Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

En metod av riktad cellisolering via Glas ytfunktionalisering

Published: September 20, 2016 doi: 10.3791/54315
Automatic Translation
1, 2, 1, 3, 1
1Department of Bioengineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2Department of Liberal Arts & Sciences, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Department of Biomedical Engineering, Illinois Institute of Technology

Introduction

Nuvarande bänkcellseparationsmetoder (t.ex. fluorescensaktiverad cellsortering en laser capture mikro-dissektion 2, immun magnetisk pärla separation 1) kan ta flera timmar efter beredning och sortering. Dessa stora tidsskalor kan påverka fysiologiska respons och expressionsnivåer, vilket resulterar i analyser som inte är representativa för den fysiologiska svaret 3. System behövs som snabbt och effektivt kan isolera specifika celltyper utan att störa cellytreceptor-nivåer i syfte att förbättra cellisolering och anrikning för biomedicinska tillämpningar. Därför är den logiska grunden för vårt tillvägagångssätt för att utveckla en skonsam metod för cellisolering.

Den "lab on a chip" -konceptet ger löfte om storleksordningar snabbare (timmar till minuter) cellisolering och oftast innebär att fånga celler på en yta och frigörande celler eller intracellulär conteNTS genom fysisk 4,5 eller kemiska metoder 6. Även om dessa metoder har några fördelar såsom att identifiera protein 7,8 uttryck, identifiera RNA uttryck 9-11, eller även tillhandahåller celler för odling in vitro 12,13, många av dessa tekniker kan inte översättas till diagnostik såsom cellreceptor profilering på grund sina icke-fysiologiska miljöer. Enzymatiska lyftmedel såsom koUagenaser kan också påverka dessa receptormängder 14,15, vilket innebär cellsreceptor kvantifiering tekniker som använder dessa lyftmedel kommer inte att generera korrekta fysiologiska data. Cellulär lys förhindrar differentiering mellan de infödda ytreceptorer, och de som tidigare intern 16. Detta protokoll beskriver en snabb och skonsam metod för cellisolering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Rengöring glasytan och förbereda reagenser

  1. Placera en glasyta i en syreplasma maskin för 5 min vid 50% effekt för att rengöra den.
  2. Förbereda 2,5 ml 2% rekonstituerad (3-aminopropyl) trietoxisilan (APTES) lösning, genom att tillsätta 50 ul av APTES och 2,45 ml etanol i ett koniskt rör.

2. APTES och DSB funktionalisering

  1. Lägga APTES-lösning till ytorna. Tillsätt 150 pl per brunn för 8-brunnsplattor. Pipettera 100 | il per brunn för 24-brunnsplattor. Pipett 1,1 ml för 60 x 15 mm glas rätter. Täcka ytan för att förhindra avdunstning och ojämn fördelning av APTES-lösning. Placera ytorna på en plattform skakare under 50 min vid rumstemperatur, vilket skapar en jämn fördelning av den APTES-skiktet.
    OBS: APTES är en aminosilan, som bildar det första skiktet av ytan. Om du använder en annan yta, heuristiskt fastställa omfattningen av lösning som behövs för att täcka ytan.
  2. Välj temperatur för ugnen, medan ytorna är på skakapparaten: Värm till 55 ° C under 2 h för de 8-brunnsplattor och plattor med 24 brunnar. Värme glas endast rätter till 90 ° C under 1 timme.
  3. Skölj ytorna med etanol.
    1. Administrera mängd etanol som krävs genom att referera baserad på ytan används. Lägg 150 ul etanol till varje brunn för 8-brunnsplattor. Tillsätt 125 l etanol till varje brunn i 24-brunnsplattor. Lägg 1,1 ml etanol för glas rätter.
    2. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan. Skölj två gånger med användning av etanol.
      OBS: Om någon av glas botten brunnsplattor har någon plast i dem, inte värmer dem över 65 ° C, som plasten börjar att smälta och varp.
  4. Torka med 100% kvävgas matas ut från en tank. Placera ytorna i oven.
  5. Förbereda 2,5 ml d-destiobiotin (DSB) lösning genom att kombinera 1,5 mg / ml DSB i 37,5 | il dimetylsulfoxid (DMSO), och 5 mg / ml 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) i 2462,5 il av 0,1 M 4-morpholinoethanesulfonic-hydrat (MES) (pH 6) buffert. kombinera sedan båda lösningarna.
  6. Tillsätt 1 pl av 2-β merkaptoetanol, efter 15 min, ner i lösningen för att avbryta reaktionen mellan DSB och EDC. Ta varma APTES funktionglasytor från ugnen. Vänta 5-10 minuter för glasytorna svalna.
  7. Lägg MES buffert ytan för att skölja med hjälp av belopp som bygger på ytan. Tillsätt 150 | il MES-buffert till varje brunn för 8-brunnsplattor. Lägg 125 | il MES-buffert till varje brunn i 24-brunnsplattor. Lägg 1,1 ml MES-buffert för glas rätter.
  8. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekadein i ytan. Skölj två gånger med MES-buffert.
  9. Applicera DSB lösning till ytorna för att tillåta dem att inkubera. Tillsätt 150 pl DSB lösning per brunn för 8-brunnsplattor. Tillsätt 100 | il DSB lösning per brunn för 24-brunnsplattor. Lägg 1,1 ml för glas rätter DSB lösning.
  10. Placera DSB täckta glasytor på en fuktig pappershandduk i en petriskål. Täck och inkubera i en 4 ° C kylskåp för 18-24 timmar.

3. Streptavidin Funktionalisering

  1. Skölj varje glasytan tre gånger med 1 ml 1,0 x Fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan. Späd streptavidin (SAv) stamlösning till 0,4 mg / ml (rekommenderas).
    OBS: PBS är isoton så den kan användas som ett medium för utspädning och sköljning. PBS används som ett lösningsmedel för SAv, och därför kommer inte att påverka förmågan hos SAv att binda till ytan.
  2. Applicera 0,4 mg / ml SAv lösning jämnt på ytorna så att ett tunt skikt av formulär på botten av glaset, väljer mängden lösning baserad på ytan. För 8-brunnsplattor, tillsätt 150 pl 0,4 mg / ml SAv lösning per brunn. För plattor med 24 brunnar, tillsätt 100 pl 0,4 mg / ml SAv lösning per brunn. För glas rätter, tillsätt 1,1 ml 0,4 mg / ml SAv lösning.
  3. Täck och flytta plattorna till en 14 cm petriskål för att behålla fukt. Inkubera petriskål i kylskåp under 18-24 timmar.
    OBS: Det är viktigt att utnyttja konsekvent volymer av APTES, DSB, och SAV på varje yta.
  4. Skölj varje glasytan tre gånger med 150 pl PBS för att avlägsna SAv. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan.
  5. Våt en pappershandduk wed avjonat vatten och placera pappershandduk plant i 14 cm petriskål som omger plattorna för att behålla fukt i brunnarna. Täck petriskål med brunnarna. Inkubera petriskål i ett 4 ° C biosäkerhet nivå 1 (BSL-1) kylskåp tills det behövs.

4. Cell Capture och Release

  1. Börja med T175-kolv (ar) av celler som är avsedda för experimentet. Suga ut mediet från kolven (er). Tvätta bort kvarvarande papper med 5 ml rumstemperatur PBS. Aspirera PBS ur kolven (er).
  2. Tillsätt 10 ml av icke-enzymatisk lyftmedel, såsom Cell Dissociation Solution, till T-175-kolv av celler. Sätt kolven i inkubatorn under sex minuter för att möjliggöra lyftning av cellerna från kolven.
  3. Efter sex minuter, tillsätt 10 ml kall Hanks balanserade saltlösning (HBSS, se lista över material) för att inaktivera lyftmedel. Ta ut 20 | il av celler för att räkna antalet celler i lösningen med användning av en hemacytometer.
    OBS! Beroende på funkalise ytor som används i infångningsexperiment, antalet celler som behövs varierar. För funktion 8 brunnsplattor, använda 300.000 celler per brunn. För funktionaliserade glasformar, använder 1,1 miljoner celler. För funktion plattor med 24 brunnar, är 125.000 celler rekommenderas. Mer information om cellräkning finns i supplementet.
  4. Upprepa steg 4.1- 4,3 för en annan kolv med celler, om färre celler är närvarande än vad som behövs för experimentet. Kombinera cellsuspensioner och att räkna celler för att få totala antalet celler i lösning.
  5. Spinn ner cellsuspension i en centrifug vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C för att få en pellet av koncentrerade celler. Hitta den lämpliga mängden av HBSS för att lägga till cellsuspensionen för att få en koncentration av 1 x 10 6 celler per ml, sedan aspirera supernatanten från de spunna ned cellerna och lägga den beräknade volymen. Denna volym kan beräknas med hjälp av ekvationerna i supplementet.
  6. Pipettera upp och ner (finfördela) att resuspendera the celler i lösning och minska cellulär hopklumpning i lösningen som kan minska antikroppsbindning. Split cell lösning i separata kontroll- och experiment lösningar. Visa Kompletterande fil för komponenter och beräkningar.
  7. Tillsätt biotinylerade antikroppar till respektive cell lösningar beskrivs i Supplemental fil. Inkubera i 30 min vid 4 ° C på en ände-över-ände-blandare.
    OBS: För MCF7GFP celler, 0,5 mg / ml hIgG eller 0,5 mg / ml HLA-ABC-antikroppar rekommenderas. För RAW makrofager, är 1 mg / ml mCD11b rekommenderas vid halva volymen redogöra för utspädnings skillnader. For Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC), 0,5 mg / ml hCD31 rekommenderas.
  8. Tvätta den funktionaliserade glasytan med HBSS. För detta experiment, är en 8-brunnars platta rekommenderas.
    1. Tillsätt 150 l HBSS till varje brunn för 8-brunnsplattor. Skölj två gånger mer med HBSS. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen.Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan. Håll kallt på 4 ° C.
  9. Lägg cell lösningar till brunnarna och vänta 45 minuter för cellerna att inkubera på is på shaker. Gör lösningen av biotin i steril HBSS med beräknade volymer som beskrivs i Supplement.
  10. Avlägsna cellen lösningen från glasbrunnar med hjälp av HBSS.
    1. Försiktigt pipett 150 l HBSS i varje brunn. Sedan pipett ut HBSS. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan.
    2. Upprepa två gånger. Efter tvätt, lägga HBSS till brunnarna för att hålla cellerna våt.
  11. Tillsätt 150 pl av 20 mM biotin lösning till respektive frigör väl, och sedan vänta 20 minuter för att möjliggöra reaktion.
  12. Minnes icke specifikt bunden cells genom tvättning med HBSS enligt ovan, och sedan om med användning av fluorescensmärkta celler, fortsätt till fluorescensbild cellerna. Också bild levande celler i en kolv (som en kontroll, för att jämföra med cellerna i brunnen). Om du använder grönt fluorescerande protein (GFP) transfekterade celler kommer excitation vara 470 nm och emissions blir 515 nm.

5. Antikropp Optimization: antikroppstiter

  1. Börja med att lyfta celler från T75 eller T175 kolv som förklaras i steg 4.1- 4.3.
    OBS: Dessa volymer är kalibrerade för plattor med 24 brunnar, men kan ändras för att passa alla glasfunktion ytor genom heuristisk tester. En representativ antikroppstiter visas i figur 1.
  2. Räkna celler med användning av hemacytometer och sedan centrifugera ner cellen lösningen i ett koniskt rör vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Rekonstruera celler till 1 miljon celler per ml, med hjälp av de beräkningar som beskrivs i Supplement.
  3. Dela upp en million celler per ml lösning till sex olika lösningar av 500 | il i olika centrifugrör för antikroppen (Ab) lösningar.
    1. Späd antikroppförrådslösningen till 10 | ig / ml, 1 pg / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml. Skapa kontrollerna med 100 pl Stain buffert (PBS + 1% natriumazid + 1% BSA), och 500 pl celler för kontroll utan Ab i det. För blankprov (nr Ab och inga celler), använd en lösning av 300 pl PBS.
      OBS: VARNING: Natriumazid är extremt giftig, explosiv, och extrem försiktighet måste iakttas vid användning av den. Kontakta materialsäkerhetsdatabladet (MSDS) och använd lämplig skyddsutrustning.
  4. Kombinera och inkubera Ab lösningar med cell lösningar i ände-över-ände-blandare vid 4 ° C under 30 min. Skölj de funktionaliserade plattor med 24 brunnar med HBSS tre gånger. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll piPette vid ungefär en 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan.
  5. Alikvot 125 ul av varje provlösning in i lämpliga APTES, DSB, och SAv funktionaliserad väl. Inkubera vid 4 ° C eller på is under 45 min på glasytan. Skölj ytan med HBSS tre gånger för att avlägsna icke-specifikt vidhäftade celler. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan. Skölj inte den nedersta raden, eftersom de är kontroller.
  6. Tillsätt 150 pl av HBSS till varje tvättas väl, sätta plattor med 24 brunnar på is, och sedan använda en plattläsare för att mäta fluorescens av GFP celler (excitation 485 nm / emission 528 nm).

6. Cell Optimization: Cell Titrering

  1. Lyft cellerna som nämns i steg 4,1 -4,3.
  2. Räkna celler med användning av en hemacytometer. Spinn ner cell sålution i koniskt rör vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Rekonstituera celler till 1 miljon celler per ml.
    OBS! Mer information om användning av hemacytometer kan hittas i supplementet.
  3. Pipett 1,6 ml från cellen lösningen för 1,6 miljoner celler lager och plats i en konisk tub. Pipett 800 ul av celler från cell lösning för 800.000 celler lager och plats i en konisk tub. Pipett 80 ul från cell lager för 80.000 celler lager och plats i en konisk tub. Pipetten 8 pl från cell lager för 8000 celler lager och plats i ett koniskt rör.
    OBS: Koncentrationerna ges per 8 såväl mätningar plattan, replikerar som behövs. Ett exempel på plattan utsignal visas i figur 2.
  4. Ta de fyra stamlösningar och snurra i en centrifug vid 500 xg under 5 min vid 4 ° C. Åter avbryta alla stamlösningar i 400 pl HBSS.
  5. Lägga 1,6 pl av 100 ng / ml antikropp mot 1600000 cell lager, 0,8 μl till 800.000 cell lager, och 0,5 l till alla andra bestånd. Inkubera antikroppen under 30 minuter i ände-över-ände-blandare under 30 minuter vid 4 ° C. Tvätta den funktionaliserade glasytan med HBSS tre gånger.
    OBS: Den funktionaliserade åtta brunnar rekommenderas för mikroskopi kvantifiering, medan den funktionaliserade 24 brunnar rekommenderas för plattläsare kvantifiering. Antikroppskoncentrationen för 8000 cell lager reducerades inte att tillåta den begränsande faktorn av infångningsytan för att inte vara bristen av antikroppar i lösning, utan snarare de fångar egenskaperna hos ytan.
  6. Applicera 150 pl provlösning till varje brunn. Applicera 1.600.000 cell lager till den första kolumnen av brunnar till vänster. Applicera 800.000 cell lager till den andra kolumnen från vänster. Applicera 80.000 cell lager till den tredje kolumnen från vänster. Slutligen tillämpar 8000 cell lager till den sista kolumnen. Inkubera i 45 min vid 4 ° C på skak.
    OBS: 1600000cell lager fungerar som den högsta koncentrationen som ska testas, och är dubbelt så mycket celler som används i vanliga cellseparationsexperiment (600.000 celler per brunn) Den 800.000 cell lager fungerar som kontroll för experimentet, eftersom det är den typiska cellulära koncentrationen som används i cellseparationsexperiment (3.000.000 celler per brunn). Den 80.000 cell lager fungerar som en tiofaldig utspädning för att testa lägre koncentrationer för cellulär capture (30.000 celler per brunn). 8000 cell lager fungerar som en hundrafaldig utspädning för att använda som ett test för att kontrollera den nedre gränsen för cellseparation (3000 celler per brunn).
  7. Skölj med HBSS tre gånger. Skölj ytan genom urladdning och dragning av vätska från en fast punkt, såsom hörnet av brunnen. Håll pipetten i ungefär 70 ° vinkel så att spetsen inte är direkt pekade in i ytan. Samla alla tvättar.
  8. Bild cellerna på ett fluorescensmikroskop, om du använder 8 brunnsplattor, ta bilder på varje suransikte, och applicera 150 ^ il biotin till varje yta under en timme vid 4 ° C på skak. Efter en timme, skölj biotin släpp brunnarna med HBSS 3 gånger som tidigare. Samla alla tvättar från brunnar för att räkna med hemocytometer och bildfrisättnings brunnar.
  9. Applicera 150 pl 20 mM överskott biotin lösning till lämpliga släpp brunnar biotin för en timme, om du använder plattor med 24 brunnar, och skölj dessa brunnar 3 gånger med HBSS. Kvantifiera plattor med 24 brunnar med användning av en plattläsare. Använd en hemacytometer att räkna celler från alla insamlade och tvättar.

7. Bildanalys

Obs: Fiji programvarupaket (http://fiji.sc/Fiji) rekommenderas för bildanalys. Inledningsvis var bilderna omvandlas till gråskalebild och därefter ljusstyrka / kontrast ändrades för att få ut cellerna.

  1. Ladda upp bilden och konvertera till gråskala genom att klicka på fliken bilden sedan rulla ner till "Typ" och sedan klicka på4; 8 bit ".
  2. Öka kontrasten i bilden genom att klicka på fliken bild och sedan bläddra till "Justera". Klicka på "ljusstyrka och kontrast", och sedan använda rullningslisterna för att göra cellerna sticker ut. Om du använder fluorescens bilder, vänd på bilderna för att göra cellerna mer definierade.
  3. Ladda en plugin på ImageJ kallas ITCN (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/itcn.html) för att analysera bilderna.
  4. Öppen ITCN. När en dialogruta som uppmanar användaren med flera parametrar för att uppskatta storleken på cellen, ställa in minsta bredd av cellen av intresse först. Klicka på "Identifiera mörka Peaks" om bilden är fluorescerande och cellerna mörkare.
  5. Ställ in tröskelvärdet på två initialt, och sedan trycker på "Count" -knappen. En nyligen räknade version av bilden visas med röda prickar avgränsar där celler har räknats.
  6. Justera tröskeln och bredd parameter för att få mer exakta mobildata från defining storleken på en "cell". Obs: Antalet räknade celler kommer att vara i en dialogruta till höger. Ändra parametrar kommer att ge olika antal räknade celler.
  7. Fortsätta att iterera genom tröskel och breddparametrar tills en bra uppskattning har uppnåtts för antalet celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Med hjälp av detta protokoll visar vi cell fånga (Figur 3A) och cellfrisättning (figur 3C) av MCF7GFP celler samt levande cell kontroller (Figur 4). Vi kvantifierade infångningscellen som 60% och 80% släpptes (Figur 3C). När vi utökat detta tillvägagångssätt till en blandning av RAW 264.7 makrofager och MCF7GFP celler, 50% av RAW makrofager fångas (Fig. 3D) och 80% av RAW makrofager var frisättning med 20 mM biotin (Figur 3B). Eftersom överskott av antikropp kan minska cell fånga, vi optimerat via titrering 0-10,000 nM HLA antikroppar, och observera att det ideala antikroppskoncentrationen är mellan 100-1000 mM antikropp (Fig. 1). På liknande sätt bestämmer vi att det ideala koncentrationen av celler som kan fångas är en x 10 5 och 1 x 10 6, eftersom under den som antal celler, värden är lägre än bakgrunden 17(Figur 2). Fluorescensdata från varje brunn bearbetas såsom beskrivs nedan.

ekvation 1

Här, är medelvärdet av 3 replikat tagits från ett prov med ingen antikropp (blank) och subtraheras från den fluorescens som erhölls från varje prov. Detta värde normaliseras sedan till den genomsnittliga maximal fluorescens. Denna behandling gör det möjligt för forskare att tydligt observera den låga gränsen för cell upptäckt.

Figur 1
Figur 1. Normaliserad tomt antikroppstiter. Human HLA-ABC titreras över en konstant mängd MCF7GFP celler (125.000 celler per brunn) och fluorescens infångade cellerna kvantifierades med hjälp av en plattläsare. Tidigarevid exponering för den funktionaliserade ytan ades cellerna och antikroppar centrifugeras för att avlägsna icke-specifik antikropp fastsättning. Utan denna centrifugering, kommer överskott av antikropp mätta yta och förhindra cell pulldown, såsom visas med koncentrationer av 10000 ng / ml där centrifugering inte var tillräcklig för att förhindra antikroppövermättnad av ytan, vilket resulterar i färre celler som binder till ytan. Grå linjen representerar kontroll. Felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Normaliserad blankas Cell Titrering. Använda optimerad antikroppskoncentration från antikroppstest, var MCF7GFP celler titreras för att hitta optimerad fånga koncentration medan keeping funktionaliserade ytan och antikroppskoncentrationer konstant. Detta kan användas för att kalibrera cell fånga för olika tillämpningar. Kolumner i denna siffra är replikat, medan rader ändra koncentrationen av celler för att hitta idén område för cell fånga. Grå linjen representerar kontroll, och felstaplar representerar standardfelet av medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Fånga och Release Experiment. En enda cellblandningen utsattes för den funktionaliserade ytan (A), fånga MCF7GFP celler med användning av HLA-ABC-antikropp. Efter tvättning med HBSS (B), förblev cellerna fångas, men när de utsätts för en lösning av 20 mM biotin (C), celler var released. En cellulär blandning av MCF7GFP celler och RAW 264.7 makrofager utsattes för en funktionaliserade ytan och fångades med hjälp av mCD11b antikropp (D). Icke-specifika MCF7GFP celler är märkta i grönt. Fluorescensintensiteten hos de MCF7GFP cellerna minskade när de utsätts för ett neutralt tvätt (E), vilket innebär att ytan inte rikta dem, och att de bifogade icke-specifikt. När de utsätts för en biotin tvätt (F), var de riktade RAW makrofager frigörs från ytan. Skala barer är 250 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4. Positiva och negativa cellkontroll för Dual cellisolering. Den positiva kontrollen RAW makrofager avbildas ona fluorescensmikroskop, visar ingen fluorescent aktivitet samt den relativa dimensionering av celler. Brightfield RAW makrofager visar cellstorlekssortering (A), medan enligt GFP excitation, finns det ingen fluorescens (B), som visas i den sammanslagna bilden (C). Den negativa kontrollen MCF7GFP celler avbildas på ett fluorescensmikroskop som visar stor fluorescerande aktivitet, liksom MCF7GFP cellernas relativa storlek. Celler avbildas på ljusfält (D), som visar dimensionering och stunder under GFP excitation (E) visar stor fluorescens, som kan tydligt visas i den sammanslagna bilden (F). Skala barer är 250 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figure 5. Jämförelse av centrifug-användning i standardreningstekniker. Den föranalys centrifugeringssteg är konserverad i provberedningen. Magnetisk pärla isolering samt FACS involverar flera ytterligare centrifugeringssteg, som inför stressen på celler och kan ändra expressionsnivåer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Kompletterande kodfil. Beräkningar. Klicka här för att ladda ner filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förbättringar i cellisoleringstekniker främjar vetenskapliga studier i struktur-funktionssamband i neurovetenskap 18, stamcells programmering i regenerativ biologi och angiogen signalering i vaskulär biologi 19. Faktum är primär cellkultur 20 (t.ex. HUVEC) i vaskulär biologi görs främst genom användning av cellisoleringstekniker. Cellisolering har också nyligen använts för kvantitativ flöde (qFlow) cytometry analys av plasmamembranreceptorer 3,14,15,19,21. Men befintliga cellisoleringsmetoder påverkar cellytereceptor nivåer och är dyra i både personal och reagens. Vi har avancerad en ny metod i ytan funktionalisering 17, som gör det möjligt att skapa en mild system för reproducerbar infångning av en enda celltyp från en blandning av celltyper för att möta dessa brister. Denna teknik kan integreras i en iterativ systemet, vilket gör att möjligheten till capturing olika celltyper i etapper med användning av specifika antikroppar. För att ytterligare förtydliga förfarandet, ett antal felsökning frågor och svar som erbjuds nedan:

Funktionalise Optimization: funktionaliseprocesserna har optimerats för ökad enhetlighet och dra ned MCF7gfp celler. Detta protokoll kan alternativt optimeras och anpassas för alla celltyper och konfiguration antikropp. Detta kan uppnås genom att ändra koncentrationerna av baskomponenterna i infångningsytan, eller genom att ändra typ eller koncentrationer av antikropparna. De flesta typer av antikroppar kan biotinyleras med användning av ovanstående protokoll. När biotinylerad, kan de sedan titreras (figur 1) för att hitta idealiska koncentration för att dra ner. Cellkoncentrationen kan titreras (Figur 2) för att hitta den perfekta koncentrationen av celler att fånga. Med hjälp av detta, det är möjligt att fånga en viss celltyp med locketTure yta kan fastställas. Till exempel, om en celltyp av intresse är på skalan av 100 celler per miljon celler, fånga koncentrationer av celler i det intervallet med användning av den funktionaliserade ytan skulle vara idealiskt. Om det under titreringen, kan ytan inte fånga celler av att små en koncentration, som är nödvändigt då optimering av ytan eller antikropp för att kunna filtrera ut celler inom denna koncentrationsområde.

Vilken cell typer används i detta protokoll? Hur kan någon ändra detta protokoll för att använda en annan celltyp?

För närvarande använder detta protokoll MCF7-GFP celler, och RAW 264.7 makrofager ingår ofta för att visa en förmåga att dra ut en celltyp i en dubbel-cellblandningen. Dessa celler valdes eftersom de var två av de mest relevanta celltyper till mus xenograft modell (human tumör inom murint miljö). För att kalibrera den process för en variation av andra celler, antikropps specificity är av största vikt. Det finns flera online-resurser för att välja antikroppar 22.

Vad är några fördelar med denna metod?

Gentle tillvägagångssätt: Bristen på kraft gör detta tillvägagångssätt mild. I själva verket är vår beräknade skjuvkraften maximalt, 24 x 10 -6 pN 17, som inte bör leda till betydande störningar för biomarkörer, eftersom hydrodynamiska stressiga 2,09 Pa (656 pN antar 314 pM två cellytan) inducerar nekros medan värden av stress under 0,59 Pa (185 pN antar 314 pM två cellytan) inte 23. Denna milda tillvägagångssätt är därför fördelaktigt över några kommersiellt tillgängliga alternativ såsom centrifugering baserade metoder 24, som utövar upp till 0,78 Pa 25 av toppskjuvning stress på grund av den plötsliga acceleration vid värden runt 600 G, som kan förändra proteinuttrycksmönster och morfologier 25 26 23. Sålunda skulle en process som kan minska mängden av centrifug användningsområden minska mängden spänningar att cellerna skulle uppleva genom rening och slutligen säkerställer mer fysiologiska data. Vår nuvarande protokollet använder centrifuger för att rena och rekonstruera cellkoncentrationen före fånga, dock är denna beredning process standard i många reningstekniker såsom magnetisk pärla isolering 27,28, flödescytometri 29, och FACS 30 (Figur 5). Vår strategi minskar alla nedströms centrifuge processer som de andra teknikerna använder förutom framställningssteget.

Biotin-avidin tillvägagångssätt: Tillämpningen av vanliga biomaterial (DSB-SAV och biotin-SAV) gör också denna metod fördelaktig 31,32. Avidin familj proteiner binder extremt selektivt till de biotin familjeproteinerna och används för en rad scientific och medicinska tillämpningar inklusive: antikropp-fluoroforen fäste 33, kvantitativ Qdot-polystyren pärla fäste 34, och skapandet av hydrogeler som svarar på stimuli i miljön för att frigöra inkapslade läkemedel 32. Dessutom, relativt lätt att skaffa biotinylerade antikroppar gör denna metod allmänt tillgängliga och anpassningsbara.

Destiobiotin tillvägagångssätt utan pärlor: infångningsytan kan genomföra användningen av destiobiotin utan användning av starka reagens och krafter för att frigöra cellerna. DSB har använts för reversibel cellbindning och frisättning av andra system i samband med DSB-antikroppar och magnetiska kulor 35. Men de hårda effekterna av separationsteknik samt stora cellulära förlust i samband med framställning av proverna 27,28 resultat i differential receptor och kemokin uttryck 28,36. Detta tillvägagångssätt syftar till att mildraoch övervinna dessa begränsningar genom att eliminera användningen av både magneten och pärlor för att skapa en mycket mer skonsam tvätt och frisättning metodik.

Vilka är de kritiska stegen i detta protokoll? Vad kan orsaka variationer? Hur kan det variabilitet styras?

Denna process har fyra kritiska steg som kan resultera i minskad effektivitet av infångningsytan. Den första kritiska steget är att förhindra vatten till APTES ytan under APTES funktionalise steg, vilket skulle resultera i förstörelsen av självmonterade yta. Detta avhjälps genom användning av etanol som lösningsmedel och bakning av APTES i ugnen för att minska hydrolys från senare vattenhaltiga lösningar. Den andra kritiska steget är EDC reaktionssteg där EDC katalyserar reaktionen av DSB med APTES: tillåter tvärbindning av de två skikten. Om EDC utesluts eller inte tillräckligt tillsätts, kommer DSB inte kunna fästa i golvet, whic h äventyrar utlösningsmekanismen. Det tredje kritiska steget är under SAv funktionalisering, som är kritisk upprätthålla SAv skiktet. Olikformighet av streptavidin skiktresulterar i minskning av infångningseffektiviteten. Den fjärde kritiska steget är i biotinylering av antikroppen, såsom den bindning av antikroppen till den infångande ytan underlättas via biotin-streptavidin samspel av infångningsytan och antikropp. Om antikroppen är icke-biotinylerad, då streptavidin lagret kommer att vara oförmögen att fånga den och dra den nedåt, vilket gör infångningsytan värdelös. Variabilitet och inkonsekvens i infångningsytan kan hänföras till koncentrationen icke-korrekthet samt stochasticity av skikt fastsättning. Denna variation kan styras med hjälp av exakta koncentrationer av skiktkomponenter kalibrerade till ytan och de avsedda målen för fångst. I denna konstruktion är koncentrationer kalibreras specifikt till fångst av MCF7-GFP celler.

e_content "> Vad är några nackdelar med denna metod?

För närvarande är den APTES funktionalisering görs med hjälp av en vätska nedsänkning av ytan under 55 minuter följt av en bakningssteg i upp till 2 timmar fas. Även om detta gör det möjligt för en komplett skikt av APTES silan för att binda till ytan, skulle en mer enhetlig process vara ångfasen silanisering 37. Detta minskar APTES kontakttid, vilket sparar forskaren tid, såväl som att öka likformigheten. Dessutom har förbättrat neddragnings observerats 17 då inkubation över natt av SAv används, och för närvarande kräver ytfunktionalisering två, över natten inkubationer, vilket gör den totala processen ta tre dagar. Så skulle optimera kemin erbjuda betydande tidsbesparingar för forskaren.

Vad är några varningar eller försiktighetsåtgärder som kan vara till hjälp?

När funktionalise ytor, är det imperative att tillbörlig omsorg tas till risken för skador i luftvägarna. Båda APTES och merkaptoetanol kan vara extremt farligt till lungorna och därmed förbundna organ, vilket är det nödvändigt att göra den funktionaliseprocessen i en kemisk huv för att minska interaktionen med de kemiska ångor. Merkaptoetanol är en tiol som är särskilt skarp i lukt. Vid användning av merkaptoetanol, tillåter förorenat avfall att sitta i huva för en dag eller två innan förfogande.

Vilka är de framtida mål och tillämpningar av denna yta?

Våra framtida mål innebära att anpassa denna yta att arbeta med ett antal relevanta celltyper för angiogena relaterade sjukdomar. Speciellt avser vi att fokusera på Human navelsträngsvenendotelceller för att segue till att använda blodprov och separera ut celler av intresse därifrån. Dessutom planerar vi att integrera separations modaliteter som aptamers i utformningen av den funktionaliserade surface för att ytterligare öka våra fånga och släpp procentsatser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) Acros Organics 919-30-2 Used to make 2% APTES solution
Plasma Cleaner Pico Diener Model 1 Cleans surfaces and allows for bonding of PDMS to glass
d-Desthiobiotin (DSB) Sigma D20655 Used as the releasing mechanism in the cellular capture surface. 
dimethyl sulfoxide (DMSO) British Drug Houses (BDH) BDH1115-1LP Dissolves the DSB into solution
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) Thermo-Scientific 5g: 22980
25g: 22981		 Activates carboxylic acids and allows binding of proteins to glass surface.
uncoated 8-well culture slide BD Falcon Case of 24: 354118
Case of 96: 354108		 Used in cellular experiments involving Zeiss fluorescence microscope such as initial capture and release quantification experiments
Glass bottom 24-well plates MatTek P24G-0-13-F Used in cellular experiments involving the plate reader such as antibody and cellular titration experiments
Mercaptoethanol Science Lab 60-24-2 Used to quench reaction between EDC and DSB
4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate
(MES Hydrate 99%)		 Fisher Scientific AC172590250 Used to make 0.1 M MES Buffer for use in EDC reaction
Precision Oven Thermo Scientific 11-475-153 Used in curing of PDMS and APTES layer.
Titramax 1000 Shaker Heidolph 13-889-420 Used to ensure even distribution of APTES on surfaces.
1x Streptavidin 5 mg [e7105-5mg] Proteo Chem 9013-20-1 Biotin-binding protein. May cause irritation.
5 cm Glass Dish Fisher Scientific 08748A Used in HUVEC studies as well as future profiling studies.
14 cm Petri Dish with Cover Sigma-Aldrich Z717231 Used to hold samples being functionalized and transport them.
MCF7-GFP cells Cell Biolabs AKR211 Stored in liquid nitrogen
RAW264.7 mouse macrophages ATCC TIB-71 Gifted to us from Smith lab at the University of Illinois. Stored in liquid nitrogen.
TrypLE Life Technologies 12605036 Stored in 100 ml at room temperature
Dulbecco’s modified Eagle medium Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 50003PC Supplier: Corning
Nonessential amino acids Cell Media Facility at School of Chemical Sciences at UIUC 25-025-CI Already added into DMEM by facility. Supplier: Corning.
Cell scraper Fisher Scientific 12-565-58 Small 23 cm 50 pack
Cell Dissociation Solution Corning MT-25-056CI Used to lift cells non-enzymatically for the use in cell experiments
Hemacytometer Hausser 02-671-54 Used to count cells for quantification of cell solutions and capture and release effectivity.
Biotin Amresco 58-85-5 Used to release cells from surface.
HBSS Created from Recipe N/A Used to keep cells alive in suspension as well as wash surfaces of non-specific binding. Adapted from Cold Spring Harbor Protocols: In 500 ml, use 4 g NaCl, 0.2 g KCl, 0.0402 g Na2PO4•7H2O, 0.03 g KH2PO4 and 0.5 g glucose. Add DI water to get to 500 ml, filter, and then refrigerate.
HLA-ABC Antibody BioLegend 311402 Antibody used to capture MCF7gfp cells
hIgG Antibody BioLegend HP6017 Antibody used to capture MCF7gfp cells
MCF7 GFP cells Cell Biolabs AKR-211 Luminal Breast Cancer line that has been transfected with green fluorescent protein.
Assorted Conicals Thermo-Scientific 15mL: 12-565-268 50/15 ml plastic conicals for storing solutions and aliquots.
Mini-Tube Rotators (End over End Mixer) Fisher Scientific 05-450-127 Used to incubate antibody and mix other cellular solutions in order to mix
Axiovert 200M (Fluorescence Microscope) Zeiss N/A Zeiss Axiovert 200 M inverted florescence microscope.
Zeba Desalting columns Thermo-Scientific PI-87770 Used to purify newly biotinylated antibodies after the use of the Biotinylation Kit. Instructions provided at: http://www.funakoshi.co.jp/data/datasheet/PCC/89894.pdf
EZ Link Sulfo NHS Low Weight Biotinylation Kit Thermo- Scientific Used to biotinylate antibodies to allow them to integrate with the capture surface
Plate Reader BioTek Synergy HTX Multimode Reader Used to quantitatively measure fluorescent intensity in the titration experiments.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Erdbruegger, U., Haubitz, M., Woywodt, A. Circulating endothelial cells: a novel marker of endothelial damage. Clin. Chim. Acta. 373 (1-2), 17-26 (2006).
  2. De Spiegelaere, W., Cornillie, P., Van Poucke, M., Peelman, L., Burvenich, C., Van den Broeck, W. Quantitative mRNA expression analysis in kidney glomeruli using microdissection techniques. Histol. Histopathol. 26 (2), 267-275 (2011).
  3. Chen, S., Guo, X., Imarenezor, O., Imoukhuede, P. I. Quantification of VEGFRs, NRP1, and PDGFRs on Endothelial Cells and Fibroblasts Reveals Serum, Intra-Family Ligand, and Cross-Family Ligand Regulation. Cell. Mol. Bioeng. 8 (3), 383-403 (2015).
  4. Cheung, L. S. L., et al. Detachment of captured cancer cells under flow acceleration in a bio-functionalized microchannel. Lab Chip. 9 (12), 1721-1731 (2009).
  5. Privorotskaya, N., et al. Rapid thermal lysis of cells using silicon-diamond microcantilever heaters. Lab Chip. 10 (9), 1135-1141 (2010).
  6. Park, K., Akin, D., Bashir, R. Electrical capture and lysis of vaccinia virus particles using silicon nano-scale probe array. Biomed. Microdevices. 9 (6), 877-883 (2007).
  7. Galletti, G., Sung, M., Vahdat, L. Isolation of breast cancer and gastric cancer circulating tumor cells by use of an anti HER2-based microfluidic device. Lab Chip. 14 (1), 147-156 (2014).
  8. Schudel, B. R., Choi, C. J., Cunningham, B. T., Kenis, P. J. A. Microfluidic chip for combinatorial mixing and screening of assays. Lab Chip. 9 (12), 1676-1680 (2009).
  9. Lien, K. Y., Chuang, Y. H., et al. Rapid isolation and detection of cancer cells by utilizing integrated microfluidic systems. Lab Chip. 10 (21), 2875-2886 (2010).
  10. Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a. PNAS. 107 (35), 18392-18397 (2010).
  11. Yu, M., Ting, D., Stott, S., Wittner, B., Ozsolak, F. RNA sequencing of pancreatic circulating tumour cells implicates WNT signalling in metastasis. Nature. 487 (7408), 510-513 (2012).
  12. Sheng, W., Ogunwobi, O., Chen, T., Zhang, J. >Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip. Lab Chip. 14 (1), 89-98 (2014).
  13. Zheng, X., Cheung, L. S. L., Schroeder, J. A., Jiang, L., Zohar, Y. A high-performance microsystem for isolating circulating tumor cells. Lab Chip. 11 (19), 3269-3276 (2011).
  14. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantification and cell-to-cell variation of vascular endothelial growth factor receptors. Exp. Cell Res. 317 (7), 955-965 (2011).
  15. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Expression of VEGF receptors on endothelial cells in mouse skeletal muscle. PLoS One. 7 (9), e44791 (2012).
  16. Ludwig, A., Kretzmer, G., Schügerl, K. Determination of a "critical shear stress level" applied to adherent mammalian cells. Enzyme Microb. Technol. 14 (3), 209-213 (1992).
  17. Ansari, A., Lee-Montiel, F. T., Amos, J., Imoukhuede, P. I. Secondary anchor targeted cell release. Biotechnol. Bioeng. 112 (11), 2214-2227 (2015).
  18. Drenan, R. M., Nashmi, R., Imoukhuede, P., Just, H., McKinney, S., Lester, H. A. Subcellular trafficking, pentameric assembly, and subunit stoichiometry of neuronal nicotinic acetylcholine receptors containing fluorescently labeled alpha6 and beta3 subunits. Mol. Pharmacol. 73 (1), 27-41 (2008).
  19. Imoukhuede, P. I., Dokun, A. O., Annex, B. H., Popel, A. S. Endothelial cell-by-cell profiling reveals temporal dynamics of VEGFR1 and VEGFR2 membrane-localization following murine hindlimb ischemia. Am J Physiol Hear. Circ Physiol. 4 (8), H1085-H1093 (2013).
  20. van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., van der Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nat. Protoc. 3 (6), 1085-1091 (2008).
  21. Imoukhuede, P. I., Popel, A. S. Quantitative fluorescent profiling of VEGFRs reveals tumor cell and endothelial cell heterogeneity in breast cancer xenografts. Cancer Med. 3 (2), 225-244 (2014).
  22. BD Biosciences. CD Marker Handbook: Human and Mouse. , at: https://www.bdbiosciences.com/documents/cd_marker_handbook.pdf (2010).
  23. Tanzeglock, T., Soos, M., Stephanopoulos, G., Morbidelli, M. Induction of mammalian cell death by simple shear and extensional flows. Biotechnol. Bioeng. 104 (2), 360-370 (2009).
  24. Processing Blood. Perritt, D., Wong, P., Macpherson, J. L., Henrichsen, K., Symonds, G., Pond, S. , at: https://www.google.com/patents/US20140030238 (2014).
  25. Fukuda, S., Schmid-Schönbein, G. W. Centrifugation attenuates the fluid shear response of circulating leukocytes. J. Leukoc. Biol. 72 (July), 133-139 (2002).
  26. dela Paz, N. G., Walshe, T. E., Leach, L. L., Saint-Geniez, M., D'Amore, P. A. Role of shear-stress-induced VEGF expression in endothelial cell survival. J. Cell Sci. 125 (Pt 4), 831-843 (2012).
  27. Allard, W. J., et al. Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant Diseases Tumor Cells Circulate in the Peripheral Blood of All Major Carcinomas but not in Healthy Subjects or Patients With Nonmalignant diseases.". Clinical Cancer Research. 10, 6897-6904 (2005).
  28. Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
  29. Chen, S., Weddel, J., Gupta, P., Conard, G., Parkin, J., Imoukhuede, P. I. QFlow Cytometer-Based Receptoromic Screening: A High-throughput Quantification Approach Informing Biomarker Selection and Nanosensor. Submiss. , (2016).
  30. Vasa, M., et al. Number and migratory activity of circulating endothelial progenitor cells inversely correlate with risk factors for coronary artery disease. Circ. Res. 89 (1), E1-E7 (2001).
  31. Hirsch, J. D., Eslamizar, L., et al. Easily reversible desthiobiotin binding to streptavidin, avidin, and other biotin-binding proteins: uses for protein labeling, detection, and isolation. Anal. Biochem. 308 (2), 343-357 (2002).
  32. Wilchek, M., Bayer, E. A. Applications of Avidin-Biotin Technology: Literature Survey. Methods Enzymol. 152 (1), 183-189 (1987).
  33. Wu, X., et al. Immunofluorescent labeling of cancer marker Her2 and other cellular targets with semiconductor quantum dots. Nat. Biotechnol. 21 (1), 41-46 (2002).
  34. Lee-Montiel, F. T., Imoukhuede, P. I. Engineering quantum dot calibration standards for quantitative fluorescent profiling. J. Mater. Chem. B. 1, 6434 (2013).
  35. Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof. Hornes, E., Korsnes, L. , Available from: http://www.google.com/patents/US5512439 (1996).
  36. Naranbhai, V., et al. Impact of blood processing variations on natural killer cell frequency, activation, chemokine receptor expression and function. J. Immunol. Methods. 366 (1-2), 28-35 (2011).
  37. Yadav, A. R., Sriram, R., Carter, J. A., Miller, B. L. Comparative study of solution-phase and vapor-phase deposition of aminosilanes on silicon dioxide surfaces. Mater. Sci. Eng. C. 35 (1), 283-290 (2014).

Tags

Cancer Research bioteknik cellisolering personlig medicin destiobiotin SAV biotin glas funktionalisering APTES MCF7-GFP RAW 264,7
En metod av riktad cellisolering via Glas ytfunktionalisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ansari, A., Patel, R., Schultheis,… More

Ansari, A., Patel, R., Schultheis, K., Naumovski, V., Imoukhuede, P. I. A Method of Targeted Cell Isolation via Glass Surface Functionalization. J. Vis. Exp. (115), e54315, doi:10.3791/54315 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter