Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En metode for målrettet Cell Isolation via Glass Surface funksjon

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54315
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Introduction

Nåværende benk-top Celleseparasjonsanordningene tilnærminger (f.eks fluorescens aktivert celle sortering 1, laser capture mikro-disseksjon 2 analysatorer, magnetiske kuler separasjon 1) kan ta flere timer med forberedelser og sortering. Disse store tidsskalaer kan påvirke fysiologiske respons og uttrykk nivåer, noe som resulterer i analyser som ikke er representative for den fysiologiske responsen tre. Systemer er nødvendig som raskt og effektivt kan isolere spesifikke celletyper uten å avbryte celleoverflate reseptor-nivåer for å forbedre celleisolering og berikelse for biomedisinske anvendelser. Derfor er begrunnelsen for vår tilnærming er å utvikle en mild metode for celleisolasjon.

Den "lab on a chip" -konseptet gir løfte om størrelsesordener raskere (timer til minutter) celle isolasjon, og oftest innebærer å fange celler på en overflate og slippe celler eller intracellulær contents gjennom fysisk 4,5 eller kjemiske metoder 6. Selv om disse metodene har noen fordeler som for eksempel å identifisere protein 7,8 uttrykk, å identifisere RNA-ekspresjon 9-11, eller til og med tilveiebringe celler for in vitro kultur 12,13, mange av disse teknikker kan ikke oversettes til diagnostikk, slik som cellereseptoren profilering på grunn til sine ikke-fysiologiske miljøer. Enzymatiske løfte agenter som kollagenaser kan også påvirke disse reseptor mengder 14,15, noe som betyr celle reseptor kvantifisering teknikker som bruker disse løfte agentene vil ikke generere nøyaktige fysiologiske data. Cellulær lyse hindrer differensiering mellom de innfødte overflatereseptorer, og de ​​som tidligere ble internalisert 16. Denne protokollen beskriver en rask og skånsom tilnærming for celleisolasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengjøring glassoverflaten og Forbereder reagenser

  1. Plasser en glassoverflate i en oksygen plasma maskin i 5 min ved 50% effekt for å rense det.
  2. Fremstille 2,5 ml 2% rekonstituert (3-aminopropyl) triethoxysilane (APTES) løsning ved å tilsette 50 ul APTES og 2,45 ml etanol i et konisk rør.

2. APTES og DSB funksjon

  1. Legg APTES løsning til overflatene. Pipetter 150 ul per brønn til 8-brønners plater. Pipetter 100 ul per brønn i 24 brønners plater. Pipetter 1,1 ml til 60 x 15 mm glass retter. Dekk overflaten for å hindre fordamping og ujevn fordeling av APTES løsning. Plasser flatene på en plattform rister i 50 minutter ved romtemperatur, noe som skaper en jevn fordeling av det APTES lag.
    MERK: APTES er et aminosilan som danner det første lag av overflaten. Ved hjelp av en annen overflate, heuristisk bestemme volumet av oppløsning som er nødvendig for å dekke overflaten.
  2. Velge den temperatur i ovnen, mens overflatene er på shaker: Varm opp til 55 ° C i 2 timer for de 8 brønners platene og 24 brønners plater. Varme glass bare retter til 90 ° C i 1 time.
  3. Skyll overflaten med etanol.
    1. Administrere mengden etanol som kreves ved å referere basert på overflaten som brukes. Tilsett 150 ul etanol til hver brønn for 8-brønners plater. Legg 125 mL etanol til hver brønn i 24 brønners plater. Legg 1,1 ml etanol for glass retter.
    2. Skyll overflaten ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten. Skyll to ganger mer hjelp etanol.
      MERK: Hvis noen av glassbunn brønners plater har noe plast i dem, ikke varme dem over 65 ° C, som plast vil begynne å smelte og deformere.
  4. Tørr med 100% nitrogengass avgis fra en tank. Plasser overflatene i oven.
  5. Forbered 2,5 ml av D-desthiobiotin (DSB) oppløsning ved å kombinere 1,5 mg / ml DSB i 37,5 ul dimetylsulfoksid (DMSO) og 5 mg / ml 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) i 2462,5 ul av 0,1 M 4-morpholinoethanesulfonic-hydrat (MES) (pH 6) buffer. Da kombinerer begge løsninger.
  6. Tilsett 1 pl 2-merkaptoetanol β, etter 15 min, inn i løsningen for å stanse reaksjonen mellom DSB og EDC. Fjern varme APTES funksjonglassflater fra ovnen. Vent 5-10 min for glassflater for å kjøle.
  7. Legg MES buffer overflaten for å skylle, under anvendelse av mengder basert på overflaten. Legg 150 pl MES-buffer til hver brønn for 8-brønners plater. Legg 125 pl MES-buffer til hver brønn i 24 brønners plater. Legg 1,1 ml MES buffer for glass retter.
  8. Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Hold pipetten på ca 70 ° vinkel slik at spissen ikke er direkte pekerinn i overflaten. Skyll to ganger mer med MES-buffer.
  9. Påfør DSB løsning til overflaten for å tillate dem å inkubere. Tilsett 150 ul DSB-løsning per brønn til 8-brønners plater. Tilsett 100 ul DSB-løsning per brønn i 24 brønners plater. Legg 1,1 ml for glass retter DSB løsning.
  10. Plasser DSB dekket glassflater på en fuktig papir håndkle inne i en petriskål. Dekk og inkuberes i en 4 ° C kjøleskap for 18-24 timer.

3. streptavidin funksjon

  1. Skyll hver glassoverflate tre ganger med 1 ml 1,0x fosfatbufret saltvann (PBS). Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten. Fortynn streptavidin (SAV) stamløsning til 0,4 mg / ml (anbefales).
    MERK: PBS er isotonisk, så den kan brukes som et medium for fortynning og skylling. PBS blir anvendt som et oppløsningsmiddel for SAv, og derfor vil ikke påvirke evnen til SAV å binde til overflaten.
  2. Anvende 0,4 mg / ml oppløsning SAV jevnt til overflaten, slik at et tynt lag av former på bunnen av glasset ved å velge mengden av løsning basert på overflaten. For 8 brønners plater, tilsett 150 mL 0,4 mg / ml SAV løsning per brønn. For 24 brønners plater, tilsett 100 mL 0,4 mg / ml SAV løsning per brønn. For glass retter, tilsett 1,1 ml 0,4 mg / ml SAV løsning.
  3. Dekk og flytte platene til en 14 cm petriskål å holde på fuktigheten. Inkuber petriskål i kjøleskap i 18-24 timer.
    MERK: Det er viktig å utnytte konsistente mengder APTES, DSB, og SAV på hver overflate.
  4. Skyll hver glassoverflate tre ganger med 150 mL PBS for å fjerne SAV. Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten.
  5. Fukt et papirhåndkle wed de-ionisert vann og plasser papirhåndkle flatt i 14 cm petriskål rundt platene for å holde på fuktigheten i brønnene. Dekk petriskål inneholdende brønnene. Inkuber petriskål i en 4 ° C biosikkerhet nivå 1 (BSL-1) kjøleskap inntil nødvendig.

4. Cell Capture and Release

  1. Begynn med T175-kolbe (r) av celler som er beregnet for forsøket. Aspirer media fra kolben (e). Vaske ut de resterende media med 5 ml PBS romtemperatur. Aspirer PBS fra kolben (s).
  2. Tilsett 10 ml av ikke-enzymatisk løftemiddel, for eksempel celledissosiasjon løsning, til T-175 kolbe av celler. Sette kolben i inkubator i 6 minutter for å tillate løfting av cellene fra kolbe.
  3. Etter 6 min, tilsett 10 ml kald Hank balanserte saltoppløsning (HBSS, se liste over materialer) for å inaktivere løfte agent. Ta ut 20 ul av celler for å telle antallet celler i oppløsning ved bruk av et hemacytometer.
    MERK: Avhengig av functionalized flater som benyttes i fangst eksperiment, antall celler er nødvendig varierer. For funksjon 8 brønners plater, bruke 300.000 celler per brønn. For funksjon glass retter, bruker 1,1 millioner celler. For funksjonaliserte 24-brønners plater, blir 125000 celler anbefalt. Mer informasjon om celletelling er funnet i Supplement.
  4. Gjenta trinnene 4.1- 4.3 for en annen kolbe av celler, hvis færre celler er til stede enn nødvendig for forsøket. Kombiner cellesuspensjoner og gjengi celler for å få totalt antall celler i oppløsning.
  5. Spinne ned cellesuspensjon i en sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C for å få en pellet av konsentrerte celler. Finne den passende mengde HBSS for å legge til cellesuspensjonen for å få en konsentrasjon på 1 x 10 6 celler pr ml, deretter aspirer supernatanten fra de nedsentrifugerte cellene, og legge til det beregnede volum. Dette volumet kan beregnes ved hjelp av ligningene i Supplement.
  6. Pipetter opp og ned (triturate) å suspendere the celler i løsning og redusere cellular klumper i løsning som kan redusere antistoffbinding. Splitte den cellulære løsning i egen kontroll og eksperimentelle løsninger. Vis Supplemental File for komponenter og beregninger.
  7. Tilsett biotinylerte antistoffer til de respektive celle løsninger som er beskrevet i Supplemental fil. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C på en ende-over-ende-blander.
    MERK: For MCF7GFP celler, 0,5 mg / ml Higg eller 0,5 mg / ml HLA-ABC antistoffer anbefales. For RAW-makrofager, er 1 mg / ml mCD11b anbefales til halve volumet å ta hensyn til utvannings forskjeller. For Menneskelig navleveneendotel Cells (HUVECs), 0,5 mg / ml hCD31 anbefales.
  8. Vask funksjonglassoverflaten med HBSS. For dette eksperimentet er en 8 brønn plate anbefales.
    1. Tilsett 150 pl HBSS til hver brønn for 8-brønners plater. Skyll to ganger mer hjelp HBSS. Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen.Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten. Hold kaldt ved 4 ° C.
  9. Legg celle løsninger til brønnene og vente 45 min for cellene inkubert på is i shaker. Gjøre løsningen av biotin i sterilt HBSS ved hjelp av beregnede volumer som er beskrevet i tillegget.
  10. Fjern cellen løsning fra glass brønnene ved hjelp HBSS.
    1. Forsiktig pipettere 150 ul HBSS i hver brønn. Deretter pipette ut HBSS. Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten.
    2. Gjenta to ganger til. Etter vasking, tilsett HBSS til brønnene for å holde cellene våt.
  11. Tilsett 150 ul 20 mM biotin-oppløsning til hver respektive utløser riktig, og deretter vente 20 minutter for å tillate reaksjon.
  12. Minnes ikke-spesifikt bundet til celles ved vasking med HBSS som nevnt ovenfor, og deretter ved bruk av fluorescerende merkede celler, fortsett til fluorescens bilde cellene. Også bilde levende celler i en kolbe (som en kontroll, for å sammenligne med cellene i brønnen). Ved bruk av grønt fluorescerende protein (GFP) transfekterte celler, vil det være eksitasjon 470 nm, og emisjonen vil være 515 nm.

5. Antistoff Optimization: Antistoff Titrering

  1. Begynn med å løfte cellene fra T75 T175 eller kolbe som beskrevet i trinn 4.1- 4.3.
    MERK: Disse volumene er kalibrert for 24 brønners plater, men kan endres for å passe noen glassfunksjon overflater gjennom heuristisk testing. En representativ antistoff titrering er vist i figur 1.
  2. Cellene telles ved bruk av et hemacytometer, og så spinne ned celleløsning i et konisk rør ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Rekonstituere cellene til 1 million celler per ml, ved hjelp av beregninger beskrevet i tillegget.
  3. Splitte en mill celler per ml oppløsning i seks forskjellige løsninger av 500 mL i forskjellige sentrifugerør for antistoff (Ab) løsninger.
    1. Fortynn antistoffet stamløsning på 10 ug / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml 1 ng / ml. Skape kontrollene ved hjelp av 100 ul Stain-buffer (PBS + 1% natriumazid + 1% BSA), og 500 ul av celler for kontroll uten Ab i den. For den tomme kontroll (Ingen Ab og ingen celler), bruk en løsning av 300 mL PBS.
      MERK: FORSIKTIG: Natriumazid er ekstremt giftig, eksplosiv og ekstrem forsiktighet må tas når du bruker den. Vennligst se datablad (HMS) HMS og bruk riktig sikkerhetsutstyr.
  4. Kombiner og inkuber Ab løsninger med celle løsninger i ende-over-ende-blander ved 4 ° C i 30 minutter. Skyll de funksjon 24 brønners plater med HBSS tre ganger. Skyll overflaten ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Hold pipette ved omtrent en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten.
  5. Delmengde 125 mL av hver prøveløsning i de aktuelle APTES, DSB, og SAV funksjon godt. Inkuber ved 4 ° C eller på is i 45 minutter på glassets overflate. Skylle overflaten med HBSS tre ganger for å fjerne ikke-spesifikt festede celler. Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten. Ikke skyll den nederste raden, som de er kontroller.
  6. Legg 150 ul HBSS til hver vasket godt, satte de 24 brønners plater på is, og deretter bruke en plateleser for å måle fluorescens av GFP celler (eksitasjon 485 nm / Utslipps 528 nm).

6. Cell Optimization: Cell Titrering

  1. Løft cellene som nevnt i trinn 4,1 -4,3.
  2. Telle celler ved hjelp av en hemacytometer. Spinn ned cellen slikning i koniske rør ved 500 xg i 5 minutter ved 4 ° C. Rekonstituer celler til 1 million celler per ml.
    MERK: For mer informasjon om bruk av hemacytometer kan bli funnet i Supplement.
  3. Pipetter 1,6 ml fra cellen løsningen for 1,6 millioner celler lager og plasser i en konisk tube. Pipetter 800 mL av celler fra cellen løsning for 800.000 celler lager og plasser i en konisk tube. Pipetter 80 mL fra cellen lager for 80.000 celler lager og plasser i en konisk tube. Pipetter 8 mL fra cellen lager for 8000 celler lager og sted i en konisk tube.
    MERK: Konsentrasjonene er gitt per 8 brønn plate målinger, replikere etter behov. Et eksempel på plate utgang er vist i figur 2.
  4. Ta de fire stamløsninger og spinne i en sentrifuge ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C. Re-suspendere alle stamløsninger i 400 ul HBSS.
  5. Legg 1,6 mL av 100 ng / ml antistoff til 1,6 millioner celle lager, 0,8 μl til 800 000 celle lager, og 0,5 ul til alle andre aksjer. Inkuber antistoffet i 30 minutter i den ende-over-ende-blander i 30 min ved 4 ° C. Vask den funksjonaliserte glassoverflaten med HBSS tre ganger.
    MERK: funksjon 8 brønns plate anbefales for mikros kvantifisering, mens funksjon 24 brønns plate anbefales for plateleser kvantifisering. Antistoffkonsentrasjonen for 8000 celle masse ble ikke redusert for å tillate at den begrensende faktor for fangst overflaten for å ikke være mangel på antistoffer i løsning, men heller å fange egenskapene til overflaten.
  6. Anvende 150 ul av prøveoppløsninger i hver brønn. Påfør 1,6 millioner mobil lager til den første kolonnen av brønner på venstre side. Påfør 800.000 celle lager til andre kolonne fra venstre. Påfør 80000 celle lager til den tredje kolonnen fra venstre. Endelig bruke 8000 cellen lager til den siste kolonnen. Inkuber i 45 minutter ved 4 ° C på risteren.
    MERK: 1600000celle lager tjener som den høyeste konsentrasjon som skal testes, og er det dobbelte av mengden av celler som brukes typisk i celleseparasjonsforsøk (600.000 celler per brønn) for 800000 cellen lager tjener som kontroll for forsøket som det er typisk cellekonsentrasjonen som er brukt i celleseparasjonsforsøk (3.000.000 celler per brønn). Den 80.000 celle lager fungerer som en ti-fold fortynning for å teste for lavere konsentrasjoner for celle-fangst (30.000 celler per brønn). Den 8000 celle lager fungerer som en hundre gangers fortynning å bruke som en test for å sjekke den nedre grensen for celleseparasjon (3000 celler per brønn).
  7. Skyll med HBSS tre ganger. Skyll overflate ved utlading og trekking av væske fra et fast punkt, for eksempel hjørnet av brønnen. Holde pipetten ved tilnærmet en 70 ° vinkel, slik at spissen ikke er direkte peker inn i overflaten. Samle alle vasker.
  8. Bilde cellene på en fluorescens mikroskop, hvis du bruker 8 brønners plater, ta bilder av hvert suransikt, og anvende 150 ul biotin til hver overflate i en time ved 4 ° C på risteren. Etter en time, skyll biotin frigivelse brønner med HBSS 3 ganger som før. Samle alle vasker fra brønner for telling med hemocytometer og bilde versjons brønner.
  9. Anvende 150 ul 20 mM overskudd av biotin løsning til passende biotin frigjørings brønnene i 1 time, ved bruk av 24 brønners plater, og deretter skylle disse brønnene 3 ganger med HBSS. Kvantifisere 24 brønners plater ved hjelp av en plateleser. Bruk en hemacytometer å telle celler fra alle innsamlede brønn vasker.

7. Bildeanalyse

Merk: FIJI programvarepakken (http://fiji.sc/Fiji) anbefales for bildeanalyse. Opprinnelig ble bildene omgjort til gråtonebilde, og deretter lysstyrke / kontrast ble endret for å hente ut cellene.

  1. Last opp bildet, og konvertere til gråtoner ved å klikke på fanen bildet så bla ned til "Type" og deretter klikke4, 8 bit ".
  2. Øk kontrasten i bildet ved å klikke på fanen bildet og deretter bla til "Juster". Klikk på "Brightness og Contrast", og deretter bruke rullefeltene for å gjøre cellene skiller seg ut. Hvis du bruker fluorescens bilder, snu bildene for å gjøre cellene mer definerte.
  3. Last inn en plugin på ImageJ kalt ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) for å analysere bildene.
  4. Åpne ITCN. Når det vises en dialogboks som ber brukeren med flere parametere for å anslå størrelsen på cellen, sette minimum bredde på cellen av interesse først. Klikk på "Detect Dark Peak" alternativet hvis bildet er fluorescerende og cellene blir formørket.
  5. Sett terskelverdi på 2 først, og deretter trykke "Count" -knappen. En nylig telte versjon av bildet vises med røde prikker avgrense hvor cellene er blitt talt.
  6. Justere terskelen og bredde parameter for å få mer nøyaktige mobildata ved Definitionng på størrelse med en "celle". Merk: Antall celler telles vil være i en dialogboks på høyre side. Endre parametre vil gi ulikt antall celler telles.
  7. Fortsette å iterere gjennom terskelen og breddeparameterne til et godt anslag er nådd for antall celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ved hjelp av denne protokollen vi vise celle fangst (figur 3A) og celle frigjøring (Figur 3C) av MCF7GFP celler samt levende cellekontroller (figur 4). Vi kvantifisert cellen fange som 60% og 80% ble gitt ut (Figur 3C). Når vi utvidet denne tilnærmingen til en blanding av RAW 264,7 makrofager og MCF7GFP-celler, ble 50% av RAW makrofager fanges opp (fig. 3D) og 80% av RAW makrofager var frigivelse med 20 mM biotin (figur 3B). Siden overskudd antistoff kan redusere celle-fangst, vi optimalisert via titrering 0-10,000 nM av HLA-antistoff, og observere at den ideelle antistoffkonsentrasjonen er mellom 100-1.000 mM antistoff (Fig. 1). Likeledes bestemmer vi at den ideelle konsentrasjonen av celler som kan fanges er 1 x 10 5 og 1 x 10 6, fordi under det antall celler, verdier er lavere enn bakgrunnen 17(Figur 2). Fluorescens data fra hver brønn blir behandlet som beskrevet nedenfor.

ligning 1

Her er gjennomsnittet av 3 replikater tatt fra en prøve uten antistoff (blank) og blir subtrahert fra den fluorescens oppnådd fra hver prøve. Denne verdien er så normalisert til gjennomsnittet maksimal fluorescens. Denne behandlingen gjør at forskeren å tydelig observere den lave grensen for mobilregistrering.

Figur 1
Figur 1. Normalisert blanket Antistoff Titrering. Menneskelig HLA-ABC titreres over en konstant mengde MCF7GFP celler (125.000 celler per brønn) og fluorescens av fangede celler ble kvantifisert ved hjelp av en plateleser. I forkanttil eksponering av den funksjonaliserte overflaten, ble cellene og antistoffene sentrifugert for å fjerne ikke-spesifikt antistoff vedlegg. Uten denne sentrifugering, vil overskudd av antistoff mette overflaten og forhindre celle nedtrekk som vist med konsentrasjoner på 10.000 ng / ml, hvor sentrifugeringen var ikke tilstrekkelig til å forhindre antistoff oversaturation av overflaten, noe som resulterer i mindre celler som binder til overflaten. Grå linje representerer kontrollen. Feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Normalisert blanket Cell Titrering. Ved hjelp av optimalisert antistoffkonsentrasjon fra antistoffet titrering, MCF7GFP celler ble titrert til å finne optimal fangst konsentrasjon mens keeping funksjon overflate og antistoffkonsentrasjoner konstant. Dette kan brukes til å kalibrere celle fangst for ulike bruksområder. Kolonner i dette tallet er gjentak, mens radene endre konsentrasjonen av celler for å finne ideen utvalg for cellulær fangst. Grå linje representerer kontroll og feilfelt representerer standard feil av gjennomsnittet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Capture and release eksperimenter. En enkelt celleblandingen ble utsatt for den funksjonaliserte overflate (A), å fange MCF7GFP celler ved anvendelse av HLA-ABC-antistoff. Når vasket med HBSS (B), forble celler fanges opp, men når de utsettes for en oppløsning av 20 mM biotin (C) ble cellene reledessuten økt. En cellulær blanding av MCF7GFP celler og RAW 264,7 makrofager ble utsatt for en funksjon overflaten og ble tatt med mCD11b antistoff (D). Uspesifiserte MCF7GFP celler er merket med grønt. Fluorescensintensitet av MCF7GFP cellene ble redusert når de utsettes for en nøytral vask (E), noe som medfører at overflaten ikke rettet mot dem, og at de vedlagte ikke-spesifikt. Når de utsettes for en biotin vask (F) ble de målrettede RAW-makrofager frigjort fra overflaten. Skala barer er 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4. Positive og Negative Cell Control for Dual Cell Isolation. Den positive kontrollen RAW Makrofager er avbildet ona fluorescens mikroskop, og viser ingen fluorescerende aktivitet, så vel som den relative dimensjonering av celler. Lysfelt RAW makrofager viser celle dimensjonering (A), mens under GFP eksitasjon, er det ingen fluorescens (B), som er vist i det flettede bildet (C). De negative kontrollceller MCF7GFP blir avbildet på en fluorescens-mikroskop og viser stor fluoriserende aktivitet, så vel som MCF7GFP cellene relative størrelse. Cellene avbildes på lysfelt (D), som viser dimensjonering, og mens under GFP eksitasjon (E) viser stor fluorescens, som kan være tydelig vist i det sammenslåtte bildet (F). Skala barer er 250 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5. Sammenligning av sentrifugen bruk i standard renseteknikker. Den pre-analyse sentrifugeringstrinn er konservert i prøvepreparering. Magnetiske kuler isolasjon samt FACS involverer flere andre sentrifugeringstrinn, som introduserer stresset på celler og kan endre uttrykket nivåer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplemental File Code. Beregninger. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Forbedringer i celleisolasjonsteknikker fremmer vitenskapelige studier i struktur-funksjon relasjoner i nevrovitenskap 18, stamcelle programmering i regenerativ biologi, og angiogenic signalering i vaskulær biologi 19. Faktisk, primære cellekultur 20 (f.eks HUVECs) i vaskulær biologi skjer primært ved bruk av celleisoleringsteknikker. Cell isolasjon ble også nylig brukt for kvantitativ flow (qFlow) cytometri analyse av plasmamembranreseptorer 3,14,15,19,21. Imidlertid eksisterende celleisolasjonsmetoder påvirke celleoverflate-reseptor-nivåer og er kostbare i både personell og reagenser. Vi har avansert en ny fremgangsmåte i overflatefunksjonalisering 17, som åpner for etablering av et mildt system av reproduserbar opptak av en enkelt celletype fra en blanding av celletyper for å møte disse mangler. Denne teknikken kan integreres i en iterativ system, slik at muligheten for capturing forskjellige celletyper i flere trinn ved hjelp av spesifikke antistoffer. For ytterligere å klargjøre prosedyren, er en rekke feilsøkings spørsmål og svar tilbudt nedenfor:

Funksjon Optimization: funksjon prosesser har blitt optimalisert for bedre jevnhet og trekke ned av MCF7gfp celler. Denne protokollen kan alternativt være optimalisert og tilpasset for en hvilken som helst celletype og antistoff-konfigurasjon. Dette kan oppnås ved å endre konsentrasjonen av base-komponentene i fangst overflate, eller ved å endre typen eller konsentrasjonen av antistoffene. De fleste antistofftyper kan biotinylert ved hjelp av ovennevnte protokoll. Når biotinylert, kan de deretter titreres (figur 1) for å finne ideell konsentrasjon for å trekke ned. Cellekonsentrasjonen kan titreres (figur 2) for å finne den ideelle konsentrasjonen av celler til fange. Ved hjelp av denne, muligheten for å fange opp en viss celletype med hettenture overflaten kan fastslås. Hvis for eksempel en celletype av interesse er på skalaen på 100 celler per million celler, fange konsentrasjoner av celler i dette området ved hjelp av den funksjonaliserte overflate ville være ideelt. Hvis det under titreringen, kan overflaten ikke fange cellene i det lille en konsentrasjon, er da optimalisering av overflaten eller antistoff nødvendig for å være i stand til å filtrere ut celler i det konsentrasjonsområde.

Hvilke celletyper brukes i denne protokollen? Hvordan kan noen endre denne protokollen til å bruke en annen celletype?

Foreløpig bruker denne protokollen MCF7--GFP celler, og RAW 264,7 makrofager er ofte inkludert for å vise evne til å trekke ut en celletype i en dual-celle blanding. Disse celler ble valgt fordi de var to av de mest relevante celletypene til mus xenograft modell (human svulst innenfor murine miljø). For å kalibrere fremgangsmåte for en rekke andre celler, antistoff specificity er viktig. Det finnes flere online ressurser tilgjengelig for å velge antistoffer 22.

Hva er noen fordeler med denne metoden?

Lett tilnærming: Mangelen på kraft gjør denne tilnærmingen milde. Faktisk er vår beregnede skjærkraft maksimalt, 24 x 10 -6 PN 17, som ikke bør føre til betydelige forstyrrelser i biomarkører, ettersom hydrodynamiske påkjenninger av 2,09 Pa (656 pN forutsatt 314 pM to celleoverflate) induserer nekrose mens verdiene av stress under 0,59 Pa (185 pN forutsatt 314 pM to celleoverflate) ikke 23. Denne milde tilnærmingen er således fordelaktig i noen kommersielt tilgjengelige alternativer som for eksempel sentrifugering baserte tilnærminger 24, som utøver opp til 0,78 Pa 25 av topp skjærspenning som følge av den plutselige akselerasjonen på verdier rundt 600 G, som kan forandre protein uttrykk mønstre og morfologier 25 , 26 23. Således en fremgangsmåte som kan redusere mengden av sentrifuger bruksområder vil redusere mengden av påkjenninger som cellene ville oppstå ved rensing og til slutt sørger for mer fysiologiske data. Vår nåværende protokollen bruker sentrifuger for å rense og rekonstituere cellekonsentrasjonen før fange opp, men denne fremstillingsprosessen er standard i mange renseteknikker, slik som magnetiske kuler isolasjon 27,28, flowcytometri 29, og FACS 30 (figur 5). Vår tilnærming reduserer alle nedstrøms sentrifugeringsprosesser som de andre teknikkene bruker i tillegg til fremstillingstrinnet.

Biotinavidin tilnærming: Anvendelsen av brukte biomaterialer (DSB-Sav og biotin-SAV) gjør også denne tilnærmingen en fordel 31,32. Avidin familie proteiner binder ekstremt selektivt til biotin familie proteiner og brukes for en rekke scientific og medisinske applikasjoner, inkludert: antistoff-fluorophore vedlegg 33, kvantitativ Qdot-Polystyrenkule vedlegg 34, og etableringen av hydrogeler som reagerer på stimuli i miljøet for å slippe innkapslede narkotika 32. I tillegg er relativt enkelt å skaffe biotinylerte antistoffer gjør denne tilnærmingen allment tilgjengelig og tilpasses.

Desthiobiotin tilnærming uten perler: Registrerings overflate er i stand til å implementere bruken av desthiobiotin uten bruk av sterke reagenser og krefter for å løsne cellene. DSB har vært brukt for reversibel cellebinding og frigivelse av andre systemer i forbindelse med DSB-antistoffer og magnetiske kuler 35. Men de harde effektene av separasjonsteknikk, så vel som den store cellulære tap forbundet med å fremstille de prøvene 27,28 resultat i differensial reseptor og kjemokin uttrykk 28,36. Denne tilnærmingen har som mål å redusereog overvinne disse begrensninger ved å eliminere bruken av både magnet og perler for å skape en mye mer skånsom vask og frigjøringsmetodikk.

Hva er de kritiske trinn i denne protokollen? Hva kan forårsake variasjon? Hvordan kan det variabilitet kontrolleres?

Denne fremgangsmåte har fire kritiske trinnene som kan resultere i redusert effektivitet av fangst overflate. Den første kritiske trinnet er å hindre vann til APTES overflaten under APTES funksjonalisering trinn, noe som ville føre til ødeleggelse av den selv-montert overflate. Dette overvinnes ved anvendelse av etanol som oppløsningsmiddel og bakervarer APTES i ovnen for å redusere hydrolyse fra senere vandige oppløsninger. Den andre kritiske trinnet er de EDC reaksjonstrinn hvori EDC katalyserer reaksjonen av DSB med APTES: slik at tverrbinding av de to lag. Hvis EDC er utelukket eller ikke er tilstrekkelig lagt, vil DSB ikke være i stand til å feste gulvet, h h vil kompromittere utløsermekanismen. Den tredje kritiske trinn er under SAV funksjon, som opprettholde SAV laget er kritisk. Ikke-ensartethet av streptavidin laget fører til reduksjon i fangsteffektivitet. Det fjerde trinnet er kritisk i den biotinylering av antistoffet, som binding av antistoffet til fangst overflate lettes via biotin-streptavidin interaksjon av fangst overflate og antistoff. Dersom antistoff er ikke-biotinylert, så streptavidin laget vil være i stand til å fange den og dra den ned, noe som gjør fangst overflaten ubrukelig. Variabilitet og inkonsistens i overflaten fangst kan tilskrives konsentrasjon ikke-regularitet samt stochasticity av laget vedlegg. Denne variasjonen kan styres ved hjelp av presise konsentrasjoner av lag komponenter kalibrert til overflaten og de tiltenkte målene for fangst. I denne designen, er konsentrasjonene kalibrert spesielt til fangst av MCF7--GFP celler.

e_content "> Hva er noen ulemper med denne metoden?

For tiden er det APTES funksjonalisering utføres ved hjelp av en væskefase neddykking av overflaten i 55 minutter, etterfulgt av et baketrinn i opp til 2 timer. Selv om dette gir mulighet for en fullstendig lag av APTES silan binder seg til overflaten, vil en mer jevn prosess være dampfasen silanisering 37. Dette reduserer APTES kontakttiden, og dermed spare forskeren tid, så vel som å øke jevnheten. I tillegg har forbedret rullegardin blitt observert 17 når inkubering over natten av SAV blir brukt, og for tiden krever overflatefunksjonalise to, over natten inkubering, noe som gjør den totale prosess tar tre dager. Så, optimalisere kjemien ville gi betydelige tidsbesparelser for forskeren.

Hva er noen advarsler eller forholdsregler som kan være nyttig?

Når funksjonalisering av overflater, er det imhelt nødvendig at forsvarlig omsorg er tatt til risikoen for luftveisskader. Både APTES og merkaptoetanol kan være ekstremt farlig til lungene og tilhørende organer, og dermed er det nødvendig å gjøre den funksjonprosessen i en kjemisk hette for å redusere vekselvirkning med de kjemiske damper. Merkaptoetanol er en tiol som er spesielt stikkende lukt i. Når du bruker merkaptoetanol tillate for forurenset avfall til å sitte i panseret for en dag eller to før de kastes.

Hva er de fremtidige mål og anvendelser av denne overflaten?

Våre fremtidige mål bære å tilpasse denne overflaten for å arbeide med en rekke relevante celletyper for angiogene relaterte sykdommer. Spesielt ønsker vi å fokusere på menneskelige navleveneendotel Cells for å naturlig overgang til å bruke blodprøver og skille ut celler av interesse derfra. I tillegg planlegger vi å integrere separasjons modaliteter som aptamerer i utformingen av det funksjon surface for å ytterligere øke vår fangst og slipp prosenter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981		 Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108		 Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		 Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Tags

Cancer Research bioteknologi celle isolasjon personlig medisin desthiobiotin SAV biotin glass funksjon APTES MCF7--GFP RAW 264,7
En metode for målrettet Cell Isolation via Glass Surface funksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ansari, A., Patel, R., Schultheis,… More

Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter