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Developmental Biology

भ्रूण Microinjection और electroporation कोरडेट में doi: 10.3791/54313 Published: October 16, 2016

Summary

हम Ciona intestinalis, रीढ़ को एक कोरडेट बहन समूह, microinjection और electroporation तकनीक का प्रयोग करने में क्षणिक transgenesis और जीन पछाड़ना प्रस्तुत करते हैं। इस तरह के तरीकों इस सरल अकशेरुकी कि रीढ़ की अल्पविकसित विशेषताओं, पृष्ठदंड और सिर संवेदी epithelia, और मानव रोग जुड़े जीन के कई orthologs सहित सुविधाओं में कार्यात्मक जीनोमिक्स की सुविधा।

Introduction

हाल ही में, जीनोम अनुक्रम और लिखित जीन repertoires मॉडल जीवों की संख्या में सुलभ हो गए हैं। जीन कार्यात्मक लिंक निर्धारण, तथापि, और कैसे इन कनेक्शनों डीएनए भ्रूण समय और अंतरिक्ष में ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधियों को अंजाम में hardwired हैं, विशेष रूप से रीढ़ में एक बड़ी चुनौती बने हुए हैं। नियामक बातचीत की जटिलता और जीनोम 1,2 की जटिलता, विशेष रूप से रीढ़ में, विवो में डीएनए के स्तर पर कुशल कार्यात्मक विश्लेषण, विशेष रूप से धीमा। दरअसल, कोई GRN वर्तमान में अंतिम, विकासशील जीव की टर्मिनली विभेदित राज्य के निषेचन से विश्लेषण किया है।

Ascidian सी intestinalis एक मॉडल जीव जहां इस तरह पूरा GRN विश्लेषण संभव हो सकता है प्रतिनिधित्व करता है। यह एक unduplicated जीनोम थोड़ा जीन अतिरेक के साथ अकशेरुकी की खासियत है। रीढ़, इसके विपरीत में जीनोम दोहराव कि हवलदार के दो दौर से गुजरा हैई बड़ा जीन परिवारों और कार्यात्मक विविधीकरण लेकिन यह भी paralogs के बीच अतिरेक उत्पन्न। कॉम्पैक्ट सीआईएस -regulatory दृश्यों (GRNs की कंट्रोल यूनिट) सी के intestinalis, और कुछ कोशिकाओं के साथ एक अचल भ्रूण वंश सी की याद ताजा करती हैं एलिगेंस। इसके अलावा, Chordates भीतर रीढ़ को एक अकशेरुकी बहन समूह के रूप में अपनी अनूठी वंशावली स्थिति विकासात्मक अवलोकन की अनुमति देता है, सेलुलर संकल्प पर, बनाने कोरडेट शरीर योजना 3-6 की।

मुख्य मुद्दा यह है कि मॉडल जीवों में कार्यात्मक जीनोमिक्स के भविष्य की सफलता सुनिश्चित करता है मात्रात्मक इन विवो perturbations के लिए भ्रूण की बड़ी संख्या की पीढ़ी है। Ciona अंडे 7 में microinjection तकनीक, और संभावना जल्दी Ciona के सैकड़ों की संख्या में इन विवो electroporation द्वारा कई क्षणिक ट्रांसजेनिक जानवरों प्राप्त करने के लिए के विकास युग्मनजों 8,9 में एक सफलता कर दिया गया है Ciona के निषेचित अंडे में electroporation एक मात्रात्मक फैशन में विश्लेषण किया जा भ्रूण की बड़ी संख्या के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार इन विवो में और ऊतक विशेष gain- या समारोह दृष्टिकोण घाटे के enhancers के कुशल विश्लेषण के रास्ते खोलने के साथ एक साथ जोड़तोड़ और विश्लेषण के लिए संभावना है। हम आगे कैसे प्रदर्शित Ciona समुदाय उपकरण विनियामक क्षेत्रों और पूर्ण खुला पढ़ने फ्रेम (ORFs) अभिव्यक्ति वैक्टर में कुशल क्लोनिंग की सिलिको भविष्यवाणी में के लिए उपयोग किया जाता है। अंत में, हम को प्रदर्शित अंतर subcellular स्थानीयकरण के fluorescently टैगया electroporation द्वारा overexpression पर प्रोटीन लेबल।

Protocol

1. Microinjection और electroporation Ciona अंडे और युग्मनज में लिए तैयारी

  1. भ्रूण के संवर्धन के लिए HEPES (ASWH) के साथ 10 एल कृत्रिम समुद्री जल को तैयार है। भंग 420 मिमी NaCl, 9 मिमी KCl, 10 मिमी 2 CaCl · 2H 2 हे, 24.5 मिमी 2 MgCl · 6H 2 हे, 25.5 मिमी MgSO 4 · 7H 2 हे, और 2.15 मिमी 3 NaHCO दोहरा आसुत जल में (DDH 2 हे) रात भर सरगर्मी से। 5 मिमी HEPES पीएच 8.0 जोड़े, और सत्यापित करें / 8.0 पीएच को समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर ASWH स्टोर। 18 डिग्री सेल्सियस के लिए यह गर्म और फिल्टर पेपर के साथ यह फिल्टर का उपयोग करने से पहले।
  2. 20% सोडियम thioglycolate, ASWH में 1% pronase: 20x निष्क्रिय dechorionation समाधान तैयार है। -20 डिग्री सेल्सियस पर 500 μl aliquots स्टोर, और उपयोग करने से पहले 10 मिलीलीटर ASWH के अंतिम मात्रा को पतला।
  3. अंडे / भ्रूण के लिए 15 से 20 संस्कृति व्यंजन तैयार करें। 3.5, 5, 9 या 15 सेमी पेट्री डिश में ASWH में पिघल 1% agarose डालो, उन्हें एक 1-2 मिमी पतली परत के साथ कोटिंग।agarose जमना और ASWH साथ प्लेटों को कवर करते हैं। उन्हें 1-2 सप्ताह अधिकतम के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर शेयर। उपयोग करने से पहले ASWH बदलें।
  4. विशेष इंजेक्शन व्यंजन तैयार करें।
    1. agarose एक 5 सेमी पेट्री डिश में पिघल 1% की एक 5-7 मिमी मोटी परत डालो, और (जैसे कि एक ज़िप ताला बंद करने के लिए एक प्लास्टिक कवर पर्ची से चिपके के रूप में) agarose पर एक मोल्ड जगह agarose के solidification पर एक खरोज उत्पादन करने के लिए कि अंडे पकड़ कर सकते हैं। 5 इंजेक्शन बर्तन करने के लिए तैयार है और 4 ASWH के साथ कवर। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और उपयोग करने से पहले ताजा ASWH के साथ बदलें। इंजेक्शन के लिए केवल ताजा प्लेट (अधिकतम एक दिन पुराने) का प्रयोग करें।
  5. 1 मिमी 2 MgCl · 6H 2 ओ 3 मिमी कश्मीर 4 [फे (सीएन) 6] · 3H 2 हे, 3 मिमी कश्मीर 3 [फे (सीएन) 6] में फॉस्फेट बफर: β-galactosidase (lacZ) धुंधला हो जाना बफर तैयार खारा बीच के साथ (पीबीएस) (पीबीटी) (137 मिमी NaCl, 2.7 मिमी KCl, 10 मिमी ना 2 HPO 4, 2 मिमी के.एच. 2 4 पीओ, 0.05% के बीच)। स्टोर में खोजएन 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरा। LacZ सब्सट्रेट तैयार 5-Bromo-4-क्लोरो-3-indolyl SS-डी-Galactopyranoside -20 डिग्री सेल्सियस पर (एक्स-लड़की, 10 यू / एमएल) 40 मिलीग्राम / मिलीलीटर में dimethylformamide (DMF) और दुकान शेयरों की aliquots में जब तक उपयोग।
  6. नल के पानी में रात भर भिगो दें पाश्चर pipettes चिपके से भ्रूण को रोकने के लिए।
  7. इंजेक्शन सुई तैयार करें।
    1. जैसे गर्मी 425 के रूप में की स्थिति पर एक micropipette खींचने सेट, (415 का एक रेशा रैंप परीक्षण से) 75 पुल, 75 वेग और समय 200।
    2. 5 रेशा युक्त कांच केशिकाओं के लिए 4 खींचो 8 से 10 लंबे, ठीक सुइयों सामान्य रूप से नोक पर बंद हुआ उत्पादन करने के लिए। एक धूल मुक्त सुई बॉक्स, एक ऊंचा समर्थन पर चिपकने वाला टेप डबल करने के लिए संलग्न में सुइयों स्टोर, टिप्स तोड़ने से बचने के लिए और जो सुई भरने के लिए सुविधाजनक है।
      नोट: हरी महत्वपूर्ण डाई (धारा 6 में वर्णित के रूप में) के साथ कुछ अंडे इंजेक्शन लगाने के द्वारा परीक्षण प्राप्त सुइयों और शर्तों खींच एक टिप आकार कि ठीक-देखते और repetit के लिए अनुमति देता है प्राप्त करने के लिए सुई समायोजित6.6 में वर्णित के रूप में इंजेक्शन ive।
  8. इंजेक्शन समाधान तैयार है। इंजेक्शन समाधान, जैसे की 4 μl, 2 मिमी एमओ के 1 μl, 10 माइक्रोग्राम के 2 μl की रचना तैयार / μl हरी महत्वपूर्ण डाई और 1 μl DDH 2 ओ 0.05-0.5 माइक्रोग्राम / μl छाया हुआ mRNA या प्रयोगात्मक प्रश्न के अनुसार प्लास्मिड डीएनए के 20 एनजी / μl के अंतिम एकाग्रता जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं। बर्फ पर रखें, तो समाधान mRNA शामिल हैं।

2. युग्मक का संग्रह

  1. एक 18 डिग्री सेल्सियस में काटना Ciona वयस्कों भ्रूण कमरे ठंडा। छोटे कैंची का प्रयोग करें और अंत है कि exhaling के पक्ष में siphons का विरोध से शुरू (कम) अपनाना जिसके तहत डिंबवाहिनी और शुक्राणु वाहिनी रन।
  2. डिंबवाहिनी बेनकाब और नाजुक डिंबवाहिनी कैंची की नोक का उपयोग करने में एक चीरा बनाते हैं। outflowing अंडे एक 6 अच्छी तरह से थाली धीरे जैसे से अलग करना बंद कैंची से डिंबवाहिनी दबाकर ASWH युक्त में सीधे गिराजी एस। एक पाश्चर विंदुक ASWH के साथ पहले से rinsed के साथ शेष अंडे स्थानांतरण।
  3. अलग कुओं में अलग-अलग जानवरों से अंडे जमा। विदारक दायरे के तहत अंडे की गुणवत्ता का निरीक्षण करें।
    नोट: अच्छी तरह से विकसित अंडे दौर और गुलाबी रंग में थोड़ा पीला कर रहे हैं। वे एक गैर सेलुलर पीतक कोट, जरायु कि अंडे के चारों ओर एक अच्छी तरह से परिभाषित perivitelline अंतरिक्ष रूपों से घिरे हैं। जरायु इसके बाहर स्थित अपने अंदर और स्टार के आकार का कूप कोशिकाओं पर परीक्षण कोशिकाओं के साथ जुड़ा हुआ है। कम गुणवत्ता के अंडे अक्सर perivitelline अंतरिक्ष या कूप कोशिकाओं की कमी है। वे कम गोल, अधिक बारीक या रंग में अलग दिखाई देते हैं। अपरिपक्व oocytes छोटे होते हैं और एक रजत सफेद रंग है।
  4. कैंची से शुक्राणु वाहिनी कट और एक अलग पाश्चर पिपेट का उपयोग कर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में केंद्रित शुक्राणु एकत्र। विभिन्न जानवरों से (कम से कम दो) एक ही ट्यूब में शुक्राणु पूल। कई दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर शुक्राणु।

3।निषेचन

  1. चरण 2 में वर्णित के रूप में 18 डिग्री सेल्सियस पर शुक्राणु और अंडे ले लीजिए।
  2. शुक्राणु सक्रिय करें।
    1. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 1 मिलीलीटर ASWH को तैयार है और 1 एम Tris पीएच 9.5 के 50 μl के साथ मिश्रण। फिर केंद्रित शुक्राणु के 20 μl जोड़ें और धीरे inverting ट्यूब द्वारा मिश्रण।
    2. एक छोटे से पेट्री डिश के एक कवर या एक गिलास स्लाइड पर रखा शुक्राणु की एक बूंद में शुक्राणु सक्रियण सत्यापित करें और विदारक गुंजाइश के तहत निरीक्षण करते हैं। spermatozoids पागलपन तैराकी जाना चाहिए।
  3. अंडे (100 और 1000 के बीच अंडे युक्त) में से प्रत्येक में अच्छी तरह से करने के लिए सक्रिय शुक्राणु समाधान के 100-200 μl जोड़ें, ऊपर और नीचे pipetting द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं, तो अंडे माध्यम में चल रहे हैं। भ्रूण चलते बिना 10 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।

4. अंडे और भ्रूण के dechorionation

  1. ASWH में 10 मिलीलीटर 20x dechorionation समाधान का एक 500 μl विभाज्य पतला। बूंद-वार 2 के 200 μl जोड़कर dechorionation समाधान को सक्रिय करें।5 एम NaOH 10 मिलीलीटर 1x dechorionation समाधान करने के लिए। एक दूधिया वेग बनेगी। धीरे ट्यूब inverting द्वारा मिश्रण।
  2. अंडे या युग्मनजों लीजिए एक पाश्चर विंदुक का उपयोग ग्लास ट्यूब में (10 मिनट बाद 3.3 कदम में प्रतीक्षा)। एक ट्यूब (1,000-5,000 के आसपास अंडे / ट्यूब) में 2 से 3 जानवरों से अंडे पूल। के बारे में 20 सेकंड के लिए उच्च गति (1,200 XG) पर कताई द्वारा एक हाथ सेंट्रीफ्यूज के साथ तलछट ट्यूब के नीचे एक भ्रूण गोली के रूप में। धीरे-धीरे सेंट्रीफ्यूज करो और एक पाश्चर विंदुक के साथ ASWH को हटा दें।
  3. प्रत्येक ट्यूब में pelleted अंडे / युग्मनजों करने के लिए सक्रिय dechorionation समाधान के 4 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे उन्हें pipetting ऊपर से और एक नल के पानी का इलाज पाश्चर विंदुक एक छोटे से रबर नाशपाती के साथ सबसे ऊपर का उपयोग कर नीचे अंडे / युग्मनजों निलंबित। समाधान 1-3 मिनट के बाद पीले बारी चाहिए।
  4. dechorionating अंडा / युग्मनज पाश्चर विंदुक का उपयोग निलंबन के एक छोटे से विभाज्य को हटाने के द्वारा dechorionation का पालन करें। एक स्लाइड पर एक बूंद जमा और विदारक एस के तहत निरीक्षणसामना। ऊपर और नीचे pipetting अंडे / युग्मनजों रखें और हर 20-30 सेकंड की जाँच करें।
    नोट: पहले कूप कोशिकाओं को अलग, तो जरायु पीले और अपारदर्शी बदल जाता है, और अंत में यह युग्मनजों से detaches। गुलाबी dechorionated अंडे / युग्मनजों ग्लास ट्यूब के नीचे डूब जाएगी। dechorionation अधिकतम से अधिक नहीं लेना चाहिए। 5 मिनट।
  5. ASWH साथ ट्यूब भरें एक बार अंडे का 50% / युग्मनजों dechorionated रहे हैं।
    नोट: बहुत धीरे बारे में 10-15 सेकंड के लिए एक बहुत कम गति सिर्फ dechorionated अंडे / भ्रूण तलछट के लिए पर्याप्त करने के लिए इसी के लिए सेंट्रीफ्यूज (8 XG)। धीरे-धीरे सेंट्रीफ्यूज रोकने के रूप में ट्यूब के नीचे अंडे / युग्मनजों की गोली उपद्रव नहीं करने के लिए।
  6. अधूरे dechorionated अंडे / युग्मनजों साथ चल सामग्री सहित ग्लास ट्यूब से लगभग सभी तरल निकालें और ASWH के साथ बदलें। धीरे-धीरे धोने के लिए और धीरे से 4.2 कदम के रूप में फिर से अपकेंद्रित्र नीचे pipet और। वैकल्पिक रूप से, युग्मनजों गंभीरता से बसने के लिए प्रतीक्षा करें। एक बार फिर से धो लें जब तक कोई जरायु मलबे है lईएफटी।
  7. स्थानांतरण अंडे / युग्मनजों हौसले से एक पाश्चर विंदुक का उपयोग करने के लिए संस्कृति व्यंजन rinsed। (प्रति 10 सेमी पकवान 200 भ्रूण के आसपास) एक साथ उनकी चिपके से बचने के लिए कम घनत्व पर युग्मनजों (नहीं अंडे) रखें। संस्कृति 13 और 20 डिग्री सेल्सियस के बीच तापमान में वांछित चरण के लिए भ्रूण। वैकल्पिक रूप से, युग्मनजों (चरण 5) electroporate या unfertilized अंडे इंजेक्षन (चरण 6)।

5. Electroporation

  1. अंडे की खाद और धारा 3 के रूप में 18 डिग्री सेल्सियस पर युग्मनजों dechorionate और 4. 50 और 400 के बीच electroporation नमूना प्रति अंडे प्रदान करें।
  2. (50 μl DDH 2 हे में मैक्स। 100 माइक्रोग्राम प्रति प्लास्मिड डीएनए) एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 50 μl प्लास्मिड डीएनए तैयार है और 200 μl 0.95 एम mannitol जोड़ें। vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं।
  3. डिस्पैच और गुरुत्वाकर्षण siliconized 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में dechorionated युग्मनजों तलछट। ट्यूब पर 100 μl चिह्नित करने के लिए ASWH नीचे निकालें।
  4. आगे बढ़ें, लगातार, प्रत्येक युग्मनज ट्यूब के लिए इस प्रकार है: जोड़नेडीएनए / mannitol समाधान के लिए एक पाश्चर विंदुक का उपयोग। धीरे युग्मनजों के साथ मिश्रण और तुरन्त एक 4 मिमी electroporation क्युवेट करने के लिए डीएनए / mannitol / युग्मनज निलंबन और स्थानांतरण ले।
  5. क्युवेट तुरंत electroporation धारक में रखें और 50 वी में 16 मिसे के एक नाड़ी देना
  6. एक ही पाश्चर विंदुक का उपयोग क्युवेट से युग्मनजों निकालें और ताजा और फ़िल्टर ASWH युक्त एक संस्कृति डिश पर उन्हें बाहर फैल गया। युग्मनजों पिपेट से पहले वे 18 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 घंटे के बाद निषेचन (HPF) cleaving शुरू करते हैं।
  7. ASWH की एक बीकर में नमूने के बीच पिपेट कुल्ला।
  8. संस्कृति के अनुसार 10 सेमी पकवान लगभग 200 भ्रूण की काफी कम घनत्व में 15-20 डिग्री सेल्सियस पर युग्मनजों साथ उनके चिपके से बचने के लिए।

6. Microinjection

  1. इंजेक्शन के लिए dechorionated अंडे तैयार करें।
    1. धारा 4 में वर्णित के रूप में, अलग से अंडे Dechorionate, 2-4 जानवरों से unfertilized और dechorionated ई रखेंअलग छोटे agarose लेपित संस्कृति बर्तन में GGS। अंडे मलबे को हटाने के बर्तन में कई बार धोएं।
    2. टेस्ट के लिए प्रत्येक व्यक्ति से (50) के आसपास dechorionated अंडे के छोटे समूहों खाद डालना। प्रत्येक बैच के लिए एक अलग से 5 सेमी पकवान का प्रयोग करें और 2 μl सक्रिय शुक्राणु (3.2 कदम) लागू होते हैं। व्यंजन घूमता द्वारा अच्छी तरह मिक्स और बग़ल में बर्तन ले जाकर डिश में अंडे से बाहर फैल गया। शुक्राणु और अंडे के बिना चल बारे में 10 मिनट के लिए एक साथ रखें।
    3. इस प्रकार के रूप में शुक्राणु की एक अधिकतम खत्म: ताजा ASWH के साथ एक ताजा संस्कृति डिश के लिए निषेचित अंडे हस्तांतरण या दो बार कुल्ला। (लगभग 3 घंटे के बाद निषेचन के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर), 32 सेल चरण तक बेफिक्र cleaving भ्रूण छोड़ दें। microinjection के लिए सबसे अच्छा विकासशील बैच (निषेचन का सबसे अच्छा और सबसे प्रतिशत नियमित दरार पैटर्न) से अंडे का चयन करें।
  2. इंजेक्शन सुई सेट करें।
    1. एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में 4 इंजेक्शन सुई backfill गुरुत्वाकर्षण के लिए अनुमति देने के लिए फ्लोरिडारेशा साथ ओउ। जमा 0.5 μl इंजेक्शन समाधान (कदम 1.8) सुई कि सुई नीचे टिप तैनात कर रहे हैं के पीछे के अंत पर हरे रंग की महत्वपूर्ण डाई युक्त। तरल के लिए प्रतीक्षा करें तल पर सुई की नोक भरने के लिए।
    2. क्षैतिज सुइयों का स्थान बदलें और एक ठीक है और लंबी धातु या प्लास्टिक विंदुक टिप का उपयोग खनिज तेल के साथ उन्हें backfill। धीरे धीरे खनिज तेल सभी हवाई बुलबुले को खदेड़ने जबकि सुई भरने के साथ इंजेक्शन समाधान उपरिशायी।
  3. सेटअप एक 18 डिग्री सेल्सियस में micromanipulator कक्ष ठंडा।
    1. एक 10 मिलीलीटर कांच खनिज तेल से भरा सिरिंज सुई धारक की प्लास्टिक टयूबिंग कनेक्ट। ट्यूबिंग और तेल के साथ सुई धारक backfill और किसी भी हवाई बुलबुले को निष्कासित।
    2. सुई धारक में सुई डालें और micromanipulator पर धारक की स्थिति।
    3. सतह के लिए 45 डिग्री रिश्तेदार के कोण पर एक सीधी रेखा के साथ सुई धारक आंदोलन को समायोजित करें।
  4. dechoriona ओरिएंटइंजेक्शन पकवान अंडे एक के बाद एक इंजेक्शन जा सकता है इतना है कि विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे की agarose खरोज साथ टेड अंडे।
  5. सुई की नोक तोड़, यदि आवश्यक हो, धीरे या agarose के खिलाफ गिलास को कवर पर्ची का एक टुकड़ा agarose पर रखा खिलाफ सुई आगे बढ़ाने के द्वारा। थोड़ा सत्यापित करने के लिए सुई की नोक खुला (हरी सुई सामग्री को निष्कासित करेंगे) है कि सिरिंज घुंडी दबाव।
  6. पहले अंडे में सुई शुरू और थोड़ा अंडा झिल्ली इंजेक्शन द्वारा पीछा तोड़ने के लिए श्वास ने एक के बाद एक unfertilized अंडे इंजेक्षन। सेल व्यास का 1/3 की एक अधिकतम करने के लिए अंडे के बीच में हरी इंजेक्शन समाधान इंजेक्षन। (यह 140 माइक्रोन का एक अंडा व्यास के लिए लगभग 30 PL से मेल खाती है)।
  7. एक ताजा संस्कृति डिश के लिए इंजेक्शन unfertilized अंडे स्थानांतरण और निषेचन तक 15-18 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें सेते हैं।
  8. परीक्षण fertilizations (कदम 6.1.2) के रूप में हौसले से सक्रिय शुक्राणु के साथ इंजेक्शन अंडे की खाद। eliminatएक ताजा संस्कृति डिश के लिए युग्मनजों के हस्तांतरण से शुक्राणु की ईए अधिकतम। भ्रूण बाहर बिखरा हुआ है और दरार चरणों के दौरान उन्हें उपद्रव नहीं है (32 सेल चरण तक)।
  9. संस्कृति एक तापमान 13 और 20 डिग्री सेल्सियस के बीच में वांछित शामिल चरण के लिए भ्रूण।
  10. उन्हें थाली के बीच में घूमता है और उन्हें siliconized 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में स्थानांतरित द्वारा भ्रूण लीजिए। फिक्स और दाग, या माउंट (चरण 7 और 8)।
  11. नियंत्रण इंजेक्शन भ्रूण को प्राप्त phenotypes की तुलना करें।
    नोट: एक दूसरे, गैर अतिव्यापी एमओ है कि एक ही प्रतिलेख को निशाना बनाता समान phenotypes प्राप्त करने के लिए इंजेक्षन। अपने हित के प्रोटीन एन्कोडिंग एक संशोधित mRNA लेकिन लगता है कि राज्यमंत्री द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं है के साथ विशिष्ट एमओ phenotype (s) बचाव। एक नियंत्रण एमओ कि कोई phenotype देता इंजेक्षन।

7. lacZ धुंधला

  1. siliconized 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एक वांछित स्तर पर भ्रूण लीजिए और 15 के लिए 1 मिलीलीटर ASWH में 0.2% glutaraldehyde में उन्हें ठीक30 मिनट के अधिकतम करने के लिए।
  2. धो 2x 1 मिलीलीटर 1x पीबीटी के साथ 10 मिनट।
  3. 500 μl lacZ धुंधला बफर में एक बार कुल्ला। (/ एमएल एक्स-लड़की शेयर 10 μl / 40 मिलीग्राम की मिलीलीटर का उपयोग करें) एक्स-लड़की सब्सट्रेट के साथ पूरक 1 मिलीलीटर धुंधला बफर बदलें। धुंधला की बेहतर निगरानी के लिए एक 12 अच्छी तरह से थाली में भ्रूण स्थानांतरण।
  4. अंधेरे में सेते हैं। 0.5 मानव संसाधन से ऊष्मायन भिन्न करने के लिए रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर, चालक lacZ व्यक्त की ताकत के आधार पर आरटी पर या 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  5. भ्रूण धुंधला बफर दूर करने के लिए 1 मिलीलीटर 1X पीबीटी में 4 गुना तक धो लें।
  6. पोस्ट तय 1 मिलीलीटर में 2% paraformaldehyde (पीएफए) 1x पीबीटी या व्याख्या और दाग भ्रूण के दृश्य के लिए 1 मिलीलीटर 1x पीबीटी में 0.2% glutaraldehyde के साथ कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए।

8. Fluorescently लेबल Wmbryos के बढ़ते

  1. 1 मिलीलीटर ASWH में 2% पीएफए ​​में 20 मिनट के लिए एक वांछित विकास मंच के भ्रूण को ठीक करें।
  2. धो भ्रूण 1 मिलीलीटर 1x पीबीटी में 2x। किसी भी प्रकाश Expos से बचेंअंधेरे की स्थिति में भ्रूण रखकर Ure।
  3. एक स्लाइड करने के लिए 50 भ्रूण को हस्तांतरण। एक कागज तौलिया के साथ पहली बार एक विंदुक के साथ और ध्यान से पीबीटी की एक अधिकतम निकालें।
  4. 20-25 μl बढ़ते मध्यम जोड़ें।
  5. यह स्थिति एक कोण में (एक तरफ से पहली बार) और धीरे-धीरे एक उठाई वस्तु (सुई, संदंश, पिपेट टिप) बुलबुले से बचने तक नमूना कवर किया जाता है के साथ इसे कम करके एक coverslip जोड़ें। एक पारदर्शी नेल पॉलिश की डॉट्स का उपयोग कर अपने किनारों पर coverslip को ठीक करें।
  6. सूखने के बाद एक नेल पॉलिश के साथ पूरे coverslip सील। -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर।

Representative Results

जीन विनियामक नेटवर्क के अध्ययन के लिए Microinjection

Ascidian की भ्रूण Ciona intestinalis अच्छी तरह से सेल वंश स्तर पर जीन कार्यात्मक या जीन के अध्ययन के लिए नियामक और सेलुलर संकल्प के साथ अनुकूल हैं। mRNAs, राज्यमंत्री या लेबल unfertilized अंडे में या निषेचन के बाद अलग-अलग blastomeres में microinjected जा सकता है। एमओ मध्यस्थता microinjection तकनीक का उपयोग पछाड़ना जीन कदम में वर्णित है 6. राज्यमंत्री विशेष रूप से चयनित जीन की mRNA के लक्ष्य और प्रोटीन में उनके अनुवाद को रोकने के। एमओ मध्यस्थता नुकसान के समारोह (LOF) विकासात्मक जीन के बहाव के जीन की एक व्यापक सरणी की अभिव्यक्ति में परिवर्तन, समग्र भ्रूण GRN 10 में एक झलक खुलासा। Ciona में इस तरह के विश्लेषण एक metazoan 11 में पहली बार पूरे भ्रूण नियामक खाका प्रदान की है। चित्रा 1 प्रदर्शित करता है कि कैसे microinjecti का एक उदाहरणपर Ciona भ्रूण के गेसट्रुला चरण में संरक्षित सीआइ -Myelin ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर (सीआइ -MYT) की अभिव्यक्ति के ऊपर विनियमन अध्ययन करने के लिए उपयोग किया गया था। सीटू संकरण (ISH), अंतर्जात अभिव्यक्ति (चित्रा 1 ए, चित्रा 1 ए 'में schematized) में से निगरानी की विशेष रूप से मस्तिष्क के, 6-पंक्ति तंत्रिका प्लेट व्यापारियों में मनाया जाता है (पंक्तियों तृतीय / चतुर्थ, लाल रंग में) और रीढ़ की हड्डी ( पंक्ति मैं, हरे रंग में)। इसके अलावा, सीआइ -MYT नदी के ऊपर विनियमन कई कारकों है कि या व्यक्त कर रहे हैं सीआइ -MYT अभिव्यक्ति शुरुआत (चित्रा 1 बी जी) के लिए पहले तंत्रिका व्यापारियों को लक्षित करने के लिए आसन्न एमओ इंजेक्शन द्वारा विश्लेषण किया गया था। ऐसे Forkhead बॉक्स ए.ए. के रूप में जल्दी भ्रूण कारकों की एमओ पछाड़ना (Foxa-एक) प्रतिलेखन कारक और fibroblast वृद्धि कारक 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (चित्रा 1 बी या -1 सी, क्रमशः) समाप्त समग्र सीआइ -MYT अभिव्यक्ति। अन्य प्रतिलेखन कारककेवल आंशिक रूप से (चित्रा 1 डी, एफ और जी में नीले तीर सिर) मस्तिष्क व्यापारियों के एक सबसेट में एमओ की मध्यस्थता डाउनरेगुलेशन में जिसके परिणामस्वरूप सीआइ -MYT अभिव्यक्ति प्रभावित करते हैं। इसके विपरीत, सीआइ -MYT अभिव्यक्ति ectopically नोडल (चित्रा 1E, लाल तीर सिर) का डाउनरेगुलेशन पर सक्रिय होता है, सुझाव है कि आम तौर पर इन नोडल पार्श्व तंत्रिका कॉर्ड व्यापारियों में सीआइ -MYT अभिव्यक्ति represses।

कुशल जीन कार्यात्मक और बढ़ाने के अध्ययन के लिए electroporation

Ciona युग्मनजों में प्लास्मिड डीएनए के electroporation क्षणिक transgenesis और vivo में प्ररूपी परिवर्तन के बाद के अवलोकन के लिए एक कारगर तरीका है। mRNA की microinjection के विपरीत, electroporation जिसमें जीन कोडिंग क्षेत्रों (ORFs, खुला पढ़ने फ्रेम) नियंत्रण में व्यक्त कर रहे हैं, ऊतक विशिष्ट overexpression के लिए अनुमति देता हैऊतक विशिष्ट चालकों की। ये आम तौर पर अच्छी तरह से ज्ञात जीनों (जैसे पृष्ठदंड व्यापारियों 8 में अभिव्यक्ति के लिए brachyury बढ़ाने के रूप में) का सीआईएस -regulatory क्षेत्रों का गठन। इसके विपरीत, electroporation उपन्यास विनियामक क्षेत्रों के कुशल विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जहां रिपोर्टर जीन (lacZ या हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन, GFP) विवो में उनकी गतिविधियों का पता चलता है। पहचान और इस तरह के एक उपन्यास नियामक क्षेत्र के बाद electroporation मध्यस्थता विश्लेषण (सीआइ -MYT के लिए) के लिए कार्यप्रवाह चित्रा 2 में दिखाया गया है।

Ciona समुदाय डेटा, आसानी के लिए ascidian विशिष्ट जीनोम ब्राउज़रों 12,13, ascidian नेटवर्क की तरह में सुलभ सीटू अभिव्यक्ति और embryological डाटा (ANISEED), 23 में एक विशाल प्रदर्शनों की सूची, विनियामक क्षेत्रों (2A चित्रा) के सिलिको में पहचान के लिए निरीक्षण किया है। इसके बाद पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीअभिव्यक्ति वैक्टर में इन क्षेत्रों के सीआर) आधारित क्लोनिंग विवो में electroporation की मध्यस्थता के परीक्षण के लिए अनुमति देता है। (चित्रा 2 बी)। चित्रा 2A में जीनोम ब्राउज़र स्क्रीन शॉट (नारंगी में, पहले तीन एक्सॉनों, और दो इंट्रोन्स दिखाई दे रहे हैं) सीआइ -MYT के लिए के.एच. प्रतिलिपि मॉडल के अपस्ट्रीम क्षेत्र से पता चलता है। विभिन्न जीनोम ब्राउज़र पटरियों व्याख्या कार्यात्मक जीनोम डेटा ऐसे chromatin immunoprecipitation (चिप) के आंकड़ों 14 (यहाँ ZicL, सेरिबैलम एल के सीआइ -zinc उंगली के लिए दिखाया गया है), दो से संबंधित Ciona प्रजातियों 15,24 या nucleosome के बीच अनुक्रम संरक्षण के रूप में इस क्षेत्र के लिए भविष्यवाणी की, अधिभोग 16,17 (ऊपर से चित्रा 2A में नीचे करने के लिए)। आम तौर पर, exonic प्रोटीन कूट क्षेत्रों में अत्यधिक (चित्रा 2A में संरेखण ट्रैक) संरक्षित कर रहे हैं। अतिरिक्त उच्च संरक्षण चोटियों गैर-कूट क्षेत्रों में अपस्ट्रीम में और पहली intron में दिखाई देते हैं। इनमें से दो nucleosome मुक्त एक होने की भविष्यवाणी कर रहे हैंएक दृश्य आधारित एल्गोरिथ्म 16,17 (चित्रा 2A में लाल फ्रेम) प्रतिलेखन कारक को आकर्षित करने के लिए सुझाव ccording। दरअसल, चिप पर चिप संकेतों 14 सीआइ -ZicL प्रतिलेखन कारक बाइंडिंग के लिए (चित्रा 2A में हरे रंग की सलाखों) इन दो संरक्षित क्षेत्रों में समृद्ध कर रहे हैं। इसके अलावा, एक अंतरफलक है कि संभावित 25 प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी साइटों के लिए खोज का उपयोग कर रहा है, हम ZIC सीआइ -ZicL चिप समूहों (नारंगी तीर और रेखांकित ZIC कोर, चित्रा 2A के साथ दृश्यों) द्वारा चिह्नित जीनोम अनुक्रम के भीतर स्थित साइटों की पहचान की। संरक्षित में सीआइ -ZicL प्रतिलेखन कारक के बंधन और जाहिर nucleosome मुक्त सीआइ -MYT की विनियामक क्षेत्रों है सीआइ -MYT अभिव्यक्ति एमओ इंजेक्शन मध्यस्थता पछाड़ना को निशाना ZicL (चित्रा -1) प्रयोगों में मनाया के डाउनरेगुलेशन के साथ संगत।

बाद रोकतेसीआइ -MYT अभिव्यक्ति के लिए सिलिको में संभावित सीआईएस -regulatory क्षेत्रों खनन, इन पीसीआर Ciona जीनोमिक डीएनए से परिलक्षित और पुनर्संयोजन lacZ रिपोर्टर में क्लोनिंग 19 plasmids द्वारा डाला जाता है। निर्माणों तो निषेचित अंडे Ciona (चित्रा 2 बी) में electroporated और lacZ धुंधला द्वारा अपनी गतिविधि (चित्रा 3) के लिए विश्लेषण कर रहे हैं।

चित्रा 3 से पता चलता है कि सिलिको दृष्टिकोण में इस तरह के एक से इसे दो अलग सीआईएस -regulatory दृश्यों कि पुनरावृत्ति सीआइ -MYT mRNA अभिव्यक्ति डोमेन (चित्रा 1 ए तुलना) की पहचान करने के लिए संभव था। आम तौर पर, क्षणिक ट्रांसजेनिक भ्रूण केवल उन कोशिकाओं है कि डीएनए में शामिल किया है प्लास्मिड डीएनए शो पच्चीकारी अभिव्यक्ति के साथ electroporated। मूसा की lacZ अभिव्यक्ति इस प्रकार pmyt-R3 से प्रेरित है और सभी व्यापारियों को भी सीआइ को व्यक्त कि में पाया जा सकता है (चित्रा 3 ए, बी, बैंगनी और लाल तीर सिर, क्रमशः) पर। इसके विपरीत, pmyt-R5 केवल पीछे (पंक्ति मैं) तंत्रिका प्लेट व्यापारियों और बाद में neurula चरण (चित्रा -3 सी, लाल तीर सिर) पर शुरू में सक्रिय है। दोनों क्षेत्रों के इस प्रकार सीआइ-MYT जीन विनियमन के दो अलग स्थानिक और लौकिक पहलुओं सांकेतिक शब्दों में बदलना। दिलचस्प है, दोनों नियामक क्षेत्रों में भी (क्रमश: चित्रा 3 ए, बी, गुलाबी, सफेद, पीले और तीर सिर) ISH में नहीं देखा अतिरिक्त व्यापारियों दाग विशेष रूप से पूर्वकाल और पार्श्व तंत्रिका प्लेट में और मांसपेशियों में। इस तरह की व्यापक अभिव्यक्ति (जैसे नोडल लिए के रूप में है कि पार्श्व तंत्रिका भाग्य represses चित्रा 1e देखें) तत्व है कि अलग नियामक टुकड़े में समाहित नहीं कर रहे हैं दमनकारी करने के लिए बात कर सकते हैं या कम से अभिव्यक्ति के स्तर जमते के साथ पायाLacZ एंजाइमी संकेत।

बढ़ाने के अध्ययन के अलावा, Ciona electroporation में भी उनकी overexpression द्वारा Ciona कोडिंग जीन की कार्यात्मक विश्लेषण की सुविधा। Ciona पूरी लंबाई ORFs का एक बड़ा संग्रह समुदाय के लिए उपलब्ध है, और इसके अलावा इस बीमारी से जुड़े जीन 18 सहित मानव orthologs, के लिए एनोटेट था। व्यक्तिगत जीनों या इस पुनर्संयोजन क्लोनिंग संगत पूर्ण ओआरएफ सीडीएनए पुस्तकालय (चित्रा 2 बी) से जीन के समूहों को आसानी से गंतव्य उचित ड्राइवरों भ्रूण में व्यक्त किया जा युक्त वैक्टर में स्थानांतरित कर रहे हैं। परिणामस्वरूप अभिव्यक्ति क्लोन इसके अलावा सीआईएस -regulatory पत्रकार के साथ सह-electroporated जा सकती बढ़ाने सक्रियण में उनकी भूमिका ख्यात परीक्षण करने के लिए निर्माण करती है। चित्रा 2 बी प्रतिलेखन के लिए पूर्ण ओआरएफ क्लोन के अलगाव को दिखाता है सीआइ -ZicL और Ci- GATAa और उनके recombinatio कारकोंn अनुकूलित गंतव्य वैक्टर कि इस तरह जल्दी अखिल बहिर्जनस्तरीय अभिव्यक्ति 15 के लिए गाता नियामक क्षेत्र (pfog चालक) के मित्र के रूप में translational टैग 19 (जैसे हरी फ्लोरोसेंट Venus- या वायरल hemagglutinin (हेक्टेयर) -tag) और एक ऊतक विशिष्ट चालक को नियंत्रित कर सकते में वर्तमान अध्ययन में इस्तेमाल किया। बहिर्जनस्तरीय और neuroectodermal ऊतकों में सीआइ -ZicL overexpression के प्रभाव pmyt-R3> lacZ और pmyt-R5> lacZ संवाददाताओं के सह electroporation (चित्रा 3 बी ',' बी '' और सी ', सी', क्रमशः) द्वारा विश्लेषण किया गया था। हमारे electroporation विश्लेषण बताते हैं कि सीआइ -ZicL pmyt-R3 के माध्यम से सीआइ -MYT अभिव्यक्ति को सक्रिय कर सकते हैं और दोनों संवाददाता निर्माणों के रूप में pmyt-R5 बढ़ाने क्षेत्रों बहिर्जनस्तरीय क्षेत्रों में अस्थानिक lacZ अभिव्यक्ति (चित्रा 3 बी में हरी तीर सिर से पता चला है ',' बी '' और सी एंड# 39;, सी ',)। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 3 डी, Ciona अंडे के सैकड़ों की संख्या में प्लास्मिड डीएनए की electroporation अभिव्यक्ति परिवर्तन, एकाग्रता निर्भर, अखिल बहिर्जनस्तरीय सीआइ -ZicL अभिव्यक्ति पर अस्थानिक pmyt-R3> lacZ अभिव्यक्ति के लिए सचित्र के सांख्यिकीय प्रासंगिक मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है।

इन विवो subcellular स्थानीयकरण के लिए electroporation

चित्रा 4 में टैग प्रतिलेखन कारक के subcellular स्थानीयकरण जब बहिर्जनस्तरीय blastomeres में electroporation पर व्यक्त अनुकूलित अभिव्यक्ति निर्माणों (चित्रा 2 बी में schematized) का उपयोग दर्शाया गया है। एक वीनस टैग (चित्रा 4 बी) या एक हा-टैग (चित्रा 4C) और उन्हें बहिर्जनस्तरीय ऊतकों में overexpressing के साथ सी-टर्मिनली टैगिंग प्रतिलेखन कारक हैं (जैसे सीआइ -GATAa के रूप में) (pfog द्वारा) हम पालन कर सकता है कि इन विवो में, 'सीआइ -GATAa ज्यादातर नाभिक के लिए, स्थानीय है के रूप में एक प्रतिलेखन कारक के लिए उम्मीद की जबकि वीनस अभिव्यक्ति सर्वव्यापी है, कोशिका द्रव्य भी शामिल है। इसी तरह के प्रयोगों समय के साथ subcellular स्थानीयकरण की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए, व्यक्ति या प्रतिलेखन कारकों के संयोजन की, संभवतः अलग टैग के साथ उनके सह स्थानीयकरण खुलासा किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। Microinjection द्वारा आकलन सीआइ -MYT विनियमन Ciona अंडे में सीआइ -MYT mRNA अभिव्यक्ति गुम्मट और morpholino (एमओ) में इंजेक्शन भ्रूण। तंत्रिका प्लेट में सीआइ -MYT (क) के गुम्मट अभिव्यक्ति पैटर्न। (ए ') तंत्रिका प्लेट (एनपी) में दाग व्यापारियों की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। पंक्ति मैं / द्वितीय: पीछे तंत्रिका भाग्य; पंक्ति तृतीय / चतुर्थ: पूर्वकाल तंत्रिका भाग्य; पंक्ति वी / छठी: मूंछ भाग्य। ( ।। जी> बी - जी) ने संकेत दिया है कि जल्दी जीन Ciona GRN (तस्वीरें इमाई एट अल से अनुकूलित में भाग लेने के नीचे दस्तक के लिए विभिन्न राज्यमंत्री के microinjection पर सीआइ -MYT अभिव्यक्ति, 2006) 11 सीआइ -MYT, सीआइ प्रतिलेखन कारक -myelin; गुम्मट, जंगली प्रकार; नीले तीर: सीआई -MYT संकेत के नुकसान; लाल तीर: अस्थानिक सीआइ -MYT संकेत। स्केल बार = 100 माइक्रोन सभी छवियों को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: बढ़ाने क्षेत्रों के सिलिको खोज और पुनर्संयोजन में Ciona भ्रूण में electroporation द्वारा क्षणिक transgenesis के लिए क्लोनिंग के लिए कार्यप्रवाह (ए) ANISEED 23 एएससीआई से एक स्नैपशॉट।MYT - भारतीय जीनोम ब्राउज़र सीआई के अपस्ट्रीम नियामक दृश्यों को दिखाता है। लाल फ्रेम, दो संभावित सीआईएस -regulatory क्षेत्रों को चिह्नित pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) और pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) कि electroporation द्वारा विश्लेषण के लिए चयन किया गया था। पटरियों के नाम: ZicL जांच: चिप पर चिप डेटा 14; KH2012 देखिए: Ciona प्रतिलिपि मॉडल intestinalis; संरेखण स्कोर सीएस / सीआइ LastZ: Ciona savignyi (सीएस) / Ciona intestinalis (सीआई) 15,24 के बीच अनुक्रम संरक्षण; सहगल 2006 में भविष्यवाणी की nucleosome अधिभोग संस्करण 1: लड़की द्वारा सहगल एट अल कम्प्यूटेशनल एल्गोरिथ्म प्रशिक्षित, 2006 16 Khoueiry में के रूप में सीआइ के लिए आवेदन किया एट अल, 2010 17 हरे रंग की सलाखों:।। सीआइ -ZicL चिप चोटियों 14; नारंगी तीर: ZIC साइटों की भविष्यवाणी की; GCTG: कोर ZIC बाध्यकारी साइट। (बी) के एक Cion से overexpression निर्माणों पैदा करने के लिए योजनाएक पूरी लंबाई ओआरएफ सीडीएनए पुस्तकालय, गंतव्य ऊतक विशिष्ट ड्राइवरों (pfog) और प्रोटीन टैग बाद में इन विवो readout सीआइ के लिए रिपोर्टर निर्माणों (जैसे pmyt-R3> lacZ या pmyt-R5> lacZ के रूप में) के साथ सह-electroporated युक्त वैक्टर में recombined। - MYT, सीआइ -myelin प्रतिलेखन कारक, सीआइ -ZicL, सेरिबैलम एल प्रतिलेखन कारक के सीआइ -Zinc उंगली;। pfog, GATA के सीआइ -Friend की नियामक क्षेत्र में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Electroporated Ciona मध्य gastrul पर सीआइ -ZicL inducible स्थानिक-सामयिक सीआइ -MYT lacZ दाग भ्रूण के सीआईएस -regulation दिखा भ्रूणएक (एमजी) / देर गेसट्रुला (एलजी) या जल्दी neurula (एन) मंच है कि या तो pmyt-R3> lacZ या pmyt-R5> lacZ और एक नियंत्रण निर्माण (pfog> mCherry) या pfog सह electroporated थे दिखाए गए हैं> ZicL। Pfog चालक 19 बाहरी झिल्ली और neuroectoderm में अस्थानिक (अखिल जानवर) ZicL अभिव्यक्ति मध्यस्थता करता है और इन कोशिकाओं में अस्थानिक lacZ दाग का कारण बनता है। (क) मिलीग्राम / एलजी चरण भ्रूण (छोटे तीर, बाएं पैनल) में या तदनुसार रंग का योजनाबद्ध प्रदेशों में pmyt-R3 lacZ गतिविधि (नीले हलकों, सही पैनल); (वी.जी.) वनस्पति देखें। पंक्ति मैं / द्वितीय: पीछे तंत्रिका भाग्य; पंक्ति तृतीय / चतुर्थ: पूर्वकाल तंत्रिका भाग्य; पंक्ति वी / छठी: मूंछ भाग्य। (ख) एक के रूप में ऊतकों में एन चरणों में pmyt-R3 गतिविधि। सीआइ -ZicL सह electroporation पर (ख ') अस्थानिक pmyt-R3 गतिविधि हरी तीर द्वारा संकेत दिया है। (ख '') बी में के रूप में भी भ्रूण ', उन्मुख पशु पोल (एक)। ( (ग ') सीआइ -ZicL सह electroporation पर अस्थानिक pmyt-R5 गतिविधि पर pmyt-R5 lacZ गतिविधि हरी तीर द्वारा संकेत दिया है। (ग '') ग में के रूप में भी भ्रूण 'लेकिन उन्मुख पशु पोल (एक)। (घ) सीआइ -ZicL के लिए प्रतिनिधि प्रयोगों की मात्रा कम मात्रा में pmyt-R3 भर में सक्रिय। एक जैविक दोहराने का प्रतिनिधित्व करती है सीआइ -MYT, सीआइ -myelin प्रतिलेखन कारक;। सीआइ -ZicL, सेरिबैलम एल प्रतिलेखन कारक के सीआइ -Zinc उंगली, सीआइ -FOG, GATA के सीआइ -Friend; गुम्मट, जंगली प्रकार; एमजी, मध्य गेसट्रुला; एलजी, देर-गेसट्रुला; एन, जल्दी neurula; एक, पशु दृश्य; वी.जी., वनस्पति दृश्य; एनएलएस lacZ, lacZ के लिए परमाणु स्थानीयकरण संकेत। स्केल बार = 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4:। वीनस टैग या Hemagglutinin- (हेक्टेयर) की electroporation स्थानीयकरण पर प्रोटीन का अंतर subcellular स्थानीयकरण pfog चालक 19 का उपयोग कर बहिर्जनस्तरीय कोशिकाओं में प्रोटीन overexpressed -tagged। (एक - सी) डीआईसी छवियों। (ए ',' बी ') प्रतिदीप्ति छवियों इसी। (ग ') TRITC के साथ प्रतिरक्षा ऊतकीय लेबलिंग पर प्रतिदीप्ति छवि इसी। स्केल बार = 100 माइक्रोन सभी छवियों को दर्शाता है। डीआईसी, अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

शाही सेना या डीएनए और डीएनए की electroporation के microinjection: वहाँ दो प्रमुख तकनीकों ट्रांसजेनिक Ciona भ्रूण उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं। Ciona भ्रूण में जीन गड़बड़ी के लिए इन तकनीकों में पहली बार 1990 के दशक 7,8 में इस्तेमाल किया गया और तब से क्रमिक सुधार हुआ है, और अब Ciona (और अन्य ascidian पीढ़ी) 20 दुनिया भर में उपयोग किया।

प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम

कि आसानी से वयस्क जानवरों से एकत्र कर रहे हैं Ciona युग्मक में सफल transgenesis महत्वपूर्ण कारकों में से एक नंबर पर निर्भर करता है। युग्मक की गुणवत्ता spawning के मौसम पर निर्भर करता है (उत्तरी अटलांटिक में आम तौर पर मई से दिसंबर, पानी का तापमान और ऑक्सीजन के साथ बदल रहा है), एक्वैरियम में समुद्र के पानी की गुणवत्ता पर (सही लवणता में, वयस्कों के 2-4 सप्ताह के लिए स्वस्थ रहने के लिए) , और अंत में वयस्कों से निकासी पर युग्मक का सही हैंडलिंग, के रूप में विभिन्न चरणों के लिए नीचे विस्तृत परमसविदा बनाना।

तैयारी चरणों के दौरान, नल के पानी के साथ पाश्चर pipettes incubating चिपके हुए हैं और agarose लेपित पेट्री डिश के समुद्र का पानी पूर्व ऊष्मायन से भ्रूण को रोकने agarose से जारी विषाक्त पदार्थों को दूर करेगा। आम तौर पर, बर्तन उपयोग करने से पहले 2 सप्ताह, 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत बैक्टीरिया विकास से बचने के लिए अप करने के लिए तैयार है और उपयोग करने से पहले हौसले से rinsed जा सकता है। एक दिन पुराने, छोटे बर्तन इंजेक्शन के लिए सबसे अच्छा लगता है।

दक्षता और dechorionation की लंबाई के अंडे / भ्रूण के लंबे समय तक इलाज के विकास को नुकसान होगा क्योंकि प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। सावधान तैयारी (कोई मिलाते हुए) और (अप करने के लिए एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर) सही भंडारण dechorionation समाधान की गुणवत्ता बनाए रखने के। अगर किसी भी तैयारी में या समय के साथ भी हिंसक मिलाया, विशेष रूप से यदि अब घंटे / दिनों के लिए कमरे के तापमान पर रखा समाधान में Proteases दक्षता खो देते हैं। हम ताजा dechorionation समाधान आसानी से उपयोग करके इस महत्वपूर्ण कदम अनुकूलित है20x शेयर समाधान के जमे हुए aliquots से तैयार किया।

नाजुक dechorionated अंडे / भ्रूण का सही से निपटने के लिए आवश्यक है और बाल काटना या भ्रूण की छुरा जबकि pipetting हानिकारक हो जाएगा। pipetting, भ्रूण निलंबन में, क्षैतिज स्थिति से ऊर्ध्वाधर में कांच पिपेट धारण करते हुए नहीं बल्कि (धीरे ​​तरल 'उड़ाने' चिकनी लेकिन जल्दी pipetting द्वारा पीछा किया उन्हें चक्कर आने के लिए ऊपर) के द्वारा जितना संभव हो उतना रखा जाता है जब। इस तरह की देखभाल धोने, मेजबान और अंडे स्थानांतरित करने के लिए सभी pipetting कदम पर लागू होता है / में और ट्यूब, cuvettes या प्लेटें, से बाहर होने से पहले और निर्धारण के बाद भ्रूण। निर्धारण पर, विशेष देखभाल भी तय भ्रूण बनाम लाइव fixatives के अवशेष से किसी भी विषाक्तता से बचने के लिए अलग pipetting उपकरणों के लिए लिया जाना चाहिए।

Microinjection और उनके छोटे आकार और पीतक झिल्ली के लचीलेपन के कारण नहीं बल्कि Ciona अंडे / भ्रूण में मुश्किल है समीक्षकों का एक अनुकूलित टिप आकार पर निर्भर करता हैइंजेक्शन सुई, इंजेक्शन की एक सही कोण (एक लाइन में सुई आंदोलन, अंडे त्रिज्या के साथ) और (इंजेक्शन के लिए आकांक्षा से पहले सक्शन द्वारा) पीतक झिल्ली का एक पतले देखते, मैनुअल तोड़ने। हवा के बुलबुले पूरी तरह से इंजेक्शन ट्यूबिंग कि सक्शन / इंजेक्शन दबाव चौरसाई के लिए खनिज तेल होता है से समाप्त हो जाते हैं अगर बाद ही संभव है। इसके अलावा, धूल या अंडा मलबे के सबसे छोटे टुकड़े सुई रोकना होगा, और आसानी से स्वच्छ काम की परिस्थितियों और इंजेक्शन पकवान पर हस्तांतरण करने से पहले अंडे के लिए rinsing कदम से परहेज कर रहे हैं। बाद इंजेक्शन, ताजा व्यंजन पर अंडे के हस्तांतरण मृत भ्रूण इंजेक्शन प्रक्रिया से बच नहीं होने से विषाक्त प्रभाव से बचना होगा।

समस्या निवारण

प्रक्रिया में संभावित समस्याओं के समाधान के बाद से संबोधित किया जा सकता है। कम निषेचन दरों अपर्याप्त शुक्राणु सक्रियण, कम अंडे की साफ-सफाई या बड़ी मात्रा में निषेचन से पैदा हो सकता है। Freshl का प्रयोग करेंY जमा और कम शुक्राणु पतला। सक्रियण पर शुक्राणु आंदोलन की जाँच करें। 4.2 कदम के रूप में वर्णित निषेचन से पहले ASWH के साथ अंडे धो लें। पानी की मात्रा को कम करने और / अच्छी तरह से निषेचन पकवान प्रति अंडे की मात्रा कम हो। तैयारी चरणों के दौरान खो भ्रूण अधिक कुशलता से नीचे undechorionated अंडे / भ्रूण अपकेंद्रित्र dechorionation समाधान की एक बूंद को जोड़ने से बचा जा सकता है। Dechorionation समय नहीं होगा तलछट और लंबे समय तक dechorionation, विषैला होता है भ्रूण विस्फोट करने के कारण आंशिक रूप से dechorionated अंडे के रूप में अनुकूलित किया जाना चाहिए।

अतुल्यकालिक विकास विच्छेदन के दौरान जारी अवशिष्ट शुक्राणु से पैदा हो सकता है। विभिन्न जानवरों से अलग बैचों अंडा रखें अनियंत्रित पार निषेचन से बचने के लिए। असामान्य विकास विभिन्न कारण हो सकते हैं। शुरुआत में और सीजन के अंत में, अलग अलग व्यक्तियों से भ्रूण रखने के बाद, सबसे अच्छा बैचों का चयन किया जा सकता है। के लिए भ्रूण perturbing से बचें10 मिनट कि निषेचन का पालन उनकी ooplasmic अलगाव के साथ हस्तक्षेप से बचने के लिए। सुनिश्चित करें कि भ्रूण विभाजित शुरू नहीं किया है, जबकि स्थानांतरित किया जा रहा pipetting बहन blastomeres और आंशिक भ्रूण में परिणामों को अलग करती है। dechorionated अंडे के लिए कम शुक्राणु का प्रयोग polyspermy से बचने के लिए। हौसले से तैयार है, लेकिन rinsed agarose व्यंजन का प्रयोग करें। सुनिश्चित करें कि pipetting डिवाइस लगानेवाला नि: शुल्क है। नियंत्रण भ्रूण कि dechorionated नहीं कर रहे थे और कम से जो कदम विकास बाधित किया गया था पता लगाने के लिए electroporated नहीं रखें। एंटीबायोटिक दवाओं के साथ भ्रूण अनुपूरक अगर प्रदूषण और अपघटन होता है।

इंजेक्शन डिवाइस 'भरा' है तो इंजेक्शन सुई उद्घाटन अपनी दाग ​​सामग्री में से कुछ को खदेड़ने द्वारा सत्यापित किया जा सकता है। Clogging सामग्री सावधानी से agarose के माध्यम से सुई टिप खींचकर से साफ किया जा सकता है। हवा इंजेक्शन ट्यूबिंग में बुलबुले और / या सुई हटाया जाना चाहिए। nee के रूप में इंजेक्शन की मात्रा के बेहतर नियंत्रण के लिए सुई बदलेंdle टिप तोड़ने या इंजेक्शन के साथ रोकना सकता है। अंडे कुल्ला और उन्हें एक साफ इंजेक्शन डिश में जगह अगर मलबे डिश में जमा किया है। इंजेक्शन समाधान आदेश में किसी भी छोटे कणों या क्रिस्टल तलछट में ताजा सुइयों भरने से पहले अपकेंद्रित्र। इसके अलावा उपयोगी केवल महत्वपूर्ण डाई के साथ इंजेक्शन अभ्यास कर रहा है। इंजेक्शन और गैर इंजेक्शन अंडे निषेचन द्वारा इंजेक्शन तकनीक की जाँच करें। अंत में, एक अनुभवी सहयोगी के साथ परामर्श के इंजेक्शन तकनीक में सुधार करने के लिए सहायक हो सकता है।

एक दूसरे गैर अतिव्यापी एक संशोधित mRNA कि राज्यमंत्री द्वारा मान्यता प्राप्त नहीं है ईमानदारी Ciona में unspecific प्ररूपी प्रभाव शासन से बाहर कर सकते हैं साथ एमओ एवं बचाव बंद लक्ष्य प्रभाव को नियंत्रित करने के लिए।

Microinjection: महत्व और सीमाओं

Ciona में Microinjection एक कोरडेट 11 में एक पूरे भ्रूण जीन विनियामक नेटवर्क (GRN) के लिए पहला खाका उत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया था। हालांकि, इस तरह के एक rema के बावजूदrkable उपलब्धि, Ciona भ्रूण में microinjection Ciona अंडे के अपेक्षाकृत छोटे आकार (व्यास में 0.14 मिमी) के कारण, सीमाएँ हैं। अन्य प्रजातियों कोरडेट जहां विदेशी डीएनए / mRNA microinjections द्वारा शुरू की है उन लोगों की तुलना, Ciona अंडे को संभालने के लिए अपेक्षाकृत मुश्किल हो जाता है और प्रयोग के प्रति इंजेक्शन Ciona भ्रूण की दर (प्रयोग के प्रति औसत 30 से 50 भ्रूण पर) कम रहता है, मात्रात्मक विश्लेषण बाधा। फिर भी, Ciona में perturbing मातृ कारकों के लिए, राज्यमंत्री के microinjection पसंद की विधि भी 16 से 32 सेल से विकास की युग्मज शुरुआत में उनकी भागीदारी चरणों में 15 अध्ययन करने के लिए है। इसके अलावा, यह बहुत अधिक मुश्किल 16-32 सेल चरण के लिए अलग-अलग blastomeres microinject को हालांकि संभव है। अंत में, microinjection, Ciona के अलावा अन्य प्रजातियों में ascidian (mRNA या डीएनए इंजेक्शन द्वारा) ट्रांसजेनिक भ्रूण पैदा करने के लिए सबसे कारगर तकनीक बनी हुई है जो पूरी तरह से optimi के लिएजेड electroporation प्रोटोकॉल मौजूद नहीं है।

Electroporation: महत्व और सीमाओं

कम संख्या और microinjection के अन्य बाधाओं को दूर करने के लिए, Ciona समुदाय के सबसे 2004 9 में प्लास्मिड डीएनए की electroporation का इस्तेमाल किया गया है क्योंकि यह विकसित और Zeller एट अल द्वारा एक अनुकूलित और मानकीकृत प्रोटोकॉल के रूप में प्रकाशित किया गया था।। वास्तव में, ट्रांसजेनिक Ciona भ्रूण के हजारों 500 भ्रूण एक साथ एक क्युवेट में electroporated अप करने के लिए 16 मिसे के लिए एक एकल 50 वी नाड़ी का उपयोग कर के साथ एक घंटे के भीतर उत्पन्न किया जा सकता है। ट्रांसजेनिक भ्रूण की भारी संख्या को पैदा करने का दृष्टिकोण अभी भी कोरडेट मॉडल जीवों के बीच अद्वितीय है। इस रूप में यहाँ एक उदाहरण प्रस्तुत किया संभावित सीआईएस -regulatory क्षेत्रों और सेलुलर / subcellular स्थानीयकरण का विश्लेषण करती है जल्दी विवो में प्रदर्शन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली के रूप में मान्यता प्राप्त होना Ciona का नेतृत्व किया था।

हालांकि electroporatiCiona युग्मनज में मौलिक कोरडेट GRN अनुसंधान के क्षेत्र में क्रांति ला दी है, फिर भी कुछ तकनीक सीमा चेहरे। सबसे पहले, plasmids क्षणिक Ciona भ्रूण में पेश कर रहे हैं और सबसे अधिक संभावना extrachromosomal सरणियों के रूप में विरासत में मिला रहे हैं, electroporated प्लास्मिड डीएनए सट्टा की स्थिरता रही। इसके अलावा, यह electroporated plasmids कि युग्मनज प्रति उठाया जाएगा की प्रतियां को नियंत्रित करने के लिए, इस प्रकार प्ररूपी उतार चढ़ाव में जिसके परिणामस्वरूप बहुत मुश्किल है, शायद यह भी असंभव है। एक और समस्या यह है कि यह electroporation परिणामों की व्याख्या करने के लिए कठिन बना देता है कि एक घटना हम mosaicism कहते हैं। Electroporated प्लास्मिड डीएनए एक सेल चरण भ्रूण के विभिन्न पदों पर ले जाया जा सकता है; जो निर्धारित करता है जो और कैसे युग्मनज के कई तिमाहियों प्लाज्मिड प्राप्त होगा वंशज blastomeres से विरासत में मिला हो। इस तरह के बदलाव के स्पष्ट रूप से मात्रात्मक प्रभाव की व्याख्या अधिक कठिन है। हालांकि, ज्यादातर समस्या है कि electropora के साथ आएtion परिवर्तनशीलता गिनती और lacZ (या GFP) सकारात्मक कोशिकाओं है, जो एक ही बैच में आसानी से प्राप्य है के आंकड़ों के साथ जैविक नमूने का एक उचित मात्रा द्वारा हल कर रहे हैं।

बहुमुखी प्रतिभा और जेनेटिक इंजीनियरिंग के लिए electroporation की संभावित

Electroporation अंत में संभावित सीआईएस -regulatory क्षेत्रों और जीन समारोह के मात्रात्मक विश्लेषण एक बार पत्रकार या अभिव्यक्ति plasmids में क्लोन के मध्य throughput प्रदर्शन के लिए अनुमति देता है। कॉम्पैक्ट Ciona जीनोम के कारण, पहचान करने और संभावित विनियामक क्षेत्रों की क्लोनिंग काफी 3 सीधा है। समुदाय डेटा के धन के उपयोग के लिए एक रणनीति चित्रा 2A में प्रदर्शन किया है। रिपोर्टर और जीन कोडिंग plasmids की क्लोनिंग आगे अनुकूलित Ciona की पीढ़ी से मदद की है, गेटवे संगत वेक्टर सुइट्स 19 और एक संगत पूरी लंबाई ओआरएफ पुस्तकालय 18। दोनों उपकरण समुदाय के लिए उपलब्ध हैं औरके रूप में चित्रा 2 बी में दिखाया गया है, नियामक चालकों और कोडिंग क्षेत्रों के कुशल, प्रतिबंध एंजाइम मुक्त पुनर्संयोजन के लिए अनुमति देते हैं।

हाल के वर्षों में, electroporation सफलतापूर्वक plasmids कि ऊतक विशिष्ट चालकों 21,22 के नियंत्रण में CRISPR / Cas9 घटकों जैसे जीन संपादन उपकरण का इजहार साथ ऊतक-लक्षित जीन में गड़बड़ी प्राप्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था। इस तरह के दृष्टिकोण जल्दी GRNs की गतिशीलता और प्रतिलेखन कारक ऊतक गठन में शामिल कोड और pluripotency से चरणबद्ध बाहर निकलें सहित संभावित संरक्षित संकेतन तंत्र, के बारे में हमारी समझ को अग्रिम जाएगा। इसके अलावा, ऊतक विशेष नुकसान या लाभ के समारोह दृष्टिकोण (CRISPR / Cas9 द्वारा या overexpression द्वारा) electroporation का उपयोग करते हुए मानव रोग से जुड़े जीन की Ciona orthologs अध्ययन करने के लिए सहायक होगा। दरअसल, मानव रोग जीन की Ciona orthologs और उनकी पूरी लंबाई ओआरएफ क्लोन कोडिंग के लिए कैटलॉग आसानी से availab हैंCiona 1 से 8 में विश्लेषण के लिए ले। रीढ़ में जीनोम विस्तृत दोहराव के कारण, सबसे मानव जीन कार्यात्मक निरर्थक paralogs कि जीन समारोह 1 के विश्लेषण को मुश्किल होती है। Ciona ऐसे महत्वपूर्ण है, अक्सर कार्यात्मक संरक्षित जीन की मौलिक भूमिकाओं को उजागर करना चाहिए लार्वा में ठेठ कोरडेट ऊतक व्यवस्था के साथ एक सरल प्रणाली जा रहा है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab with constant temp. (~18 °C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC - Station Biologique,
Roscoff, France
For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic Petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1 M pH 9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12 hr
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5 ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2 ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K4Fe(CN)6•3H2O Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5 mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
anti-HA tag antibody abcam ab9110 for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT
TRITC goat anti-rabbit antibody Jackson 111-025-144 for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT

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References

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भ्रूण Microinjection और electroporation कोरडेट में<em&gt; Ciona intestinalis</em
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Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).More

Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).

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