Summary
私たちは、 カタユウレイボヤにマイクロインジェクションやエレクトロポレーション技術を使用して、脊椎動物への脊索動物の姉妹グループを、一過性遺伝子導入および遺伝子ノックダウンを提示します。このような方法は、脊索とヘッド感覚上皮、およびヒト疾患関連遺伝子の多くのオルソログを含む脊椎動物の基本的な特性を備えています。この単純な無脊椎動物における機能ゲノミクスを容易にします。
Introduction
最近では、ゲノム配列および転写遺伝子レパートリーは、モデル生物の数がアクセス可能となっています。しかし、遺伝子機能のリンクを決定し、これらの接続は、胚の時間と空間全体の転写活性を実行するためのDNAにハードワイヤードされているか、特に脊椎動物では、主要な課題のまま。特に脊椎動物における規制の相互作用の複雑さとゲノム1,2の複雑さは、in vivoでの DNAレベルで特に効率的な機能解析を、スローダウン。確かに、何GRNは、現在開発生物の最後の、最終分化状態に受精から分析されていません。
ホヤC.腸管は、そのような完全なGRNは可能かもしれない解析モデル生物を表します。これは、少しの遺伝子の冗長性と無脊椎動物の典型的な重複しないゲノムを持っています。脊椎動物では、対照的に、肝炎ゲノム重複の2ラウンドを受けましたeは、より大きな遺伝子ファミリーと機能の多様化だけでなく、パラログ間の冗長性を生成しました。 C.のコンパクトなシス -regulatoryシーケンス（GRNsの制御ユニット） 腸管 、および少数の細胞で不変の胚系統は、Cを連想させますエレガンス 。さらに、脊索動物内の脊椎動物への無脊椎動物の姉妹グループとして独自の系統学的位置が形成脊索動物のボディープラン3-6で、セルラー解像度で、発達の観察を可能にします。
モデル生物における機能ゲノミクスの将来の成功を保証する重要な問題は、定量的なin vivoでの摂動のための胚の多数の生成です。 Ciona卵 7におけるマイクロインジェクション技術の開発、および迅速Ciona接合体8,9の何百ものin vivoエレクトロポレーションにより多くの一過性トランスジェニック動物を得る可能性がで突破口となっています
Protocol
Ciona卵と接合体におけるマイクロインジェクションやエレクトロポレーション1.準備
- 胚の培養にHEPES（ASWH）と10 L人工海水を準備します。 420 mMのNaClを、9のKClを溶解し、10mMの塩化カルシウム2・2H 2 O、24.5のMgCl 2・6H 2 O、25.5ミリモルのMgSO 4・7H 2 O、および2.15 mMの二重蒸留水中のNaHCO 3（のddH 2 O）一晩攪拌することによって。 5 mMのHEPES pHが8.0を追加し、確認してください/ 8.0にpHを調整します。 4℃でASWHを保管してください。 18°Cにそれをウォームアップし、使用前にろ紙でそれをフィルタリングします。
- 20％のチオグリコール酸ナトリウム、ASWHの1％プロナーゼ：20倍、不活性化dechorionation溶液を調製します。 -20℃で500μlのアリコートを保存し、使用前に10ミリリットルASWHの最終体積に希釈します。
- 卵/胚のために15〜20培養皿を準備します。 1〜2ミリメートル薄い層でそれらを被覆し、3.5、5、9または15センチメートルペトリ皿にASWH内の溶融1％アガロースを注ぎます。アガロースが固化し、ASWHでプレートをカバーしてみましょう。 1〜2週間の最大のために4℃でそれらを買いだめ。使用前にASWHを交換してください。
- 特殊な注射料理を準備します。
- アガロース5センチメートルペトリ皿に溶け1％5-7 mm厚の層を注ぎ、そしてアガロースの凝固時にインデントを生成する（例えば、プラスチックカバースリップに接着開閉ジップロックなど）アガロースに金型を配置それは、卵を保持することができます。 5注入皿に4を用意し、ASWHでカバー。 4℃で保存し、使用前に新鮮なASWHと交換します。 （最大1日齢）注射のための唯一の新鮮なプレートを使用してください。
- 1mMのMgCl 2・6H 2 O、3 mMのK 4 [Fe（CN）6]を・3H 2 O、3 mMのK 3 [Fe（CN）6]をリン酸緩衝中：βガラクトシダーゼ（LacZの）染色バッファーを準備しますツイーン（PBT）（137ミリモルのNaCl、2.7ミリモルのKCl、10mMののNa 2 HPO 4、2mMのKH 2 PO 4、0.05％ツイーン）と食塩水（PBS）。ショップInは4℃で暗いです。するまで-20℃で40 mg / mlとでジメチルホルムアミド（DMF）のアリコートと店舗在庫でのLacZ基質5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリルβ-D-ガラクトピラノシド（X-galを、10 U / ml）を調製つかいます。
- くっつくの胚を防止するために、水道水に一晩パスツールピペットを浸します。
- 注射針を準備します。
- （415のフィラメントランプテストから）、75速度75と時刻200を引き出し、そのような熱425のような条件でマイクロピペットプラーを設定します。
- 通常、先端に閉じ8〜10長い、細い針を製造するために4〜5フィラメント含有ガラスキャピラリーを引き出します。ヒントを破る避けるために、高架支持体上に粘着テープを倍に付着したゴミを無料ニードルボックスに針を格納し、針の充填に便利です。
注：緑の重要な色素で、いくつかの卵を注入することにより得られた針をテストします（セクション6で説明したように）と微調整を可能にする先端形状を得るための条件を引っ張って針とrepetitを調整6.6で説明したように、注射をアイブ。
- 注射液を準備します。注射液の4μLを準備し、 例えば 、2 mMのMO、を10μg/μlの緑生体色素と1μlののddH 2 Oの2μlに1μlので構成される0.05〜0.5μgの/μlのキャップされたmRNAまたは実験的な質問に応じたプラスミドDNAの20 ngの/μlの最終濃度を追加します。よく混ぜます。解決策は、mRNAが含まれている場合は、氷上で保管してください。
配偶子の2コレクション
- 18°CでCiona大人の解剖は、胚の部屋を冷却します。小さなハサミを使用して、（短い）卵管と精子ダクトランその下でサイフォン呼気の側にサイフォンと対向する端から開始します。
- 卵管を露出させ、微妙にハサミの先端を使用して、卵管の切開を行います。優しく例えば剥離閉じたハサミで卵管を押してASWHを含む6ウェルプレートに直接流出卵をドロップGS。パスツールピペットASWHで予めすすいで、残りの卵を移します。
- 異なるウェルに異なる動物から卵を付着させます。解剖顕微鏡下で卵の品質を確認します。
注：まあ開発卵の色がわずかに黄色へのラウンドとピンクです。これらは、非細胞卵黄コート、卵の周りに明確に定義された卵黄周囲の空間を形成する絨毛膜に囲まれています。絨毛膜は、その外側に、その内側と星型包細胞で試験細胞と関連しています。低品質の卵は、多くの場合、囲卵腔または包細胞を欠いています。彼らはより少ないラウンド、より細かいまたは色が異なって表示されます。未成熟卵母細胞は小さく、銀白色を持っています。 - はさみで精子ダクトをカットし、独立したパスツールピペットを用いて、1.5mlチューブに濃縮された精子を集めます。同じチューブに（少なくとも二つ）の異なる動物から精子をプール。数日間、4℃で保存精子。
3。受精
- ステップ2で説明したように18℃で精子と卵を収集します。
- 精子をアクティブにします。
- 1.5mlチューブに1ミリリットルASWHを準備し、1 MトリスpH9.5の50μlのミックス。その後、濃縮された精子の20μlを添加し、穏やかにチューブを転倒混和。
- 小さなペトリ皿のカバーやスライドガラス上に配置された精子のドロップで精子活性化を確認し、解剖顕微鏡下で観察します。 spermatozoidsは必死に泳いする必要があります。
- （100〜1,000卵の間含む）卵の各ウェルに活性化精子液の100から200μl加え、ピペッティングによりよく混ぜので、卵は培地中に浮遊しています。胚を移動させずに10分間待ちます。
卵や胚の4 Dechorionation
- ASWHで10ミリリットルに20倍dechorionation溶液500μlのアリコートを希釈します。 2の滴下200μlのを追加することにより、dechorionationソリューションをアクティブにします。10ミリリットルの1x dechorionation溶液に5 M NaOHで。乳白色の沈殿物が形成されます。静かにチューブを転倒混和。
- （10分は、ステップ3.3で待機した後に）パスツールピペットを用いて、ガラス管の中に卵や接合体を収集します。 （1,000〜5,000卵/管の周りに）一本のチューブに2〜3匹の動物から卵をプール。チューブの底に胚ペレットを形成するために、約20秒間高速（1200 XG）で回転することにより、手の遠心分離機で土砂。ゆっくりと遠心機を停止し、パスツールピペットでASWHを削除します。
- 各チューブ内のペレット化の卵/接合体に活性化dechorionation液の4ミリリットルを追加します。卵をサスペンド/静かにそれらをピペッティング水道水で処理したパスツールピペットを用いて、接合体は、小さなゴム梨をトッピング。解決策は、1-3分後に黄色がかっ有効にしてください。
- パスツールピペットを使用してdechorionating卵/接合体懸濁液の小アリコートを除去することによってdechorionationに従ってください。スライド上のドロップを堆積し、解剖の下で観察します対処。上下の卵/接合体をピペット保ち、毎20〜30秒を確認してください。
注記：ファースト包細胞を切り離し、その後、絨毛膜は、黄色と不透明になり、最終的にはそれが接合体から切り離します。ピンクの卵/接合体は、ガラス管の底に沈んでしまうdechorionated。 dechorionationは最大以上かかるべきではありません。 5分。 - 卵/接合体の50％がdechorionatedされるとASWHでチューブを埋めます。
注：非常に軽く遠心（8 XG）だけで十分なdechorionated卵/胚を沈降することは非常に低速に相当する約10〜15秒間。チューブの底に卵/接合体のペレットを混乱しないようにゆっくりと遠心分離機を停止します。 - 不完全dechorionated卵/接合体と浮遊物質を含むガラス管からほぼすべての液体を除去し、ASWHと交換します。ゆっくりピペットと洗い流し、ゆっくりとステップ4.2のように再び遠心分離します。また、重力によって落ち着く接合体を待ちます。何の絨毛膜の破片がlでなくなるまでもう一度洗いますEFT。
- 転送卵/接合体を新たにパスツールピペットを用いて培養皿をすすぎ洗いします。一緒に粘着するのを避けるために（10cmディッシュあたり200の胚の周りの）低密度で接合体（ない卵）を保管してください。培養13と20℃の間の温度で所望の段階までの胚。また、接合体（ステップ5）、エレクトロポレーションまたは未受精卵（ステップ6）を注入します。
5.エレクトロポレーション
- 卵を受精し、セクション3と4のように18℃の接合体をdechorionateエレクトロポレーションサンプルあたり50〜400卵の間に提供します。
- 1.5ミリリットルチューブ（最大のddH 2 O50μl中100μgのプラスミドDNA）で50μlのプラスミドDNAを調製し、200μlの0.95 Mマンニトールを追加します。ボルテックスでよく混ぜます。
- 発送と重力がシリコン処理1.5ミリリットルチューブでdechorionated接合体を沈降します。チューブに100μlのマークまでASWHを削除します。
- 次のように各接合体管のために、連続して、続行します。addパスツールピペットを用いて、DNA /マンニトール溶液。静か接合体と混合し、瞬時に、4mmのエレクトロポレーションキュベットにDNA /マンニトール/接合体懸濁液と転送を取ります。
- エレクトロポレーションホルダーにすぐにキュベットを置き、50 Vで16ミリ秒の単一パルスを与えます
- 同じパスツールピペットを用いてキュベットから接合体を取り外し、新鮮な、そして濾過ASWHを含む培養皿上にそれらを広げ。彼らは18℃で約1時間後に受精（HPF）の切断を開始する前に、接合体をピペット。
- ASWHのビーカー内のサンプル間のピペットを洗浄します。
- 文化10cmディッシュあたり約200の胚の十分に低い密度で15-20℃の接合体は、一緒に粘着するのを避けるために。
6.マイクロインジェクション
- 注射用Dechorionated卵を準備します。
- セクション4に記載のように、2-4の動物から、別に卵をDechorionate未受精とdechorionated電子メールをください別の小さなアガロースコーティングした培養皿でGGS。破片を除去するために皿に卵を数回洗浄します。
- テストは、各個体から（50前後）dechorionated卵の小さなバッチを肥やします。各バッチのための独立した5cmのディッシュを使用し、2μlの活性化された精子（ステップ3.2）を適用します。料理を渦巻くことでよく混ぜ、横料理を動かすことによって、皿に卵を広げます。移動せずに約10分間精子と卵を一緒に保管してください。
- 次のように精子の最大の排除：新鮮な培養皿に受精卵を転送したり、新鮮なASWHで二回すすいでください。 （約3時間後の受精のために18℃で）32細胞期までの非摂動切断胚を残します。マイクロインジェクションのために最良の開発バッチ（受精の最高の割合とほとんどの定期的な切断パターン）から卵を選択してください。
- 注射針を設定します。
- FL重力を可能にするために垂直位置で4注射針を埋め戻しフィラメントに沿ってOW。針は先端を下に配置されている針のバックエンドで緑色の生体色素を含む預金は0.5μlの注射液（ステップ1.8）。下部に針の先端を埋めるために、液体のを待ちます。
- 水平方向の針の位置を変更し、罰金と長い金属またはプラスチックピペットチップを使用して、鉱物油でそれらを埋め戻します。ゆっくり針を充填しながら、すべての気泡を排出鉱油で注射液をオーバーレイ。
- セットアップ18°Cでのマニピュレーターは、部屋を冷却しました。
- 鉱物油が充填された10mlのガラスシリンジに針ホルダのプラスチックチューブを接続します。オイルとチューブと針ホルダを埋め戻し、任意の気泡を追い出します。
- ニードルホルダーに針を挿入し、マイクロマニピュレーターにホルダーを配置します。
- 表面に対して45°の角度で直線に沿って針ホルダの動きを調整します。
- オリエントdechoriona卵を解剖顕微鏡下で一つずつ注入することができるように、注射皿のアガロースインデント沿っテッド卵。
- 必要に応じて、そっとアガロースに対するまたはアガロース上に配置されたガラスカバースリップの一部に対して針を押して、針の先端を破ります。わずかに針の先端が開いた（緑の針の内容が追放されます）であることを確認するために、シリンジのノブに圧力をかけます。
- 最初の卵に針を導入し、わずかに注射した卵膜を破壊するために吸引することにより、1により未受精卵の1を注入します。セル径の1/3の最大の卵の中央に緑の注射液を注入します。 （これは、140ミクロンの卵の直径は約30 PLに相当します）。
- 新鮮な培養皿に注入された未受精卵を転送し、受精するまで15-18℃でそれらをインキュベートします。
- テスト受精（ステップ6.1.2）のように新たに活性化した精子を注入した卵を受精。 Eliminat新鮮な培養皿に接合体を転送することにより、精子のEAの最大。胚を広げ、（32細胞期まで）の切断段階でそれらを混乱しないでください。
- 培養13と20℃の間の温度で所望の段階までの胚。
- プレートの中央にそれらを旋回し、シリコン処理1.5ミリリットルチューブにそれらを転送することにより胚を収集します。修正し、汚れ、またはマウント（ステップ7,8）。
- 制御注入された胚に得られる表現型を比較。
注：同一の表現型を得るために、同一の転写産物を標的とする第二の、非重複MOを注入。修正されたmRNAは、目的のタンパク質をコードするが、それは、MOSによって認識されないと、特定のMO表現型（複数可）を救出。何の表現型を与えない対照MOを注入します。
7.のLacZ染色
- シリコン処理1.5ミリリットルチューブ内の所望の段階で胚を収集し、15のために1ミリリットルASWH中の0.2％グルタルアルデヒド中でそれらを修正30分最大。
- 1ミリリットル1X PBTでの洗浄2回10分。
- 500μlのLacZ染色バッファーで一度すすいでください。 X-gal基質を補充した1ミリリットル染色バッファーを交換してください（10μL/ 40ミリグラムのミリリットルを使用/ mlのX-Galをストック）。染色のよりよい観察のために12ウェルプレートに胚を移します。
- 暗闇の中でインキュベートします。 0.5時間のインキュベーションを変化させるために一晩4℃でのLacZを発現しているドライバの強さに応じて、室温でまたは37℃で。
- 染色緩衝液を除去するために1ミリリットル1X PBTで4倍に胚を洗浄します。
- 1ミリリットル中の2％パラホルムアルデヒド（PFA）1X PBTまたは染色された胚の解釈および視覚化のために1ミリリットル中の0.2％グルタルアルデヒド1X PBTを用いて室温で10分間ポスト修正。
蛍光標識Wmbryos 8.取り付け
- 1ミリリットルASWH 2％PFAで20分間希望の発達段階の胚を修正しました。
- 胚は1ミリリットル1X PBTで2倍洗います。任意の光エキスポを避けます暗いところでの胚を保つことによってURE。
- 1のスライドに50胚まで転送します。ペーパータオルで最初にピペットで、慎重にPBTの最大値を削除します。
- 20〜25μlのマウンティング培地を追加します。
- （第1の側から）の角度でそれを配置することによってカバースリップを追加し、ゆっくりとサンプルが覆われているまで、泡を避け先のとがっ（針、鉗子、ピペットチップ）でそれを下げます。透明なマニキュアのドットを使用して、その縁でカバーガラスを固定してください。
- 乾燥後のマニキュアと全体カバースリップを封印。 -20℃の暗所で保管してください。
Representative Results
遺伝子制御ネットワークの研究のためのマイクロインジェクション
ホヤカタユウレイボヤの胚細胞系譜レベルおよびセルラー解像度での遺伝子の機能や遺伝子調節の研究に非常に適しています。 mRNAに、MOSまたはラベルが未受精卵に、または受精を以下の個々の割球に微量注入することができます。マイクロインジェクション技術を用いてノックダウンMO媒介遺伝子を特異的に選択された遺伝子のmRNAを標的とタンパク質にその翻訳を妨げるステップ6のMOに記載されています。 MO媒介機能喪失（LOF）発生遺伝子のは全体の胚GRN 10を垣間見るを明らかにし、下流遺伝子の広範な配列の発現を変化させます。 Cionaでのこのような分析は、後生動物の11の最初の全胚の規制青写真を提供する。1ディスプレイにどのようにmicroinjectiの例を図上Ciona胚の原腸段階で保存されたCiの -Myelin転写因子（CI -MYT）の発現の上流調節を研究するために利用されました。 in situハイブリダイゼーション（ISH） でによって監視、内因性発現（ 図1a 'に図式図1aは 、）は、特に脳（行III / IV、赤）および脊髄（の、6行神経板の前駆体で観察されます緑の行I、）。また、Ciの -MYT上流調節はで発現またはC -MYT発現開始（ 図1b-g）の前に神経前駆体に隣接しているいくつかの因子を標的とMOの注入によって分析しました。このようなフォークヘッドボックスなどの初期胚因子のMOノックダウンAA（フォクサ-a）は、転写因子および線維芽細胞増殖因子9/16/20（FGF9 / 16/20）（それぞれ、 図1Bまたは1Cは 、）全体のCiの -MYTを排除します表現。他の転写因子部分的にしか脳前駆体（ 図1dと 、fとgの青い矢印の頭）のサブセットでMO媒介ダウンレギュレーションの結果Ciの -MYTの発現に影響を与えます。逆に、Ciの -MYT発現は異所結節は、通常、これらの横方向の神経索の前駆体でCiの -MYTの発現を抑制することを示唆し、節点（ 図1eと 、赤い矢印の頭）のダウンレギュレーションによって活性化されます。
効率的な遺伝子の機能およびエンハンサー研究のためのエレクトロポレーション
Ciona接合体へのプラスミドDNAのエレクトロポレーションは、一過性遺伝子導入およびin vivoでの表現型の変化のその後の観察のための効率的な方法です。 mRNAのマイクロインジェクションは異なり、エレクトロポレーションは、遺伝子のコード領域（のORF、オープンリーディングフレーム）の制御下で発現される、組織特異的過剰発現を可能にします組織固有のドライバの。これらは通常、（そのような脊索前駆体8での発現のための短尾エンハンサー）のよく知られている遺伝子のシス -regulatory領域を構成しています。逆に、エレクトロポレーションは、レポーター遺伝子（LacZのまたは緑色蛍光タンパク質、GFP）は、インビボでその活性を明らかにする新規な調節領域の効率的な分析のための器械です。識別および（CI -MYTための）そのような新規な調節領域のその後のエレクトロポレーション媒介性分析のためのワークフローは、図2に示されています。
Cionaコミュニティデータの膨大なレパートリーは、ホヤ、ネットワーク内のための現場での発現および発生学的データ（アニス）23のようなホヤ、特定のゲノムブラウザ12,13、中に容易にアクセス可能、調節領域（ 図2A）のインシリコ識別のために検査されます。その後のポリメラーゼ連鎖反応（P発現ベクターへのこれらの領域のCR）ベースのクローニングin vivoでのエレクトロポレーション媒介テストを行うことができます。（ 図2B）。 図2Aにおけるゲノムブラウザ画面ショットは（オレンジ色で、最初の3つのエキソン、および2つのイントロンが表示されている）Ciの -MYTためのKH転写産物モデルの上流領域を示しています。異なるゲノムブラウザトラックは、機能ゲノムデータは、クロマチン免疫沈降（チップ）（ここでZicL、小脳LのCiの -亜鉛フィンガーのために示した）データ14、二つの関連Ciona種 15,24またはヌクレオソーム間の配列保存として、この地域の予測注釈を付けます占有16,17（上から図2Aの下へ）。一般的に、エクソンのタンパク質コード領域は非常に（ 図2Aにおける配向トラック）に保存されています。追加の高い保護ピークは、上流の非コード領域にし、最初のイントロンに表示されます。これらのうちの2つは、ヌクレオソーム自由Aであると予測されていますシーケンスベースのアルゴリズム16,17の転写因子に接近可能性を示唆している（ 図2Aの赤枠）にccording。実際、結合Ciの -ZicL転写因子のためのチップオンチップ信号14（ 図2Aの緑色のバー）は、これら2つの保存された領域に濃縮されています。さらに、潜在的な転写因子結合部位を検索インターフェイス25を使用して、我々は、C -ZicLのChIPクラスター（下線付きのZIC-コア、 図2Aとオレンジ色の矢印とシーケンス）でマークされたゲノム配列内に位置ZICサイトを同定しました。 Ciの -MYTの自由な調節領域は、予想通りZicL（ 図1D）を標的MO-注入によるノックダウン実験で観察されたCiの -MYT発現のダウンレギュレーションと一致しているヌクレオソーム保存さでCiの -ZicL転写因子の結合と。
後抑止Ciの -MYT発現のためのin silicoの潜在的なシス -regulatory領域を採掘し、これらのPCRはCionaゲノムDNAから増幅し、LacZレポータープラスミド19へのクローニング組換えにより挿入されています。構築物はその後受精Cionaの卵（ 図2B）にエレクトロポレーションおよびLacZ染色によるそれらの活性（ 図3）について分析します。
図3は 、このようなことによりインシリコアプローチでは、Ciの -MYT mRNA発現ドメイン（ 図1aと比較）を再現する二つの別々 のシス -regulatory配列を同定することが可能であったことを示しています。一般的に、一過性トランスジェニック胚は、DNAを取り込んだ細胞のみでのプラスミドDNAのショーモザイク表現でエレクトロポレーション。モザイクLacZ発現は、このようにpmyt-R3によって駆動され、また、Ciのを表現するすべての前駆体で見つけることができます図3a、B、紫と赤の矢印の頭）。これとは対照的に、pmyt-R5は、神経板前駆体だけ後方（行I）において活性であると、後神経胚段階（ 図3c、赤い矢印の頭）で始まります。二つの領域は、このようにCI-MYT遺伝子調節の二つの別個の空間的および時間的な側面をコードします。興味深いことに、両方の調節領域は、（それぞれ、 図3a、B、ピンク、白、黄色の矢印の頭）は、特に前方および横方向の神経板にし、筋肉に、ISHでは見られない追加の前駆体を染色します。このような幅の広い表現は（横神経運命を抑制するなどのNodalのような図1eのを参照）、単離された規制の断片に含まれていない要素を抑圧するためにポイントまたは蓄積して検出された低発現レベルにありLacZの酵素信号。
エンハンサーの研究に加えて、Ciona内エレクトロポレーションはまた、彼らの過剰発現によりCionaコードする遺伝子の機能解析を容易にします。 Ciona全長ORFの大規模なコレクションは、コミュニティに利用可能で、さらには疾患関連遺伝子18を含むヒトのオルソログ、のために注釈をつけました。個々の遺伝子またはこの組換えクローニング互換完全ORF cDNAライブラリー（ 図2B）からの遺伝子のグループを容易に胚で発現される適切なドライバを含むデスティネーションベクターに移します。得られた発現クローンは、さらにシス -regulatoryレポーターと同時エレクトロポレーションすることができエンハンサー活性化におけるそれらの推定役割をテストするために構築する。 図2Bは、転写因子Ciの -ZicLとCI-GATAaとそのrecombinatioのための完全なORFクローンの単離を示してnは、このような初期のパン-外胚葉発現の15のためのガタ調節領域（pfogドライバ ）の友達に翻訳タグ19（ 例えば 、緑色蛍光Venus-またはウイルス赤血球凝集素（HA）-tag）と組織特定のドライバが含まれていてもよい適応デスティネーションベクターへ本研究で使用されます。外胚葉および神経外胚葉組織におけるCiの -ZicL過剰発現の効果は、（それぞれ、 図3b '、B'及びC '、C'）pmyt-R3> LacZおよびpmyt-R5>のLacZレポーターの同時エレクトロポレーションによって分析しました。私たちのエレクトロポレーションの分析は、＆ '、B' 'およびcを Ciの -ZicLはpmyt-R3を介しCiの -MYT発現を活性化することができ、両方のレポーター構築物としてpmyt-R5のエンハンサー領域は、外胚葉領域における異所性LacZ発現（ 図3bで緑色の矢印の頭を示したことを示唆しています＃39;、C ''、）。 図3dに示すように、Cionaの卵の数百のプラスミドDNAのエレクトロポレーションは、濃度依存性、汎外胚葉Ciの -ZicLの発現の際に、異所性pmyt-R3> LacZ発現のために示した発現変化の統計的に関連定量を可能にします。
in vivoでの細胞内局在のためのエレクトロポレーション
（ 図2Bに図式化）適応発現構築物を使用して、外胚葉割球にエレクトロポレーションの際に発現された場合、図4は、タグ付けされた転写因子の細胞内局在を示しています。金星タグ（ 図4b）、またはHAタグ（ 図4c）と（例えばCiの -GATAaなど）のC末端タグ付け転写因子による及び外胚葉組織でそれらを過剰発現（pfog）我々は、転写因子のために予想されるように金星の発現は細胞質を含む、ユビキタスであるのに対し、in vivoで、「Ciの -GATAaは主に、核に局在していることを観察することができました。同様の実験は、おそらく異なるタグとの共局在を明らかに、個々のまたは転写因子の組合せの、経時的細胞内局在のダイナミクスを研究するために行われてもよいです。
図1：WTおよびモルホリノ（MO）でCiona卵のマイクロインジェクションによって評価Ciの -MYT規制 Ciの -MYT mRNAの発現は、胚に注入しました。神経板でCiの -MYTの（a）は、WT発現パターン。 （A '）神経板（NP）で染色された前駆体の模式図。ロウI / II：後方神経運命。行III / IV：前方神経の運命。行V / VI：PALP運命。 （
図2： シリコエンハンサー領域の探索と再結合に Ciona胚におけるエレクトロポレーションによる一過性の遺伝子導入のためのクローニングのためのワークフロー （A）アニス23子嚢からスナップショット。MYT -ディアンゲノムブラウザは、Ciの上流の調節配列を同定します。レッドフレームは、二つの潜在的シス -regulatory領域をマークしpmyt-R3（scaffold_196：76883..77079）とpmyt-R5（scaffold_196：75856..76041）エレクトロポレーションによって分析のために選択しました。トラックの名称：ZicLプローブ：チップオンチップデータ14。 KH2012転写物：Cionaは、転写物のモデルを腸管 。アラインメントスコアのCs / CiのLastZ：Cionaのsavignyi（CS）/ カタユウレイボヤ （CI）15,24間の配列保存。シーガル2006は、ヌクレオソーム占有バージョン1予測：シーガルらによって計算アルゴリズムを訓練されたひよこを、2006年16 Khoueiry らのようにCIに適用され、2010年17グリーンバー：Ciの -ZicLチップ14をピークに、。。。オレンジ色の矢印は：ZICサイトを予測しました。 GCTG：コアZIC結合部位。 CIONから過剰発現構築物を生成するための（B）スキーム。その後、in vivoでの読み出しCiのための（例えばpmyt-R3>のLacZまたはpmyt-R5> LacZのような）レポーター構築物で同時電気穿孔組織固有のドライバ（pfog）およびタンパク質タグを含むデスティネーションベクターに組み換え全長ORF cDNAライブラリー、 - MYT、Ciの -myelin転写因子; Ciの -ZicL、小脳L転写因子のCiの -亜鉛フィンガー;。pfog、GATAのCiの -Friendの調節領域は、 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
。図3：ミッドgastrulでCiの -MYTのLacZ染色された胚のCiの -ZicL誘導時空シス -regulationを示すエレクトロポCiona胚（MG）/後期原腸胚（LG）または初期神経胚（JA）ステージは> pmyt-R3>のLacZまたはpmyt-R5> LacZおよび対照構築物（pfog> mCherryを）またはpfogのいずれかと同時エレクトロポレーションしたことが示されていますZicL。 pfogドライバ 19は、外胚葉および神経外胚葉における異所性（パン・動物）ZicL発現を仲介し、これらの細胞における異所性のLacZ染色を引き起こします。ミリガウス/ LGの段階の胚（小さな矢尻、左パネル）または相応に着色された模式的な地域で（a）は pmyt-R3 LacZ活性（青丸、右パネル）。植物ビュー（VG）。ロウI / II：後方神経運命。行III / IV：前方神経の運命。行V / VI：PALP運命。 （b）の中のような組織でEN段階でpmyt-R3の活動を。 Ciの -ZicL共エレクトロポレーション時に（B '）異所性pmyt-R3活性は、緑の矢印で示されています。 （B ''）Bと同じ胚'、指向動物極アップ（）。 （
図4：金星タグ付きまたはHemagglutinin-（HA）のエレクトロポレーションローカライズの際にタンパク質の差動細胞内局在は pfogドライバ 19を使用して、外胚葉細胞で過剰発現するタンパク質をタグ付き。 （ - c）は DIC画像。蛍光画像を、対応する（A '、B'）。 （C '）TRITCによる免疫組織学的ラベリング時に対応する蛍光画像。スケールバー= 100μmのは、すべての画像を参照します。 DIC、微分干渉コントラストが。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
RNAまたはDNAのマイクロインジェクションおよびDNAのエレクトロポレーション：トランスジェニックCionaの胚を生成するための2つの主要な技術があります。 Ciona胚における遺伝子摂動のためのこれらの技術は、最初の7,8、1990年代に、その後に連続的に改善され、現在、世界Ciona（および他のホヤ属）20で利用から使用されました。
プロトコルにおける重要なステップ
簡単に大人の動物から採取されたCionaの配偶子に成功した遺伝子導入は重要な要素の数によって異なります。配偶子の品質は（大人2〜4週間健康維持、正しい塩分で）水族館で海の水質で、（水温や酸素とともに変化し、北部大西洋で、一般的に月〜12月）産卵期に依存します、そして最終的に大人からの抽出時の配偶子の正しい取り扱い上、のさまざまなステップについては、以下に詳述するようにプロトコル。
準備段階中に、水道水でパスツールピペットをインキュベートすると、アガロースから放出された有害物質を除去するアガロースでコーティングされたペトリ皿の水のプレインキュベーションを貼付し、海から胚を防ぐことができます。一般に、皿は、細菌の増殖を防ぐために4℃で保存し、使用前に2週間までに調製されてもよいし、使用前に新たにすすぎました。生後1日、小皿は、注射のために最善のようです。
dechorionationの効率性と長さは、開発に悪影響を与えるだろう卵/胚の長期の治療などのプロトコルにおける重要なステップです。 （1週間まで4℃で）慎重な準備（なし振とう）し、正しいストレージdechorionationソリューションの品質を維持。いずれかの混合あまりにも激しく準備時または時間をかけた場合、溶液中のプロテアーゼは長い時間/日間室温に保たれ、特に場合は、効率を失います。私たちは便利な新鮮dechorionation溶液を用いて、この重要なステップを最適化しました20×ストック溶液の凍結アリコートから調製しました。
ピペッティングが有害になりながら、壊れやすいdechorionated卵/胚の正しい取り扱いが不可欠とせん断または胚の刺すようです。ピペッティング、胚は、懸濁液中の水平方向の位置ではなく、縦にガラスピペットを保持しながら、（軽く滑らかなしかし迅速なピペッティングに続いてそれらを旋回する液体を「吹く」による）を可能な限り維持されている場合。このようなケアは、固定前と後、洗浄、再懸濁およびチューブ、キュベットまたはプレートの内と外の卵/胚を転送するためのすべてのピペッティング操作に適用されます。固定時には、特別なケアはまた、固定剤の遺跡から任意の毒性を回避するために、固定された胚に対して、ライブ用に別々のピペット装置に取られるべきです。
マイクロインジェクションはそのサイズが小さいと卵黄膜の弾力性に起因するCionaの卵/胚にかなりトリッキーであると批判の最適化された先端サイズに依存します注射針、注射の完全な角度（卵の半径に沿って1ラインの針の動き、）と（前の注射のための吸引に吸引によって）卵黄膜の微調整、手動の破壊。気泡が完全に吸引/注入圧力を平滑化するための鉱油を含有する注入チューブから除去される場合、後者のみが可能です。また、ほこりや卵破片の最小ピースが針を詰まらせるだろう、と簡単にきれいな労働条件と注入皿に移す前に卵のためのすすぎ工程によって回避されます。ポスト噴射は、新鮮な皿に卵の転送は、注入手順を生き延びた死んでいない胚からの毒性作用を避けることができます。
トラブルシューティング
手順の潜在的な問題は、以下の解決策によって対処することができます。低受精率が不十分な精子活性化、低卵の清浄度や大きな受精・ボリュームから生じる可能性があります。 freshl使用yはプールし、少ない精子を希釈しました。活性化の際に精子の動きを確認してください。ステップ4.2で説明したように、受精前にASWHで卵を洗います。水量を減らし、/よく受精皿当たりの卵の量を減らします。製造工程中の胚を失うことは、より効率的にundechorionated卵/胚下遠心分離機にdechorionation溶液の滴を添加することによって回避することができます。 Dechorionation時間がない堆積物と延長dechorionationは、有毒である胚を爆発させるだろう、部分的にdechorionated卵のように最適化されるべきです。
非同期開発は解剖の際に放出残留精子から生じ得ます。制御不能なクロス受精を回避するために、異なる動物から分離された卵のバッチを保管してください。異常な発達は、さまざまな原因が考えられます。冒頭シーズンの終わりに、分離された別の個体由来の胚を保持した後、最高のバッチを選択してもよいです。以下のための胚を乱す避けます彼らの卵細胞質の分離との干渉を避けるために受精に従って10分。ピペッティングは、部分的な胚における姉妹割球と結果を分離として転送されながら胚を除起動しなかったことを確認してください。多精子受精を回避するために、dechorionated卵のためのより少ない精子を使用してください。新たに調製したが、すすぎアガロース料理をご使用ください。ピペット装置は、固定剤自由であることを確認してください。 dechorionatedないと破壊されたステップの開発で検出するために、エレクトロポレーションされていなかった対照胚を保管してください。汚染や分解が発生した場合、抗生物質との胚を補います。
注入装置は、「目詰まり、 'ている場合、注射針の開口部は、染色されたコンテンツの一部を排出することによって確認することができます。目詰まり物質は慎重にアガロースを介して針の先端をドラッグすることで拭き取ることができます。空気が注入チューブ内の気泡および/または針を削除する必要があります。旧姓のように注入量のより良好な制御のための針を変更DLE先端が破損したり、注射に沿って詰まることがあります。卵をすすぎ、破片が皿の中で蓄積してきた場合は、クリーン注入皿に配置します。どんな小さな粒子または結晶を沈殿させるために、新鮮な針を充填する前に注射液を遠心。また、役立つだけで生体色素の注射を実践されています。注入および非注入卵を受精することによって注入技術を確認します。最後に、経験豊富な同僚と相談すると、注入技術を改善するのに役立つことができます。
オフターゲット効果を制御するために第二の非重複忠実Cionaで非特異的表現型効果を除外することができたMOによって認識されていない変更されたmRNAとMOと救助を。
マイクロインジェクション：意義と限界
Cionaにおけるマイクロインジェクションは、脊索動物11で全胚遺伝子調節ネットワーク（GRN）の最初の青写真を生成するために利用されました。しかしながら、このようなREMAにもかかわらずCiona胚におけるrkable達成、マイクロインジェクションが原因Cionaの卵の比較的小さいサイズ（直径0.14ミリメートル）に、制限があります。外来DNA / mRNAを微量注入によって導入された他の脊索動物種のものと比較すると、Cionaの卵は、取り扱いが比較的困難であり、実験当たりの注射Ciona胚の割合は、定量分析を妨げる、（実験あたりの平均30〜50の胚に）低いまま。それにもかかわらず、Cionaに母体の要因を摂動するために、MOSのマイクロインジェクションは、16〜32細胞期15から開発の接合体発症への関与を研究するために選択される方法です。また、はるかに難しいが、16から32細胞期までの個々の割球を顕微注入するためにかかわらず可能です。最後に、マイクロインジェクションはの完全optimi、Ciona以外のホヤの種で（mRNAまたはDNAの注射による）トランスジェニック胚を生成するための最も効率的な技術のままZEDエレクトロポレーションプロトコルは存在しません。
エレクトロポレーション：意義と限界
それはツェラーらによって開発され、最適化され、標準化されたプロトコルとして公開されて以来の低い数字およびマイクロインジェクションの他の制約を克服するために、Cionaコミュニティのほとんどは、プラスミドDNAのエレクトロポレーションを使用しています。2004年9で。確かに、トランスジェニックCiona胚の数千人同時に16ミリ秒の単一の50 Vのパルスを使用して、1つのキュベットにエレクトロ最大500の胚を用いて1時間以内に生成することができます。トランスジェニック胚の膨大な数を生成するアプローチは、依然として脊索動物のモデル生物の中でユニークです。すぐに生体内で実行するための強力なモデルシステムとして認識されるように、ここで例示したようにこれは、潜在的なシス -regulatory領域および細胞内/細胞内局在の解析Cionaを率いていました。
electroporatiが、Ciona接合体で基本的に脊索動物GRNの研究分野に革命をもたらした上で、技術はそれにもかかわらず、いくつかの限界に直面しています。まず、プラスミドを一過Cionaの胚に導入され、最も可能性の高い投機的なエレクトロポレーションプラスミドDNAの安定性を作り、染色体外アレイとして継承されます。また、このようにして表現型の変動を生じ、接合体あたりに取り込まれるエレクトロプラスミドのコピーを制御するために、おそらく不可能な、非常に困難です。エレクトロポレーションの結果を解釈することを困難にさらなる問題は、我々はモザイクを呼ぶ現象です。エレクトロポレーションのプラスミドDNAは、1細胞期胚の異なる位置に取り込まれ得ます。その子孫割球によって継承されるようにすると、接合体の各方面がプラスミドを受け取る方法を決定します。このような変形例は明らかに、定量的な効果の解釈をより難しくします。しかし、ほとんどの問題electroporaが付属していますション変動性はカウントし、単一のバッチで容易に入手されたLacZ（またはGFP）陽性細胞の統計で、生物学的サンプルの適切な量によって解決されます。
遺伝子工学のためのエレクトロポレーションの多様性と潜在的な
エレクトロポレーションは、最終的には潜在的なシス -regulatory地域と一度レポーターまたは発現プラスミドにクローニングされた遺伝子機能の定量分析の中間スループットスクリーニングを可能にします。コンパクトCionaゲノムに、識別し、潜在的な調節領域のクローニングは、3非常に簡単です。コミュニティの豊富なデータを使用するための戦略は、 図2Aに示されています。レポーター遺伝子をコードするプラスミドのクローニングをさらにCionaの発生により適応促進され、GATEWAY適合性ベクタースイート19と互換性のある完全長ORFライブラリー18。どちらのツールは、コミュニティに利用可能であり、図2Bに示すように、規制ドライバおよびコード領域の効率的な、制限酵素を含まない組換えを可能にします。
近年では、エレクトロポレーションが正常組織固有のドライバ21,22の制御下にCRISPR / Cas9コンポーネントのような遺伝子編集ツールを発現するプラスミドを持つ組織標的遺伝子操作を実現するようになりました。このようなアプローチは、迅速GRNsのダイナミクスと組織形成及び多能性から段階的に終了に関与する転写因子コードを含む潜在的に保存されたシグナル伝達機構の理解を進めます。さらに、エレクトロポレーションを用いて、組織特異的loss-がまたは（CRISPR / Cas9によって、または過剰発現による）機能獲得型のアプローチは、ヒト疾患関連遺伝子のCionaオルソログを研究する手段になります。実際、ヒトの疾患遺伝子のCionaオルソログのカタログとその全長ORFをコードクローンは容易にご利用できますされていますルCiona 1 8での分析のために。脊椎動物のゲノムワイド重複のために、ほとんどのヒト遺伝子は、遺伝子機能1の分析を複雑に機能的に重複パラログを有している。Cionaは 、このような重要なことは、多くの場合、機能的に保存された遺伝子の基本的な役割を明らかにする必要があります幼虫における典型的な脊索動物の組織に構成されたシンプルなシステムです。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lab with constant temp. (~18 °C) | For embryo work | ||
| Ciona intestinalis adults | UPMC - Station Biologique, Roscoff, France |
For collecting gametes | |
| NaCl | Roth | 3957.1 | For ASWH |
| KCl | Roth | 6781.1 | For ASWH |
| CaCl2x2H2O | Roth | A119.1 | For ASWH |
| MgCl2x6H2O | Roth | 2189.1 | For ASWH |
| MgS04x7H2O | Roth | P027.2 | For ASWH |
| NaHCO3 | Roth | 6885.1 | For ASWH |
| Hepes | Roth | HN78.3 | For ASWH |
| Sodium thioglycolate | Sigma | MZ-6 | For Dechorionation |
| Pronase | Sigma | T0632-100G | For Dechorionation |
| D-Mannitol | Sigma Aldrich | M9546-250G | For electroporation |
| Plasmid DNA (prep >1µg/µl) | Macherey-Nagel | 740410.100 | For electroporation or microinjection |
| Agarose | any supplier | For coating embryo culture dishes | |
| Plastic Petri dishes | VWR | 612-2079 | Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH |
| Small scissors | any supplier | For dissecting gametes | |
| NaOH | Roth | 6771.1 | For activating dechorionation solution |
| Tris | Roth | 5429.3 | 1 M pH 9.5, for sperm activation |
| Pasteur pipettes | VWR | 612-1701 | Treated by immersion in tap water for at least 12 hr |
| Hand centrifuge | Hettich Zentrifugen | 1011 | Use glass centrifuge tubes |
| 1.5 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3406-250EA | |
| 2 ml Eppendorf tubes | Sigma | T3531-200EA | |
| Square electroporator | Bio Rad Gene Pulser Xcell | ||
| Electroporation cuvettes 4 mm | Eurogentec | CE-0004-50 | |
| Coverslips | Sto Premium | PR248212600 | |
| Glass slides | VWR | ECN 613-1551 | |
| Glutaraldehyde | Sigma | G6257-10ML | For fixation in LacZ staining |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148-500G | For fixation of fluorescent samples |
| Vectashield | Vector | H-1000 | For mounting of fluorescent samples |
| X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) | Roth | 2315.2 | LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide) |
| K4Fe(CN)6•3H2O | Merck | 4984 | For LacZ staining buffer |
| K3Fe(CN)6 | Merck | 4973 | For LacZ staining buffer |
| Na22HPO4 | Roth | 4984.2 | For PBT |
| KH2PO4 | Roth | 3904.2 | For PBT |
| Tween | Sigma | SLBJ5103V | For PBT |
| Mineral Oil | Sigma | M8410 | Embryo culture tested |
| Green Vital Dye | Fast Green Sigma | F7251 | for microinjection; 10µg/µl |
| Micropipette Puller (Flaming/Brown) | Sutter Instruments | Model P-97 | For pulling injection needles |
| Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 | Harvard Apparatus Ltd. UK | 30-0038 | 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection |
| Micromanipulator | Narishige | MWS-2 | Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection |
| Injection holder | Narishige | 1M-H1 | For holding injection needles, entire system filled with mineral oil |
| All Glass Syringe | Walter Graf & Co GmbH & Co. KG | No. 95199.10427A4 | 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure |
| Morpholinos | GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA | Injection at 0.25-0.5 mM | |
| Capped mRNA | Ambion mMessage mMashine kit | Injection at 0.05-0.5µg/µl | |
| Plasmid DNA | Injection at 20 ng/µl | ||
| Recombination cloning kit | Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen | 11789-013 | |
| Recombination cloning kit | Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen | 11791-019 | |
| anti-HA tag antibody | abcam | ab9110 | for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT |
| TRITC goat anti-rabbit antibody | Jackson | 111-025-144 | for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT |
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