Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Embryo mikroinjektion och elektroporering i chordate doi: 10.3791/54313 Published: October 16, 2016

Summary

Vi presenterar övergående genmodifiering och gen knockdown i tarmsjöpung, en chordate syster grupp till ryggradsdjur, med hjälp av mikroinjektion och elektroporering tekniker. Sådana metoder underlättar funktionsgenomik i denna enkla ryggradslösa som har rudimentära egenskaper ryggradsdjur, inklusive notokord och huvud sensoriska epitel, och många ortologer av sjukdomsassocierade gener mänskliga.

Introduction

Nyligen har genomsekvensen och transkriberade genrepertoarer blir tillgängliga i ett antal modellorganismer. Fastställande gen funktionella samband, dock, och hur dessa anslutningar hårdkodade i DNA för att utföra transkriptionsaktivitet under embryo tid och utrymme, förblir en stor utmaning, särskilt i ryggradsdjur. Komplexiteten i reglerings interaktioner och komplexiteten av genom 1,2, särskilt i ryggradsdjur, bromsa effektiva funktionsanalyser, i synnerhet på DNA-nivå in vivo. Faktum är att ingen GRN närvarande analyseras från befruktning till finalen, terminalt differentierat tillstånd av en organism under utveckling.

Den ascidian C. intestinalis representerar en modellorganism där sådan komplett GRN analyser kan vara möjligt. Den har en unduplicated genom typiska ryggradslösa djur med liten gen redundans. Ryggradsdjur, i kontrast har genomgått två omgångar genomdubbel som HAVe genererade större genfamiljer och funktionell diversifiering men också redundans mellan paraloger. De kompakta cis -regulatory sekvenser (styrenheter GRNs) av C. intestinalis och en oföränderlig embryonal härstamning med få celler påminner om C. elegans. Dessutom dess unika fylogenetiska position som en ryggradslösa syster grupp ryggradsdjur inom chordates tillåter utvecklings observation, på cellulär upplösning av formnings chordate kropp plan 3-6.

Nyckelfrågan som säkerställer framtida framgångar för funktionsgenomik i modellorganismer är generering av ett stort antal embryon för kvantitativa in vivo störningar. Utvecklingen av mikroinjektion teknik Ciona ägg 7, och möjligheten att snabbt få många transient transgena djur genom in vivo elektroporering i hundratals Ciona Zygoter 8,9 har varit ett genombrott i Ciona möjliggör ett stort antal embryon som skall analyseras på ett kvantitativt sätt, vilket öppnar möjligheter till en effektiv analys av förstärkare in vivo och vävnadsspecifika GAIN- eller förlust av funktions metoder, med möjligheten för samtidiga manipulationer och analyser. Vi visar vidare hur Ciona gemenskap verktyg utnyttjas för in silico förutsägelse av regulatoriska regioner och effektiv kloning av fullständiga öppna läsramar (ORF) i expressionsvektorer. Slutligen visar vi differential subcellulära lokaliseringar av fluorescerande taggadeeller märkta proteiner vid överuttryck genom elektroporering.

Protocol

1. Förberedelser för mikroinjektion och elektroporation i Ciona ägg och Zygotes

  1. Förbered 10 L artificiellt havsvatten med HEPES (ASWH) för odling av embryon. Lös upp 420 mM NaCl, 9 mM KCl, 10 mM CaCl22 H2O, 24,5 mM MgCl2 · 6H 2 O, 25,5 mM MgSO 4 · 7 H2O, och 2,15 mM NaHCOs 3 i dubbeldestillerat vatten (DDH 2 O) genom omröring över natten. Lägg 5 mM HEPES pH 8,0, och kontrollera / justera pH till 8,0. Förvara ASWH vid 4 ° C. Värma upp det till 18 ° C och filtrera det med filterpapper före användning.
  2. Förbered 20x inaktiv dechorionation lösning: 20% natriumtioglykolat, 1% pronas i ASWH. Lagra 500 | il alikvoter vid -20 ° C, och späd till en slutvolym av 10 ml ASWH före användning.
  3. Förbered 15 till 20 odlingsskålar för ägg / embryon. Pour smält 1% agaros i ASWH i 3,5, 5, 9 eller 15 cm petriskålar, belägga dem med en 1-2 mm tunt lager.Låt agarosen stelna och täcka plattorna med ASWH. Lagra dem vid 4 ° C under maximalt 1-2 veckor. Ersätta ASWH före användning.
  4. Förbered speciella injektion rätter.
    1. Häll en 5-7 mm tjockt skikt av smält 1% agaros i en 5 cm petriskål och placera en form på agaros (såsom en zip-lock stängning limmade till ett plasttäckglas) för att producera en fördjupning vid stelning av agaros som kan hålla äggen. Förbered 4 till 5 injektions rätter och täck med ASWH. Förvara vid 4 ° C och ersätta med färsk ASWH före användning. Använd endast färska plattor för injektion (maximalt en dag gammal).
  5. Förbereda β-galaktosidas (LacZ) färgning buffert: 1 mM MgCl2 · 6H 2 O, 3 mM K 4 [Fe (CN) 6] · 3H 2 O, 3 mM K 3 [Fe (CN) 6] i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med Tween (PBT) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 0,05% Tween). store in mörker vid 4 ° C. Förbereda LacZ substratet 5-brom-4-klor-3-indolyl ß-D-galaktopyranosid (X-gal, 10 U / ml) i alikvoter om 40 mg / ml i dimetylformamid (DMF) och lagra lager vid -20 ° C tills användning.
  6. Blötpasteurpipetter i kranvatten över natten för att förhindra embryon från att fastna.
  7. Förbered injektionsnålar.
    1. Inrätta en mikropipett avdragare på förhållanden såsom värme 425, dra 75, hastighet 75 och tid 200 (från glödramptest av 415).
    2. Pull 4 till 5 filamentinnehållande glaskapillärer att producera 8 till 10 långa, tunna nålar normalt stängda vid spetsen. Förvara nålar i en dammfri nål låda, fäst vid dubbelhäftande tejp på en upphöjd stöd, för att undvika att bryta de tips och som är bekvämt för nål fyllning.
      OBS: Testa de erhållna nålar genom att injicera ett par ägg med grönt vitala färgämnet (som beskrivs i avsnitt 6) och justera nålen drar betingelser för att erhålla en spetsform som gör det möjligt att finjusteras och repetitive injektion enligt beskrivningen i 6.6.
  8. Bereda injektionslösningen. Förbered 4 pl av injektionslösningen, till exempel, består av 1 pl 2 mM MO, 2 pl 10 mikrogram / l grön vitala färgämnet och en l DDH 2 O. Lägga till en slutlig koncentration av 0,05 till 0,5 ug / ul capped mRNA eller 20 ng / | il av plasmid-DNA i enlighet med den experimentella fråga. Blanda väl. Håll på is om lösningen innehåller mRNA.

2. Insamling av könsceller

  1. Dissekera Ciona vuxna i en 18 ° C och kyldes embryo rum. Använda en liten sax och börja från den ände som motsätter sig de vattenlåsen på den sida av utandning (kortare) sifon under vilka äggledaren och spermien kanalen körningen.
  2. Exponera äggledare och noga göra ett snitt i äggledaren med hjälp av spetsen på saxen. Släpp utströmmande äggen direkt i en 6-brunnar innehåller ASWH genom att försiktigt trycka äggledaren med slutna sax stripp av t.ex.gs. Överför återstående äggen med en pasteurpipett förväg sköljas med ASWH.
  3. Deponera ägg från olika djur i olika brunnar. Observera ägget kvalitet under dissekera omfattning.
    OBS: Väl utvecklade ägg är runda och rosa till svagt gul i färgen. De är omgivna av en icke-cellulär vitelline päls, chorion som bildar en väldefinierad perivitellina utrymme runt ägget. Chorion är associerad med testceller vid sina inre och stjärnformade follikelceller på dess utsida. Ägg av låg kvalitet ofta saknar perivitellina utrymme eller follikelcellerna. De verkar mindre runda, mer detaljerad eller olika i färg. Omogna oocyter är mindre och har ett silver vit färg.
  4. Skär spermier kanal med saxen och samla koncentrerad spermier i en 1,5 ml rör med hjälp av en separat pasteurpipett. Pool spermier från olika djur (åtminstone två) i samma rör. Store spermier vid 4 ° C under flera dagar.

3.Befruktning

  1. Samla spermier och ägg vid 18 ° C såsom beskrivits i steg 2.
  2. Aktivera spermier.
    1. Förbereda en ml ASWH i ett 1,5 ml rör och blanda med 50 pl av 1 M Tris, pH 9,5. Tillsätt sedan 20 pl koncentrerad spermier och blanda försiktigt genom att vända röret.
    2. Kontrollera aktiverings spermier i en droppe sperma placeras på en cover av en liten petriskål eller ett objektglas och observera under dissekera omfattning. De spermatozoider bör simma frenetiskt.
  3. Lägg 100-200 l av spermier lösning aktiveras till varje brunn av ägg (som innehåller mellan 100 och 1.000 ägg), blanda väl genom att pipettera upp och ned, så att äggen är flytande i mediet. Vänta i 10 minuter utan att flytta de embryon.

4. dechorionation ägg och embryon

  1. Späd en 500 ul alikvot av 20x dechorionation lösning till 10 ml i ASWH. Aktivera dechorionation lösning genom att tillsätta droppvis 200 ul av 2.5 M NaOH till 10 ml 1x dechorionation lösning. En mjölkaktig fällning bildas. Blanda försiktigt genom att vända röret.
  2. Samla ägg eller zygoter (efter 10 min vänta i steg 3,3) i glasrör med användning av en Pasteur-pipett. Pool äggen från 2 till 3 djur i ett rör (cirka 1000-5000 ägg / rör). Sediment med en hand centrifug genom spinning vid hög hastighet (1200 x g) under ca 20 sek för att bilda ett embryo pellet på botten av röret. Långsamt stoppa centrifugen och avlägsna ASWH med en Pasteur-pipett.
  3. Tillsätt 4 ml av aktiverade dechorionation lösning på de pelleterade ägg / zygoter i varje rör. Suspendera ägg / zygoter genom att försiktigt pipettera dem uppåt och nedåt med hjälp av en kranvatten behandlad pasteurpipett toppad med en liten gummi päron. Lösningen ska vända gulaktig efter 1-3 min.
  4. Följ dechorionation genom att ta bort en liten portion av dechorionating ägg / zygot suspension med hjälp av pasteurpipett. Sätt in en droppe på en bild och observera under dissekera sklara. Håll pipet ägg / zygoter upp och ned och kontrollera varje 20-30 sek.
    OBS: Första follikelstimulerande celler lossnar, då chorion blir gul och ogenomskinlig, och slutligen den lossnar från zygoter. Rosa dechorionated ägg / zygoter kommer att sjunka till botten av glasröret. Den dechorionation bör inte ta mer än max. 5 min.
  5. Fyll röret med ASWH gång 50% av ägg / zygoter är dechorionated.
    OBS: centrifug Mycket försiktigt (8 xg) under ca 10-15 sek som motsvarar en mycket låg hastighet precis tillräckligt för att sedimentera dechorionated ägg / embryon. Långsamt stoppa centrifugen för att inte störa pelleten av ägg / zygoter i botten av röret.
  6. Ta bort nästan all vätska från glasröret inklusive flytande material med ofullständigt dechorionated ägg / zygoter och ersätta med ASWH. Sakta pipettera upp och ner för att tvätta och centrifugera försiktigt igen som i steg 4,2. Alternativt vänta zygoter att slå sig ner genom gravitation. Tvätta en gång tills ingen chorion skräp är left.
  7. Överför ägg / zygoter till nyligen sköljas odlingsskålar med hjälp av en pasteurpipett. Håll zygoter (inte ägg) vid låg densitet (cirka 200 embryon per 10 cm skål) att undvika att de fastnar i varandra. Kultur embryona till det önskade stadiet vid temperaturer mellan 13 och 20 ° C. Alternativt electroporate de zygoter (steg 5) eller injicera obefruktade ägg (steg 6).

5. Elektroporation

  1. Befrukta äggen och dechorionate de zygoter vid 18 ° C som i avsnitt 3 och 4. Ge mellan 50 och 400 ägg per elektroporering prov.
  2. Förbered 50 | il plasmid-DNA i ett 1,5 ml rör (max. 100 | j, g plasmid-DNA i 50 | j, l DDH 2 O) och tillsätt 200 | il 0,95 M mannitol. Blanda väl genom att vortexa.
  3. Dispatch och allvar sedimentera dechorionated zygoter i silikoniserade 1,5 ml rör. Avlägsna ASWH ner till 100 | j, l märke på röret.
  4. Fortsätt, följd, för varje zygot rör enligt följande: läggDNA / mannitol-lösning med användning av en Pasteur-pipett. Blanda försiktigt med zygoter och omedelbart ta upp DNA / mannitol / zygot fjädring och överföring till en 4 mm elektroporeringskyvett.
  5. Placera kuvetten omedelbart in i elektroporation hållaren och ge en enda puls av 16 msek vid 50 V.
  6. Ta bort zygoter från kyvetten med hjälp av samma pasteurpipett och sprida ut dem på en odlingsskål med färskt och filtreras ASWH. Pipett zygoter innan de börjar klyva cirka en timme efter befruktning (HPF) vid 18 ° C.
  7. Skölj pipetten mellan proverna i en bägare med ASWH.
  8. Odla zygoter vid 15-20 ° C vid tillräckligt låg densitet på cirka 200 embryon per 10 cm skål för att undvika att de fastnar i varandra.

6. Mikroinjektion

  1. Förbered dechorionated ägg för injektion.
    1. Dechorionate äggen separat, från 2-4 djur, som beskrivs i avsnitt 4. Håll obefruktade och dechorionated eggs i separata små agaros belagda odlingsskålar. Tvätta äggen flera gånger under de rätter att ta bort skräpet.
    2. Test befrukta små partier av dechorionated ägg (cirka 50) från varje individ. Använd en separat 5 cm skålen för varje parti och applicera 2 pl aktiverade spermier (steg 3,2). Blanda väl genom att snurra rätter och sprida ut äggen i skålen genom att flytta disken i sidled. Hålla spermier och ägg tillsammans för cirka 10 minuter utan att flytta.
    3. Eliminera högst sperma på följande sätt: överföra befruktade ägg till en ny odlingsskål eller skölj två gånger med färsk ASWH. Lämna de klyvnings embryon ostörda tills 32-cellstadiet (vid 18 ° C under ca 3 h efter befruktning). Välj ägg från de bästa utvecklings parti (bäst andelen befruktning och mest regelbundet klyvningsmönster) för mikroinjektion.
  2. Ställ in injektionsnålar.
    1. Återfyllning 4 injektionsnålar i vertikalt läge för att medge gravitations flow längs filamentet. Deposit 0,5 pl injektionslösning (steg 1,8) innehållande grön vitala färgämnet på den bakre änden av nålar som är placerade nålspets ner. Vänta på att vätska för att fylla nålspetsen vid botten.
    2. Ompositionera nålarna horisontellt och återfyllning dem med mineralolja under användning av en fin och lång metall eller plast pipettspetsen. Sakta overlay injektionslösningen med mineralolja utvisa alla luftbubblor när du fyller nålen.
  3. Setup mikromanipulator i ett 18 ° C Kyld rum.
    1. Anslut plaströr av nålhållaren till en 10 ml glasspruta fylld med mineralolja. Återfyllning slangen och nålhållaren med olja och utvisa eventuella luftbubblor.
    2. För in nålen i nålhållaren och placera hållaren på mikromanipulator.
    3. Justera nålhållaren rörelse längs en rät linje med en vinkel på 45 ° i förhållande till ytan.
  4. Orientera dechorionaTED ägg längs agarosen indrag av injektions skålen så att äggen kan injiceras en efter en under dissektion mikroskop.
  5. Bryt nålspetsen, om nödvändigt, genom att försiktigt trycka nålen mot agaros eller mot en glasbit täckglas placeras på agarosen. Något tryck sprutan ratten för att kontrollera att nålspetsen är öppen (grön nål innehåll kommer utvisa).
  6. Injicera det obefruktade ägg ett i taget genom att först införa nålen i ägget och något aspire att bryta ägg membran följt av injektion. Injicera grön injektionslösning in i mitten av ägget till ett maximum av 1/3 av celldiametern. (Detta motsvarar ungefär 30 pl för ett ägg diameter av 140 | j, m).
  7. Överför injicerade obefruktade ägg till en ny odlingsskål och inkubera dem vid 15-18 ° C tills befruktning.
  8. Gödsla de injicerade ägg med nyaktiverat sperma som i test fertilizations (steg 6.1.2). Eliminatmaximal ea av spermier genom att överföra zygoter till en ny odlingsskål. Sprid ut embryona och inte störa dem under klyvningssteg (upp till 32-cellstadiet).
  9. Kultur embryona till den önskade scenen på en temperatur som ligger mellan 13 och 20 ° C.
  10. Samla in embryon genom att virvla dem i mitten av plattan och överföra dem i silikoniserade 1,5 ml rör. Fix och fläck, eller montera (steg 7 och 8).
  11. Jämför de erhållna fenotyper till kontroll injicerade embryon.
    OBS: Injicera en andra, icke-överlappande MO som riktar samma transkript för att få identiska fenotyper. Rädda specifika MO fenotyp (s) med en modifierad mRNA som kodar ditt protein av intresse, men som inte känns igen av MO. Injicera en kontroll MO som ger ingen fenotyp.

7. LacZ Färgning

  1. Samla embryon vid en önskad scen i silikoniserade 1,5 ml rör och fixera dem i 0,2% glutaraldehyd i en ml ASWH för 1530 min max.
  2. Tvätta 2x 10 min med 1 ml 1x PBT.
  3. Skölj en gång i 500 pl LacZ färgning buffert. Ersätt med X-Gal-substrat kompletterat 1 ml färgningsbuffert (använd 10 ^ / ml 40 mg / ml X-Gal lager). Överföra embryon till ett 12-brunnsplatta för bättre observation av färgning.
  4. Inkubera i mörker. Varierar inkubation från 0,5 h till över natten vid 4 ° C, vid RT eller vid 37 ° C beroende på styrkan av förarens uttryckande LacZ.
  5. Tvätta embryona upp till 4 gånger i 1 ml 1X PBT för att avlägsna färgning buffert.
  6. Post-fix under 10 minuter vid rumstemperatur med 2% paraformaldehyd (PFA) i 1 ml 1x PBT eller 0,2% glutaraldehyd i en ml 1x PBT för tolkning och visualisering av färgade embryon.

8. Montering av fluorescens Labelled Wmbryos

  1. Fäst embryon från en önskad utvecklingsstadiet för 20 minuter i 2% PFA i en ml ASWH.
  2. Tvätta embryona 2x i en ml 1x PBT. Undvik ljus mässorure genom att hålla embryon i mörker.
  3. Överför upp till 50 embryon till en bild. Ta bort högst PBT först med en pipett och noggrant med en pappershandduk.
  4. Lägg 20-25 l monteringsmedium.
  5. Lägg till en täck genom att placera den i en vinkel (från ena sidan först) och långsamt sänka den med ett spetsigt föremål (nål, pincett, pipettspetsen) undvika bubblor tills provet är täckt. Fäst täck vid sina kanter med hjälp av punkter med en transparent nagellack.
  6. Försegla hela täckglas med ett nagellack efter torkning. Förvaras i mörker vid -20 ° C.

Representative Results

Mikroinjektion för gen reglerande studier nätverks

Embryon av ascidian tarmsjöpung är väl lämpade för gen funktionella eller genreglerande studier på cell härstamning nivå och med cellulär upplösning. mRNA, MO eller etiketter kan injiceras i det obefruktade ägget eller i enskilda blastomeres efter befruktning. MO medierad gen knockdown med hjälp av mikroinjektion teknik beskrivs i steg 6. MO särskilt inriktade mRNA av utvalda gener och förhindra deras translation till protein. MO medierad förlust-of-funktion (LOF) av utvecklings gener förändrar uttryck för ett brett spektrum av nedströms gener, övergripande avslöjar en inblick i den embryonala GRN 10. Sådana analyser i Ciona gav första hela embryot reglerande plan i en metazoan 11. Figur 1 visar ett exempel på hur microinjectipå utnyttjades för att studera uppströms reglering av uttrycket av den konserverade Ci -Myelin Transcription Factor (Ci -MYT) vid gastrulastadium av Ciona embryon. Övervakas genom in situ hybridisering (ISH), endogena uttryck (Figur 1a, schematiserad i Figur 1a) observeras i 6-raden neurala platt prekursorer av särskilt hjärnan (raderna III / IV, i rött) och ryggmärgen ( rad jag, i grönt). Dessutom var Ci -MYT uppströms reglering analyserades med MO injektion rikta flera faktorer som uttrycks i eller intill neurala prekursorer före Ci -MYT uttryck debut (Figur 1b-g). MO knockdown av tidiga embryonala faktorer, såsom den forkhead rutan Aa (FOXA-a) transkriptionsfaktorn och fibroblasttillväxtfaktor 9/16/20 (FGF9 / 16/20) (figur 1b eller 1c, respektive) eliminerar övergripande Ci -MYT uttryck. Andra transkriptionsfaktorerendast delvis påverkar Ci -MYT uttryck resulterar i MO-medierad nedreglering i en delmängd av hjärn prekursorer (blå pilspetsar i figur 1d, f och g). Omvänt är Ci -MYT uttryck ektopiskt aktiveras vid nedreglering av Nodal (Figur 1e, röda pilspetsar), vilket tyder på att Nodal undertrycker normalt Ci -MYT uttryck i dessa sido prekursorer nerv sladd.

Elektroporering för effektiv gen funktionella och förstärkare studier

Elektroporering av plasmid-DNA i Ciona zygoter är en effektiv metod för transient transgenes och efterföljande observation av fenotypiska förändringar in vivo. Till skillnad från mikroinjektion av mRNA, möjliggör elektroporering för vävnadsspecifik uttryck, i vilken gen kodande regioner (ORF, öppna läsramar) uttrycks under kontrollav vävnadsspecifika drivrutiner. Dessa utgör normalt cis -regulatory regioner av väl kända gener (såsom brachyury enhancer för expression i notochord prekursorer 8). Omvänt är elektroporering avgörande för effektiv analys av nya regulatoriska regioner där reportergener (lacZ eller grönt fluorescerande proteinet, GFP) visar sin aktivitet in vivo. Tillvägagångssättet för identifiering och efterföljande elektroporering medierad analys av en sådan ny regulatorregion (för Ci -MYT) visas i figur 2.

En stor repertoar av Ciona samhällsuppgifter, lätt tillgängliga i ascidian specifika genom webbläsare 12,13, liksom ascidian nätverket för In situ Expression och embryologiska data (ANISFRÖ) 23, inspekteras för identifiering av reglerande regioner (figur 2A) in silico. Efterföljande polymerase chain reaction (PCR) baserad kloning av dessa regioner i expressionsvektorer medger elektroporation medierad testning in vivo. (Figur 2B). Genom sökskärm-shot i Figur 2A visar uppströmsregionen av transkriptet modellen KH för Ci -MYT (första tre exoner, i orange, och två introner är synliga). Olika genomet webbläsaren spår kommentera funktionella genomuppgifter förutspådde för denna region, såsom kromatin immunoprecipitation (chip) uppgifter 14 (här visas för ZicL, Ci -zinc finger lillhjärnan L), sekvenskonservering mellan två besläktade Ciona arter 15,24 eller nukleosomen beläggning 16,17 (från topp till botten i figur 2A). Generellt är exonic proteinkodande regioner som är starkt konserverade (inriktningsspåret i figur 2A). Ytterligare höga bevarande toppar visas i icke-kodande regioner uppströms och i första intron. Två av dessa förutsägs vara nukleosomen fri ennligt en sekvens baserad algoritm 16,17 (röda ramar i figur 2A), vilket tyder tillgängligheten till transkriptionsfaktorer. I själva verket är Chip-on-chip signaler 14 för Ci -ZicL transkriptionsfaktorbindnings (gröna staplar i figur 2A) anrikas i dessa två konserverade regioner. Dessutom använder ett gränssnitt 25 som söker efter potentiella transkriptionsfaktorbindningsställen, identifierade vi Zic platser belägna inom genomsekvenser markerade med Ci -ZicL CHIP kluster (orange pilar och sekvenser med strukna zic-kärna, figur 2A). Bindningen av Ci -ZicL transkriptionsfaktor i bevarad och förutsägbart nukleosomen gratis regulatoriska regioner Ci -MYT stämmer överens med nedreglering av Ci -MYT uttryck observeras i MO-injektion medieknockdown experiment inriktade ZicL (figur 1d).

efter avskräckagruvdrift potential cis -regulatory regioner i silico för Ci -MYT uttryck, dessa PCR-amplifieras från Ciona genom-DNA och införas genom rekombination kloning i LacZ reporter plasmider 19. Konstruktionerna sedan electroporated i befruktade Ciona ägg (fig 2B) och analyserades för sin aktivitet genom att LacZ-färgning (figur 3).

Figur 3 visar att genom en sådan in silico tillvägagångssätt var det möjligt att identifiera två separata cis -regulatory sekvenser som rekapitulera Ci -MYT mRNA-uttryck domäner (jämför figur 1a). Allmänhet, transient transgena embryon electroporated med plasmid-DNA visar mosaikuttryck i endast de celler som har inkorporerat DNA. Mosaik LacZ-uttryck drives sålunda av pmyt-R3 och kan hittas i alla prekursorer som också uttrycker Ci (figur 3a, b, lila och röda pilen huvuden, respektive). Däremot är pmyt-R5 endast aktiv i posterior (rad I) neurala platt prekursorer och med början vid den senare neurula steget (figur 3c, röda pilhuvuden). De två regionerna således koda två separata rumsliga och tidsmässiga aspekter av Ci-myt genreglering. Intressant, båda regulatoriska regioner fläckar också ytterligare prekursorer inte sett på ISH, särskilt i främre och laterala neurala plattan och i muskel (figur 3a, b, rosa, vit och gul pilar, respektive). En sådan bredare uttryck kan peka på repressiva element som inte ingår i de isolerade reglerings fragment (såsom Nodal som förtrycker lateral neurala öde, se figur 1e) eller låga nivåer detekteras med ackumuleraLacZ enzymatisk signal.

Förutom förstärkare studier, elektroporering i Ciona underlättar också de funktionella analyser av Ciona kodande gener genom deras uttryck. En stor samling av Ciona full längd ORF är tillgänglig för samhället, och dessutom kommenterad för mänskliga ortologer, inklusive sjukdomsassocierade gener 18. Enskilda gener eller grupper av gener från detta rekombination-kloning kompatibel fullständiga ORF cDNA-bibliotek (Figur 2B) är lätt överföras till destinations vektorer innehållande lämpliga drivrutiner som skall uttryckas i embryon. Resulterande expressionskloner kan dessutom samverka electroporated med cis -regulatory reporter konstruktioner för att testa deras förmodade roll i förstärkare aktivering. Figur 2B illustrerar isoleringen av fullständiga ORF kloner för transkriptionsfaktorer Ci -ZicL och Cl GATAa och deras recombination in anpassade destination vektorer som kan innehålla translationella taggar 19 (t.ex. grönt fluorescerande Venus eller viral hemagglutinin (HA) -taggen) och en vävnadsspecifik drivrutin såsom Friend Of Gata reglerande regionen (pfog förare) för tidig pan-ektodermal uttryck 15 som används i föreliggande studie. Effekten av Ci -ZicL överuttryck i ektodermal och neuroektodermala vävnader analyserades genom sam-elektroporering av pmyt-R3> LacZ och pmyt-R5> LacZ reportrar (Figur 3b ', b' 'och c', c '', respektive). Våra elektroporering analyser tyder på att Ci -ZicL kan aktivera Ci -MYT uttryck genom pmyt-R3 och pmyt-R5 enhancer regioner som båda reporterkonstruktioner visade ektopisk LacZ uttryck i ektodermal regioner (grön pilspetsar i figur 3b ', b' 'och C &# 39;, c '',). Som visas i figur 3d, elektroporering av plasmid-DNA i hundratals Ciona ägg tillåter statistiskt relevant kvantifiering av uttrycksförändringar, illustrerade för ektopisk pmyt-R3> LacZ uttryck vid koncentrationsberoende, pan-ektodermal Ci -ZicL uttryck.

Elektroporation för in vivo subcellulära lokalisering

Figur 4 visar den subcellulära lokalisering av märkta transkriptionsfaktorer när det uttrycks på elektroporering i ektodermal blastomerer hjälp av anpassade uttryckskonstruktioner (schematiserad i Figur 2B). Av C-terminalt taggtranskriptionsfaktorer (såsom Ci -GATAa) med en Venus-tagg (figur 4b) eller en HA-tag (figur 4c) och överuttryck dem i ektodermal vävnader (pfog) Kunde vi konstatera att in vivo "Ci -GATAa oftast lokaliserad till kärnor, som förväntat för en transkriptionsfaktor, medan Venus uttryck är allestädes närvarande, inklusive cytoplasman. Liknande experiment kan utföras för att studera dynamiken i subcellulära lokalisering över tiden, enskilda eller kombinationer av transkriptionsfaktorer, möjligen avslöja deras samlokalisering med olika taggar.

Figur 1
Figur 1:. Uppskatta Ci -MYT reglering genom mikroinjektion i Ciona ägg Ci -MYT mRNA-expression i WT och morfolino (MO) injicerat embryon. (A) WT uttrycksmönstret för Ci -MYT i neurala plattan. (A ') Schematisk representation av färgade prekursorer i den neurala plattan (NP). Rad I / II: bakre neural öde; rad III / IV: främre neurala öde; rad V / VI: palp öde. ( .. g> b - g) Ci -MYT uttryck på mikroinjektion av olika MO för att slå ner indikerade gener som deltar i den tidiga Ciona GRN (bilder anpassade från Imai et al, 2006) 11 Ci -MYT, Ci -myelin transkriptionsfaktor; WT, vildtyp; blå pilspetsar: förlust av Ci -MYT signal; röda pilspetsar: ektopisk Ci -MYT signal. Skalstreck = 100 um avser alla bilder. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Workflow för in silico söka enhancer regioner och rekombination kloning för transient genmodifiering genom elektroporering i Ciona embryon (A) En ögonblicksbild från aniss 23 asci.dian genomet webbläsare identifierar uppströms regulatoriska sekvenser av Ci - myt. Röda ramar markera två potentiella cis -regulatory regioner pmyt-R3 (scaffold_196: 76883..77079) och pmyt-R5 (scaffold_196: 75856..76041) som valdes ut för analys genom elektroporering. Namnen på spåren: ZicL sonder: Chip-on-chip uppgifter 14; KH2012 Avskrifter: tarmsjöpung avskrift modeller; Justering Score Cs / Ci LastZ: sekvenskonservering mellan Ciona savignyi (Cs) / tarmsjöpung (Ci) 15,24; . Segal 2006 förutspådde nukleosomen beläggning version 1: chick utbildad beräkningsalgoritm genom Segal et al, 2006 16 tillämpas på Ci som i Khoueiry et al, 2010 17 Gröna staplar:.. Ci -ZicL ChIP toppar 14; orange pilar: förutspått Zic platser; GCTG: core zic bindningsstället. (B) System för att generera överuttryck konstruktioner från en Kommen fullängds ORF cDNA-bibliotek, rekombineras i destinations vektorer innehållande vävnadsspecifika förare (pfog) och protein taggar därefter co-electroporated med reporterkonstruktioner (såsom pmyt-R3> LacZ eller pmyt-R5> LacZ) för in vivo avläsning Ci. - MYT, Ci -myelin transkriptionsfaktor, Ci -ZicL, Ci -Zinc finger lillhjärnan L transkriptionsfaktor;. pfog, reglerande regionen Ci -Friend av GATA klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3: electroporated Ciona embryon visar Ci -ZicL inducerbar tid och rum cis -Förordning av Ci -MYT LacZ färgade embryon vid mitten gastrul.en (MG) / sena gastrula (Ig) eller tidig neurula (EN) steget visas som sam-elektro med antingen pmyt-R3> LacZ eller pmyt-R5> LacZ och en styr konstruktion (pfog> mCherry) eller pfog> ZicL. Den pfog förare 19 förmedlar ektopisk (pan-djur) ZicL uttryck i ektoderm och neuroectoderm och orsakar ektopisk LacZ fläck i dessa celler. (A) pmyt-R3 LacZ-aktivitet i mg / BS skede embryon (små pilspetsar, vänstra panelen) eller i motsvarande färgade schematiska områden (blå cirklar, högra panelen); vegetabiliskt visa (VG). Rad I / II: bakre neural öde; Rad III / IV: främre neurala öde; Rad V / VI: palp öde. (B) pmyt-R3 aktivitet på En stadier i vävnader som i en. (B ') Ektopisk pmyt-R3 aktivitet vid Ci -ZicL co-elektroporering indikeras av gröna pilspetsar. (B '') Samma embryon som i b ', orienterade djur pol upp (en). ( pmyt-R5 LacZ-aktivitet på En stadier (c ') Ektopisk pmyt-R5 aktivitet upon Ci -ZicL co-elektroporering indikeras av gröna pilspetsar. (C ') Samma embryon som i c' men orienterade djur pol upp (en). (D) Kvantifiering av representativa experiment för Ci -ZicL över aktiverande pmyt-R3 vid låga koncentrationer. Ci -ZicL, Ci -Zinc finger lillhjärnan L transkriptionsfaktor;, Ci -dimma, Ci -Friend av GATA en biologisk upprepning är Ci -MYT, Ci -myelin transkriptionsfaktor representerade. WT, vildtyp; MG, mid-gastrula; lg sena gastrula; eN, tidig neurula; en, visa djur; vg, vegetabiliskt view; nls LacZ, kärnlokaliseringssignal för LacZ. Skalstreck = 100 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4:. Differential subcellulär lokalisering av proteiner vid elektroporering Lokalisering av Venus-märkta eller Hemagglutinin- (HA)-märkt protein överuttrycks i ektodermal celler med pfog föraren 19. (A - c) DIC bilder. (A ', b') Motsvarande fluorescensbilder. (C ') Motsvarande fluorescens bild på immun histologiska märkning med TRITC. Skalstreck = 100 um avser alla bilder. DIC, Differential interferenskontrast. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Det finns två stora teknik för att generera transgena Ciona embryon: mikroinjektion av RNA eller DNA och elektroporering av DNA. Dessa tekniker för gen störning i Ciona embryon användes först under 1990-talet 7,8 och därefter successivt förbättrats, och nu används i Ciona (och andra ascidian släkten) 20 i världen.

Kritiska steg i protokollet

Framgångsrik transgenes i Ciona könsceller som lätt samlas in från vuxna djur beror på ett antal kritiska faktorer. Kvaliteten på könsceller beror på lekperioden (i allmänhet från maj till december i norra Atlanten, förändras med vattentemperatur och syresättning), vid havet vattenkvaliteten i akvarier (vid rätt salthalt, vuxna hålla sig friska för 2-4 veckor) och slutligen på korrekt hantering av könsceller vid utvinning från de vuxna, som beskrivs nedan för de olika stegen iprotokoll.

Under beredningssteg kommer inkubation Pasteur pipetter med kranvatten förhindra embryon från stickning och havsvatten pre-inkubation av agaros-belagda petriskålar kommer att ta bort giftiga ämnen som frigörs från agarosen. I allmänhet kan rätter beredas upp till 2 veckor före användning, lagras vid 4 ° C för att undvika bakterietillväxt och sköljas på nytt före användning. En dag gammal, små rätter verkar bäst för injektioner.

Effektivitet och längd dechorionation är ett avgörande steg i protokollet som långvarig behandling av ägg / embryon kommer att skada utvecklingen. Noggranna förberedelser (ingen skakning) och korrekt lagring (vid 4 ° C i upp till en vecka) bevara kvaliteten på dechorionation lösning. Proteaser i lösningen förlora effektivitet om antingen blandas alltför våldsamt vid beredning eller över tid, särskilt om de hålls vid rumstemperatur under längre timmar / dagar. Vi har optimerat detta kritiska steg med färska dechorionation lösning bekvämtställdes från frusna alikvoter av 20x stamlösning.

Korrekt hantering av ömtåliga dechorionated ägg / embryon är nödvändig och klippning eller stickande av embryon medan pipettering kommer att skada. När pipettering, embryon bibehålls så mycket som möjligt i suspension (genom att försiktigt "blåsa" vätska att virvla upp dem följt av jämn men snabb pipettering), samtidigt som du håller glaspipett vertikalt snarare än horisontellt läge. Sådan vård gäller alla pipetteringssteg för tvätt, resuspension och överföring av ägg / embryon in och ut ur rör, kyvetter eller plattor, före och efter fixering. Vid fixering bör särskild omsorg vidtas för att separata pipetteringsanordningar för levande kontra fasta embryon för att undvika toxicitet från resterna av fixativ.

Mikroinjektion är ganska knepigt i Ciona ägg / embryon på grund av sin ringa storlek och motståndskraft vitellinmembranet och kritiskt beror på en optimerad spetsstorlekinjektionsnålen, en perfekt vinkel av injektion (nål rörelse i en linje, längs ägg radie) och ett finstämt, manuell brytning av vitellinmembranet (genom sugning före strävan efter injektion). Den senare är endast möjligt om luftbubblor elimineras i sin helhet från injektions slangen som innehåller mineralolja för utjämning sug- / insprutningstryck. Dessutom kommer de minsta bitar av damm eller ägg skräp täppa nålen, och kan lätt undvikas genom rena arbetsvillkor och sköljningssteg för ägg före överföring på injektions skålen. Efter injektionen, kommer överföringen av ägg på färska rätter undvika toxiska effekter från döda embryon som inte har överlevt injektionsproceduren.

Felsökning

Potentiella problem i förfarandet kan ställas via följande lösningar. Låga befruktnings avgiften kan uppstå från otillräcklig spermier aktivering, låg ägg renhet eller stora befruktning volymer. använda freshly poolas och mindre utspädda spermier. Kontrollera att spermiernas rörlighet vid aktivering. Tvätta ägg med ASWH före befruktningen som beskrivs i steg 4,2. Minska vattenvolymen och reducera mängden ägg per befruktning skålen / brunn. Förlorande embryon under framställningsstegen kan undvikas genom tillsats av en droppe av dechorionation lösning för att centrifugera mer effektivt ned undechorionated ägg / embryon. Dechorionation tid bör optimeras som delvis dechorionated ägg kommer inte sediment och långvarig dechorionation är giftigt, vilket embryona att explodera.

Asynkron utveckling kan uppstå från kvarvarande spermier frigörs under dissekering. Håll ägget partier separerade från olika djur för att undvika okontrollerad korsbefruktning. Onormal utveckling kan ha olika orsaker. I början och i slutet av säsongen, efter att hålla embryot från olika individer separerade, de bästa satserna kan väljas. Undvik störande embryon för10 min som följer befruktning för att undvika att störa deras ooplasmic segregation. Se till att embryona inte börja dela samtidigt som överförs som pipettering skiljer syster blastomerer och leder till partiella embryon. Använd mindre spermier för dechorionated ägg för att undvika polyspermi. Använd nyberedda men sköljdes agaros rätter. Se till att pipetteringsanordningen är fixerings gratis. Håll kontrollembryon som inte dechorionated och inte electroporated att upptäcka vid vilket steg utveckling stördes. Komplettera embryon med antibiotika om förorening och nedbrytning inträffar.

Om injektionsanordningen har "tilltäppt" nålöppningen injektion kan verifieras genom att utvisa en del av dess färgade innehåll. Igensättning material kan torkas bort genom att försiktigt dra nålspetsen genom agarosen. Luftbubblor i injektionsslangen och / eller nålen ska tas bort. Byt nål för bättre kontroll av injektionsvolymen som needle spetsen kan gå sönder eller täppa längs injektion. Skölj äggen och lägg dem i en ren injektion maträtt om skräp har samlats i skålen. Centrifugera injektionslösningen innan fylla färska nålar för att sedimentera eventuella små partiklar eller kristaller. Också användbart tränar injektion med vitala färgämnet. Kontrollera injektionsteknik av gödsling injicerade och icke-injicerade ägg. Slutligen kan samråd med en erfaren kollega vara till hjälp för att förbättra injektionsteknik.

För att kontrollera för off-mål åstadkommer en andra icke-överlappande MO och räddning med en modifierad mRNA som inte erkänns av MO kan troget utesluta ospecifika fenotypiska effekter i Ciona.

Mikroinjektion: betydelse och begränsningar

Mikroinjektion i Ciona utnyttjades för att generera den första utkastet till ett helt embryo-gen reglerande nätverk (GRN) i en chordate 11. Men trots en sådan remarkable prestation, mikroinjektion i Ciona embryon har begränsningar på grund av den relativt lilla storlek (0,14 mm i diameter) av Ciona ägg. Jämfört med de andra chordate arter där främmande DNA / mRNA införs genom microinjections, Ciona ägg är jämförelsevis svåra att hantera och graden av injicerade Ciona embryon per experiment är fortfarande låg (i genomsnitt 30 till 50 embryon per experiment), hindrar kvantitativa analyser. Men för störande moderns faktorer i Ciona, är mikroinjektion av MO metoden för val också för att studera deras deltagande i zygotiska debut av utveckling från 16 till 32 cell steg 15. Dessutom är det möjligt men mycket svårare att mikroinjicera enskilda blastomeres upp till 16-32 cellstadiet. Slutligen är mikroinjektion den mest effektiva tekniken för att generera transgena embryon (av mRNA eller DNA-injektion) i andra fall än Ciona ascidian arter, som till fullo OptimiZed elektroporation protokoll inte existerar.

Elektroporation: betydelse och begränsningar

För att övervinna de låga siffror och andra begränsningar av mikroinjektion, de flesta av Ciona samfundet har använt elektroporering av plasmid-DNA, eftersom det har utvecklats och publicerats som ett optimerat och standardiserat protokoll från Zeller et al. 2004 9. I själva verket tusentals transgena Ciona embryon kan genereras inom en timme med upp till 500 embryon samtidigt elektroporerade i en kyvett med hjälp av en enda 50 V puls av 16 msek. Tillvägagångssättet för att generera massiva mängder transgena embryon är fortfarande unik bland chordate modellorganismer. Detta har lett Ciona att snabbt erkänd som en kraftfull modellsystem för att utföra in vivo analyser av potentiella cis -regulatory regioner och cellulär / subcellulära lokalisering, som exemplifieras här.

Även electroporatipå i Ciona zygoter har i grunden revolutionerat chordate GRN forskningsområdet, tekniken ändå står inför vissa begränsningar. Först plasmider transient introduceras i Ciona embryon och är mest sannolikt ärvs som extrakromosomala arrayer, vilket stabiliteten av electroporated plasmid DNA spekulativa. Dessutom är det mycket svårt, kanske omöjligt, att kontrollera kopior av electroporated plasmider som kommer att tas upp per zygot, vilket resulterar i fenotypiska variationer. Ett ytterligare problem som gör det svårt att tolka elektroporer utfall är ett fenomen som vi kallar mosaicism. Electroporated plasmid-DNA kan tas upp vid olika lägen hos en-cellstadiet embryo; som bestämmer vilka och hur många fjärdedelar av zygot får plasmid att ärvas av ättlingen blastomerer. Sådana variationer gör klart tolkningen av kvantitativa effekter svårare. De flesta problem som kommer med electroporation variabilitet löses av en lämplig mängd av biologiska prover, med räkning och statistik LacZ (eller GFP) positiva celler, som är lätt att få tag i ett enda parti.

Mångsidighet och potential elektroporering för genteknik

Elektroporering möjliggör slutligen för mid-throughput screening av potentiella cis -regulatory regioner och kvantitativa analyser av genfunktion gång klonade i reporter eller expressionsplasmider. På grund av den kompakta Ciona genomet, är ganska enkelt 3 identifiera och kloning av potentiella regulatoriska regioner. En strategi för att använda den rikedom av samhället data visas i figur 2A. Kloning av reporter och gen som kodar plasmider underlättas ytterligare genom alstring av Ciona anpassas GATEWAY kompatibel vektor sviter 19 och en kompatibel fullängds ORF bibliotek 18. Båda verktygen är tillgängliga för samhället ochmöjliggöra effektiv, restriktionsenzymfritt rekombination av reglerande förare och kodande regioner, såsom visas i figur 2B.

Under de senaste åren, var elektroporering framgångsrikt anpassat för att uppnå vävnads riktade genmanipulation med plasmider som uttrycker gen redigeringsverktyg som de crispr / Cas9 komponenter under kontroll av vävnadsspecifika drivrutiner 21,22. Sådana metoder kommer snabbt öka vår förståelse av dynamiken i GRNs och de potentiellt konserverade signaleringsmekanismer, inklusive transkriptionsfaktor koder som är involverade i vävnadsbildning och stegvis avfarten från pluripotens. Dessutom kommer vävnadsspecifika förlust eller få-of-funktion metoder (genom crispr / Cas9 eller med överuttryck) med hjälp av elektroporering vara avgörande för att studera Ciona ortologer av sjukdomsassocierade gener humana. I själva verket, kataloger för Ciona ortologer av sjukdomsgener mänskliga och sin fulla längd ORF kodande kloner är lätt tillgänglig ile för analys i Ciona en åtta. På grund av genomet breda dubbel hos ryggradsdjur, de flesta mänskliga gener har funktionellt redundanta paraloger som försvårar analyser av geners funktion 1. Ciona är ett enklare system med den typiska chordate vävnads arrangemang larver bör avslöja grundläggande roller sådana viktiga, ofta funktionellt konserverade gener.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lab with constant temp. (~18 °C)  For embryo work
Ciona intestinalis adults UPMC - Station Biologique,
Roscoff, France
For collecting gametes
NaCl Roth 3957.1 For ASWH
KCl Roth 6781.1 For ASWH
CaCl2x2H2O Roth A119.1 For ASWH
MgCl2x6H2O Roth 2189.1 For ASWH
MgS04x7H2O Roth P027.2 For ASWH
NaHCO3 Roth 6885.1 For ASWH
Hepes  Roth HN78.3 For ASWH
Sodium thioglycolate  Sigma MZ-6 For Dechorionation
Pronase  Sigma T0632-100G For Dechorionation
D-Mannitol  Sigma Aldrich M9546-250G For electroporation
Plasmid DNA (prep >1µg/µl) Macherey-Nagel 740410.100 For electroporation or microinjection
Agarose any supplier For coating embryo culture dishes
Plastic Petri dishes VWR 612-2079 Coated with 1% Agarose in ASWH, covered with ASWH
Small scissors any supplier For dissecting gametes
NaOH  Roth 6771.1 For activating dechorionation solution
Tris  Roth 5429.3 1 M pH 9.5, for sperm activation
Pasteur pipettes  VWR 612-1701 Treated by immersion in tap water for at least 12 hr
Hand centrifuge Hettich Zentrifugen 1011 Use glass centrifuge tubes
1.5 ml Eppendorf tubes Sigma T3406-250EA
2 ml Eppendorf tubes Sigma T3531-200EA
Square electroporator Bio Rad Gene Pulser Xcell
Electroporation cuvettes 4 mm Eurogentec CE-0004-50
Coverslips Sto Premium PR248212600
Glass slides VWR ECN 613-1551
Glutaraldehyde Sigma G6257-10ML For fixation in LacZ staining
Paraformaldehyde Sigma  P6148-500G For fixation of fluorescent samples
Vectashield Vector H-1000 For mounting of fluorescent samples
X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl ß-D-Galactopyranoside) Roth 2315.2 LacZ substrate; stock in 40 mg/ml DMF (Dimethylformamide)
K4Fe(CN)6•3H2O Merck 4984 For LacZ staining buffer
K3Fe(CN)6 Merck 4973 For LacZ staining buffer
Na22HPO4 Roth 4984.2 For PBT
KH2PO4 Roth 3904.2 For PBT
Tween  Sigma SLBJ5103V For PBT
Mineral Oil Sigma M8410 Embryo culture tested
Green Vital Dye Fast Green Sigma  F7251 for microinjection; 10µg/µl
Micropipette Puller (Flaming/Brown) Sutter Instruments Model P-97 For pulling injection needles
Borosilicate glass capillaries GC100TF-10 Harvard Apparatus Ltd. UK 30-0038 1.0 mm O.D. x 0.78 mm I.D., containing filament, for microinjection
Micromanipulator Narishige MWS-2 Three-axis Oil Hydraulic System; for 3D fine movement during injection
Injection holder Narishige 1M-H1 For holding injection needles, entire system filled with mineral oil
All Glass Syringe Walter Graf & Co GmbH & Co. KG  No. 95199.10427A4 10 ml FortunaOptima; filled with mineral oil, for fine tuning of microinjection pressure 
Morpholinos  GeneTools LLC, Pilomath, OR, USA Injection at 0.25-0.5 mM
Capped mRNA Ambion mMessage mMashine kit Injection at 0.05-0.5µg/µl 
Plasmid DNA Injection at 20 ng/µl
Recombination cloning kit Gateway BP Clonase Enzyme Mix Invitrogen 11789-013
Recombination cloning kit Gateway LR Clonase Enzyme mix Invitrogen 11791-019
anti-HA tag antibody abcam ab9110 for Immunofluorescence, use 1:400 in 3% BSA/PBT
TRITC goat anti-rabbit antibody Jackson 111-025-144 for Immunofluorescence, use 1:300 in 3% BSA/PBT

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holland, P. W., Garcia-Fernandez, J., Williams, N. A., Sidow, A. Gene duplications and the origins of vertebrate development. Dev Suppl. 120, (1), 125-133 (1994).
  2. Simmen, M. W., Leitgeb, S., Clark, V. H., Jones, S. J., Bird, A. Gene number in an invertebrate chordate, Ciona intestinalis. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, (8), 4437-4440 (1998).
  3. Dehal, P., et al. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins. Science. 298, (5601), 2157-2167 (2002).
  4. Satoh, N., Satou, Y., Davidson, B., Levine, M. Ciona intestinalis: an emerging model for whole-genome analyses. Trends Genet. 19, (7), 376-381 (2003).
  5. Delsuc, F., Brinkmann, H., Chourrout, D., Philippe, H. Tunicates and not cephalochordates are the closest living relatives of vertebrates. Nature. 439, (7079), 965-968 (2006).
  6. Lemaire, P. Unfolding a chordate developmental program, one cell at a time: invariant cell lineages, short-range inductions and evolutionary plasticity in ascidians. Dev Biol. 332, (1), 48-60 (2009).
  7. Hikosaka, A., Satoh, N., Makabe, K. Regulated spatial expression of fusion gene constructs with the 5′ upstream region of Halocynthia roretzi muscle actin gene in Ciona savignyi embryos. Roux's Arch Dev Biol. 203, (1-2), 104-112 (1993).
  8. Corbo, J. C., Levine, M., Zeller, R. W. Characterization of a notochord-specific enhancer from the Brachyury promoter region of the ascidian, Ciona intestinalis. Development. 124, (3), 589-602 (1997).
  9. Zeller, W. R. Generation and use of transgenic ascidian embryos. Methods Cell Biol. 74, (74), 13-30 (2004).
  10. Satou, Y., Imai, K. S., Satoh, N. Action of morpholinos in Ciona embryos. Genesis. 30, (3), 103-106 (2001).
  11. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, (5777), 1183-1187 (2006).
  12. Tassy, O., et al. The ANISEED database: digital representation, formalization, and elucidation of a chordate developmental program. Genome Res. 20, (10), 1459-1468 (2010).
  13. Brozovic, M., et al. ANISEED 2015: a digital framework for the comparative developmental biology of ascidians. Nucleic Acids Res. (2015).
  14. Kubo, A., et al. Genomic cis-regulatory networks in the early Ciona intestinalis embryo. Development. 137, (10), 1613-1623 (2010).
  15. Rothbächer, U., Bertrand, V., Lamy, C., Lemaire, P. A combinatorial code of maternal GATA, Ets and β-catenin-TCF transcription factors specifies and patterns the early ascidian ectoderm. Development. 134, (22), 4023-4032 (2007).
  16. Segal, E., et al. A genomic code for nucleosome positioning. Nature. 442, (7104), 772-778 (2006).
  17. Khoueiry, P., et al. A cis-regulatory signature in ascidians and flies, independent of transcription factor binding sites. Curr Biol. 20, (9), 792-802 (2010).
  18. Gilchrist, M. J., et al. A pipeline for the systematic identification of non-redundant full-ORF cDNAs for polymorphic and evolutionary divergent genomes: Application to the ascidian Ciona intestinalis. Dev Biol. 404, (2), 149-163 (2015).
  19. Roure, A., et al. A multicassette Gateway vector set for high throughput and comparative analyses in ciona and vertebrate embryos. PLoS One. 2, (9), e916 (2007).
  20. Kumano, G., Takatori, N., Negishi, T., Takada, T., Nishida, H. A maternal factor unique to ascidians silences the germline via binding to P-TEFb and RNAP II regulation. Curr Biol. 21, (15), 1308-1313 (2011).
  21. Sasaki, H., Yoshida, K., Hozumi, A., Sasakura, Y. CRISPR/Cas9-mediated gene knockout in the ascidian Ciona intestinalis. Dev Growth Differ. 56, (7), 499-510 (2014).
  22. Stolfi, A., Gandhi, S., Salek, F., Christiaen, L. Tissue-specific genome editing in Ciona embryos by CRISPR/Cas9. Development. 141, (21), 4115-4120 (2014).
  23. ANISEED, Free Software Foundation Inc.,. Available from: http://www.aniseed.cnrs.fr/v3 (2007).
  24. VISTA, 1997-2013 The Regents of the University of California. http://genome.lbl.gov/vista/index.shtml (2013).
  25. Genomatix Inc. http://www.genomatix.de/cgi-bin//eldorado/main.pl (2013).
Embryo mikroinjektion och elektroporering i chordate<em&gt; Tarmsjöpung</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).More

Kari, W., Zeng, F., Zitzelsberger, L., Will, J., Rothbächer, U. Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis. J. Vis. Exp. (116), e54313, doi:10.3791/54313 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter