Introduction
Aktuelle bench-top cellesepareringspræparater tilgange (f.eks fluorescensaktiveret cellesortering 1, laser capture micro-dissektion 2, immuno-magnetisk perle separation 1) kan tage flere timers forberedelse og sortering. Disse store tidsskalaer kan påvirke fysiologiske respons og ekspressionsniveauerne, hvilket resulterer i analyser, der ikke er repræsentative for den fysiologiske reaktion 3. Systemer er behov, som hurtigt og effektivt kan isolere specifikke celletyper uden at forstyrre celleoverfladereceptor-niveauer for at forbedre celleisolering og berigelse for biomedicinske anvendelser. Derfor rationalet for vores tilgang er at udvikle en blid tilgang til celle isolation.
Den "lab på en chip" konceptet tilbyder løftet om størrelsesordener hurtigere (timer-til-minut) celle isolation, og oftest involverer opfange celler på en overflade og frigive celler eller intracellulær conteNTS gennem fysisk 4,5 eller kemiske metoder 6. Selv om disse fremgangsmåder har et par fordele såsom identifikation af protein 7,8 ekspression, identificere RNA-ekspression 9-11, eller endog bestemmelser celler til in vitro dyrkning 12,13, kan mange af disse teknikker ikke oversat til diagnostik, såsom celle-receptor profilering grund af deres ikke-fysiologiske miljøer. Enzymatiske løft, såsom collagenaser kan også påvirke disse receptor mængder 14,15, hvilket betyder, celle-receptor kvantificering teknikker, der bruger disse løfte agenter vil ikke generere præcise fysiologiske data. Cellular lysis forhindrer differentiering mellem de indfødte overfladereceptorer, og dem, der tidligere blev internaliseret 16. Denne protokol beskriver en hurtig og skånsom fremgangsmåde til celleisolering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Rengøring glasoverfladen og forberede reagenser
- Placer en glasoverflade i en ilt plasma maskine i 5 minutter ved 50% magt til at rense den.
- Forbered 2,5 ml 2% rekonstitueret (3-aminopropyl) triethoxysilan (APTES) opløsning, ved at tilsætte 50 pi af APTES og 2,45 ml ethanol i et konisk rør.
2. APTES og DSB funktionalisering
- Tilføj APTES løsning til overfladerne. Tilsæt 150 pi per brønd til 8 brønds plader. Tilsæt 100 pi per brønd i 24 brønds plader. Pipette 1,1 ml til 60 x 15 mm glas retter. Dæk overflader for at forhindre fordampning og ujævn fordeling af APTES opløsning. Placer overfladerne på en platform-ryster i 50 minutter ved stuetemperatur, hvilket skaber en jævn fordeling af APTES laget.
BEMÆRK: APTES er en aminosilan, der udgør det første lag af overfladen. Hvis du bruger en anden overflade, heuristisk bestemme volumen opløsning er nødvendig for at dække overfladen. - Vælg temperatur i ovnen, mens overfladerne er på rysteapparatet: Opvarm til 55 ° C i 2 timer for brønds plader 8 og pladerne med 24 brønde. Varme glas retter kun til 90 ° C i 1 time.
- Skyl overflader med ethanol.
- Administrere mængde ethanol kræves af indrykke baseret på overfladen anvendes. Tilsæt 150 pi ethanol til hver brønd til 8 brønds plader. Tilføj 125 pi ethanol til hver brønd plader godt i 24. Tilføj 1,1 ml ethanol til glas retter.
- Skyl overfladen ved afladning og trække væske fra en fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen. Skyl to gange mere under anvendelse af ethanol.
BEMÆRK: Hvis nogen af glasbund brønde har nogen plastik i dem, ikke varme dem over 65 ° C, da plasten vil begynde at smelte og warp.
- Tør med 100% nitrogengas dispenseres fra en tank. Placer overflader i oven.
- Forbered 2,5 ml d-desthiobiotin (DSB) opløsning ved at kombinere 1,5 mg / ml DSB i 37,5 pi dimethylsulfoxid (DMSO) og 5 mg / ml 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) i 2462,5 pi af 0,1 M 4-morpholinoethansulfonsyre-hydrat (MES) (pH 6) puffer. Så kombinere begge løsninger.
- Tilsæt 1 pi 2-β mercaptoethanol, efter 15 min, i opløsningen for at standse reaktionen mellem DSB og EDC. Fjern hot APTES funktionaliserede glasoverflader fra ovnen. Vent 5-10 min for glasoverflader at køle.
- Tilføj MES buffer overfladen til at skylle, anvendelse af mængder baseret på overfladen. Tilføj 150 pi MES buffer til hver brønd til 8 brønds plader. Tilføj 125 pi MES buffer til hver brønd i 24 brønds plader. Tilføj 1,1 ml MES-buffer for glas retter.
- Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten på ca. 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegedeind i overfladen. Skyl to gange mere med MES-buffer.
- Påfør DSB løsning på de overflader, der tillader dem at inkubere. Tilsæt 150 pi DSB opløsning per brønd i 8 brønds plader. Tilsæt 100 pi DSB opløsning per brønd i 24 brønds plader. Tilføj 1,1 ml til glas retter DSB opløsning.
- Placer DSB dækket glasoverflader på en fugtig papirserviet inde i en petriskål. Dæk og inkuberes i et 4 ° C køleskab i 18-24 timer.
3. Streptavidin Funktionalisering
- Skyl hvert glas overflade tre gange med 1 ml 1,0x phosphatbufret saltvand (PBS). Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen. Fortynd streptavidin (SAv) stamopløsning til 0,4 mg / ml (anbefales).
BEMÆRK: PBS er isotonisk, så det kan anvendes som et medium til fortynding og skylning. PBS anvendes som et opløsningsmiddel for SAv, og derfor ikke vil påvirke evnen af SAV til at binde til overfladen. - Påfør 0,4 mg / ml SAv opløsning jævnt til overfladerne, således at et tyndt lag af formularer i bunden af glasset, vælge den mængde løsning baseret på overfladen. I 8 brønds plader, tilsættes 150 pi 0,4 mg / ml SAv opløsning per brønd. For plader med 24 brønde tilsættes 100 pi 0,4 mg / ml SAv opløsning per brønd. For glas retter, tilsættes 1,1 ml 0,4 mg / ml SAv løsning.
- Dæk og flytte pladerne til en 14 cm petriskål til at bevare fugten. Inkubér petriskålen i køleskab i 18-24 timer.
BEMÆRK: Det er vigtigt at udnytte konsistente mængder APTES, DSB, og SAv på hver overflade. - Skyl hvert glas overflade tre gange med 150 pi PBS til fjernelse SAv. Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen.
- Fugt en køkkenrulle wed deioniseret vand og placer køkkenrulle fladt i 14 cm petriskål omgiver pladerne til at bevare fugten i brøndene. Dæk petriskål indeholdende brøndene. Inkubér petriskålen i et 4 ° C biosikkerhed niveau 1 (BSL-1) køleskab indtil brug.
4. Cell Capture and Release
- Start med T175 kolbe (r) af celler beregnet til eksperimentet. Aspireres mediet fra kolben (s). Udvaske de resterende medier med 5 ml stuetemperatur PBS. Aspirer PBS fra kolben (s).
- Der tilsættes 10 ml ikke-enzymatisk løfte- middel, såsom Cell Dissociation Solution, til T-175 kolbe af celler. Sæt kolben i inkubatoren i 6 min at give mulighed for at løfte af cellerne fra kolben.
- Efter 6 min, tilsættes 10 ml koldt Hanks Balanced Salt Solution (HBSS; Se liste over materialer) for at inaktivere løft agent. Tag 20 pi celler for at tælle antallet af celler i opløsning under anvendelse af et hæmacytometer.
BEMÆRK: Afhængigt af funkind- lagt overflader skal i capture eksperiment, antallet af celler og behov varierer. For funktionaliserede 8 brønds plader, bruge 300.000 celler pr. For funktionaliserede glas retter, bruge 1,1 millioner celler. For funktionaliserede brønds plader 24, er 125.000 celler anbefales. Mere information om celletælling findes i tillægget. - Gentag trin 4.1- 4.3 for en anden kolbe af celler, hvis færre celler er til stede end nødvendigt til eksperimentet. Kombiner cellesuspensioner og fintælling celler for at få totale antal celler i opløsning.
- Spin ned cellesuspension i en centrifuge ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C for at få en pellet af koncentrerede celler. Find den passende mængde HBSS at tilføje til cellesuspensionen for at få en koncentration på 1 x 10 6 celler pr ml, derefter aspireres supernatanten fra de spundne ned celler, og tilsæt den beregnede mængde. Denne mængde kan beregnes ved hjælp af ligninger i Supplement.
- Pipette op og ned (tritureres) at resuspendere the celler i opløsning og reducere cellulær sammenklumpning i opløsning som kan reducere antistofbinding. Split den cellulære løsning til separat styring og eksperimentelle løsninger. Se Supplerende fil for komponenter og beregninger.
- Tilføj de biotinylerede antistoffer til de respektive celle opløsninger som beskrevet i Supplemental File. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C på en ende-over-ende mixer.
BEMÆRK: MCF7GFP celler, 0,5 mg / ml hlgG eller 0,5 mg / ml HLA-ABC antistoffer anbefales. For RAW makrofager, er 1 mg / ml mCD11b anbefales til halv volumen til at redegøre for de udvanding forskelle. For Menneskelig navleveneendotelceller (HUVEC'er), 0,5 mg / ml hCD31 anbefales. - Vask den funktionaliserede glasoverfladen med HBSS. Til dette forsøg er en 8-brønds plade tilrådes.
- Tilsæt 150 pi HBSS til hver brønd til 8 brønds plader. Skyl to gange mere hjælp HBSS. Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden.Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen. Hold kold ved 4 ° C.
- Tilføj-løsninger til brøndene og vente 45 min for cellerne at inkubere på is på rysteapparatet. Gør løsningen af biotin i sterilt HBSS ved at bruge beregnede mængder, som beskrevet i tillægget.
- Fjern cellen opløsningen fra glas brøndene ved hjælp HBSS.
- Forsigtigt pipettere 150 pi HBSS til hver brønd. Derefter pipetteres ud HBSS. Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen.
- Gentag to gange mere. Efter vask tilsættes HBSS til brøndene for at holde cellerne våd.
- Tilføj 150 ul 20 mM biotin løsning på hver respektive release godt, og derefter vente 20 min for at tillade reaktion.
- Huske ikke-specifikt bundet celles ved vask med HBSS som anført ovenfor, og derefter, hvis anvendelse af fluorescens-mærkede celler, fortsætte til fluorescensbillede cellerne. Også billedet levende celler i en kolbe (som en kontrol, at sammenligne med cellerne i brønden). Hvis der anvendes grønt fluorescerende protein (GFP) transficerede celler, vil excitation 470 nm og emission vil være 515 nm.
5. Antistof Optimering: antistoftitrering
- Begynd med at løfte cellerne fra T75 eller T175 kolbe som forklaret i trin 4.1- 4.3.
BEMÆRK: Disse mængder er kalibreret til plader med 24 brønde, men kan ændres til at passe eventuelle glas funktionaliserede overflader gennem heuristisk test. Et repræsentativt antistof titrering er vist i figur 1. - Tæl celler under anvendelse af hæmacytometer og derefter vågeblus cellen opløsning i et konisk rør ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C. Rekonstruere celler til 1 million celler pr ml, under anvendelse af de beregninger, der beskrives i Supplement.
- Split 1 million celler per ml opløsning i seks forskellige opløsninger af 500 pi i forskellige centrifugeglas af antistoffet (Ab) opløsninger.
- Fortynd antistoffet stamopløsning til 10 pg / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Opret kontrollerne ved anvendelse af 100 pi Stain Buffer (PBS + 1% natriumazid + 1% BSA), og 500 pi celler til kontrol uden Ab i det. For blindprøvekontrollen (Ingen Ab og ingen celler), skal du bruge en opløsning af 300 pi PBS.
BEMÆRK: ADVARSEL: Natriumazid er ekstremt giftige, eksplosive, og ekstrem omhu skal tages når du bruger den. Se venligst sikkerhedsdatablad (MSDS), og anvende passende sikkerhedsudstyr.
- Fortynd antistoffet stamopløsning til 10 pg / ml, 1 ug / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Opret kontrollerne ved anvendelse af 100 pi Stain Buffer (PBS + 1% natriumazid + 1% BSA), og 500 pi celler til kontrol uden Ab i det. For blindprøvekontrollen (Ingen Ab og ingen celler), skal du bruge en opløsning af 300 pi PBS.
- Kombiner og inkuber Ab løsninger med cellen løsninger i ende-over-ende blander ved 4 ° C i 30 minutter. Skyl de funktionaliserede 24 brønds plader med HBSS tre gange. Skyl overfladen ved afladning og trække væske fra en fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold piPette ved omtrent en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen.
- Alikvote 125 pi af hver prøveopløsning i de passende APTES, DSB, og SAv funktionaliserede godt. Der inkuberes ved 4 ° C eller på is i 45 minutter på glasoverfladen. Skyl overfladen med HBSS tre gange for at fjerne ikke-specifikt bundne celler. Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen. IKKE skylle den nederste række, som de er kontroller.
- Tilføj 150 ul HBSS til hver vaskes godt, satte brønde 24 på is, og derefter bruge en plade læser til at måle fluorescens af GFP-celler (Excitation 485 nm / Emission 528 nm).
6. Cell Optimering: Cell Titrering
- Løft cellerne som nævnt i trin 4.1 -4,3.
- Tæl celler under anvendelse af et hæmacytometer. Spin down celle sålution i konisk rør ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C. Rekonstruere celler til 1 million celler pr ml.
BEMÆRK: Yderligere oplysninger om brug af hemacytometer kan findes i tillægget. - Pipette 1,6 ml fra cellen løsning til 1,6 millioner celler lager og sted i en konisk rør. Pipette 800 pi celler fra cellen løsning til 800.000 celler lager og sted i en konisk rør. Pipette 80 pi fra cellen lager for 80.000 celler materiel og sted i en konisk rør. Pipette 8 pi fra cellen materiel til 8.000 celler materiel og sted i en konisk rør.
BEMÆRK: Koncentrationer er givet pr 8 såvel plade målinger replikere efter behov. Et eksempel på plade output er vist i figur 2. - Tag de fire stamopløsninger og spin i en centrifuge ved 500 xg i 5 min ved 4 ° C. Re-suspendere alle stamopløsninger i 400 pi HBSS.
- Tilføj 1,6 pi 100 ng / ml antistof til 1,6 millioner celler lager, 0,8 μl til 800.000 celle lager, og 0,5 pi til alle andre bestande. Inkubér antistoffet i 30 minutter i ende-over-ende-blander i 30 minutter ved 4 ° C. Vask den funktionaliserede glasoverfladen med HBSS tre gange.
BEMÆRK: Pladen funktionaliserede 8 godt anbefales til mikroskopi kvantificering, mens anbefales funktionaliserede plade 24 godt for pladelæser kvantificering. Antistofkoncentration for 8.000 celle bestand blev ikke reduceret til at tillade den begrænsende faktor indfangningsfladen at ikke være manglen på antistoffer i opløsning, men snarere registreringsmidlet egenskaber af overfladen. - Påfør 150 pi af prøveopløsningerne til hver brønd. Påfør 1,6 millioner celle lager til den første kolonne af brønde til venstre. Påfør 800.000 celle materiel til den anden kolonne fra venstre. Påfør 80.000 celle materiel til den tredje kolonne fra venstre. Endelig anvender 8000 celle materiel til den sidste kolonne. Inkuber i 45 minutter ved 4 ° C på rysteapparat.
BEMÆRK: 1,6 millionercelle lager tjener som den højeste koncentration, der skal testes, og er dobbelt så mange celler, som anvendes typisk i cellesepareringspræparater eksperimenter (600.000 celler per brønd) Den 800.000 celle lager tjener som kontrol for forsøget, da det er den typiske cellulære koncentration der anvendes i cellesepareringspræparater eksperimenter (3.000.000 celler per brønd). Den 80.000 celle lager fungerer som en ti gange fortynding til at teste for lavere koncentrationer for cellulær capture (30.000 celler pr brønd). Den 8.000 celle lager tjener som en hundrede ganges fortynding til brug som en test for at kontrollere den nedre grænse for cellulær separation (3.000 celler pr brønd). - Skyl med HBSS tre gange. Skyl overfladen ved losning og trække væske fra et fast punkt såsom hjørnet af brønden. Hold pipetten ved ca. en 70 ° vinkel, så spidsen ikke er direkte pegede i overfladen. Saml alle vaske.
- Billede cellerne på et fluorescens mikroskop, hvis du bruger 8 brønde, tage billeder af hver suransigt, og anvende 150 pi biotin til hver overflade i en time ved 4 ° C på rysteapparat. Efter en time, skylles frigivelse brønde biotin med HBSS 3 gange som tidligere. Saml alle vaske fra brønde til at tælle med hæmocytometeret og image de release brønde.
- Påfør 150 ul 20 mM overskydende biotin løsning til passende brønde biotin release i 1 time, hvis du bruger plader med 24 brønde, og derefter skylles de brønde 3 gange med HBSS. Kvantificere plader med 24 brønde under anvendelse af en pladelæser. Brug et hæmacytometer at tælle celler fra alle indsamlede såvel vaske.
7. Image Analysis
Bemærk: Det anbefales at FIJI softwarepakke (http://fiji.sc/Fiji) til billedanalyse. Indledningsvis blev billederne konverteret til gråtoner billedet og derefter lysstyrke / kontrast blev ændret til at bringe cellerne.
- Læg op billedet, og konvertere til gråtoner ved at klikke på fanen billedet og derefter rulle ned til "Type" og derefter klikke på4; 8 bit ".
- Øg kontrasten i billedet ved at klikke på fanen billede og derefter rulle til "Adjust". Klik på "lysstyrke og kontrast", og derefter bruge rullepanelerne til at gøre cellerne skiller sig ud. Hvis du bruger fluorescens billeder, vend billederne for at gøre cellerne mere defineret.
- Læg en plugin på ImageJ kaldet ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) at analysere billederne.
- Open ITCN. Når der vises en dialogboks, der beder brugeren med flere parametre at estimere størrelsen af cellen, skal du indstille den mindste bredde af cellen af interesse først. Klik på "Detect Mørke Peaks" valgmulighed, hvis billedet er fluorescerende, og cellerne er formørket.
- Sæt tærskelværdien på 2 i første omgang, og derefter trykke på knappen "Count". En nyligt talt version af billedet vises med røde prikker afgrænser hvor celler er blevet talt.
- Justér tærsklen og bredde parameter for at få mere præcise cellulære data efter defining størrelsen af en "celle". Bemærk: Antallet af celler tælles vil være i en dialogboks til højre. Ændring af parametre vil give forskellige antal celler tælles.
- Fortsæt med at gentage gennem tærskel og bredde parametre, indtil et godt estimat er nået for antallet af celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Brug af denne protokol viser vi celleindfangning (figur 3A) og celle frigivelse (figur 3C) i MCF7GFP celler såvel som levende celle (Figur 4). Vi kvantificeret cellen capture som 60% og 80% blev frigivet (figur 3C). Når vi udvidet denne fremgangsmåde til en blanding af RAW 264.7 makrofager og MCF7GFP celler blev 50% af RAW makrofager fanget (fig. 3D) og 80% af RAW makrofager var frigivelse med 20 mM biotin (figur 3B). Da overskydende antistof kan reducere celle fange, vi optimeret via titrering 0-10.000 nM af HLA-antistof, og observere, at den ideelle koncentration antistof er mellem 100-1.000 mM antistof (fig. 1). Tilsvarende bestemmer vi, at den ideelle koncentration af celler, der kan opfanges, er 1 x 10 5 og 1 x 10 6, idet under dette antal celler, værdier er lavere end baggrunden 17(Figur 2). De fluorescensdata fra hver brønd forarbejdet som beskrevet nedenfor.
Her er gennemsnittet af 3 replikater taget fra en prøve uden antistof (blind) og subtraheres fra fluorescensen opnået fra hver prøve. Denne værdi er derefter normaliseret til den gennemsnitlige maksimale fluorescens. Denne behandling gør det muligt for forskeren at klart observere den lave grænse for cellulære detektion.
Figur 1. Normalized blændet antistoftitrering. Humant HLA-ABC titreres over en konstant mængde MCF7GFP celler (125.000 celler per brønd), og fluorescensen af indfangede celler blev kvantificeret ved anvendelse af en pladelæser. Forudat være udsat for den funktionaliserede overflade, blev cellerne og antistoffer centrifugeret for at fjerne ikke-specifikt antistof binding. Uden denne centrifugering, vil overskydende antistof mætte overfladen og forhindre cell pulldown, som vist med koncentrationer på 10.000 ng / ml, hvor centrifugering ikke var tilstrækkeligt til at hindre antistof overmætning af overfladen, hvilket resulterer i mindre celler binder til overfladen. Grå linje repræsenterer kontrol. Fejl søjler repræsenterer standardafvigelse af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Normaliseret slettet Cell Titrering. Brug optimeret antistofkoncentration fra antistoftitrering, MCF7GFP celler blev titreret til at finde optimeret capture koncentration mens keeping funktionaliseret overflade og antistofkoncentrationer konstant. Dette kan bruges til at kalibrere celleindfangning til forskellige applikationer. Kolonner i denne figur er gentagelser, mens rækkerne ændrer koncentrationen af celler til at finde ideen interval for cellulær fange. Grå linje repræsenterer kontrol, og fejl barer repræsenterer standardafvigelsen af middelværdien. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Capture og Release Eksperimenter. En enkelt celle blanding blev udsat for den funktionaliserede overflade (A), opfange MCF7GFP celler under anvendelse HLA-ABC-antistof. Når vasket med HBSS (B), forblev celler fanget, men når de udsættes for en opløsning af 20 mM biotin (C) blev celler released. En cellulær blanding af MCF7GFP celler og RAW 264,7 makrofager blev udsat for en funktionaliseret overflade og blev taget med mCD11b antistof (D). Ikke-specifikke MCF7GFP celler er mærket med grønt. Fluorescensintensitet af MCF7GFP celler nedsat, når de udsættes for en neutral vask (E), hvilket indebærer, at overfladen ikke målrette dem, og at de vedlagte ikke-specifikt. Ved udsættelse for en biotin vask (F), blev de målrettede RAW makrofager frigøres fra overfladen. Scale barer er 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Positive and Negative Cell Control til Dual Cell Isolation. Den positive kontrol RAW makrofager er afbildet ona fluorescensmikroskop, der viser ingen fluorescerende aktivitet samt den relative dimensionering af celler. Brightfield RAW makrofager viser celle dimensionering (A), mens under GFP excitation, er der ingen fluorescens (B), som er vist i det flettede billede (C). Den negative kontrol MCF7GFP celler afbildes på et fluorescens-mikroskop, der viser stor fluorescerende aktivitet, samt MCF7GFP cellernes relative størrelse. Celler afbildes på lysfelt (D), der viser dimensionering, og mens under GFP excitation (E) viser stor fluorescens, som kan tydeligt vist i det flettede billede (F). Scale barer er 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5. Sammenligning af centrifuge brug i standard oprensningsteknikker. foranalysen centrifugeringstrin er konserveret i forberedelsen. Magnetisk perle isolation samt FACS involverer flere yderligere centrifugeringstrin, som indfører stress på celler og kan ændre ekspressionsniveauerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende Code File. Beregninger. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Forbedringer i celle isolation teknikker fremmer videnskabelige undersøgelser i mellem struktur og funktion i neurovidenskab 18, stamceller programmering i regenerativ biologi og angiogen signalering i vaskulær biologi 19. Faktisk primær cellekultur 20 (f.eks HUVEC'er) i vaskulær biologi sker primært gennem anvendelse af celleisolering teknikker. Cell isolation blev også for nylig anvendt til kvantitativ flow (qFlow) cytometri analyse af plasma membran receptorer 3,14,15,19,21. Men de eksisterende celle isolation metoder påvirker celleoverfladereceptor niveauer, og er dyre i både personale og reagenser. Vi har avancerede en ny metode i overfladefunktionalisering 17, som giver mulighed for oprettelse af en blid system med reproducerbar opsamling af en enkelt celletype fra en blanding af celletyper til at opfylde disse mangler. Denne teknik kan integreres i en iterativ system gives mulighed for capturing forskellige celletyper i faser ved hjælp af specifikke antistoffer. For yderligere at tydeliggøre proceduren, tilbydes en række fejlfinding spørgsmål og svar nedenfor:
Funktionalisering Optimering: funktionalisering processer er blevet optimeret til forbedret ensartethed og træk ned for MCF7gfp celler. Denne protokol kan alternativt være optimeret og tilpasset til enhver celletype og antistof konfiguration. Dette kan opnås ved ændring af koncentrationer af basiskomponenter i capture overflade, eller ved at ændre typen eller koncentrationer af antistofferne. De fleste antistoftyper kan biotinyleres under anvendelse af ovennævnte protokol. Når biotinyleret, kan de så titreres (figur 1) for at finde ideelle koncentration til trække ned. Cellekoncentrationen kan titreres (figur 2) for at finde den ideelle koncentration af celler til fange. Ved hjælp af denne, det er muligt at fange en bestemt celletype med hættentur overflade kan konstateres. For eksempel, hvis en celletype af interesse er på omfanget af 100 celler per million celler, fanger koncentrationer af celler i dette område ved hjælp af den funktionaliserede overflade ville være ideelt. Hvis der under titreringen, kan overfladen ikke fange celler af denne lille en koncentration, der er nødvendigt derefter optimering af overfladen eller antistoffet for at være i stand til at filtrere celler inden for dette koncentrationsområde.
Hvilken celle typer anvendes i denne protokol? Hvordan kunne nogen ændre denne protokol til at bruge en anden celletype?
I øjeblikket er denne protokol bruger MCF7-GFP celler, og RAW 264,7 makrofager er ofte inkluderet for at vise en evne til at trække sig ud én celletype i en dual-celle blanding. Disse celler blev udvalgt som de var to af de mest relevante celletyper til muse xenograftmodel (human tumor inden murine miljø). For at kalibrere fremgangsmåden til en række andre celler, antistof specificity er altafgørende. Der er flere online ressourcer til rådighed til at vælge antistoffer 22.
Hvad er nogle fordele ved denne metode?
Gentle tilgang: Den manglende kraft gør denne tilgang blid. Faktisk vores beregnede forskydningskraft er maksimalt, 24 x 10 -6 pN 17, som ikke bør forårsage betydelige forstyrrelser biomarkører, idet hydrodynamiske belastninger af 2,09 Pa (656 pN antagelse 314 pM 2 celle overfladeareal) inducerer nekrose mens værdier af stress nedenfor 0,59 Pa (185 pN antager 314 pM 2 celle overfladeareal) ikke 23. Denne milde tilgang er derfor fordelagtig over nogle kommercielt tilgængelige muligheder såsom centrifugering tilgange 24, som udøver op til 0,78 Pa 25 af top shear stress på grund af den pludselige acceleration på værdier omkring 600 G, som kan ændre protein ekspressionsmønstre og morfologier 25 , 26 23. Således en proces, der kan reducere mængden af centrifuge kutymer vil reducere mængden af spændinger, at cellerne vil opleve gennem rensning og i sidste ende sikre mere fysiologiske data. Vores nuværende protokol anvender centrifuger at oprense og rekonstituere cellekoncentrationen før indfange dog denne fremstillingsproces er standard i mange oprensningsteknikker, såsom magnetiske perler isolation 27,28, flowcytometri 29, og FACS 30 (figur 5). Vores tilgang reducerer alle downstream centrifugeringstrin processer, at de andre teknikker anvender udover fremstillingstrinnet.
Biotin-avidin tilgang: Anvendelsen af almindeligt anvendte biomaterialer (DSB-Sav og biotin-SAV) gør også denne fremgangsmåde fordelagtigt 31,32. Avidin familie proteiner binder ekstremt selektivt til biotin familie proteiner og anvendes til en række scientSp ec ifik og medicinske applikationer, herunder: antistof-fluoroforen fastgørelse 33, kvantitativ Qdot-polystyren perle vedhæftet fil 34, og oprettelsen af hydrogeler, der reagerer på stimuli i miljøet til at frigive indkapslede stoffer 32. Derudover den relative lethed erhverve biotinylerede antistoffer gør denne tilgang bredt tilgængelig og kan tilpasses.
Desthiobiotin tilgang uden perler: indfangningsfladen er i stand til at gennemføre anvendelsen af desthiobiotin uden brug af barske reagenser og kræfter til at frigive cellerne. DSB har været anvendt til reversibel cellebinding og frigivelse af andre systemer sammenholdt med DSB-antistoffer og magnetiske perler 35. Men de barske virkninger af separation teknik samt den store cellulære tab forbundet med at forberede prøverne 27,28 resultat i differential receptor og chemokinekspression 28,36. Denne tilgang har til formål at afbødeog overvinde disse begrænsninger ved at eliminere brugen af både magneten og perler at skabe en langt mere skånsom vask og frigivelse metode.
Hvad er de kritiske skridt i denne protokol? Hvad kan forårsage variation? Hvordan kan kontrolleres, at variabilitet?
Denne proces har fire vigtige trin, der kan resultere i nedsat effektivitet indfangningsfladen. Det første afgørende skridt er at forebygge vand til APTES overfladen under APTES funktionalisering trin, som ville resultere i ødelæggelsen af den selv-samlet overflade. Dette afhjælpes ved anvendelse af ethanol som opløsningsmiddel og bagning af APTES i ovnen for at reducere hydrolyse fra senere vandige opløsninger. Det andet kritiske trin er EDC reaktionstrin, hvor EDC katalyserer reaktionen af DSB med APTES: tillader tværbinding af de to lag. Hvis EDC er udelukket eller ikke tilstrækkeligt tilføjet, vil DSB ikke kunne knytte gulvet, whic h vil kompromittere den mekanisme udgivelse. Det tredje kritiske trin er under SAV funktionalisering, som opretholdelse af SAv lag er kritisk. Manglende ensartethed streptavidin lag resulterer i en reduktion i capture effektivitet. Det fjerde kritiske trin er i biotinylering af antistoffet, som bindingen af antistoffet til indfangning overflade lettes via biotin-streptavidin interaktion indfangningsfladen og antistof. Hvis antistoffet er ikke-biotinyleret, så streptavidin lag vil være ude af stand til at fange den og trække den ned, hvilket gør indfangningsfladen ubrugelig. Foranderlighed og inkonsekvens i overfladen capture kan henføres til koncentration ikke-regelmæssighed samt stokastik af lag vedhæftet fil. Denne variation kan styres ved hjælp af præcise koncentrationer af lag komponenter kalibreret til overfladen og de tilsigtede mål for fangst. I dette design, er koncentrationer kalibreret specifikt til erobringen af MCF7-GFP celler.
e_content "> Hvad er nogle ulemper ved denne metode?I øjeblikket er APTES funktionalisering gøres ved at anvende en flydende nedsænkning af overfladen i 55 minutter efterfulgt af en bagetrin i op til 2 timer fase. Selv om dette giver mulighed for en komplet lag af APTES silan til at binde til overfladen, ville en mere ensartet proces være dampfasen silanisering 37. Dette formindsker APTES kontakttid, hvorved der spares forskeren tid, samt øge ensartethed. Derudover har forbedret pull-down blevet observeret 17, når der anvendes inkubation natten over af SAV og i øjeblikket, overfladen funktionalisering kræver to, overnight inkubationer, hvilket gør den samlede proces tager tre dage. Så optimere kemien ville give betydelige tidsbesparelser for forskeren.
Hvad er nogle advarsler eller forholdsregler, der kan være nyttige?
Når funktionalisering overflader, er det imperative at der tages behørigt hensyn til risikoen for respiratorisk skade. Både APTES og mercaptoethanol kan være ekstremt farligt for lungerne og tilhørende organer, således er det nødvendigt at gøre den funktionalisering processen i en kemisk hætte for at reducere interaktionen med de kemiske dampe. Mercaptoethanol er en thiol, der er særlig skarp i lugt. Ved brug af mercaptoethanol, give mulighed for forurenet affald at sidde i hætte for en dag eller to før bortskaffelse.
Hvad er de fremtidige mål og anvendelser af denne overflade?
Vores fremtidige mål indebærer at tilpasse denne overflade til at arbejde med en række relevante celletyper for angiogene sygdomme. Især agter vi at fokusere på menneskelige navleveneendotelceller for at segue at bruge blodprøver og udskille celler af interesse derfra. Derudover planlægger vi at integrere modaliteter adskillelse såsom aptamerer i udformningen af den funktionaliserede overflade til yderligere at øge vores opsamling og release procenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) | Acros Organics | 919-30-2 | Used to make 2% APTES solution |
| Plasma Cleaner Pico | Diener | Model 1 | Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass |
| d-Desthiobiotin (DSB) | Sigma | D20655 | Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. |
| dimethyl sulfoxide (DMSO) | British Drug Houses (BDH) | BDH1115-1LP | Dissolves the DSB into solution |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) | Thermo-Scientific | 5g: 22980 25g: 22981 |
Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface. |
| uncoated 8-well culture slide | BD Falcon | Case of 24: 354118 Case of 96: 354108 |
Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments |
| Glass bottom 24-well plates | MatTek | P24G-0-13-F | Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments |
| Mercaptoethanol | Science Lab | 60-24-2 | Used to quench reaction between EDC and DSB |
| 4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES Hydrate 99%) |
Fisher Scientific | AC172590250 | Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction |
| Precision Oven | Thermo Scientific | 11-475-153 | Used in curing of PDMS and APTES layer. |
| Titramax 1000 Shaker | Heidolph | 13-889-420 | Used to ensure even distribution of APTES on surfaces. |
| 1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] | Proteo Chem | 9013-20-1 | Biotin-binding protein. May cause irritation. |
| 5 cm Glass Dish | Fisher Scientific | 08748A | Used in HUVEC studies as well as future profiling studies. |
| 14 cm Petri Dish with Cover | Sigma-Aldrich | Z717231 | Used to hold samples being functionalized and transport them. |
| MCF7-GFP cells | Cell Biolabs | AKR211 | Stored in liquid nitrogen |
| RAW264.7 mouse macrophages | ATCC | TIB-71 | Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen. |
| TrypLE | Life Technologies | 12605036 | Stored in 100 ml at room temperature |
| Dulbecco’s modified Eagle medium | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 50003PC | Supplier: Corning |
| Nonessential amino acids | Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC | 25-025-CI | Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning. |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 12-565-58 | Small 23 cm 50 pack |
| Cell Dissociation Solution | Corning | MT-25-056CI | Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments |
| Hemacytometer | Hausser | 02-671-54 | Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity. |
| Biotin | Amresco | 58-85-5 | Used to release cells from surface. |
| HBSS | Created from Recipe | N/A | Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate. |
| HLA-ABC Antibody | BioLegend | 311402 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| hIgG Antibody | BioLegend | HP6017 | Antibody used to capture MCF7gfp cells |
| MCF7 GFP cells | Cell Biolabs | AKR-211 | Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein. |
| Assorted Conicals | Thermo-Scientific | 15mL: 12-565-268 | 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots. |
| Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) | Fisher Scientific | 05-450-127 | Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix |
| Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) | Zeiss | N/A | Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope. |
| Zeba Desalting columns | Thermo-Scientific | PI-87770 | Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf |
| EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit | Thermo- Scientific | Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface | |
| Plate Reader | BioTek | Synergy HTX Multimode Reader | Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments. |
References
- Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
- De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
- Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
- Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
- Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
- Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
- Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
- Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
- Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
- Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
- Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
- Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
- Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
- Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
- Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
- BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
- Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
- Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
- Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
- dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
- Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
- Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
- Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
- Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
- Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
- Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
- Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
- Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
- Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).
