Introduction
Geçerli tezgah üstü hücre ayırma yaklaşımları (örneğin, floresan aktif hücre 1 sıralama, lazer yakalama mikro-diseksiyonu 2, bağışıklık manyetik boncuk ayırma 1) hazırlanması ve sıralama birkaç saat sürebilir. Bu büyük zaman ölçekleri fizyolojik tepki 3'ün temsilcisi değildir analizlerde ortaya çıkan fizyolojik tepki ve ifade düzeylerini etkileyebilir. Sistem hızla ve verimli bir şekilde, biyomedikal uygulamalar için, hücre İzolasyonu ve Zenginleştirilmesi geliştirmek için hücre yüzeyi reseptörü seviyeleri bozmadan özel hücre tipleri izole ihtiyaç vardır. Bu nedenle, bir yaklaşım mantığı hücre izolasyonu için hafif bir yaklaşım geliştirmek için.
"Bir çip üzerinde laboratuvar" kavramı büyüklüğü daha hızlı (saat-to-dakika) hücre izolasyonu siparişlerin söz sunar ve en sık bir yüzey üzerine hücreleri yakalama ve hücreleri veya hücre içi conte serbest içerirFiziksel 4,5'ten aracılığıyla NTS veya kimyasal yöntemler 6. Bu yaklaşımlar, in vitro kültür 12,13 hücreleri sağlayarak bile RNA ifade 9-11 belirleme, protein 7,8 ifadesini tanımlayan ya da birkaç avantajı sunuyor olsa da, bu tekniklerin pek çok tür hücre reseptör profil nedeniyle olarak teşhis tercüme edilemez onların fizyolojik olmayan ortamlara. Böyle hassas fizyolojik veri oluşturmak olmaz bu kaldırma maddeleri kullanmayın hücre reseptör ölçümü teknikleri anlam ayrıca reseptör miktarları 14,15 etkileyebilir kollajcnazların gibi enzimatik kaldırma ajanlar. Hücre lizizi doğal yüzey reseptörleri arasındaki farkı önler, ve daha önce 16 içsel edilenler. Bu protokol, hücre izolasyonu için hızlı ve hassas bir yaklaşımı tarif eder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cam Yüzey Temizleme ve Hazırlama Reaktifler
- temizlemek için% 50 güç, 5 dakika boyunca bir oksijen plazma sistemi bir cam yüzey üzerine koyun.
- APTES 50 ul ve konik bir tüp içinde etanol 2.45 ml ekleyerek, 2.5 ml% 2 yeniden (3-aminopropil) trietoksisilan (APTES) çözeltisi hazırlayın.
2. APTES ve DSB fonksiyonlandırmalar
- yüzeylere APTES solüsyonu ekleyin. 8 kuyucuğu için kuyu başına Pipet 150 ul. 24 kuyucuğu için kuyu başına Pipet 100 ul. 60 x 15 mm cam yemekleri için 1.1 ml pipetle. buharlaşma ve APTES çözümünün dengesiz dağılımını önlemek için yüzeyleri örtün. APTES tabakanın eşit dağılımını oluşturur, oda sıcaklığında 50 dakika için bir platformlu sallayıcı üzerinde yüzeyleri yerleştirin.
NOT: APTES yüzeyin birinci katmanını oluşturan bir aminosilan olduğunu. Farklı yüzey kullanıyorsanız, sezgisel yüzeyini kapsayacak şekilde gerekli çözelti hacmini belirler. - yüzeyler çalkalayıcı üzerinde iken, fırın sıcaklığı seçin: Isı 55 ° C 8 kuyucuğu için 2 saat ve 24 kuyucuğu için. Isı, cam, 1 saat boyunca 90 ° C'ye kadar, sadece yemekler.
- etanol ile yüzeyleri durulayın.
- kullanılan yüzeyin dayalı başvurarak gerekli etanol miktarı yönetme. 8 kuyucuğu için her kuyuya 150 ul etanol ekleyin. her bir 24 yuvalı plakalar 125 ul etanol ekleyin. Cam yemekleri için 1.1 ml etanol ekleyin.
- boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. iki kat daha fazlasını kullanarak etanol durulayın.
NOT: cam alt kuyu plakaların herhangi onları herhangi bir plastik varsa plastik eritmek ve çözgü başlayacak gibi, 65 ° C'nin üzerinde ısıtmayın yok.
- bir depodan tevzi% 100 azot gazı ile kurutun. o yüzeyleri yerleştirinven.
- 2462.5 dimetil sülfoksit (DMSO) 37.5 ul, 1.5 mg / ml DSB birleştirerek D-destiobiyotin (DSB) çözeltisi 2.5 mL hazırlayın ve 5 mg / ml 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) 0.1 M, 4-morpholinoethanesulfonic asit hidratı (MES) (pH 6) tampon ul. Sonra her iki çözümü birleştirir.
- DSB EDC arasındaki reaksiyonu söndürmek için çözelti içine 15 dakika sonra, 2-β merkaptoetanol 1 ul ekle. Fırından cam yüzeyler işlevselleştirilmiş sıcak APTES çıkarın. soğutmak için cam yüzeyler için 5-10 dakika bekleyin.
- MES yüzeyde dayalı miktarları kullanılarak, durulama yüzeyi tampon ekleyin. 150 ul MES 8 kuyu plakaları için de her tampon ekleyin. 125 ul MES 24 kuyucuğu için her oyuğa tampon ekleyin. Cam yemekleri için 1.1 ml MES tamponu ekleyin.
- boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutunyüzeye. MES tamponu ile iki kez daha durulanır.
- Onları inkübe izin yüzeylere DSB çözümü uygulayın. 8 kuyucuğu için kuyu başına 150 ul DSB çözüm ekleyin. 24 yuvalı plakalar için göz başına 100 ul DSB solüsyonu eklenir. cam tabaklar DSB çözümü için 1.1 ml ekleyin.
- Petri kabı içinde nemli bir kağıt havlu üzerine DSB kaplı cam yüzeyler yerleştirin. Kapak ve 18-24 saat süreyle 4 ° C buzdolabında kuluçkaya yatmaktadır.
3. Streptavidin Fonksiyonlandırma
- 1.0x fosfat tamponlu tuz (PBS) 1 ml her bir cam yüzeyi, üç kez yıkayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. 0.4 mg streptavidin (Sav) stok solüsyonu sulandırmak / ml (önerilir).
NOT: seyreltme ve durulama için bir araç olarak kullanılabilir, böylece PBS izotonik. PBS SA için bir çözücü olarak kullanılanh, ve bu nedenle, yüzeyi bağlanma Sav yeteneğini etkilemez. - cam alt formları ince tabaka yüzey göre çözeltinin miktarını seçmek ve böylece yüzeylere eşit Sav çözeltisi 0.4 mg / ml uygulanır. 8 kuyucuğu için, oyuk başına 150 ul 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. 24 yuvalı plakalar için, oyuk başına 100 ul 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir. Cam yemekler için, 1.1 ml 0.4 mg / ml Sav çözeltisi ilave edilir.
- Kapak ve nemi korumak için bir 14 cm Petri kabı plakaları taşıyın. 18-24 saat buzdolabında Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır.
NOT: Her yüzeyde APTES, DSB ve Sav tutarlı hacimleri kullanmak esastır. - SAv kaldırmak için her cam yüzeyi PBS 150 ul ile üç kez yıkayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun.
- Bir kağıt havlu w Islakith de-iyonize su ve kuyu nem tutma plakaları çevreleyen 14 cm Petri kabındaki düz kağıt havlu yerleştirin. kuyu içeren Petri kabı örtün. kadar gerekli bir 4 ° C Biyogüvenlik düzeyi 1 (BSL-1) buzdolabında Petri kabı kuluçkaya yatmaktadır.
4. Hücre Yakalama ve Yayın
- deney amaçlı hücrelerin T175 balonuna (ler) ile başlayın. balona (ler) den medya aspire. Oda sıcaklığı 5 ml PBS kalan medyayı yıkayın. balona (ler) den PBS aspire.
- hücre, T-175 balonuna, bu hücre ayrışma Çözüm olarak enzimatik olmayan kaldırma maddesi 10 ml ekleyin. şişeden hücreler kaldırabilmek için 6 dakika kuluçka makinesi içinde balon koyun.
- 6 dakika sonra, soğuk Hank Dengeli Tuz Çözeltisi 10 ml ekleyin (HBSS; Malzemelerin Listesi) kaldırma ajanı inaktive. Bir hemasitometre kullanılarak çözelti içinde hücrelerin sayısını saymak için hücrelerin 20 ul çıkarın.
NOT: fonksiyon bağlıyakalama deneyde kullanılan yüzeyler laşma, gereken hücre sayısı değişir. fonksiyonelleştirilmiş 8 kuyucuğu için kuyu başına 300.000 hücre kullanın. işlevselleştirilmiş cam yemekleri için, 1,1 milyon hücreleri kullanır. fonksiyonelleştirilmiş 24 kuyucuğu için 125,000 hücreleri tavsiye edilir. hücre sayımı hakkında daha fazla bilgi eki bulunur. - adımları tekrarlayın 4.1- 4.3 hücrelerinin bir şişe için, daha az hücre deney için gerekli daha varsa. çözeltide hücrelerinin toplam sayısını elde etmek için hücre süspansiyonları ve yeniden sayılması hücreleri birleştirin.
- Yoğunlaşan hücreler, bir tablet elde etmek için 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj hücre süspansiyonu dönerler. Daha sonra, ml başına 1 x 10 6 hücre konsantrasyonu elde döndürülür hücrelerden süpernatanı havalandırın, ve hesaplanan hacim kazandırmak için hücre süspansiyonu ekleyin HBSS uygun miktarda Bul. Bu hacim Eki'nde denklemler kullanılarak hesaplanabilir.
- Pipet yukarı ve aşağı (çiğnemek) th tekrar süspansiyonçözelti e hücreleri ve antikor bağlanma azaltabilir çözeltide hücresel topaklanma azaltır. Ayrı kontrol ve deney çözümler hücresel çözüm bölün. bileşenleri ve hesaplamalar için ek Dosya görüntüleyin.
- Yan Dosya açıklandığı gibi ilgili hücre çözümleri biotinlenmiş antikorlar ekleyin. bir uç aşırı uç karıştırıcı üzerinde 4 ° C'de 30 dakika süreyle inkübe edilir.
Not: MCF7GFP hücreleri, 0.5 mg / ml hIgG veya 0.5 mg / ml, HLA-ABC antikorlar için tavsiye edilir. RAW makrofajlar için, 1 mg / ml mCD11b seyreltme farklılıkları hesaba yarım ses seviyesinde tavsiye edilir. İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde (HUVECler), 0.5 mg / ml hCD31 önerilir. - HBSS ile fonksiyonalize cam yüzeyi yıkayın. Bu deney için, 8 oyuklu plaka tavsiye edilir.
- 8 kuyucuğu için her kuyuya 150 ul HBSS ekleyin. HBSS kullanarak iki kez daha durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın.ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. 4 ° C'de soğuk tutmak.
- kuyulara hücre çözümleri ekleyin ve hücreler çalkalayıcı üzerinde buz üzerinde inkübe için 45 dakika bekleyin. Ek açıklandığı gibi hesaplanan miktarlar kullanılarak steril HBSS biyotin çözüm olun.
- HBSS kullanarak cam kuyulardan hücre çözüm çıkarın.
- Yavaşça her kuyuya 150 ul HBSS pipetle. Sonra HBSS dışarı pipetle. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun.
- iki kez daha tekrarlayın. Yıkama işleminden sonra, ıslak hücreler tutmak için oyuklara HBSS ekleyin.
- her bir ilgili serbest bırakmak için 20 mM biyotin solüsyonunun 150 ul ekleyin ve daha sonra reaksiyon için izin vermek için 20 dakika beklemek.
- spesifik olmayan şekilde bağlanmış hücre hatırlamakHBSS ile yıkanarak s yukarıda belirtilen ve daha sonra floresan etiketli hücreleri kullanarak eğer, görüntüyü hücreleri floresan devam ettikçe. Ayrıca bir şişe içinde görüntü canlı hücreleri (bir kontrol olarak, bir gözdeki hücrelerin ile karşılaştırmak için). Yeşil floresan proteini (GFP) transfekte edilmiş hücrelerin kullanılması durumunda, uyarma 470 nm olacak ve emisyon 515 nm olur.
5. Antikor Optimizasyonu: Antikor Titrasyon
- Adım 4.1- 4.3 açıklandığı gibi T75 veya T175 şişesi hücreleri kaldırarak başlayın.
NOT: Bu miktarlar 24 kuyucuğu için kalibre edilir, ancak sezgisel test yoluyla herhangi bir cam fonksiyonelleştirilmiş yüzeyleri uygun şekilde değiştirilebilir. Temsili bir antikor titrasyonu, Şekil 1 'de gösterilmiştir. - Hemasitometre kullanılarak hücre sayımı ve daha sonra 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de konik bir tüp hücre çözeltisi aşağı doğru döndürün. Ek olarak anlatılan hesaplamalar kullanılarak, ml başına 1 milyon hücre hücreleri sulandırın.
- 1 m bölmekantikor (Ab) çözümleri için farklı santrifüj tüplerine 500 ul altı farklı çözümler ml solüsyon başına illion hücreleri.
- 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml antikor stok çözeltisi ile seyreltilir. Leke tampon maddesi (PBS +% 1 sodyum azid +% 1 BSA) 100 ul, ve hiçbir Ab kontrol hücrelerinin 500 ul kullanılarak kontrol oluşturun. Boş kontrol için (Resim Ab ve hücre yok), 300 ul PBS bir çözelti kullanır.
NOT: DİKKAT: Sodyum azit son derece toksik, patlayıcı ve kullanırken son derece dikkatli olunmalıdır. Malzeme Güvenlik Bilgi Formu (MSDS) bakın ve uygun güvenlik ekipmanları kullanın.
- 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml antikor stok çözeltisi ile seyreltilir. Leke tampon maddesi (PBS +% 1 sodyum azid +% 1 BSA) 100 ul, ve hiçbir Ab kontrol hücrelerinin 500 ul kullanılarak kontrol oluşturun. Boş kontrol için (Resim Ab ve hücre yok), 300 ul PBS bir çözelti kullanır.
- Bir araya getirin ve 30 dakika boyunca 4 ° C'de, son aşırı ucunda karıştırıcı içinde, hücre çözümleri Ab çözümler inkübe edin. HBSS ile üç kez fonksiyonelleştirilmiş 24 kuyucuğu durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. pi tutunPette ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı.
- Uygun APTES içine her numune çözeltisinin Kısım 125 ul, DSB ve Sav iyi fonksiyonalize. 4 ° C'de ya da cam yüzeyi üzerinde, 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. spesifik olmayan bağlanmış hücreler uzaklaştırılmıştır HBSS ile üç defa yüzey durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. Bu kontroller gibi, alt satır durulama yapmayın.
- , Iyi yıkanmış her HBSS 150 ul ekleyin buz üzerinde 24 kuyu tabak koymak ve sonra GFP hücrelerinin (Uyarım 485 nm / Emisyon 528 nm) floresan ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.
6. Hücre Optimizasyonu: Hücre Titrasyon
- adımlarda 4.1 -4.3 belirtildiği gibi hücreleri kaldırın.
- hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. böylece hücre aşağı spin4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 xg'de konik tüp dökülmesinden. ml başına 1 milyon hücre hücreleri sulandırın.
NOT: hemasitometre kullanımına ilişkin daha fazla bilgi Ek bulunabilir. - Pipet konik bir tüp içinde 1,6 milyon hücre stok ve yer için hücre çözeltisinden 1.6 ml. konik bir tüp içinde 800.000 hücre stok ve yer için hücre çözeltisinden hücreler 800 ul pipetle. Pipet konik bir tüp içinde 80,000 hücre stok ve yer için hücre stokunun 80 ul. Pipet konik bir tüp içinde 8.000 hücre stok ve yer için hücre stoktan 8 ul.
NOT: Konsantrasyonları gerektiği gibi çoğaltmak, 8 kuyu plaka ölçülerine göre verilir. Plakası çıkışı bir örneği, Şekil 2'de gösterilmiştir. - Dört stok çözelti alın ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj içinde dönerler. HBSS 400 ul tüm stok çözümleri yeniden askıya.
- , 1.600.000 hücre stoku 100 ng / ml antikor 1.6 ul 0.8 μ800.000 hücre stokuna l ve diğer tüm stokları 0.5 ul. 4 ° C'de 30 dakika boyunca uçtan aşırı ucunda bir karıştırıcıda 30 dakika boyunca antikorun inkübe edin. HBSS ile üç kez fonksiyonlaşmış cam yüzeyi yıkayın.
Not: işlevselleştirilmiş 24 plaka plaka okuyucu ölçümü için tavsiye edilirken işlevselleştirilmiş 8 oyuklu plaka, mikroskopi ölçümü için tavsiye edilir. 8000 hücre stoku için antikor konsantrasyonu çözelti içinde antikorların eksikliği vermeye yakalama yüzeyinin sınırlayıcı bir faktör izin vermek için, indirgenmiş değildi, ama daha çok yüzey yakalama özellikleri. - Her bir oyuğa ve örnek solüsyonların 150 ul uygulanır. Soldaki kuyuların ilk sütuna 1,6 milyon hücre stoku uygulayın. soldan ikinci sütuna 800.000 hücre stok uygulayın. soldan üçüncü sütunda 80.000 hücre stok uygulayın. Nihayet son sütuna 8.000 hücre stok geçerlidir. çalkalayıcıda 4 ° C'de 45 dakika süreyle inkübe edin.
NOT: 1,6 milyonHücre stok test edilecek en yüksek konsantrasyon olarak hizmet verir ve (600.000 hücre kuyu başına) hücre ayırma deneylerinde genellikle kullanılan tipik hücresel konsantrasyonu olarak 800.000 hücre stok deney için kontrol olarak hizmet vermektedir hücrelerin çift miktarı ki (oyuk başına 3.000.000 hücre) hücre ayırma deneyleri kullanılır. 80.000 hücre stoku hücre yakalama için daha düşük konsantrasyonlarda (oyuk başına 30,000 hücre) test etmek için bir on kat sulandırıldıktan olarak hizmet eder. yüz kat seyreltme hücresel ayırma alt sınırı (oyuk başına 3.000 hücre) kontrol etmek için bir test olarak kullanmak kadar 8.000 hücre stok vermektedir. - HBSS ile üç kez durulayın. boşaltma ve de köşesinde bir sabit noktadan sıvı çizerek yüzey durulayın. ucu doğrudan yüzeye işaret değil bu yüzden yaklaşık 70 ° açı pipet tutun. Tüm yıkar toplayın.
- Görüntü bir floresan mikroskop hücreleri, 8 kuyu plakaları kullanıyorsanız, sur her fotoğraf çekmekYüz ve çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de bir saat süre ile, her yüzeyine 150 ul biyotin uygulanır. Bir saat sonra, daha önce olduğu gibi HBSS ile 3 kez biyotin salma kuyu durulayın. hemasitometre ve görüntü bırakma kuyuları ile sayılması için kuyulardan tüm yıkar toplayın.
- 24 yuvalı plakalar kullanılarak ise, 1 saat süre ile biyotin salma uygun oyuklara ve HBSS ile gözlere 3 kez yıkayın 20 mM fazla biyotin solüsyonunun 150 ul uygulanır. Bir plaka okuyucusu kullanılarak 24 oyuklu plakalar nicelleştirmektedir. tüm toplanan kuyu yıkar hücreleri saymak için bir hemasitometre kullanın.
7. Görüntü Analizi
Not: FİJİ yazılım paketi (http://fiji.sc/Fiji) görüntü analizi için tavsiye edilir. Başlangıçta, görüntüler gri tonlama görüntüye dönüştürüldü ve parlaklık / kontrast hücrelerini ortaya çıkarmak için değişmiş oldu.
- Görüntüyü yükleyin ve "Tip" aşağı kaydırma sonra resim sekmesini tıklatarak ve ardından tıklayarak gri tonlamaya dönüştürmek4, 8 bit ".
- Görüntü sekmesini tıklatarak ve ardından "ayarlama" kaydırarak görüntü kontrastını arttırmak. "Parlaklık ve Kontrast" üzerine tıklayın ve sonra hücrelerin öne çıkması için kaydırma çubuklarını kullanın. floresan görüntüleri kullanarak, daha fazla tanımlanmış hücreleri yapmak için görüntüleri ters.
- ImageJ görüntüleri analiz etmek (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) ITCN denilen üzerine bir eklenti yükleyin.
- Açık ITCN. Bir iletişim kutusu hücrenin boyutunu tahmin etmek birkaç parametre ile kullanıcıya sorar göründüğünde, öncelikle ilgi hücrenin minimum genişliğini ayarlayın. görüntü floresan ve hücrelerin karanlık ise "Algılama Karanlık Peaks" seçeneğini tıklayın.
- "Kont" düğmesine basın, sonra başlangıçta 2'de eşik değerini ayarlayın ve. Resmin Bir yeni sayılır versiyonu hücreleri sayılmış nerede belirleyen kırmızı noktalar ile görünecektir.
- tanımdan daha doğru hücresel veri almak için eşik ve genişliği parametre ayarlayınBir "hücre" boyutunu ng. Not: Sağdaki bir iletişim kutusu olacak sayılan hücrelerin sayısı. Değişen Parametreler sayılan hücrelerin farklı numarası verecektir.
- iyi bir tahmin hücrelerin sayısı için ulaşılıncaya kadar eşik ve genişlik parametreleri arasında yineleme devam ediyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu hücre yakalama (Şekil 3A) ve MCF7GFP hücrelerinin hücre serbest bırakın (Şekil 3C) ve canlı hücre kontrolleri (Şekil 4) göstermektedir, bu protokolü kullanarak. % 60 ve% 80 (Şekil 3C) serbest bırakıldı gibi hücre yakalama sayılabilir. Bu RAW 264.7 makrofajlar ve MCF7GFP hücre karışımına Bu yaklaşımını sonra ham makrofajlar% 50 yakalanmış (Şek. 3D) ve RAW makrofajlar% 80 20 mM biyotin (Şekil 3B) ile serbest bırakma vardı. Fazla antikor hücre yakalama azaltabilir yana, biz HLA antikor 0-10,000 nM titre aracılığıyla optimize edilmiş ve ideal bir antikor konsantrasyonu 100-1000 mM antikor (Şek. 1) arasında olduğunu görüyoruz. Benzer şekilde, yakalanabilir hücrelerin ideal konsantrasyon hücrelerinin bu sayının altına beri, 1 x 10 5 ve 1 x 10 6 olduğunu tespit, değerler arka 17 daha düşüktür(Şekil 2). Her kuyudan flüoresans verileri aşağıda tarif edildiği gibi işlenir.
Burada, 3 kez tekrarlanmış ortalama Resim antikoru (boş) bir örnek alınır ve her bir örnekten elde edilen fluoresans çıkartılır. Bu değer ortalama maksimal floresan sonra normalize edilir. Bu işlem araştırmacı açıkça hücresel saptama alt limiti gözlemlemek için izin verir.
Şekil 1. Normalleştirilmiş Körleştirilmiş Antikor titrasyonu. İnsan HLA-ABC plaka okuyucusu kullanılarak ölçüldü MCF7GFP hücreleri sabit bir miktar (oyuk başına 125,000 hücre) ve ele hücrelerinin flüoresansı üzerinde titre edilir. öncefonksiyonalize yüzey maruz kalma, hücreler ve antikorlar, spesifik olmayan bir antikor eki çıkarmak için santrifüjlendi. Bu santrifüj olmadan, fazla antikor yüzeyi doyurmak ve santrifüj yüzeyine bağlanma az hücrelerde elde edilen yüzey antikoru doyma önlemek için yeterli değildir 10,000 ng / ml konsantrasyonları ile gösterildiği gibi, hücre açılan menüyü önler. Gri hat kontrolü temsil eder. Hata çubukları, ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Normalize Körleştirilmiş Hücre Titrasyon. Antikor titrasyonu optimize antikor konsantrasyonunu kullanarak, MCF7GFP hücreleri ke sırasında optimize yakalama konsantrasyonunu bulmak için titre edildiSabit işlevsel yüzey ve antikor konsantrasyonları eping. Bu, farklı uygulamalar için, hücre yakalama kalibre etmek için kullanılabilir. satır hücresel yakalama fikri aralığını bulmak için hücrelerin konsantrasyonunu değiştirmek ise bu rakam Kolonlar, çoğaltır vardır. Gri hat kontrolü temsil eder ve hata çubukları ortalamanın standart hatasını temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. Yakalama ve Deneyler bırakın. Bir tek hücre karışımı HLA-ABC antikor kullanarak MCF7GFP hücreleri yakalayan işlevsel yüzey (A) maruz bırakılmıştır. HBSS (B) ile yıkandı, hücreler ele kalmış ancak 20 mM biyotin (C) bir çözeltiye maruz kaldığında, hücreler rele edildiased. MCF7GFP hücreleri ve RAW 264.7 makrofaj hücre karışımı, işlevsel yüzey maruz bırakılarak, mCD11b antikoru (D) kullanılarak yakalandı. Non-spesifik MCF7GFP hücreleri yeşil etiketli. Yüzey onları hedef olmadığını ima nötr yıkama (E), maruz kaldığında MCF7GFP hücrelerinin floresan yoğunluğu azalmış ve onlar non-spesifik bağlı olduğunu. Bir biotin yıkama (F) maruz kaldığında, hedeflenen RAW makrofajlar yüzeyinden serbest bırakıldı. Ölçek çubukları 250 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Çift Hücre İzolasyon için Şekil 4. Pozitif ve Negatif Hücre Kontrolü. Pozitif kontrol RAW Makrofajlar o görüntülüna floresan aktivitesi hem de hücre görece boyut gösteren, mikroskop ışık vermiştir. GFP uyarma altında, birleştirilmiş görüntü (C) 'de gösterilmiştir Resim flöresanlı (B) var ise aydınlık RAW makrofaj hücre boyutlandırma (A) göstermektedir. Negatif kontrol MCF7GFP hücreleri bir floresan büyük bir fluoresan aktivitesi gösteren bir mikroskop gibi MCF7GFP hücrelerin görece boyutu görüntülü. Hücreler boyutlandırma gösteren aydınlık (D) üzerine görüntülü ve GFP uyarma altında ise (E) açıkça birleştirilmiş görüntü (F) gösterilebilir büyük floresan göstermektedir. Ölçek çubukları 250 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fstandart saflaştırma teknikleri santrifüj kullanımının ŞEKIL 5. karşılaştırması. ön analiz santrifüjleme adımı örnek hazırlama muhafaza edilir. Hücreleri üzerine stres tanıtır ve ifade seviyelerini değiştirebilir manyetik boncuk izolasyon yanı FACS karıştırmak gibi çeşitli ek santrifüj adım. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Yan Kod Dosyası. Hesaplamalar. Bu dosyayı indirmek için tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hücre izolasyonu tekniklerindeki ilerlemeler vasküler biyoloji 19 hücre yenileyici biyoloji programlama ve anjiyojenik sinyalizasyon kök, nörobilim 18 yapı-işlev ilişkilerinin bilimsel çalışmaları teşvik edilir. Gerçekten de, birincil hücre kültürü 20 (ör HUVECler) vasküler biyoloji esas olarak hücre izolasyon teknikleri kullanılarak yapılır. Hücre izolasyonu da en son plazma zarı reseptörlerinin 3,14,15,19,21 kantitatif akışı (qFlow) sitometrisi analizi için kullanıldı. Ancak, mevcut hücre izolasyon yöntemleri, hücre yüzeyi reseptör seviyelerini etkileyen personel ve reaktifler hem de masraflıdır. Biz bu eksiklikleri karşılamak için hücre tiplerinin bir karışımından tek bir hücre tipi tekrarlanabilir yakalama hafif bir sistemin oluşturulması için izin yüzey işlevsellik 17 yeni bir yöntem gelişmiş. Bu teknik, c imkânı sağlayan bir iteratif sistemine entegre edilebilirspesifik antikorlar kullanılarak aşamalarında farklı hücre tiplerini apturing. ayrıca prosedürü açıklığa kavuşturmak için, sorun giderme soruları ve cevapları bir dizi aşağıda sunulmaktadır:
Işlevselleştirme Optimizasyonu: fonksiyonlandırmalar süreçleri gelişmiş bütünlüğü için optimize ve aşağı MCF7gfp hücrelerinin çekin edilmiştir. Bu protokol alternatif optimize edilmiş ve herhangi bir hücre tipi ve antikor konfigürasyonu için özelleştirilebilir. Bu yakalama sathında veya türü ya da antikor konsantrasyonları değiştirilerek temel bileşenlerin konsantrasyonları değiştirilmesi ile elde edilebilir. Çoğu antikor türleri yukarıdaki protokolü kullanılarak biyotinile edilebilir. Bir kez biotinlenmiş, daha sonra aşağı çekme için ideal konsantrasyonunu bulmak için (Şekil 1) titre edilebilir. Hücre konsantrasyonu yakalamak için hücrelerin doğru konsantrasyonunu bulmak için (Şekil 2) titre edilebilir. kapak ile belirli bir hücre tipi yakalama bu fizibilite kullanılmasıTure yüzeyi tespit edilebilir. Örneğin, ilgi konusu bir hücre tipi ideal olacaktır ve fonksiyonalize bir yüzey ile bu aralıktaki hücre konsantrasyonları yakalayan milyon hücre başına 100 hücre ölçekte ise. Titrasyon sırasında, yüzey o küçük bir konsantrasyon hücreleri yakalamak yapamıyorsanız, yüzey veya antikor sonra optimizasyon sırası bu konsantrasyon aralığında hücreleri filtre edebilmek için gereklidir.
Hangi hücre tipleri bu protokol kullanılır? Nasıl birisi farklı bir hücre türünü kullanmak için bu protokolü değiştirebilir?
Şu anda, bu protokol MCF7-GFP hücrelerini kullanır ve RAW 264.7 makrofajlar genellikle çift hücre karışımı bir hücre tipini çekip bir yeteneğini göstermek için dahil edilmiştir. onlar fare xenograft modelinde (fare ortamında insan tümör) en alakalı hücre tiplerinin iki olduğu gibi bu hücreler seçildi. Diğer çeşitli hücreler, antikor, SP işlemini kalibre etmek içinecificity her şeyden önemlidir. Antikorlar 22 seçmek için kullanılabilecek çeşitli çevrimiçi kaynaklar vardır.
Bu yöntemin bazı avantajları nelerdir?
Nazik bir yaklaşım: kuvvet eksikliği bu yaklaşım nazik hale getirir. Gerçekten de, bizim hesaplanan kesme kuvveti 24 (314 uM 2 hücre yüzey alanı varsayarak 656 pN) 2.09 Pa hidrodinamik stresleri beri, biyomarkerların önemli bozulmasına neden olmamalıdır x 10 -6 pN 17, neden nekroz, maksimum ise aşağıda stres değerleri 0.59 Pa (185 pN varsayarak 314 uM 2 hücre yüzey alanı) değil 23 yapmak. Bu nazik yaklaşım nedeniyle, protein ekspresyonu ve morfolojileri 25 değişebilir 600 G etrafında değerlerde ani hızlanma, böyle 0.78 zirve kayma gerilmesi Pa 25 kadar uyguladıkları, santrifüj tabanlı 24 yaklaşırken bazı ticari seçenekler üzerinde böylece avantajlıdır 26 23 neden. Böylece santrifüj kullanımların miktarını azaltabilecek bir süreç hücreleri saflaştırma yoluyla deneyim ve sonuçta daha fizyolojik verileri sağlayacak gerilmelerin miktarını azaltacaktır. Mevcut protokolü arındırmak ve yakalamak için daha önceki bir hücre konsantrasyonunu yeniden yapılandırmak için santrifüj kullanır ki, bu hazırlık süreci, manyetik boncuk izolasyon 27,28 kadar saflaştırma teknikleri standarttır sitometrisi 29 akış ve FACS 30 (Şekil 5). Bizim yaklaşımımız diğer teknikler hazırlık aşamasında ek olarak kullanan tüm aşağı santrifüj işlemleri azaltır.
Biyotin-avidin yaklaşım: Yaygın olarak kullanılan biyomateryallerin (DSB-Sav ve biyotin-Sav) uygulaması da 31,32 avantajlı bu yaklaşımı oluşturur. Avidin ailesi proteinleri biyotin ailesi proteinleri son derece seçici bir şekilde bağlanan ve Scient bir dizi için kullanılanIFIC ve dahil olmak üzere tıbbi uygulamaları: antikor-fluorofor eki 33, kantitatif Qdot-polistiren boncuk eki 34 ve kapsüllü ilaçlar 32 serbest bırakmak için çevre uyaranlara tepki hidrojellerin oluşturulması. Buna ek olarak, biotinlenmiş antikorlar elde göreli kolaylığı bu yaklaşımın yaygın olarak erişilebilir ve özelleştirilebilir hale getirir.
Boncuk olmadan destiobiyotin yaklaşım: yakalama yüzey hücreleri serbest bırakmak için sert reaktifler ve güçlerin kullanımı olmadan destiyobiyotin kullanımını uygulamak mümkün değildir. DSB DSB-antikorları ve manyetik boncuk 35 ile bağlantılı olarak diğer sistemler tarafından geri hücre bağlanması ve serbest bırakılması için kullanılmaktadır. Ancak, ayırma tekniğinin sert etkileri yanı sıra büyük hücresel kayıp numuneleri diferansiyel reseptör ve kemokin ifadesi 28,36 yılında 27,28 sonucu hazırlanması ile ilgili. Bu yaklaşım azaltmayı amaçlamaktadırve çok daha nazik yıkama ve bırakma yöntemini oluşturmak için mıknatıs ve boncuk hem kullanımını ortadan kaldırarak bu sınırlamaları aşmak.
Bu protokol kritik adımlar nelerdir? Ne değişkenlik neden olabilir? Bu değişkenlik nasıl kontrol edilebilir?
Bu süreç yakalama yüzeyinin azalması verimlilik neden olabilir dört kritik adımlar vardır. ilk kritik aşama kendi kendini monte yüzeyinin bozulmasına neden olur APTES işlevselleştirme adımları sırasında APTES suyun yüzeye önlenmesidir. Bu, daha sonra sulu çözeltilerden hidrolizi azaltmak için fırın içinde APTES bir çözücü olarak etanol kullanarak ve pişirme ile giderilir. iki tabaka çapraz bağlanmasını sağlayan: İkinci kritik bir safha, EDC APTES'le DSB reaksiyonu katalize ettiği EDC reaksiyon adım. EDC dışlanmış ya da yeterince ilave değilse, DSB yüklenebileceğini, zemin eklemek mümkün olmayacaktır h serbest bırakma mekanizmasını tehlikeye atar. Sav katmanı korumaktan kritik olduğu gibi üçüncü kritik bir adım, Sav fonksiyonlandırmalar sırasında. Yakalama etkinliğindeki azalma streptavidin tabakası sonuçlarının düzensizlik. Yakalama yüzeyine antikorun bağlanma çekim yüzeyi ve antikorun biyotin-streptavidin etkileşim yoluyla kolaylaştırılmaktadır dördüncü kritik bir adım, antikorun biyotinilasyon bulunmaktadır. Antikor olmayan biotinillenmemiş ise, streptavidin katman yakalama yüzey işe yaramaz hale onu yakalamak ve onu aşağı çekmek mümkün olmayacaktır. Yüzey yakalama Değişkenlik ve tutarsızlık konsantrasyonu olmayan düzenlilik yanı sıra katman eki stochasticity isnat edilebilir. Bu varyasyon tabakası yüzeyine kalibre edilmiş bileşenler ve yakalama amaçlanan hedeflere kesin konsantrasyonu kullanılarak kontrol edilebilir. Bu tasarımda, konsantrasyonlar MCF7-GFP hücrelerinin yakalanması için özel olarak kalibre edilir.
e_content "> Bu yöntemin bazı dezavantajları nelerdir?Şu anda, APTES'le işlevsellik kadar 2 saat süre ile bir pişirme aşaması takip 55 dakika yüzeyinin bir sıvı faz daldırma kullanılarak yapılır. Bu yüzeyine bağlanma APTES silanın tam bir katman için izin verse de, daha muntazam bir proses buhar fazlı silanizasyon 37 olacaktır. Bu nedenle araştırmacı, zaman tasarrufu, hem de tekdüzelik artan APTES temas süresini azaltır. Buna ek olarak, gelişmiş açılan Sav gecede inkübasyon kullanılan 17 gözlenmiştir ve şu anda, yüzey fonksiyonlandırmalar genel işlem üç gün sürebilir yapma, iki gecede inkubasyon gerektirir. Yani, kimya optimize araştırmacı için önemli ölçüde zaman tasarrufu sunacak.
Bazı uyarılar veya önlemler yararlı olabilir nelerdir?
yüzeyler fonksiyonalize, bu imUygun bakım solunum hasar riski alındığını zaruri. Her iki APTES ve merkaptoetanol böylece kimyasal dumanı ile etkileşimi azaltmak için kimyasal bir kaput fonksiyonlandırmalar işlemi yapmak için gerekli olan, akciğerler ve ilgili organlara son derece tehlikeli olabilir. Mersaptoetanol koku, özellikle keskin olan bir tiyoldür. merkaptoetanol kullanırken, atmadan önce bir veya iki gün için kaputu oturup kontamine atıklar için izin verir.
Bu yüzeyin gelecekteki amaçları ve uygulamaları nelerdir?
Gelecekteki amaçları anjiyojenik ilgili hastalıkların hakkında hücre tiplerinde çeşitli çalışmak için bu yüzey özelleştirme içerir. Özellikle, biz kan örnekleri kullanarak ve oradan çıkar hücreleri ayıran segue için İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri odaklanmak istiyoruz. Ayrıca, bu tür işlevselleştirilmiş Surfac tasarım içine aptamers olarak ayırma yöntemleri entegre planıe daha da yakalama ve salıverme oranlarını arttırmaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | Used to make 2% APTES solution |
| Plasma Cleaner Pico | Diener | Model 1 | Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass |
| d-Desthiobiotin (DSB) | Sigma | D20655 | Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | Dissolves the DSB into solution |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo-Scientific | 5g: 22980 25g: 22981 |
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface. |
| uncoated 8-well culture slide | BD Falcon | Case of 24: 354118 Case of 96: 354108 |
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments |
| Glass bottom 24-well plates | MatTek | P24G-0-13-F | Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments |
| Mercaptoethanol | Science Lab | 60-24-2 | Used to quench reaction between EDC and DSB |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%) |
Fisher Scientific | AC172590250 | Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction |
| Precision Oven | Thermo Scientific | 11-475-153 | Used in curing of PDMS and APTES layer. |
| Titramax 1000 Shaker | Heidolph | 13-889-420 | Used to ensure even distribution of APTES on surfaces. |
| 1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | Biotin-binding protein. May cause irritation. |
| 5 cm Glass Dish | Fisher Scientific | 08748A | Used in HUVEC studies as well as future profiling studies. |
| 14 cm Petri Dish with Cover | Sigma-Aldrich | Z717231 | Used to hold samples being functionalized and transport them. |
| MCF7-GFP cells | Cell Biolabs | AKR211 | Stored in liquid nitrogen |
| RAW264.7 mouse macrophages | ATCC | TIB-71 | Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen. |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | Stored in 100 ml at room temperature |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 50003PC | Supplier: Corning |
| Nonessential amino acids | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 25-025-CI | Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning. |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 12-565-58 | Small 23 cm 50 pack |
| Cell Dissociation Solution | Corning | MT-25-056CI | Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments |
| Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity. |
| Biotin | Amresco | 58-85-5 | Used to release cells from surface. |
| HBSS | Created from Recipe | N/A | Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate. |
| HLA-ABC Antibody | BioLegend | 311402 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| hIgG Antibody | BioLegend | HP6017 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| MCF7 GFP cells | Cell Biolabs | AKR-211 | Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein. |
| Assorted Conicals | Thermo-Scientific | 15mL: 12-565-268 | 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots. |
| Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) | Fisher Scientific | 05-450-127 | Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix |
| Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) | Zeiss | N/A | Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope. |
| Zeba Desalting columns | Thermo-Scientific | PI-87770 | Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf |
| EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit | Thermo- Scientific | Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HTX Multimode Reader | Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments. |
References
- Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
- De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
- Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
- Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
- Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
- Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
- Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
- Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
- Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
- Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
- Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
- Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
- Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
- Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
- BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
- Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
- Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
- dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
- Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
- Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
- Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
- Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
- Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
- Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
- Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
- Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
- Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).
