل بين نوعين Ciona ذات الصلة 15،24 أو جسيم نووي الإشغال 16،17 (من أعلى إلى أسفل في الشكل 2A). عموما، مناطق تشفير البروتين exonic والحفظ جدا (محاذاة المسار في الشكل 2A). تظهر قمم إضافية الحفاظ على ارتفاع في مناطق غير الترميز المنبع وفي إنترون الأول. ومن المتوقع اثنين من هؤلاء أن يكون جسيم نووي حرccording لمقرها تسلسل خوارزمية 16،17 (إطارات الحمراء في الشكل 2A) مما يشير إلى إمكانية الوصول إلى عوامل النسخ. في الواقع، يتم إثراء إشارات رقاقة على رقاقة 14 لتسى -ZicL عامل النسخ ملزمة (أشرطة خضراء في الشكل 2A) في هذه المناطق الحفظ اثنين. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام واجهة 25 الذي يبحث عن المواقع المحتملة عامل النسخ ملزمة، حددنا مواقع شركة زيورخ للتأمين تقع ضمن تسلسل الجينوم تميزت مجموعات تسى -ZicL رقاقة (الأسهم البرتقالية وتسلسل مع تحته خط زيوريخ النواة، الشكل 2A). وملزمة من تسى -ZicL عامل النسخ في التمايز ومتوقع جسيم نووي المناطق التنظيمية خالية من تسى -MYT وبما يتفق مع downregulation من تسى -MYT التعبير التي لوحظت في MO-حقن التجارب ضربة قاضية بوساطة تستهدف ZicL (1D الشكل).
بعد ردعالتعدين المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة المحتملة في سيليكون للتعبير تسى -MYT، وهذه هي PCR تضخيمها من Ciona الحمض النووي الجيني والمدرج بواسطة إعادة التركيب استنساخ إلى مراسل LacZ البلازميدات 19. ثم يتم electroporated يبني في بويضات المخصبة Ciona (الشكل 2B) وتحليلها لنشاطهم من قبل LacZ تلطيخ (الشكل 3).
ويبين الشكل 3 أنه من خلال مثل هذا في نهج سيليكون وكان من الممكن التعرف على اثنين منفصلة تسلسل -regulatory رابطة الدول المستقلة أن ألخص تسى -MYT مرنا مجالات التعبير (قارن الشكل 1A). عموما، الأجنة وراثيا عابر electroporated مع البلازميد عرض الحمض النووي التعبير الفسيفساء في تلك الخلايا فقط التي أدرجت في الحمض النووي. وهكذا دفعت فسيفساء LacZ التعبير pmyt-R3 ويمكن العثور عليها في جميع السلائف التي تعبر أيضا تسى (الشكل 3A، ب، الأرجواني والأحمر السهم رؤساء، على التوالي). في المقابل، pmyt-R5 تنشط فقط في الخلفية (الصف الأول) السلائف لوحة العصبية والبدء في مرحلة لاحقة neurula (الشكل 3C، السهم رؤساء الأحمر). وبالتالي المنطقتين ترميز جانبين منفصلين المكانية والزمانية للتنظيم الجينات في Ci-MYT. ومن المثير للاهتمام، سواء المناطق التنظيمية أيضا وصمة عار السلائف إضافية لم أر في فرط ضغط الدم، وخصوصا في الجزء الأمامي ولوحة العصبية الجانبية وفي العضلات (الشكل 3A، ب، والوردي، والأبيض، ورؤساء السهم الأصفر، على التوالي). قد يشير هذا التعبير أوسع القمعية العناصر التي لم ترد في شظايا التنظيمية معزولة (مثل لالعقدية الذي يقمع مصير العصبي الجانبي، انظر الشكل 1E) أو إلى مستويات التعبير منخفضة الكشف مع تراكمLacZ إشارة الأنزيمية.
بالإضافة إلى الدراسات محسن، Electroporation للفي Ciona يسهل أيضا تحليلات وظيفية Ciona الجينات الترميز التي كتبها overexpression بهم. مجموعة كبيرة من Ciona ORFS طول كامل متاح للمجتمع، والمشروح وعلاوة على ذلك لorthologs الإنسان، بما في ذلك الجينات المرتبطة بالمرض 18. ونقل الجينات أو مجموعة من الجينات من هذا متوافقة الكاملة مكتبة ORF كدنا] الاستنساخ إعادة التركيب (الشكل 2B) الفردية بسهولة إلى نواقل جهة التي تحتوي على برامج التشغيل المناسبة أن أعرب في الأجنة. مما أدى استنساخ التعبير يمكن علاوة على ذلك أن يشترك electroporated مع مراسل رابطة الدول المستقلة -regulatory يبني لاختبار الدور المفترض في تفعيل محسن. الشكل 2B يوضح عزل الحيوانات المستنسخة ORF الكاملة عن عوامل النسخ تسى -ZicL وCi- GATAa وrecombinatio بهمن في ناقلات جهة تكييفها التي قد تحتوي على علامات متعدية 19 (مثل الفلورسنت الأخضر Venus- أو هيماغلوتينين الفيروسي (HA) -tag) وبرنامج تشغيل معين الأنسجة مثل صديق من المنطقة التنظيمية غاتا (سائق pfog) في أوائل التعبير عموم الأديمي الظاهر 15 المستخدمة في هذه الدراسة. تم تحليل تأثير تسى -ZicL overexpression في الأدمة والأديم الظاهر العصبي الأنسجة عن طريق المشاركة في Electroporation للمن pmyt-R3> LacZ وpmyt-R5> صحفيين LacZ (الشكل 3B، ب '' ج '، ج' '، على التوالي). وتشير التحليلات Electroporation لللدينا أن تسى -ZicL قد تفعيل التعبير تسى -MYT من خلال pmyt-R3 وأظهر pmyt-R5 المناطق محسن على حد سواء يبني مراسل التعبير LacZ خارج الرحم في مناطق الأدمة (الأخضر السهم رؤساء في الشكل 3B، ب '' و ج و# 39؛، ج ''،). كما هو مبين في الشكل 3D، وElectroporation للمن البلازميد في مئات من البيض Ciona يسمح لتقدير المعنيين إحصائيا من التغييرات التعبير، ويتضح للخارج الرحم pmyt-R3> التعبير LacZ على تركيز يتوقف، لعموم الأديمي الظاهر التعبير تسى -ZicL.
Electroporation للفي الجسم الحي دوين الخلوي التعريب
الرقم 4 يصور توطين التحت خلوية من عوامل النسخ الموسومة عندما أعرب على Electroporation للفي الأدمة عن Blastomeres استخدام التركيبات التعبير تكييفها (schematized في الشكل 2B). عوامل C-عضال علامات النسخ (مثل تسى -GATAa) مع علامة فينوس (الشكل 4B) أو HA العلامة (الشكل 4C) وoverexpressing لهم في أنسجة الأدمة (pfog) يمكن أن نلاحظ أن في الجسم الحي، "تسى -GATAa المترجمة معظمها إلى نوى، كما هو متوقع لعامل النسخ، في حين أن فينوس التعبير في كل مكان، بما في ذلك السيتوبلازم. يمكن إجراء تجارب مماثلة لدراسة ديناميات توطين التحت خلوية مع مرور الوقت، من فرد أو مجموعة من عوامل النسخ، وربما تكشف عن زملائهم في توطين مع به مختلفة.
الشكل 1: تقييم تسى تنظيم -MYT بواسطة حقن مكروي في البيض Ciona التعبير تسى -MYT مرنا في WT وMorpholino (MO) حقن الأجنة. (أ) نمط التعبير WT من تسى -MYT في لوحة العصبية. (أ ') تمثيل تخطيطي السلائف الملون في لوحة العصبية (NP). صف I / II: مصير العصبي الخلفي. الصف الثالث / الرابع: مصير العصبي الأمامي. الصف الخامس / السادس: امسة مصير. (
الشكل 2: سير العمل في البحث سيليكون والمناطق محسن وإعادة التركيب استنساخ لtransgenesis عابرة من Electroporation للفي الأجنة Ciona (A) لقطة من زقاق اليانسون 23.ويحدد متصفح الجينوم ديان متواليات التنظيمية المنبع من تسى - MYT. إطارات الحمراء علامة منطقتين -regulatory رابطة الدول المستقلة المحتملة، pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) وpmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) التي اختيرت لتحليلها من قبل Electroporation لل. أسماء المسارات: تحقيقات ZicL: الشذرة على رقاقة البيانات 14؛ KH2012 النصوص: Ciona المعوية نماذج نسخة. محاذاة نتيجة جيم / تسى LastZ: الحفاظ على تسلسل بين Ciona سافيجني (جيم) / Ciona المعوية (CI) 15،24. . سيغال 2006 توقع جسيم نووي الإشغال النسخة 1: كتكوت تدريب خوارزمية حسابية من قبل سيجال وآخرون، 2006 16 تنطبق على تسى كما هو الحال في Khoueiry وآخرون، 2010 17 الحانات الخضراء:. تسى -ZicL الشذرة قمم 14؛ السهام البرتقالي: توقعت مواقع شركة زيورخ للتأمين. GCTG: الموقع ملزمة الأساسية زيوريخ. (ب) خطة لتوليد بنيات overexpression من Cionكامل طول مكتبة ORF كدنا]، معاد في ناقلات جهة التي تحتوي على نسج برامج معينة (pfog) والعلامات البروتين بعد ذلك شارك electroporated مع ثوابت مراسل (مثل pmyt-R3> LacZ أو pmyt-R5> LacZ) في الجسم الحي قراءات تسى - MYT، تسى عامل -myelin النسخ؛ تسى -ZicL، تسى -Zinc إصبع من المخيخ عامل L النسخ؛. pfog، والمنطقة التنظيمية من تسى -Friend من GATA الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الأجنة Electroporated Ciona تظهر تسى -ZicL محرض -regulation رابطة الدول المستقلة المكانية والزمانية من تسى -MYT LacZ الأجنة الملون في منتصف gastrul.وأظهرت (ملغ) / في وقت متأخر من المعيدة (LG) أو neurula أوائل مرحلة (EN) التي شارك electroporated مع إما pmyt-R3> LacZ أو pmyt-R5> LacZ وتحكم بناء (pfog> mCherry) أو pfog> ZicL. السائق pfog 19 يتوسط خارج الرحم (عموم الحيوان) ZicL التعبير في الأديم الظاهر والأديم الظاهر العصبي ويسبب وصمة عار LacZ خارج الرحم في هذه الخلايا. (أ) النشاط pmyt-R3 LacZ في الأجنة مرحلة ملغ / LG (السهام الصغيرة، لوحة اليسرى) أو في الأقاليم التخطيطية الملونة في المقابل (الدوائر الزرقاء، اللوحة اليمنى). عرض النباتي (جيد جدا). صف I / II: مصير العصبي الخلفي. الصف الثالث / الرابع: مصير العصبي الأمامي. الصف الخامس / السادس: امسة مصير. (ب) النشاط pmyt-R3 في مراحل EN في الأنسجة كما هو الحال في. يشار ب ( ') خارج الرحم النشاط pmyt-R3 على تسى -ZicL شارك في Electroporation للمن السهام الخضراء. (ب '') نفس الأجنة كما هو الحال في ب "، الموجهة نحو القطب الحيواني حتى (على). (
الرقم 4: توطين التحت خلوية التفريقي للبروتينات على Electroporation للتوطين فينوس الموسومة أو Hemagglutinin- (HA) -tagged البروتينات overexpressed في خلايا الأدمة باستخدام برنامج تشغيل pfog 19. (أ - ج) وصور مدينة دبي للإنترنت. (أ، ب ') الموافق الصور مضان. (ج ') الموافق صورة مضان على وضع العلامات النسيجي المناعي مع TRITC. شريط مقياس = 100 ميكرون يشير إلى جميع الصور. مدينة دبي للإنترنت، التفاضلية التدخل التباين. الرجاء النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
هناك نوعان من التقنيات الرئيسية لتوليد أجنة Ciona المعدلة وراثيا: Microinjection من RNA أو DNA و electroporation الحمض النووي. استخدمت هذه التقنيات لاضطراب الجينات في الأجنة Ciona أولا في 1990s 7،8 ومنذ ذلك الحين تحسنت تباعا، وتستخدم الآن في Ciona (وغيرهم من أجناس ascidian) 20 في جميع أنحاء العالم.
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
transgenesis الناجح في الأمشاج Ciona التي يتم جمعها بسهولة من الحيوانات البالغة يعتمد على عدد من العوامل الحاسمة. نوعية الأمشاج تعتمد على موسم التفريخ (عموما من مايو.-ديسمبر. في شمال المحيط الأطلسي، وتغيير درجة حرارة الماء والأوكسجين)، على نوعية مياه البحر في أحواض السمك (في الملوحة الصحيحة والبالغين البقاء بصحة جيدة لمدة 2-4 أسابيع) وأخيرا على التعامل الصحيح من الأمشاج على استخراج من البالغين، كما هو مفصل أدناه للحصول على الخطوات المختلفة فيبروتوكول.
خلال خطوات إعداد واحتضان ماصات باستور مع الاستفادة من المياه ومنع الأجنة من الالتصاق ومياه البحر قبل حضانة أطباق بتري المغلفة الاغاروز وإزالة المواد السامة المنبعثة من الاغاروز. عموما، قد تكون على استعداد أطباق لتصل إلى 2 أسابيع قبل الاستخدام، وتخزينها في 4 درجة مئوية لتجنب نمو البكتيريا وتشطف حديثا قبل الاستخدام. يوم واحد من العمر، أطباق صغيرة تبدو أفضل لحقن.
الكفاءة وطول dechorionation هي خطوة حاسمة في بروتوكول كعلاج لفترات طويلة من البيض / الأجنة سيضر التنمية. إعداد دقيق (لا الهز) والتخزين الصحيح (في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوع واحد) الحفاظ على نوعية الحل dechorionation. البروتياز في حل تفقد كفاءة إذا إما مختلطة بعنف أيضا في إعداد أو مع مرور الوقت، ولا سيما إذا كان يحتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لأطول ساعات / يوم. لقد الأمثل هذه الخطوة الهامة باستخدام حل dechorionation جديدة ملائمأعدت من قسامات المجمدة من 20x وحل الأسهم.
المعالجة الصحيحة للالهشة البيض dechorionated / الأجنة أمر ضروري والقص أو طعن أجنة في حين pipetting لسوف يكون ضارا. عندما pipetting ل، تتم المحافظة على الأجنة قدر الإمكان في تعليق (عن طريق بلطف "تهب" السائل إلى دوامة عنها يتبع من قبل pipetting سلس ولكن سريع)، في حين عقد ماصة الزجاج في عمودي بدلا من وضع أفقي. تنطبق هذه الرعاية لجميع الخطوات pipetting لللغسيل، إعادة تعليق، ونقل البيض / الأجنة داخل وخارج الأنابيب، cuvettes أو لوحات، قبل وبعد التثبيت. على التثبيت، كما ينبغي إيلاء عناية خاصة لأجهزة pipetting لمنفصلة ليعيش مقابل الأجنة ثابتة لتجنب أي سمية من بقايا مثبتات.
حقن مكروي هو صعب إلى حد ما في Ciona البيض / الأجنة بسبب صغر حجمها ومرونة الغشاء المحي وخطيرة يعتمد على حجم غيض الأمثل للإبرة الحقن، زاوية الكمال من حقن (حركة إبرة في سطر واحد، على طول نصف قطرها البيض) ودقيقا، وكسر اليدوي من الغشاء المحي (عن طريق الشفط قبل التطلع للحقن). هذا الأخير غير ممكن إلا إذا تم القضاء على فقاعات الهواء تماما من أنابيب الحقن التي تحتوي على الزيوت المعدنية لتعويض الضغط شفط / الحقن. وبالإضافة إلى ذلك، فإن أصغر قطعة من الغبار أو البيض الحطام تسد الإبرة، ويتم تجنبها بسهولة عن طريق ظروف العمل نظيفة والشطف خطوات للبيض قبل نقل على طبق الحقن. حقن آخر، فإن نقل البيض على الأطباق الطازجة تجنب الآثار السامة من أجنة ميتة لا بعد أن نجا من إجراء الحقن.
استكشاف الأخطاء وإصلاحها
ويمكن معالجة المشاكل المحتملة في الإجراء عن طريق الحلول التالية. وقد تنشأ معدلات التسميد منخفضة من تنشيط الحيوانات المنوية غير كافية، ونظافة البيض منخفضة أو وحدات التخزين الإخصاب كبيرة. استخدام freshlذ المجمعة وأقل المخفف الحيوانات المنوية. تحقق من حركة الحيوانات المنوية على التنشيط. غسل البيض مع ASWH قبل الإخصاب كما هو موضح في الخطوة 4.2. تقليل حجم المياه وتقليل كمية من البيض في طبق الإخصاب / جيد. فقدان الأجنة خلال خطوات إعداد يمكن تجنبها عن طريق إضافة قطرة من حل dechorionation لأجهزة الطرد المركزي أكثر كفاءة أسفل البيض / الأجنة undechorionated. يجب أن يكون الأمثل Dechorionation الوقت والبيض dechorionated جزئيا لن الرواسب وdechorionation لفترات طويلة هي سامة، مما تسبب في الأجنة لتنفجر.
قد تنشأ تطوير متزامنة من الحيوانات المنوية المتبقية صدر أثناء تشريح. الحفاظ على دفعات بيضة فصل من الحيوانات المختلفة لتجنب غير المنضبط تلاقح. نمو غير طبيعي يمكن أن يكون لأسباب مختلفة. في بداية ونهاية الموسم، بعد حفظ الجنين من مختلف الأفراد المنفصلين، ويمكن اختيار أفضل دفعات. تجنب تشويش الأجنة ل10 دقيقة التي تلي الإخصاب لتجنب التداخل مع عزلهم ooplasmic. تأكد من أن الأجنة لم تبدأ بتقسيم أثناء نقله كما pipetting ليفصل عن Blastomeres الشقيقة والنتائج في الأجنة جزئية. استخدام كميات أقل من الحيوانات المنوية للبيض dechorionated لتجنب تعدد الإمناء. استخدام أطباق الأغاروس الطازجة ولكن تشطف. تأكد من أن الجهاز pipetting لنقدمه مجانا مثبت. إبقاء الأجنة السيطرة التي لم dechorionated وليس electroporated للكشف على الخطوة التي التنمية تعطلت. تكملة الأجنة مع المضادات الحيوية في حالة حدوث تلوث والتحلل.
إذا كان الجهاز حقن و"انسداد"، افتتاح إبرة الحقن يمكن التحقق منها من قبل طرد بعض من محتواه الملون. يمكن محوها المواد انسداد قبالة عن طريق سحب بعناية طرف الإبرة من خلال الاغاروز. فقاعات الهواء في أنابيب حقن و / أو يجب إزالة إبرة. تغيير الإبرة لتحسين السيطرة على حجم الحقن مثل نيغيض DLE قد كسر أو تسد على طول الحقن. شطف البيض ووضعها في طبق حقن نظيفة إذا تراكمت الحطام في الطبق. أجهزة الطرد المركزي في حل حقن قبل ملء الإبر جديدة من أجل الرواسب أي جزيئات صغيرة أو البلورات. من المفيد أيضا تمارس حقن فقط مع صبغ حيوي. التحقق من تقنية الحقن عن طريق التسميد البيض حقن وغير حقنه. وأخيرا، والتشاور مع زميل ذوي الخبرة يمكن أن تكون مفيدة لتحسين تقنية الحقن.
للسيطرة على الآثار بعيدا عن الهدف الثاني غير متداخلة MO والإنقاذ مع مرنا المحورة التي لا تعترف بها المنظمات الأعضاء يمكن استبعاد بإخلاص آثار المظهري غير محددة في Ciona.
حقن مكروي: أهمية والقيود
تم استخدام حقن مكروي في Ciona لتوليد أول مخطط لشبكة تنظيمية كله الجنين الجين (GRN) في حبلي 11. ومع ذلك، على الرغم من هذا ريماتحقيق rkable، حقن مكروي في الأجنة Ciona له حدود، ويرجع ذلك إلى الحجم الصغير نسبيا (0.14 مليمتر في القطر) من البيض Ciona. مقارنة بتلك الأنواع حبلي أخرى حيث دنا غريب / هو عرض مرنا بواسطة إبر دقيقة جدا، والبيض Ciona صعبة نسبيا في التعامل معها ويبقى معدل الأجنة Ciona حقن في التجربة منخفض (في المتوسط 30-50 الأجنة في التجربة)، التي تعرقل التحليلات الكمية. ومع ذلك، لعوامل الأمهات مشوشة في Ciona، Microinjection من المنظمات الأعضاء هو الأسلوب المفضل أيضا لدراسة مشاركتها في بداية اقحي التنمية من الخلية 16-32 مراحل 15. وبالإضافة إلى ذلك، فمن الممكن وإن كان أكثر صعوبة لmicroinject عن Blastomeres الفردية وصولا إلى مرحلة 16-32 الخلية. وأخيرا، لا يزال حقن مكروي التقنية الأكثر كفاءة لتوليد الأجنة وراثيا (عن طريق مرنا أو حقن الحمض النووي) في الأنواع ascidian أخرى من Ciona، التي optimi بالكامللا توجد زيد بروتوكولات Electroporation لل.
Electroporation لل: أهمية والقيود
للتغلب على الأرقام المنخفضة وغيرها من القيود من حقن مكروي، وقد استخدمت معظم المجتمع Ciona Electroporation للمن البلازميد منذ تم تطويره ونشره على أنه بروتوكول الأمثل وموحد من قبل زيلر وآخرون في عام 2004 9. في الواقع، الآلاف من الأجنة Ciona المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد خلال ساعة واحدة مع ما يصل إلى 500 الأجنة electroporated في وقت واحد في كفيت واحدة باستخدام واحد 50 V نبض 16 ميللي ثانية. النهج لتوليد أعداد كبيرة من الأجنة وراثيا لا يزال فريد بين الكائنات نموذج حبلي. وقد أدى هذا Ciona لا بد من الاعتراف بسرعة كنظام نموذج قوي لأداء المجراة تحليلات المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة المحتملة والخلوية / دوين الخلوي التعريب، كما يتضح هنا.
على الرغم من أن electroporatiعلى في بيضات ملقحة Ciona ثورة جذري في مجال الأبحاث حبلي GRN، والتقنية ومع ذلك يواجه بعض القيود. أولا، يتم إدخال البلازميدات عابر في الأجنة Ciona وعلى الأرجح الموروث صفائف خارج الصبغي، مما يجعل من استقرار electroporated البلازميد المضاربة. وعلاوة على ذلك، فإنه من الصعب جدا، بل وربما من المستحيل، للسيطرة على نسخ من البلازميدات electroporated التي سيتم تناولها في البيضة الملقحة، مما أدى إلى تقلبات المظهرية. وثمة مشكلة أخرى أن يجعل من الصعب تفسير النتائج Electroporation للظاهرة التي نسميها الاصباغ. يمكن اتخاذها Electroporated DNA البلازميد تصل في مواقع مختلفة من مرحلة الجنين خلية واحدة. الذي يحدد وعدد أرباع البيضة الملقحة سوف تتلقى البلازميد تكون موروثة من قبل عن Blastomeres أصل أفريقي. هذه الاختلافات تجعل بوضوح تفسير الآثار الكمية أكثر صعوبة. ومع ذلك، فإن معظم المشاكل التي تأتي مع electroporaتحل تقلب نشوئها من مبلغ مناسب من العينات البيولوجية، مع العد والإحصاء لLacZ (أو GFP) خلايا الإيجابية، التي يتم الحصول عليها بسهولة في دفعة واحدة.
براعة وإمكانات Electroporation للللهندسة الوراثية
Electroporation لليسمح في نهاية المطاف للفحص منتصف الإنتاجية من المناطق -regulatory رابطة الدول المستقلة المحتملة والتحليلات الكمية وظيفة الجين مرة واحدة مستنسخة إلى المراسل أو التعبير البلازميدات. ويرجع ذلك إلى الجينوم Ciona المدمجة، وتحديد واستنساخ المناطق التنظيمية المحتملة غير واضحة إلى حد ما 3. ويتجلى استراتيجية لاستخدام ثروة من البيانات المجتمع في الشكل 2A. ومما يسر استنساخ مراسل والجينات البلازميدات ترميز من قبل جيل من Ciona تكييفها، GATEWAY متوافقة أجنحة ناقلات 19 و طوله متوافق ORF مكتبة 18. على حد سواء الأدوات المتاحة للمجتمع والسماح للكفاءة، وتقييد إعادة التركيب خالية من إنزيم السائقين التنظيمية ومناطق الترميز، كما هو مبين في الشكل 2B.
في السنوات الأخيرة، تم تكييفها Electroporation للبنجاح لتحقيق التلاعب الجيني يستهدف الأنسجة مع البلازميدات التي تعبر عن أدوات التحرير الجينات مثل مكونات كريسبر / Cas9 تحت سيطرة الأنسجة برامج معينة 21،22. وهذه النهج تتقدم بسرعة فهمنا لديناميات GRNs وآليات الإشارات يحتمل الحفظ، بما في ذلك رموز عامل النسخ تشارك في تكوين الأنسجة والخروج التدريجي من تعدد القدرات. وعلاوة على ذلك، سوف loss- الأنسجة محددة أو الحصول على وظيفة من النهج (من كريسبر / Cas9 أو overexpression) باستخدام Electroporation للأن يكون مفيدا لدراسة orthologs Ciona من الجينات المرتبطة بأمراض الإنسان. في الواقع، كتالوجات للorthologs Ciona من جينات الأمراض البشرية والكامل طول ORF الترميز الحيوانات المستنسخة هي التواجد بسهولةلو لتحليلها في Ciona 1 8. ويرجع ذلك إلى الازدواجية الجينوم واسعة في الفقاريات، ومعظم الجينات البشرية تمتلك paralogs زائدة عن الحاجة وظيفيا التي تعقد تحليلات وظيفة الجين 1. Ciona كونه نظاما أبسط مع ترتيب الأنسجة حبلي نموذجي في اليرقات يجب الكشف عن الأدوار الأساسية لتلك الجينات المهمة في كثير من الأحيان الحفاظ ظيفيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab with constant temp. (~18 °C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC - Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1 M pH 9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12 hr |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K4Fe(CN)6•3H2O | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5 mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 | |
| anti-HA tag antibody | abcam | ab9110 | for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT |
| TRITC goat anti-rabbit antibody | Jackson | 111-025-144 | for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT |
References
- Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120 (1), 125-133 (1994).
- Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (8), 4437-4440 (1998).
- Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298 (5601), 2157-2167 (2002).
- Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19 (7), 376-381 (2003).
- Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439 (7079), 965-968 (2006).
- Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332 (1), 48-60 (2009).
- Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux's Arch Dev Biol. 203 (1-2), 104-112 (1993).
- Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124 (3), 589-602 (1997).
- Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74 (74), 13-30 (2004).
- Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30 (3), 103-106 (2001).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312 (5777), 1183-1187 (2006).
- Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20 (10), 1459-1468 (2010).
- Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. , (2015).
- Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137 (10), 1613-1623 (2010).
- Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134 (22), 4023-4032 (2007).
- Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).
- Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20 (9), 792-802 (2010).
- Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404 (2), 149-163 (2015).
- Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2 (9), e916 (2007).
- Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21 (15), 1308-1313 (2011).
- Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56 (7), 499-510 (2014).
- Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141 (21), 4115-4120 (2014).
- ANISEED, Free Software Foundation Inc.,. , Available from: http://www.aniseed.cnrs.fr/v3 (2007).
- VISTA, 1997-2013 The Regents of the University of California. , http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml (2013).
- Genomatix Inc. , http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl (2013).
