Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Embryo Mikroinjektion og Elektroporering i Chordatzoologi doi: 10.3791/54313 Published: October 16, 2016

Summary

Vi præsenterer forbigående transgenese og gen knockdown i Ciona intestinalis, en chordate søster gruppe til vertebrater, ved hjælp mikroinjektion og elektroporeringsteknikker. Sådanne metoder lette funktionel genomforskning i denne enkle hvirvelløse at funktioner rudimentære karakteristika hvirveldyr, herunder notochord og hoved sensoriske epithel, og mange ortologer af humane sygdom forbundet gener.

Introduction

For nylig er genomsekvens og transskriberede genrepertoirer bliver tilgængelige i en række modelorganismer. Bestemmelse gen funktionelle links, dog, og hvordan disse forbindelser er hardwired i DNA til at udføre transkriptionsaktivitet hele embryonale tid og rum, er fortsat en stor udfordring, især i hvirveldyr. Kompleksiteten af regulatoriske interaktioner og kompleksiteten af genomer 1,2, navnlig i hvirveldyr, bremse effektive funktionelle analyser, især på DNA-niveau in vivo. Faktisk er ingen GRN øjeblikket analyseret fra befrugtning til den endelige, terminalt differentieret tilstand udvikle organisme.

Den søpung C. intestinalis repræsenterer en model organisme, hvor en sådan fuldstændig GRN analyser kan være muligt. Det har en duplikeret genom typisk for hvirvelløse dyr med lille gen redundans. Hvirveldyr i modsætning har gennemgået to runder af genom gentagelser, der have genereret større gen familier og funktionelle diversificering, men også redundans mellem paraloger. De kompakte cis reguleringsmyndigheder sekvenser (styreenhederne af GRNs) af C. intestinalis, og et ufravigeligt embryonale afstamning med få celler minder om C. elegans. Endvidere sin enestående fylogenetiske position som en hvirvelløse søster gruppe hvirveldyr inden chordater tillader udviklingsmæssige observation, ved cellulær opløsning, den danner chordate krop plan 3-6.

Det centrale spørgsmål, der sikrer den fremtidige succes for funktionel genomforskning i modelorganismer er dannelsen af et stort antal embryoner til kvantitative in vivo forstyrrelser. Udviklingen af mikroinjektion teknik i Ciona æg 7, og muligheden for hurtigt at opnå mange transient transgene dyr ved in vivo elektroporation i hundredvis af Ciona zygoter 8,9 har været et gennembrud i Ciona muliggør et stort antal embryoner, der skal analyseres i en kvantitativ måde, dermed åbne muligheder for en effektiv analyse af forstærkere in vivo og vævsspecifik GAIN- eller tab af funktion tilgange, med mulighed for samtidige manipulationer og analyser. Vi viser yderligere, hvordan Ciona fællesskabsredskaber er brugt til in silico forudsigelse af regulatoriske regioner og effektiv kloning af fuldstændige åbne læserammer (ORF'er) i ekspressionsvektorer. Endelig har vi demonstrere differentiale subcellulære lokaliseringer af fluorescens-mærkedeeller mærket proteiner upon overekspression ved elektroporation.

Protocol

1. Forberedelser til mikroinjektion og Elektroporation i Ciona Æg og Zygoter

  1. Forbered 10 L kunstigt havvand med HEPES (ASWH) til dyrkning af embryoner. Opløs 420 mM NaCl, 9 mM KCI, 10 mM CaCl2 · 2H 2 O, 24,5 mM MgCl2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO4 · 7H 2 O, og 2,15 mM NaHCO3 i dobbelt destilleret vand (Hedeselskabet 2 O) ved omrøring natten over. Tilsæt 5 mM HEPES pH 8,0, og kontrollere / justere pH til 8,0. Opbevar ASWH ved 4 ° C. Varm det op til 18 ° C og filtrere det med filtrerpapir før brug.
  2. Forbered 20x inaktiveret dechorionation løsning: 20% natrium thioglycolat, 1% pronase i ASWH. Indeholde 500 pi prøver ved -20 ° C, og fortyndes til et slutvolumen på 10 ml ASWH før brug.
  3. Forbered 15 til 20 petriskåle for æg / embryoner. Hæld smeltet 1% agarose i ASWH i 3,5, 5, 9 eller 15 cm petriskåle, belægges med en 1-2 mm tyndt lag.Lad agarose størkne og dække pladerne med ASWH. Oplagre dem ved 4 ° C i maksimalt 1-2 uger. Udskift ASWH før brug.
  4. Forbered særlige injektion retter.
    1. Hæld en 5-7 mm tykt lag af smeltet 1% agarose i en 5 cm petriskål, og placere en mug på agarose (såsom en zip lock lukning limet til en plastik dækglas) for at fremstille en fordybning ved størkning af agarosen der kan holde æggene. Forbered 4 til 5 injektion retter og dække med ASWH. Opbevar ved 4 ° C og erstatte med frisk ASWH før brug. Brug kun friske plader til injektion (maksimalt én dag gammel).
  5. Forbered β-galactosidase (LacZ) farvning puffer: 1 mM MgCl2 · 6H 2 O, 3 mM K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] i phosphatpufret saltvand (PBS) med Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 0,05% Tween). Store in mørke ved 4 ° C. Forbered LacZ substrat 5-brom-4-chlor-3-indolyl ß-D-galactopyranosid (X-gal, 10 U / ml) i portioner på 40 mg / ml i dimethylformamid (DMF) og gemme bestande ved -20 ° C indtil brug.
  6. Soak Pasteur pipetter i ledningsvand natten over for at forhindre, at embryoner klistrer.
  7. Forbered kanyler.
    1. Opsæt en mikropipette aftrækker på forhold som varme 425, træk 75, hastighed 75 og tid 200 (fra en glødetråd rampe test af 415).
    2. Træk 4 til 5 filament-holdige glaskapillarer at producere 8 til 10 lange, fine nåle normalt er lukkede på spidsen. Opbevar nåle i et støvfrit nål boks, der er knyttet til dobbelt klæbende tape på en forhøjet støtte, for at undgå at bryde tips, og som er bekvemt for nål påfyldning.
      BEMÆRK: Test de opnåede nåle ved at indsprøjte et par æg med grønne vitale farvestof (som beskrevet i afsnit 6), og juster nålen trækker betingelser for at opnå et tip form, der giver mulighed for finjusteret og repetitive injektion som beskrevet i 6.6.
  8. Forbered injektionsopløsning. Forbered 4 pi af injektionsopløsning, fx sammensat af 1 pi 2 mM MO, 2 pi 10 pg / pl grøn vitale farvestof og 1 pi Hedeselskabet 2 O. Tilføj en slutkoncentration på 0,05-0,5 pg / pl capped mRNA eller 20 ng / pl plasmid DNA ifølge den eksperimentelle spørgsmål. Bland godt. Hold på is, hvis opløsningen indeholder mRNA.

2. Indsamling af mælke

  1. Dissekere Ciona voksne i en 18 ° C afkølet embryo værelse. Bruge en lille saks og starte fra den ende, der modsætter Sifonerne på den side af udånding (kortere) sifon hvorefter æggelederen og sædkanalen løb.
  2. Eksponere æggelederen og delikat lave et snit i æggelederen med spidsen af ​​saksen. Drop den udstrømmende æggene direkte i en 6-brønds plade indeholdende ASWH ved at trykke forsigtigt æggelederen med de lukkede saks stripping off f.eksgs. Overfør resterende æg med en Pasteur-pipette pre-skyllet med ASWH.
  3. Depositum æg fra forskellige dyr i forskellige brønde. Overhold kvaliteten æg under dissekere rækkevidde.
    BEMÆRK: Veludviklet æg er runde og lyserøde til svagt gul i farven. De er omgivet af en ikke-cellulær vitelline pels, chorion, der danner en veldefineret perivitelline rum omkring ægget. Chorion er forbundet med testceller på dens inderside og stjerneformede follikelceller på dens yderside. Æg af lav kvalitet mangler ofte perivitelline rum eller folliklen celler. De synes mindre rund, mere detaljeret eller forskellig farve. Umodne oocytter er mindre og har en sølv hvid farve.
  4. Skær sædkanalen med saksen og indsamle koncentreret sperm i et 1,5 ml rør med en separat Pasteur pipette. Pool sperm fra forskellige dyr (mindst to) i det samme rør. Store sædceller ved 4 ° C i adskillige dage.

3.Befrugtning

  1. Indsamle sæd og æg ved 18 ° C som beskrevet i trin 2.
  2. Aktiver sperm.
    1. Forbered 1 ml ASWH i et 1,5 ml rør og blandes med 50 pi 1 M Tris pH 9,5. Derpå tilsættes 20 ul koncentreret sædceller og forsigtigt blandes ved at vende røret.
    2. Verificere sperm aktivering i en dråbe sperm anbragt på et låg af en lille petriskål eller et objektglas og observere under dissektionsmikroskop. De spermatozoider skal svømme febrilsk.
  3. Tilføj 100-200 ml af det aktiverede sperm opløsning til hver brønd af æg (indeholdende mellem 100 og 1.000 æg), bland godt ved pipettering op og ned, så æggene er flydende i mediet. Vent i 10 minutter uden at flytte embryoner.

4. Dechorionation af æg og embryoner

  1. Fortynd en 500 pi portion af 20x dechorionation løsning på 10 ml i ASWH. Aktiver dechorionation opløsning ved tilsætning dråbevis 200 pi 2.5 M NaOH til 10 ml 1x dechorionation løsning. En mælkeagtig bundfald vil dannes. Bland forsigtigt ved at vende røret.
  2. Indsamle æg eller zygoter (efter 10 min vente i trin 3.3) i glasrør under anvendelse af en Pasteur-pipette. Samle æg fra 2 til 3 dyr i et rør (ca. 1.000-5.000 æg / rør). Sediment med en hånd centrifuge ved spinding ved høj hastighed (1.200 x g) i ca. 20 sek til dannelse af et embryo pellet i bunden af ​​røret. stoppe Langsomt centrifugen og fjern ASWH med en Pasteur-pipette.
  3. Tilsæt 4 ml aktiveret dechorionation løsning på de pelleterede æg / zygoter i hvert rør. Hæng de æg / zygoter ved forsigtigt pipettering dem op og ned ved hjælp af en vand-behandlet hanen Pasteur pipette toppet med en lille gummi pære. Opløsningen skal vende gullig efter 1-3 min.
  4. Følg dechorionation ved at fjerne en lille portion af dechorionating æg / zygote suspension under anvendelse af Pasteur-pipette. Depositum en dråbe på et dias og observere under dissekere sklare. Hold pipettering æg / zygoter op og ned og kontrollere hver 20-30 sek.
    BEMÆRK: Første follicle celler løsnes, så chorion bliver gult og uigennemsigtig, og endelig det løsner fra zygoter. Pink dechorionated æg / zygoter vil synke til bunden af ​​glasrøret. Den dechorionation bør ikke tage mere end max. 5 min.
  5. Fyld glasset med ASWH når 50% af æggene / zygoter er dechorionated.
    BEMÆRK: Meget forsigtigt centrifuge (8 xg) for omkring 10-15 sek, svarende til en meget lav hastighed lige nok til at sedimentere de dechorionated æg / embryoner. stoppe langsomt centrifugen til ikke forstyrrer pellet af æg / zygoter i bunden af ​​røret.
  6. Fjern næsten al væsken fra glasrøret herunder flydende materiale med ufuldstændigt dechorionated æg / zygoter og erstat med ASWH. Langsomt pipetteres op og ned for at vaske og forsigtigt centrifugeres igen som i trin 4.2. Alternativt, vent zygoter at slå sig ned ved hjælp af tyngdekraften. Vask en gang mere, indtil der ikke chorion vragrester er left.
  7. Overfør æg / zygoter til frisk skyllet dyrkningsskåle under anvendelse af en Pasteur-pipette. Hold zygoter (ikke æg) ved lav densitet (ca. 200 embryoner pr 10 cm skål) for at undgå deres stikning sammen. Kultur embryoner til den ønskede scene ved temperaturer mellem 13 og 20 ° C. Alternativt elektroporere zygoter (trin 5) eller injicere de ubefrugtede æg (trin 6).

5. Elektroporation

  1. Gød æggene og dechorionate de zygoter ved 18 ° C som i afsnit 3 og 4. Sørg mellem 50 og 400 æg pr elektroporation prøve.
  2. Forbered 50 pi plasmid-DNA i et 1,5 ml rør (max. 100 ug plasmid-DNA i 50 gl Hedeselskabet 2 O) og tilsæt 200 pi 0,95 M mannitol. Bland godt ved hvirvelblanding.
  3. Forsendelse og alvor sedimentere dechorionated zygoter i siliconiserede 1,5 ml rør. Fjern ASWH ned til 100 pi mærket på røret.
  4. Fortsæt, fortløbende for hver zygote rør som følger: tilføjeDNA / mannitol-opløsning under anvendelse af en Pasteur-pipette. Bland forsigtigt med zygoter og straks tage op DNA / mannitol / zygote suspension og overførsel til en 4 mm elektroporation cuvette.
  5. Placer kuvetten straks i holderen elektroporation og give en enkelt puls på 16 ms ved 50 V.
  6. Fjern zygoter fra kuvetten ved hjælp af den samme Pasteur pipette og sprede dem ud på en kultur skål indeholdende frisk og filtreret ASWH. Pipette de zygoter før de begynder at kløve omkring 1 time efter befrugtning (HPF) ved 18 ° C.
  7. Skyl pipetten mellem prøverne i et bægerglas med ASWH.
  8. Kultur de zygoter ved 15-20 ° C ved lav nok tæthed på omkring 200 embryoner pr 10 cm skål for at undgå deres stikning sammen.

6. Mikroinjektion

  1. Forbered Dechorionated Æg til injektion.
    1. Dechorionate æggene adskilt fra 2-4 dyr, som beskrevet i afsnit 4. Hold ubefrugtede og dechorionated eGGS i separate små agarosecoatet dyrkningsskåle. Vask æggene flere gange i skålene til at fjerne resterne.
    2. Test befrugte små partier af de dechorionated æg (omkring 50) fra hvert individ. Brug en separat 5 cm skål for hvert parti og anvende 2 pi aktiveret sperm (trin 3.2). Bland godt ved at slynge retterne og spredt ud æggene i skålen ved at flytte Skålene sidelæns. Hold sperm og æg sammen i ca. 10 minutter uden at flytte.
    3. Eliminere højst sperm som følger: overføre befrugtede æg til en frisk dyrkningsskål eller skylle to gange med frisk ASWH. Efterlad spaltningen embryoner uforstyrrede indtil 32-celle stadium (ved 18 ° C i ca. 3 timer efter befrugtning). Vælg æg fra den bedste udvikling batch (bedste procentdel af befrugtning og mest regelmæssige spaltning mønster) til mikroinjektion.
  2. Opsæt injektionen Needles.
    1. Efterfylde 4 kanyler i en lodret position for at tillade tyngdekraften flow langs filamentet. Deposit 0,5 pi injektion-opløsning (trin 1.8) indeholdende grønne vitalfarvestof på bagenden af ​​nålene, der er placeret nålespids nedad. Vente for væsken til at fylde nålespidsen i bunden.
    2. Flyt nålene vandret og efterfylde dem med mineralolie med en fin og lang metal eller plast pipettespids. overlay langsomt injektionsopløsningen med mineralolie udstøde alle luftboblerne ved udfyldelse af nålen.
  3. Opsætning af mikromanipulator i en 18 ° C Cooled Room.
    1. Tilslut plastrøret nåleholderens til en 10 ml glassprøjte fyldt med mineralolie. Efterfylde slanger og nåleholderen med olie og uddrive luftbobler.
    2. Stik nålen i nåleholderen og placer holderen på mikromanipulator.
    3. Juster nåleholder bevægelse langs en lige linje med en vinkel på 45 ° i forhold til overfladen.
  4. Vend dechorionated æg langs agarose indrykning af injektionen skålen, således at æggene kan injiceres en efter en under dissektion mikroskop.
  5. Bryd nålespidsen, om nødvendigt ved forsigtigt at skubbe nålen mod agarose eller mod et stykke glas dækglas placeret på agarose. Lidt pres sprøjten knappen for at kontrollere, at nålespidsen er åben (grønne nål indhold vil udvise).
  6. Injicere ubefrugtede æg én efter én ved først at indføre nålen ind i ægget og lidt opsugning at bryde ægget membran efterfulgt af injektion. Injicere grøn injektionsopløsning ind i midten af ​​ægget til højst 1/3 af cellen diameter. (Dette svarer til ca. 30 pl til et æg diameter på 140 um).
  7. Overfør de injicerede ubefrugtede æg til en frisk dyrkningsskål og inkubere dem ved 15-18 ° C indtil befrugtning.
  8. Gød de injicerede æg med frisk aktiveret sperm som i test fertilizations (trin 6.1.2). Eliminatea maksimalt sæden ved at overføre zygoter til en frisk dyrkningsskål. Spredt ud embryonerne og ikke forstyrre dem under spaltningsprodukter etaper (op til 32-celle stadie).
  9. Kultur embryoner til den ønskede fase ved en temperatur mellem 13 og 20 ° C.
  10. Indsamle embryoner ved omrystning dem i midten af ​​pladen og overføre dem til siliconiserede 1,5-ml rør. Fix og plet, eller montere (trin 7 og 8).
  11. Sammenligne de opnåede fænotyper til kontrol- injicerede embryoner.
    BEMÆRK: Injicer en anden, ikke-overlappende MO der retter sig mod samme afskrift at opnå identiske fænotyper. Redde den specifikke MO fænotype (r) med en modificeret mRNA, der koder din protein af interesse, men som ikke er anerkendt af MOS. Sprøjt en kontrol MO, der giver nogen fænotype.

7. LacZ Farvning

  1. Saml embryoner på et ønsket tidspunkt i silikonebelagte 1,5 ml rør og løse dem i 0,2% glutaraldehyd i 1 ml ASWH i 15til 30 maksimum min.
  2. Wash 2x 10 min med 1 ml 1x PBT.
  3. Skyl en gang i 500 pi LacZ-farvning buffer. Erstat med X-Gal-substrat suppleret 1 ml farvning puffer (anvend 10 pl / ml 40 mg / ml X-Gal lager). Overfør embryoner i en plade med 12 brønde for bedre observation af farvning.
  4. Der inkuberes i mørke. Varierer inkubation fra 0,5 time til natten over ved 4 ° C, ved stuetemperatur eller ved 37 ° C afhængigt af styrken af ​​driveren udtrykker LacZ.
  5. Vask embryoner op til 4 gange i 1 ml 1X PBT for at fjerne farvning buffer.
  6. Post-fix i 10 minutter ved stuetemperatur med 2% paraformaldehyd (PFA) i 1 ml 1x PBT eller 0,2% glutaraldehyd i 1 ml 1x PBT for fortolkning og visualisering af de farvede embryoer.

8. Montering af fluorescens Labelled Wmbryos

  1. Fix de embryoner af en ønsket udviklingsstadiet i 20 minutter i 2% PFA i en ml ASWH.
  2. Vask embryoner 2x i 1 ml 1x PBT. Undgå lys udstillingerure ved at holde embryoner i mørke omgivelser.
  3. Overfør op til 50 embryoner til et dias. Fjern maksimalt PBT først med en pipette og omhyggeligt med køkkenrulle.
  4. Tilføj 20-25 pi monteringsmedium.
  5. Tilføj et dækglas ved at placere den i en vinkel (fra den ene side først), og langsomt sænke den med en spids genstand (nål, pincet, pipettespids) at undgå bobler indtil prøven er dækket. Fastgør dækglasset på kanterne ved hjælp prikker af en gennemsigtig neglelak.
  6. Forsegle hele dækglasset med en neglelak efter tørring. Opbevares mørkt ved -20 ° C.

Representative Results

Mikroinjektion for gen-regulatoriske netværk undersøgelser

Embryoner af søpung Ciona intestinalis er velegnede til gen-funktionelle eller gen-regulatoriske undersøgelser på cellelinie niveau og med cellulær opløsning. mRNA, mos eller etiketter kan mikroinjiceres ind i befrugtede æg eller i individuelle blastomeres efter befrugtning. MO medieret gen knockdown hjælp af mikroinjektion teknik er beskrevet i trin 6. MOS specifikt retter sig mod mRNA af udvalgte gener og forhindre deres oversættelse til protein. MO medieret tab af funktion (LOF) af udviklingsmæssige gener ændrer udtryk for en bred vifte af downstream gener, samlet afslører et indblik i den embryonale GRN 10. Sådanne analyser Ciona forudsat den første hele embryo regulerende blueprint i et metazo 11. Figur 1 viser et eksempel på, hvordan microinjectipå blev anvendt til at undersøge opstrøms regulering af ekspressionen af det konserverede Ci -Myelin Transcription Factor (Ci -MYT) på gastrula fase af Ciona embryoer. Overvåget af in situ hybridisering (ISH), endogen udtryk (figur 1a, skematiseret i figur 1a ') er observeret i de 6-rækken neurale plade forstadier, af især hjernen (rækker III / IV, i rødt) og rygmarven ( rækken i, grøn). Desuden blev Ci -MYT opstrøms regulering analyseret ved MO injektion målretning flere faktorer, der udtrykkes i eller tilstødende til neurale forstadier før Ci -MYT ekspression indtræden (figur 1b-g). MO knockdown af tidlige embryonale faktorer, såsom Forkhead boksen Aa (Foxa-a) transkriptionsfaktor og fibroblastvækstfaktor 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (figur 1b eller 1c henholdsvis) eliminerer overordnede Ci -MYT udtryk. Andre transkriptionsfaktorerkun delvist påvirker Ci -MYT ekspression resulterer i MO-medieret nedregulering i en undergruppe af hjernens forstadier (blå pilespidser i fig 1d, f og g). Omvendt er Ci -MYT udtryk ektopisk aktiveres ved nedregulering af Nodal (figur 1e, rød pilespidser), hvilket tyder på, at Nodal normalt undertrykker Ci -MYT udtryk i disse laterale nerve ledning forstadier.

Elektroporering til effektiv gen funktionelle og enhancer undersøgelser

Elektroporation af plasmid DNA ind Ciona zygoter er en effektiv metode til transient transgenese og efterfølgende observation af fænotypiske ændringer in vivo. I modsætning mikroinjektion af mRNA, elektroporering tillader vævsspecifik overekspression, i hvilket gen kodende regioner (ORF'er, åbne læserammer) udtrykkes under kontrolaf væv specifikke drivere. Disse udgør normalt cis reguleringsmyndigheder regioner af kendte gener (såsom Brachyury enhanceren til ekspression i rygstrengen forstadier 8). Omvendt elektroporering er medvirkende til effektiv analyse af hidtil ukendte regulatoriske regioner, hvor reportergener (lacZ eller grønt fluorescerende protein GFP) afsløre deres aktivitet in vivo. Arbejdsgangen for identifikation og efterfølgende elektroporering medieret analyse af et sådant hidtil ukendt regulatorisk region (for Ci -MYT) er vist i figur 2.

Et stort repertoire af Ciona community data, let tilgængelige i søpung specifikke genom browsere 12,13, ligesom søpung Netværk for In situ Expression og embryologiske data (anisfrø) 23, inspiceres for i silico identifikation af regulatoriske regioner (Figur 2A). Efterfølgende polymerasekædereaktion (PCR) baseret kloning af disse regioner i ekspressionsvektorer tillader elektroporering medieret testning in vivo. (Figur 2B). Genomet browser skærmbillede i Figur 2A viser regionen opstrøms for KH udskrift model for Ci -MYT (første tre exoner, i orange, og to introner er synlige). Forskellige genom browser spor anmærke funktionelle genomdata forudsagt for denne region, såsom kromatin immunpræcipitering (chip) data 14 (her vist for ZicL, Ci -zinc finger af lillehjernen L), bevaring sekvens mellem to beslægtede Ciona arter 15,24 eller nukleosom belægning 16,17 (fra top til bund i figur 2A). Generelt er exon protein kodende regioner særdeles konserveret (justering spor i figur 2A). Yderligere høj bevaringsværdi toppe vises i ikke-kodende områder opstrøms og i den første intron. To af disse forventes at være nukleosom fri enccording til en sekvens baseret algoritme 16,17 (røde rammer i figur 2A), hvilket tyder tilgængelighed til transkriptionsfaktorer. Faktisk er Chip-on-chip signaler 14 til Ci -ZicL transskriptionsfaktorbindende (grønne søjler i figur 2A) beriget med disse to konserverede områder. Endvidere ved anvendelse af en grænseflade 25, der søger efter potentielle transcriptionsfaktor bindingssites, vi identificeret zic lokaliseret i genomet sekvenser markeret med Ci -ZicL Chip klynger (orange pile og sekvenser med understregede ZIC-kerne, figur 2A). Bindingen af Ci -ZicL transskription faktor i bevaret og forudsigeligt nukleosom gratis regulatoriske regioner af Ci -MYT er i overensstemmelse med nedregulering af Ci -MYT udtryk observeret i MO-injektion medierede Knockdown eksperimenter rettet ZicL (figur 1d).

efter afskrækkeminedrift potentielle cis reguleringsmyndigheder regioner i silico for Ci -MYT ekspression, er disse PCR amplificeret fra Ciona genomisk DNA og indsat ved rekombination kloning i LacZ reporter plasmider 19. Konstruktionerne derpå elektroporeret i befrugtede Ciona æg (figur 2B) og analyseret for deres aktivitet med LacZ-farvning (figur 3).

Figur 3 viser, at ved en sådan in silico tilgang var det muligt at identificere to særskilte cis reguleringsmyndigheder sekvenser, rekapitule- Ci -MYT mRNA-ekspression domæner (sammenlign figur 1a). Generelt transient transgene embryoner elektroporeret med plasmid-DNA show mosaik ekspression i kun de celler der har inkorporeret DNA. Mosaic LacZ-ekspression er således drevet af pmyt-R3 og kan findes i alle de prækursorer, der også udtrykker Ci (figur 3a, b, lilla og røde pil hoveder, henholdsvis). I modsætning hertil pmyt-R5 er kun aktiv i posterior (række I) neurale plade prækursorer og starter ved senere neurula stadium (figur 3c, røde pilespidser). De to regioner således indkode to separate rumlige og tidsmæssige aspekter af Ci-MYT genregulering. Interessant begge regulatoriske regioner også plette yderligere forstadier ikke set i ISH, især i den forreste og laterale neurale plade og i muskler (figur 3a, b, pink, hvid og gul pilespidser, henholdsvis). En sådan bredere udtryk kan pege på undertrykkende elementer, der ikke er indeholdt i de isolerede regulatoriske fragmenter (såsom Nodal der undertrykker lateral neural skæbne, se figur 1e) eller for lave ekspressionsniveauer detekteret med akkumulerendeLacZ enzymatisk signal.

Foruden enhancer undersøgelser, elektroporering i Ciona letter også de funktionelle analyser af Ciona kodende gener ved deres overekspression. En stor samling af Ciona fuld længde ORF'er er til rådighed for samfundet, og blev desuden kommenteret for humane ortologer, herunder sygdom-associerede gener 18. Individuelle gener eller grupper af gener fra denne rekombination-kloning kompatibel fuld ORF cDNA bibliotek (figur 2B) er let overføres til destination vektorer indeholdende relevante drivere skal udtrykkes i fostre. Resulterende udtryk kloner kan endvidere co-elektroporeret med cis reguleringsmyndigheder reporter-konstruktioner at teste deres formodede rolle i enhancer-aktivering. Figur 2B illustrerer isoleringen af fuld ORF kloner for transkriptionsfaktorer Ci -ZicL og CI- GATAa og deres recombination i adapterede destination vektorer, der kan indeholde translationelle tags 19 (f.eks grønt fluorescerende Venus eller viral hemagglutinin (HA) -tagget) og et væv bestemt driver såsom Friend Of Gata regulatoriske region (pfog driver) for tidlig pan-ectodermal udtryk 15 anvendes i den foreliggende undersøgelse. Effekten af Ci -ZicL overekspression i ektodermale og neuroektodermale væv blev analyseret ved co-elektroporering af pmyt-R3> LacZ og pmyt-R5> LacZ reportere (figur 3b ', b' 'og c', c '', henholdsvis). Vores elektroporation analyser tyder på, at Ci -ZicL kan aktivere Ci -MYT udtryk gennem pmyt-R3 og pmyt-R5 forstærker regioner som både reporter konstruktioner viste ektopisk LacZ udtryk i ektodermale regioner (grønne pilespidser i figur 3b ', b' 'og c &# 39;, c '',). Som vist i figur 3d, elektroporering af plasmid-DNA i hundredvis af Ciona æg muliggør statistisk relevant kvantificering af ekspressionssystemer ændringer, illustreret for ektopisk pmyt-R3> LacZ-ekspression ved koncentrationsafhængig, pan-ektodermal Ci -ZicL ekspression.

Elektroporering til in vivo subcellulære lokalisering

Figur 4 afbilder den subcellulære lokalisering af taggede transkriptionsfaktorer, når de udtrykkes ved elektroporering i ektodermale blastomeres hjælp tilpassede ekspressionskonstruktioner (skematiseret i figur 2B). Af C-terminalt tagging transkriptionsfaktorer (såsom Ci -GATAa) med en Venus tag (figur 4b) eller en HA-tag (figur 4c) og overudtrykker dem i ektodermale væv (pfog) Kunne vi observere, at in vivo, "Ci -GATAa er hovedsagelig lokaliseret til kerner, som forventet for en transskriptionsfaktor, hvorimod Venus ekspression er allestedsnærværende, herunder cytoplasmaet. kan udføres lignende forsøg for at studere dynamikken i subcellulære lokalisering over tid, af individuelle eller kombinationer af transkriptionsfaktorer, eventuelt afsløre deres co-lokalisering med forskellige mærker.

figur 1
Figur 1:. Vurdering Ci -MYT regulering ved mikroinjektion i Ciona æg Ci -MYT mRNA-ekspression i WT og Morpholino (MO) injicerede embryoner. (A) WT ekspressionsmønsteret for Ci -MYT i den neurale plade. (A ') Skematisk fremstilling af farvede forstadier i neurale plade (NP). Række I / II: posterior neural skæbne; række III / IV: anterior neural skæbne; rækken V / VI: Palpe skæbne. ( .. g> b - g) Ci -MYT udtryk ved mikroinjektion af forskellige MoS for banker ned angivne gener, der deltager i den tidlige Ciona GRN (billeder tilpasset fra Imai et al, 2006) 11 Ci -MYT, Ci -myelin transskription faktor; WT, vildtype; blå pilespidser: tab af Ci -MYT signal; røde pilespidser: ektopisk Ci -MYT signal. Scale bar = 100 um henviser til alle billeder. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Workflow i silico søgen efter enhancerregioner og rekombination kloning for forbigående transgenese ved elektroporation i Ciona embryoner (A) Et snapshot fra anis 23 Ascl.dian genom browser identificerer opstrøms regulatoriske sekvenser af Ci - MYT. Røde rammer markerer to potentielle cis reguleringsmyndigheder regioner, pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) og pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041), der blev udvalgt til analyse ved elektroporation. Navne på sporene: ZicL sonder: Chip-on-Chip-data 14; KH2012 Udskrifter: Ciona intestinalis udskrift modeller; Justering Score Cs / Ci LastZ: bevaring sekvens mellem Ciona savignyi (Cs) / Ciona intestinalis (Ci) 15,24; . Segal 2006 forudsagde nukleosom belægning version 1: chick trænet beregningsmæssige algoritme af Segal et al, 2006 16 anvendt på Ci som i Khoueiry et al, 2010 17 Grønne søjler:.. Ci -ZicL chip Peaks 14; appelsin pile: forudsagde Zic sites; GCTG: core ZIC bindingssted. (B) Ordning for generering overekspression konstruktioner fra en Kommen ORF af fuld længde cDNA bibliotek, rekombineret til destination vektorer indeholdende vævsspecifikke drivere (pfog) og protein tags efterfølgende co-elektroporeret med reporterkonstruktioner (såsom pmyt-R3> LacZ eller pmyt-R5> lacZ) til in vivo udlæsning Ci. - MYT, Ci -myelin transskription faktor Ci -ZicL, Ci -Zinc finger af lillehjernen L transskription faktor. pfog, regulatoriske region Ci -Friend af GATA klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: elektroporeres Ciona embryoner viser Ci -ZicL inducerbare spatio-temporale cis -forordning af Ci -MYT LacZ farvede embryoner medio gastrul.en (MG) / sen-gastrula (LG) eller tidlig neurula (en) fase vises der blev co-elektroporeret med enten pmyt-R3> LacZ eller pmyt-R5> LacZ og en kontrolgruppe konstruktion (pfog> mCherry) eller pfog> ZicL. Den pfog driver 19 medierer ektopisk (pan-dyr) ZicL udtryk i ektoderm og neuroectoderm og forårsager ektopisk LacZ plet i disse celler. (A) pmyt-R3 LacZ aktivitet i mg / NLK embryoer (små pilespidser, venstre panel) eller i tilsvarende farvede skematiske territorier (blå cirkler, højre panel); vegetabilsk visning (vg). Række I / II: posterior neural skæbne; Række III / IV: anterior neural skæbne; Række V / VI: Palpe skæbne. (B) pmyt-R3 aktivitet ved EN stadier i væv som i en. (B ') Ektopisk pmyt-R3 aktivitet ved Ci -ZicL co-elektroporation er angivet med grønne pilespidser. (B ') Samme embryoner som i b', orienterede dyr pole op (en). ( pmyt-R5 LacZ aktivitet ved EN stadier (c) Ektopisk pmyt-R5 aktivitet på Ci -ZicL co-elektroporation er angivet med grønne pilespidser. (C ') Samme embryoner som i c' men orienteret dyr pæl op (en). (D) Kvantificering af repræsentative eksperimenter for Ci -ZicL over-aktivering pmyt-R3 ved lave koncentrationer. Et biologisk gentagelse er repræsenteret Ci -MYT, Ci -myelin transskription faktor. Ci -ZicL, Ci -Zinc finger af lillehjernen L transskription faktor Ci -tåge, Ci -Friend Gata; WT, vildtype; mg, mid-gastrula; LG, sene-gastrula; eN, tidlig neurula; et dyrs visning; vg, vegetabilsk view; NLS LacZ, kernelokaliseringssignal for LacZ. Scale bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4:. Differential subcellulære lokalisering af proteiner ved elektroporation Lokalisering af Venus-mærket eller Hemagglutinin- (HA) -mærket proteiner overudtrykt i ektodermale celler ved hjælp af pfog driver 19. (A - c) DIC-billeder. (A ', b') Tilsvarende fluorescens billeder. (C ') Tilsvarende fluorescens billede på immun histologisk mærkning med TRITC. Scale bar = 100 um refererer til alle billeder. DIC, Differential Interference Contrast. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Der er to store teknikker til at danne transgene Ciona embryoner: mikroinjektion af RNA eller DNA og elektroporation af DNA. Disse teknikker til gen-forstyrrelse i Ciona embryoer blev først brugt i 1990'erne 7,8 og fra da af successivt forbedret, og nu udnyttes i Ciona (og andre søpung slægter) 20 på verdensplan.

Kritiske trin i protokollen

Vellykket transgenese i Ciona kønsceller, som er let indsamlet fra voksne dyr afhænger af en række kritiske faktorer. Kvaliteten af ​​kønsceller afhænger af gydeperioden (generelt fra maj til december i det nordlige Atlanterhav, skiftende med vand temperatur og iltning), på havet vandkvaliteten i de akvarier (ved korrekt saltholdighed, voksne forblive sunde i 2-4 uger) og endelig på korrekt håndtering af kønsceller upon udtræk fra voksne, som beskrevet nedenfor for de forskellige trin iprotokol.

Under forberedelse trin, vil inkubere Pasteur-pipetter med postevand forhindre embryoner fra stikning og havvand præ-inkubering af agarose belagt petriskåle vil fjerne giftige stoffer frigives fra agarose. Generelt kan retter fremstilles op til 2 uger før anvendelse, opbevaret ved 4 ° C for at undgå bakterievækst og skylles umiddelbart før anvendelse. En dag gammel, små retter synes bedst for injektioner.

Effektivitet og længden af ​​dechorionation er et afgørende skridt i protokollen, som forlænget behandling af æg / embryoner vil skade udviklingen. Omhyggelig forberedelse (ingen rystning) og korrekt opbevaring (ved 4 ° C i op til en uge) bevare kvaliteten af ​​den dechorionation opløsning. Proteaser i løsningen mister effektivitet, hvis enten blandet alt for voldsomt på forberedelse eller over tid, især hvis de opbevares ved stuetemperatur i længere timer / dage. Vi har optimeret denne kritiske skridt ved at bruge frisk dechorionation løsning bekvemtfremstillet ud fra frosne alikvoter af 20x stamopløsning.

Korrekt håndtering af skrøbelige dechorionated æg / embryoner er afgørende, og klipning eller stikkende af embryoner mens pipettering vil være skadelig. Når pipettering, er embryoner opretholdes så meget som muligt i suspension (ved forsigtigt "blæse" flydende til at hvirvle dem op efterfulgt af glat men hurtig pipettering), mens du holder glaspipette i lodret snarere end vandret. Sådan pleje gælder for alle pipetteringstrin til vask, resuspension og overførsel æg / embryoner i og ud af rør, skåle eller plader, før og efter fiksering. Efter fiksering, bør særlig forsigtighed også tages til separate Afpipetteringsudstyr til levende versus faste embryoer for at undgå enhver toksicitet fra resterne af fikseringsmidler.

Mikroinjektion er temmelig tricky i Ciona æg / embryoner på grund af deres lille størrelse og modstandsdygtighed vitellinmembranen og kritisk afhængig af en optimeret spids størrelseinjektionsnålen, en perfekt vinkel på injektion (nålens bevægelse i en linje, langs radius æg) og en fintunet, manuel brydning af vitellinmembranen (ved sugning før aspiration til injektion). Sidstnævnte er kun mulig, hvis der helt fjernet luftbobler fra injektion rør, som indeholder mineralolie til udjævning af suge- / injektionstrykket. Desuden vil de mindste stykker af støv eller æg snavs tilstoppe nålen, og er let undgås ved rene arbejdsforhold og skylletrin for æg før overførsel af injektion skålen. Indlæg injektion, vil overførslen af ​​æg på friske retter undgå toksiske virkninger fra døde fostre ikke har overlevet injektionsproceduren.

Fejlfinding

Potentielle problemer i proceduren kan løses ved følgende løsninger. Lave befrugtning priserne kan skyldes utilstrækkelig sperm aktivering, lav æg renlighed eller store befrugtning mængder. Brug freshly samlet og mindre fortyndede sæd. Kontroller sperm bevægelse ved aktivering. Vask æg med ASWH før befrugtning som beskrevet i trin 4.2. Reducer vandmængde og reducere mængden af ​​æg pr befrugtning fad / brønd. Mister embryoner under trinnene forberedelse kan undgås ved at tilsætte en dråbe dechorionation løsning mere effektivt centrifugeres ned undechorionated æg / embryoner. Dechorionation tid bør optimeres som delvist dechorionated æg vil ikke sediment og langvarig dechorionation er giftigt, hvilket får embryoner til at eksplodere.

Asynkron udvikling kan skyldes resterende sperm frigivet under dissektion. Hold ægget batches adskilt fra forskellige dyr for at undgå ukontrolleret krydsbefrugtning. Unormal udvikling kan have forskellige årsager. Ved begyndelsen og slutningen af ​​sæsonen, efter ophold embryonet fra forskellige individer adskilte, kan udvælges de bedste batches. Undgå forstyrrende embryoner til10 min, der følger befrugtning for at undgå at forstyrre deres ooplasmic adskillelse. Sørg for, at embryoner ikke startede dividere mens der overføres som pipettering adskiller søster blastomeres og resultater i delvise embryoner. Brug mindre sæd til dechorionated æg for at undgå polyspermi. Der benyttes frisk fremstillede, men skyllet agarose retter. Sørg for, at pipettering enheden er fiksativ gratis. Holde kontrol embryoer, der ikke blev dechorionated og ikke elektroporerede at detektere, på hvilket trin udvikling blev afbrudt. Supplere embryoner med antibiotika, hvis forurening og nedbrydning finder sted.

Hvis injektionen enheden har "tilstoppet" kanylen åbning kan kontrolleres ved at udstøde nogle af sine farvede indhold. Tilstopning materiale kan tørres af ved forsigtigt at trække nålespidsen gennem agarose. Luftbobler i injektion slanger og / eller nål bør fjernes. Skift nålen for bedre kontrol af injektionen volumen som den needle tip knækker, eller tilstoppe langs injektion. Skyl æggene og læg dem i en ren indsprøjtning skål, hvis der er støv i fadet. Centrifugere før fyldning friske nåle for at sedimentere alle små partikler eller krystaller injektionsvæsken. Også nyttigt øver injektion med vital farvestof. Kontroller injektionsteknik ved gødskning injicerede og ikke-injicerede æg. Endelig kan rådføre sig med en erfaren kollega være nyttigt at forbedre injektionsteknik.

For at kontrollere for off-target effekter en anden ikke-overlappende MO og redning med en modificeret mRNA, der ikke er anerkendt af MOS kan trofast udelukke uspecifikke fænotypiske effekter i Ciona.

Mikroinjektion: betydning og begrænsninger

Mikroinjektion i Ciona blev anvendt til at generere den første plan for en hel embryo gen regulatoriske netværk (GRN) i en chordate 11. Men på trods af en sådan remarkable præstation, mikroinjektion i Ciona embryoer har begrænsninger på grund af den relativt lille størrelse (0,14 mm i diameter) af Ciona æg. Sammenlignet med de andre chordate arter, hvor fremmed DNA / mRNA indført ved mikroinjektioner, Ciona æg er forholdsvis vanskelige at håndtere, og hastigheden af injicerede Ciona embryoner pr eksperiment fortsat lav (i gennemsnit 30 til 50 embryoner pr eksperiment), hvilket hæmmer kvantitative analyser. Ikke desto mindre, for forstyrrende maternelle faktorer i Ciona, mikroinjektion af MOS den foretrukne metode også for at studere deres involvering i zygotisk indsættende udvikling fra 16-32 celle iscenesætter 15. Desuden er det muligt, selvom meget vanskeligere at microinject individuelle blastomerer op til 16-32 celle stadiet. Endelig mikroinjektion fortsat den mest effektive teknik til frembringelse af transgene embryoner (ved mRNA eller DNA-injektion) i andre end Ciona søpung arter, for hvilke fuldt optimized elektroporation protokoller ikke eksisterer.

Elektroporation: betydning og begrænsninger

For at overvinde de lave numre og andre begrænsninger mikroinjektion, har de fleste af de Ciona samfund anvendte elektroporation af plasmid-DNA, da det blev udviklet og udgivet som en optimeret og standardiseret protokol ved Zeller et al. I 2004 9. Faktisk tusindvis af transgene Ciona embryoner kan genereres inden for en time med op til 500 embryoner samtidigt elektroporeret i en kuvette ved anvendelse af en enkelt 50 V puls på 16 msek. Tilgangen til at generere massive antal af transgene embryoner er stadig unik blandt chordate modelorganismer. Dette havde ført Ciona at blive hurtigt anerkendt som en kraftfuld model system til at udføre in vivo analyser af potentielle cis reguleringsmyndigheder regioner og cellulære / subcellulære lokalisering, som eksemplificeret her.

selvom electroporatipå i Ciona zygoter har fundamentalt revolutioneret chordate GRN forskningsfelt, ikke desto mindre står teknikken nogle grænser. Først plasmider transient indføres i Ciona embryoner og er mest sandsynligt nedarves som ekstrakromosomale arrays, hvilket gør stabiliteten af elektroporerede plasmid-DNA spekulative. Desuden er det meget vanskeligt, måske endda umuligt, at kontrollere kopier af elektroporerede plasmider der vil blive taget op pr zygote, hvilket resulterer i fænotypiske udsving. Et yderligere problem, som gør det vanskeligt at fortolke elektroporation resultater er et fænomen, som vi kalder mosaicisme. Elektroporeret plasmid-DNA kan optages i forskellige positioner af den ene-celle stadium foster; som bestemmer, hvilke og hvor mange kvartaler af zygote vil modtage plasmid skal arves af de efterkommer blastomeres. Sådanne variationer klart gøre fortolkningen af ​​kvantitative virkninger vanskeligere. Men de fleste problemer, der kommer, med electroporation variabilitet løses ved en passende mængde af biologiske prøver, med optælling og statistik LacZ (eller GFP) positive celler, som er let tilgængelige i ét parti.

Alsidighed og potentiale elektroporation for genteknologi

Elektroporation sidst giver mulighed for mid-throughput screening af potentielle cis reguleringsmyndigheder regioner og kvantitative analyser af genfunktion engang klonet ind reporter eller ekspressionsplasmider. På grund af den kompakte Ciona genom, identificere og kloning af potentielle regulatoriske regioner er forholdsvis ligetil 3. En strategi for at bruge den rigdom af fællesskab data demonstreres i figur 2A. Kloning af reporter og genkodende plasmider lettes yderligere ved at danne Ciona tilpasset, GATEWAY kompatible vektor suites 19 og et kompatibelt ORF af fuld længde bibliotek 18. Begge værktøjer er tilgængelige for samfundet ogmulighed for effektiv, restriktionsenzym-fri rekombination af regulatoriske drivere og kodende regioner, som vist i figur 2B.

I de senere år blev elektroporation held tilpasset for at opnå væv målrettet genmanipulation med plasmider, der udtrykker gen redigeringsværktøjer ligesom CRISPR / Cas9 komponenter under kontrol af væv specifikke drivere 21,22. Sådanne tilgange vil hurtigt fremme vores forståelse af dynamikken i GRNs og de potentielt bevarede signalsystemer mekanismer, herunder transskription faktor koder er involveret i dannelse væv og den trinvise exit fra pluripotens. Desuden vil vævsspecifik underskudsgivende eller få af funktion tilgange (efter CRISPR / Cas9 eller ved overekspression) under anvendelse af elektroporation være medvirkende til at studere Ciona orthologer af humane sygdomsassocierede gener. Faktisk kataloger for Ciona orthologer af humane sygdomsgener og deres fulde længde ORF kodning kloner er let tilgængle til analyse i Ciona 1 8. På grund af de genomet brede gentagelser i hvirveldyr, de fleste menneskelige gener besidder funktionelt overflødige paraloger som komplicerer analyser af genfunktion en. Ciona være et enklere system med den typiske chordate væv arrangement i larver skal afdække grundlæggende roller så vigtige, ofte funktionelt bevarede gener.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab with constant temp. (~18 °C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC - Station Biologique,
Roscoff, France
For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic Petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1 M pH 9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12 hr
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5 ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2 ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K4Fe(CN)6•3H2O Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5 mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
anti-HA tag antibody abcam ab9110 for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT
TRITC goat anti-rabbit antibody Jackson 111-025-144 for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120, (1), 125-133 (1994).
  2. Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (8), 4437-4440 (1998).
  3. Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298, (5601), 2157-2167 (2002).
  4. Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19, (7), 376-381 (2003).
  5. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439, (7079), 965-968 (2006).
  6. Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332, (1), 48-60 (2009).
  7. Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux's Arch Dev Biol. 203, (1-2), 104-112 (1993).
  8. Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124, (3), 589-602 (1997).
  9. Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74, (74), 13-30 (2004).
  10. Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30, (3), 103-106 (2001).
  11. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, (5777), 1183-1187 (2006).
  12. Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20, (10), 1459-1468 (2010).
  13. Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. (2015).
  14. Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137, (10), 1613-1623 (2010).
  15. Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134, (22), 4023-4032 (2007).
  16. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, (7104), 772-778 (2006).
  17. Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20, (9), 792-802 (2010).
  18. Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404, (2), 149-163 (2015).
  19. Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2, (9), e916 (2007).
  20. Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21, (15), 1308-1313 (2011).
  21. Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56, (7), 499-510 (2014).
  22. Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141, (21), 4115-4120 (2014).
  23. ANISEED, Free Software Foundation Inc.,. Available from: http://www.aniseed.cnrs.fr/v3 (2007).
  24. VISTA, 1997-2013 The Regents of the University of California. http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml (2013).
  25. Genomatix Inc. http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl (2013).
Embryo Mikroinjektion og Elektroporering i Chordatzoologi<em&gt; Ciona intestinalis</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).More

Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter