Abstract
Pattedyrcellekultur i monolag er mye brukt til å studere forskjellige fysiologiske og molekylære prosesser. Men denne tilnærmingen til å studere voksende celler genererer ofte uønskede gjenstander. Derfor cellekultur i et tre-dimensjonalt (3D) miljø, ofte ved hjelp av ekstracellulære matriks-komponenter, dukket opp som et interessant alternativ på grunn av sin nære likhet med det native in vivo vev eller organ. Vi har utviklet en 3D-cellekultursystem med to avdelinger, nemlig (i) en sentral del som inneholder kreftceller innleiret i en kollagen-gel som virker som et pseudo-primær macrospherical tumor og (ii) en perifer cellefri kammer laget av et fibrin gel, det vil si et ekstracellulært matrisekomponent forskjellig fra den som anvendes i midten, hvor kreftceller kan migrere (invasjon foran) og / eller dannelse av mikrosfærisk tumorer som representerer sekundære eller satellitt tumorer. Dannelsen av satellitt tumorer i det perifere kammer erbemerkelsesverdig korrelert til den kjente aggressivitet eller metastatisk opprinnelse av de innfødte kreftceller, noe som gjør denne 3D kultur systemet unikt. Denne cellekultur tilnærming kan anses for å vurdere kreftcelle invasivitet og motilitet, celle-ekstracellulær matriks interaksjoner, og som en metode for å evaluere anti-kreft legemidler egenskaper.
Introduction
Gransker de grunnleggende og biomedisinske egenskaper ved kreftcelle invasjon / migrasjon og påfølgende metastase etablering er gjenstand for en intens forskning 1,2. Metastase er den ultimate stadium av kreft og dens kliniske behandlingen fortsatt ukjent. En bedre forståelse av metastaser på cellulære og molekylære nivåer vil muliggjøre utvikling av mer effektive behandlingsformer 3.
Flere egenskaper av metastatiske celler kan utforskes in vitro 4 inkludert deres stemness og potensial til å skaffe seg en overgang tilstand (f.eks epithelioid-mesenchymale overgang) for å migrere og invadere i og fra den primære svulsten 5. Imidlertid har den in vitro vurderingen av invasjons / metastaseprosesser vært en utfordring, siden det praktisk talt utelukker bidraget av blod / lymfatiske sirkulasjon. Organotypiske kulturer som embed tumorfragmenter i kollagen gels har previouslu blitt brukt til å overvåke kreft aggressivitet. Selv om kompleksiteten av tumorer er bevart (f.eks tilstedeværelsen av ikke-kreftceller), tumorfragmenter blir utsatt for begrenset diffusjon medium, for prøvetaking variasjon, og til en overvekst av stromale celler 6. En alternativ metode består i voksende kreftceller innenfor komponenter i den ekstracellulære matriks (ECM), som etterligner den tredimensjonale (3D) cellemiljøet. Spredning av brystkreftcellelinjer i en kollagen-gel og / eller en basalmembran-avledet matriks er blant de best karakteriserte eksempler på 3D-cellekultur. Ved å bruke spesielle 3D cellekultur miljøer, kan uorganisert montering observert for brystkreft celler dyrket under standardbetingelser reverseres i den spontane dannelsen av melke acini og rørformede strukturer 7-10. Videre er dannelsen av flercellede tumor sfæroider avledet fra adenokarsinom-cancerceller deltar ved hjelp av ulike teknikker (f.eks hengende dråper, flytende sfæroider, agar embedment) nå utgjør den mest brukte 3D-cellekultur-analyse 11-13. Imidlertid er denne analysen begrenset av den begrensede sett av kreftcellelinjer som kan danne sfæroider og ved den korte perioden tilgjengelig for å studere celler i disse tilstandene.
I denne visualisert teknikken, vi heri innføre en sofistikert 3D-cellekultur-analyse hvor kreftcellene av interesse er innleiret i en kollagen-gel for å tillate in vitro dannelse av en pseudo-primærtumor som kan alternativt belegges med en basalmembran-avledet matrise. En gang er dannet, blir den pseudo-primær tumor deretter klemt i en acellulær matrise (fibringel i det foreliggende tilfelle), noe som gjør at kreftceller til å krysse grenseflaten mellom de to kamrene matriks (se figur 1). Interessant, sekundær tumor-lignende strukturer som stammer fra den pseudo-primærtumor sammen med aggressive kreftceller vises ifibringel. Et slikt 3D kultursystem gir den fleksibilitet som kreves for å undersøke, for eksempel anticancer legemidler, genekspresjon og celle-celle og / eller celle-interaksjoner ECM 14-16.
Figur 1:.. Oversikt over Method Skjematisk oppsummering av metode for å generere 3D cellekultur system som modell for kreftstudier Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Ingen etikk vurdering siden animalske og menneskelige kreftceller ble kjøpt eller ber gitt til oss.
1. Making Kollagen Plugger (Pseudo-primær tumor)
- Forbered en kollagen spredning. Type I kollagen fra rottehale sener (RGT) kan enten trekkes ut og sterilisert som tidligere rapportert 17, eller kjøpes. Spre frysetørret RTT kollagen (3,25-3,50 mg / ml i 0,02 N eddiksyre) ved hjelp av en blender (high-speed setting; fem 2 min løper) for en jevn blanding.
- Harvests (trypsin-EDTA, vanligvis) og bruke trypan blå utelukkelse for telling levedyktige celler ved hjelp av en hemocytometer. Juster til ønsket celletetthet (5 x 10 4 celler per plugg).
- Fremstille alle løsninger (NaOH, føtalt bovint serum, DMEM 5x, NaHCO3) hver for seg (tabell 1) under sterile betingelser og holde avkjølt på is. Merk: Rekkefølgen for tilsetning av de forskjellige oppløsninger er viktig for å forhindre osmotisk sjokk eller sure i celler.
- Utfør celle dispersjon (1,25 x 10 6 celler) i den endelige kollagenoppløsning (5 ml) så raskt som mulig. Bland godt (ved å pipettere opp og ned) og samtidig unngå luftbobler, og deretter raskt å fordele 200 ul av klar-til-bruk løsning i hver brønn av en 96-brønns plate. Forsiktig treffer multi-brønn plate på arbeidsområdet overflaten av cellekultur hetten for å fjerne luftbobler og for å fordele oppløsningen jevnt i brønnene.
- Etter å ha fylt opp alle brønnene (dette trinnet tar ca 15-20 min per 96-brønns plate), lagre den i kuvøse.
- Inkuber platen ved 37 ° C fra 2 timer til over natten. Kollagen gelering (dvs. fibrillogenese) skjer innen 30 min. Legg kulturmedium (100 ul / brønn) til kulturen for å utføre en inkubasjon over natten.
2. første laget av fibrin Gel
- Fibrinogen Solution forberedelse.
MERK: Den samme batch av fibrin gel bør ideelt sett brukes til mer reproduserbare results, kan som fibringel dannelse variere mellom ulike satser av kommersielt frysetørket fibrinogen.- Bruk alltid en nylaget fibrinogen løsning. Bringe den frysetørkede fibrinogen til romtemperatur før åpning av ampullen for å unngå hydrat krystalldannelse.
- Progressivt oppløse fibrinogen i forvarmet (37 ° C) Hanks balanserte saltløsning (HBSS) med Ca2 + / Mg2 + ved en arbeidskonsentrasjon på 3 mg / ml (vurdere å fremstille et 15% overskudd av den minste sluttvolum kreves : f.eks 17.25 mg i 5,75 ml for en 5 ml oppløsning).
- Legg forvarmet HBSS dråpevis ved først å oppløse fibrinogen fragmenter. Bryt ned større fragmenter med en slikkepott i begeret. Omrør begeret fra tid til annen for å lette blandingen. Ikke bruk et røre plate under prosedyren. Oppløs det gjenværende pulver ved å pipettere suspensjonen opp og ned.
- Hold fibrinogen løsning lunken mens klorlizing oppløsningen ved å føre den gjennom et 0,22 um filter. Merk: Hvis HBSS er ikke varm nok eller fibrinogen ikke fullt oppløst, kan løsningen tette filteret. Hvis det er aktuelt, skifte filter en eller to ganger, noe som kan redusere fibrinogen konsentrasjon, og dermed fibrinaggregat stivhet.
- Suspendere cellene av interesse (for eksempel endotelceller) til klar-til-bruk løsning fibrinogen samtidig å justere sluttvolumet, som et alternativ prosedyre.
- Forbereder trombinoppløsninger.
- Forbered en stamløsning i DDH 2 O (50 NIH enheter / ml), deretter sterilisere den ved hjelp av en 0,22 mikrometer filter.
- Bruk en fibrinogen / trombin-forhold ≥1: 0,0075 (v / v) for å generere de fibrin-gelen.
- Generering fibrin Gel.
- Hold sterile fibrinogen og trombin lager løsninger på is i løpet av alle de neste trinnene. Den fibrin-geler er tillatt å danne i 24-brønners plater.
- Straks overlegg the overflate av hver brønn med en fibrinogen-oppløsning (200 ul / brønn) og samtidig unngå luftbobledannelse. Prosess 6 brønner på en gang.
- Når fibrinogen-oppløsningen fullstendig dekker overflaten av brønnene, vippe platen ved en 45 ° vinkel og tilsett 1,5 mL av trombin-løsning til den første brønnen ved å slippe den trombin inn i sentrum av brønnen, og deretter forsiktig virvle platen horisontalt 1-2 sek.
- La platen i en stabil posisjon under laminær hette (5-10 minutter) inntil gelering / koagulasjonsprosessen er fullført (NB: polymerisasjonsprosessen skal ikke bli forstyrret, for eksempel, ved å transportere platen til inkubatoren).
- Når de første seks brønnene har polymerisert, gjenta den samme sekvens (dvs. de 3 foregående trinn) for de neste seks brønnene før alle brønnene har blitt behandlet.
3. andre lag av fibrin Gel og klemt Kollagen Plug
- AlternativA: (Bruke Collagen Plug Umiddelbart).
- Sørg for at det første laget av fibrin gel har polymerisert i alle brønner med delikat vippe platen. Plasser 96-brønners plate inneholdende kollagen-gel pluggene side om side med den 24-brønns plate (som inneholder fibrin-geler) for å lette overføring av kollagen pluggene.
- Tilsett en dråpe av HBSS i hver brønn i platen inneholdende kollagen plugger.
- Fjern hver kollagen plugg fra brønnen med en tynn nål som er montert på en sprøyte (brukt som et håndtak), eller ved hjelp av en mikro skje (se video). Overfør hver kollagen pluggen på første fibrin gel laget ved hjelp av en eller to mikro-skjeer, samtidig sørge for at kollagen pluggen er godt sentrert i brønnen og at sterilitet er godt vedlikeholdt.
- Overlappe den tidligere dannede fibrin-gel med det andre laget av fibrinogen-oppløsning (300 ul / brønn) og innføre den trombin som beskrevet i 2.3, holde en minimal. 1: 0,0075 forhold og en sekvens av seks brønner av gangen </ Li>
- Alternativ B (Coating Collagen Plug med et tynt lag av Growth Factor-redusert basalmembran (GFRBM)).
- Cool alle oppkjørte løsninger og virkemidler på forhånd og holde dem ved 4 ° C eller på is (f.eks pipetter, tips, reagensglass) under håndtering siden frosne prøver av GFRBM er svært følsomme for overoppheting hastighet under tining (følg produsentens anvisninger) .
- Etter fjerning fra platebrønner, suge hver kollagen plugg i 2 minutter i et 1,5-ml sentrifugerør på is inneholdende 100 ul av en ren GRFBM løsning.
- Overfør hver belagt plugg på den første fibrin lag og samtidig sikre den er godt sentrert, slik det er beskrevet tidligere. Inkuber plug-inneholdende plater ved 37 ° C i 5 min for å tillate GRFBM for å danne en gel. Legge til den andre fibrin lag som i trinn 3.1.4.
4. cellekulturmedium betingelser
- Fyll hver brønn med kulturmedium (400 mL). De kulturmedier og kosttilskudd vil bli valgt på grunnlag av cellelinjen og forsøksbetingelser.
- Legg aprotinin, en antifibrinolytisk middel, til dyrkingsmediet ved en endelig konsentrasjon på 100 kallikrein-inhibitor-enheter (KIU) / ml.
MERK: Oppbevar platene i en cellekulturinkubator under de betingelser som anvendes for cellelinje testes. - Etterfyll kulturer med friskt medium annenhver dag eller i henhold til den eksperimentelle tidsplan, og legge aprotinin. Før tilsetning av friskt medium, lett vippe platen (ved en 30-35 ° vinkel), og helle-pipette mot siden av brønnen mens forsiktig utsuging det kondisjonerte medium under konstant observasjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som tidligere nevnt, en interessant trekk ved denne 3D-cellekultur-analyse er at kreftceller ikke bare kan migrere fra kollagen pluggen til den tilstøtende fibrin-gelen, men også etablere sekundære tumorer (for eksempel satellitt-tumor-lignende strukturer). Dette kan observeres direkte med et invertert fasekontrastmikroskop ved lave og høye forstørrelser gjennom gelen tykkelse, spesielt med en lang arbeidsavstand kondensator (figur 2). Ved hjelp av denne 3D-cellekultur-metoden, kan oppførselen til kjente metastatiske celler lett sammenlignet med det som ble funnet i ikke-metastatiske celler, som demonstrert gjentatte ganger med forskjellige forsøksoppsett 15. For eksempel er tallrike satellitt tumorer funnet tilfeldig dispergert i fibringelen med metastatisk cellelinjen B16F10 mens kun meget få små satellitt tumorer kan så påvises med sin ikke-metastaserende motstykke, B16F0 cellelinje (figur 2).
Figur 2:. Behavior of Mouse Melanoma B16F10 (A) og (B) B16F0 celler i 3D-cellekultursystem B16F10 og B16F0 cellelinjer er kjent for å være metastatisk og svakt metastatisk, henholdsvis. En øvre riss av kompositt gelen er vist etter 15 dager i kultur i 24-brønns plate. Kollagen plugg (*) er tilstøtende til en fibringel lag i hvilke celler har migrert (piler) og utformet satellitt tumorer som sett ved høyere forstørrelse. Ganske enkelt, disse cellelinjene uttrykker et høyt nivå av melanin som gir mulighet for direkte visualisering (dvs. uten flekker). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Formen på de fremre og satellitt svulster migrasjon kan variere som en funcsjon av cellelinjeegenskaper. For eksempel, de murine mammary gland carcinoma 4T07 celler, som er dårlig metastatisk, men er meget invasiv lokalt, danner en migrering front som strekker seg radialt inn i den fibrin-gel (figur 3A). Etter 14 dager med kultur, har disse cellene trukket bort fra den vandrende foran for å danne stellar-form strukturer tett ligner brystkjerteltumorer strukturer (figur 3B-D).
Figur 3: Mus brystkjertelen carcinoma 4T07 Cells. Disse cellene viser en sterk evne til å migrere i den fibrin gel (A). Den stiplede linjen markerer kollagen pluggen og pilene viser retningen av migrasjon foran. Cellene jevnt invadere fibrin matrisen (A), og godt organisert, stellar-form rørformede strukturer kan observeres i 3D (B end C). Visninger henhold fasekontrastmikroskop. (A - C) og histologiske snitt farget av hematoxylin og eosin (D) vises Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
De cellestrukturer som observeres med denne 3D kultursystem, spesielt satellitt tumorer, kan kvantifiseres ved plane projeksjon etter farging av gelene med en metylenblått-løsning som vist tidligere 16. Beising gelprøver med Hoechst 33258 ved ulike stadier av cellekulturen gjør det mulig å visualisere cellekjernene i henhold epifluorescens invertert mikroskop (figur 4).
Figur 4: Hormon Responsive brystkreft celler. menneskelig BreastKreft MCF-7 celler ble eksponert for ulike konsentrasjoner av Tamoxifen. Satellite svulster i fibrin gels (øvre rad) ble observert av fasekontrastmikroskop. DNA fra kollagen-geler (som indikerer tilstedeværelsen av celler i pseudo-primærsvulster) (nederste rad), ble farget med Hoechst 33258 og visualisert ved hjelp av epifluorescens mikroskopi. Som forventet, tamoxifen indusert DNA fragmentering som et resultat av apoptose. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| reagenser | Volum |
| DMEM 5x (ingen bikarbonat) Forbered fra pulver | 1 ml |
| FBS | 0,5 ml |
| 0,26 M NaHCO3 | 0,5 ml |
| 1 N NaOH | 20 mL |
| ddH2O | 100 pl |
| Hold denne løsningen på is | |
| cellesuspensjon | 880 mikroliter |
| Vel blande på is og til sist raskt legge til: | |
| RTT kollagen (3,5 mg / ml) | 2 ml |
| totalt volum | 5 ml |
Tabell 1:. Collagen plugger reagenser som kreves, og fremstilling av en kollagenløsning til 18-19 plugger. Bland godt umiddelbart etter tilsetning av kollagen (ved å snu beholderen opp og ned), samtidig unngå luftbobler, og deretter straks fordele 200 ul til hver brønn.
| Steps | | mulige årsaker | Solutions | |
| Trinn 1. kollagen plugg | luft~~POS=TRUNC bobler~~POS=HEADCOMP | Upassende pipettering * | Bland godt og samtidig unngå overdreven bobler. |
| Tegn hver 200 ml med pipette stempelet hele veien ned og slipper bare 200 mL (omvendt pipettering). * | |||
| Kollagen plug sammentrekning | Kollagen plugg krymper med visse cellelinjer, spesielt når inkubert over natten. | Sjekk om celler indusere kollagen sammentrekning før du starter eksperimentet. Det anbefales å overvåke sammentrekning over et par dager. Ellers kan plugger kontrakt i klemt gel. | |
| Gelering ikke forekommer | Sjekk reagenser for friskhet, molaritet, pH, etc.); sørge for at ingen reagens er utelatt. | Begynn på nytt fra beginning. | |
| Trinn 2. Første laget av fibrin gel | luft~~POS=TRUNC bobler~~POS=HEADCOMP | Samme kommentar *; trenger praksis. | Samme oppløsning. * Luftbobler kan forbli i den fibrin-gelen, men de forsvinner vanligvis over tid ved 37 ° C. |
| Gelering ikke forekommer | Feil mengde fibrinogen brukes; sjekk trombin konsentrasjon eller degradering. | Begynn på nytt fra begynnelsen. | |
| Anta trombin-oppløsningen er utilstrekkelig; lett øke konsentrasjonen og / eller volum av trombin (for eksempel to ganger). | |||
| Restvæskefase Etter gele | Fibrinogen løsning og trombin ikke godt blandet. | Begynn på nytt fra begynnelsen. | |
| Fibrin er ikke homogen (dvs. fibrillar strukturer, agglomerater) | Trombin har tilsidesatt diffust i gel; exspring eller utilstrekkelig agitasjon | Trenger praksis; starte på nytt fra begynnelsen. | |
| Trinn 3. Sandwich / 2 nd fibrinlaget | Samme kommentarer som i trinn 2. | ||
| Kollagen pluggen er raskt (noen timer) omgitt av tomme områder i fibrin | Fibrin har ikke tilstrekkelig polymerisert i kontakt med kollagen gel | Begynn på nytt fra begynnelsen | |
| Kollagen plugger kan være progressivt (dager-uker) omgitt av tomme områder i fibrin | Lokal lyse; | Hvis det er begrenset til noen få steder rundt pluggen, kan forsøket gå på. Ellers vurdere å starte fra begynnelsen. Kan være på grunn av cellene som utskiller overdreven bruk av plasminogen aktivator. | |
| Ikke glem antifibrinolytisk agent! | |||
| Trinn 4 og 5. Cell kultur og oppfølging | fibrinolyse | Problem med antifibrinolytisk middel (nedbrytning, suboptimal dose, osv.). | Hvis omfattende satellitt svulster eller invasjon, øke dosen av antifibrinolytisk agent. |
| forsuring | Overdreven cellevekst. | Endre celledyrkingsmedium oftere. | |
Tabell 2: Feilsøking Mulige problemer og forslag til løsninger..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Som et viktig teknisk fotnote, er det avgjørende at ikke i noe gap er til stede på grenseflaten mellom det sentrale og det perifere geler. Ellers kan det redusere kapasiteten av cellene for å migrere / invaderer fibringel. Et mellomrom mellom kollagen og fibrin-geler kan dannes i løpet av den første 24-timers kultur hvis trombin ikke er passende fortynnet. Det er også mulig at cellelinjen testet kunne føre kollagen gelen for å trekke seg sammen i løpet av kulturen, for derved å forårsake en forholdsvis stor plass til å danne mellom begge geler. Dette er spesielt forventet når stromale celler blandes i kollagen-gel sammen med kreftceller på grunn av myofibroblastic-lignende aktivitet 18. For å unngå denne gjenstand, bør den kollagen pluggen inkuberes ved 37 ° C i en lengre periode (≥48 hr ) for å indusere kontraksjon gel før montering av fibrin-sandwich.
Et problem også oppstått med analysen er tilstedeværelseav merkbar fibrin fibriller eller agglomerater. Denne ensidige skyet i stedet for gjennomsiktig aspekt til fibrin gel, noe som kompliserer tolking grunn forstyrrelse av kreftcellen trekkveier. Slike problemer kan oppstå som følge av utilstrekkelig eller overdreven risting av fibrinogen-oppløsningen under polymerisasjonsprosessen i kulturplater. Det kan også være på grunn av feil tilsetning av trombin til fibrinogen-oppløsningen (trinn 2.3). En feil format eller klart fibrin gel kan ikke fastsettes en gang størknet. Kollagen eller fibrin gels kan inneholde luftbobler som i de fleste tilfeller vil bli spontant frigjort ut etter et par dager i kuvøse; likevel, minimerer riktig pipettering deres forekomst. Det anbefales å innføre et anti-fibrinolytisk middel ved begynnelsen av celledyrkningsperioden. Fibrinolyse kan forekomme etter en lang periode med cellekultur på grunn av cellulær aktivitet og aktivering av proteolytiske enzymer (dvs. plasminogen aktivator) innen collagen plugg og satellitt tumorer, avhengig av kreftcelletyper og deres aggressivitet 19 sikret frigjøring av kollagen pluggen fra degradert fibringel og cellebinding til bunnen av platene er to konsekvenser av overdreven fibrinolyse (se avsnitt feilsøking i tabell 2). En begrensning av den foreliggende teknikk er tykkelsen av fibrin gel, noe som kan gjøre det vanskelig å observere cellene gjennom hele gelen. Men bruk av et mikroskop med en lang arbeidsavstand kondensator er med på å omgå denne begrensningen, og for å overvåke celler langs hele Z-aksen. Confocal eller intramikroskopi kan også gi et alternativ til å visualisere cellene i fibrin gel.
En av de viktigste mål for å utvikle denne 3D-cellekulturmodell var å tilveiebringe en ekstracellulær matriks kammer gjennom hvilket kreftceller er i stand til å fritt migrere og utvikle seg. Fibrin ble valgt på grunn av dens tilstedeværelse i tumorersom skylder for å øke vaskulær permeabilitet forårsaket av inflammasjon, nekrose og forandret angiogenese, og siden fibrin er også kjent å legge til rette for tumorcelle-invasjon 20,21. Grensesnittet mellom de to kamrene presenterer mye interesse som det etterligner fremstilling av nye støttende matriks, slik som fibrin, i tumorer. Dessuten, oksygen og næringsstoffer diffusjon, og i det lange løp, pH-stabilitet, er muligens dysregulerte i kollagen rommet i forhold til den perifere fibrin rommet i hvilket diffusjon lettes. På grunn av det store antall kreftceller opprinnelig er samlet i en sentral plugg kollagen, er tegn på nekrose / apoptose observeres i løpet av den primære svulsten under kultur, simulere fenomenet observert under utvidelse av primære tumorer hos pasienter 22. Videre er dannelsen av satellitt svulster bemerkelsesverdig knyttet til aggressivitet av kreftceller samt deres metastatisk atferd. Avhengig av cellelinjen og typen of eksperiment, inkubasjonstiden er nødvendig for å observere relevante metastatiske prosesser kan være så lenge som 30 dager. Dette er vanligvis lenger enn for andre 3D-analyser, men den ekstra forsinkelse bringer fordelen av å studere en modell mer representativ for in situ-tumorer.
Det er vel anerkjent at celler dyrket i 3D kultur modeller viser forskjeller i cellesignalisering og genekspresjon i forhold til monolaget cellekulturer 5,23. Økende kreftceller i 3D også påvirker deres følsomhet for cytostatika 24-26. Et viktig og attraktivt trekk ved denne 3D cellekulturmodell ligger i muligheten for å modifisere den ECM-konsentrasjonen, og således stivheten av gelen, noe som kan være av interesse for dem som arbeider med de biomekaniske egenskapene til den celle-celle og celle-ECM vekselvirkninger, så vel som effekten av matrisens egenskaper på celle invasjon / migreringsprosesser 27. 3D-cellekultur-analyse er presentert her kan tilpasseed å dekke ulike innstillinger og / eller eksperimentelle forhold. For eksempel kan analysen bli skalert opp for å imøtekomme studier som krever et stort antall celler; ved å doble mengden av materiale og antall celler, kan kollagen plugger fremstilles i en 48-brønns plate og lagvis på en fibringel i en 6-brønns plate. På den annen side kan det være vanskelig å miniatyrdyrkningssystem for high-throughput undersøkelser og målinger på grunn av inkonsekvent homogenitet av fibringel.
Innføringen av ikke-kreftceller i en av de to gel Kamrene kan endre virkemåten av kreftcellene. For eksempel er dannelsen av satellitt tumorer forverret når prostatacancer-cellelinjen PC3 blandes med fibroblaster og endotelceller 14. Alternativt kan fluorescensmerket-merkede cellelinjer bli innført i gelen kamrene for å undersøke celle-celle interaksjoner og / eller til å holde cellene i løpet av dyrkningsperioden. Videre histological seksjoner kan tilberedes etter gel fiksering; imidlertid, kan kvaliteten på immunhistokjemi resultatene varierer mellom antistoffer ettersom kryssreaksjoner med fibrin kan forekomme. Rutine farging av histologiske snitt som med hematoksylin og eosin (H & E), kan avsløre celle organisasjon inne i gel-matriser (figur 3D).
Det er relativt enkelt å fjerne kollagen pluggen fra fibrin gel (for eksempel ved å trekke ut støpselet med et glass pipette). Således kan celler og satellitt tumorer som er tilstede i fibringelen dyrkes separat fra de som finnes i kollagen pluggen. Celler fra satellitt kolonier kan høstes ved å ekstrahere koloniene med kirurgiske sakser eller en skalpell og dyrke dem i kulturmedium uten aprotinin for å frigjøre cellene fra den fibringel. Oppsamlings celler fra de forskjellige avdelinger av den sammensatte gelen kan tillate ulike videre studier, inkludert gen og protein ekspresjon analyse. Det kanogså anvendes for å isolere cellepopulasjoner med aggressive fenotyper for videre in vitro eller in vivo studier. For eksempel ble denne 3D kulturmodell som brukes for å identifisere gener som er involvert i melanoma metastasis 16. Alle disse representative anvendelser viser klart den fleksibilitet som tillates av en bi-kompartment 3D cellekultursystem hvor celle ko-kultur kan bli utført.
I konklusjonen, er utformingen av vår 3D kultur systemet fleksibelt og kan tilby nye veier for å undersøke biologiske og molekylære hendelser under kreftcelle apoptose, migrasjon og metastasering så vel som for kreft narkotika evaluering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Freeze-dried collagen | Sigma-Aldrich | C7661 | from rat tail tendon (soluble dispersion) or home-made (see Rajan et al., ref.#14) |
| Fibrinogen (freeze-dried) | Sigma-Aldrich | F8630 | Type I-S, 65 - 85% protein with ≥ 75% of protein is clottable |
| Thrombin | EMD Chemicals Inc. | 605157 | Gibbstown, NJ; NIH units/mg dry weight |
| Growth factor-reduced Matrigel | Corning | 356234 | Previously from BD Biosciences |
| Aprotinin | Sigma-Aldrich | A6279 | solution at 5 - 10T IU/ml (Trypsin Inhibitor Unit) |
| Micro-spoons | Fisher Scientific | 2140115 | Fisherbrand Handi-Hold Microspatula |
| 96 well plate, round base | Sarstedt | 3925500 | |
| 24 well plate | Sarstedt | 3922 | |
| Dulbecco's modified Eagle's Medium | Sigma Chemical, Co. | D5546 | DMEM |
| Fetal Bovine Serum | VWR | CAA15-701 | FBS, Canadian origin. |
| Trypsin-EDTA | Sigma Chemical, Co. | T4049 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Chemical, Co. | H8264 | HBSS |
References
- Alizadeh, A. M., Shiri, S., Farsinejad, S. Metastasis review: from bench to bedside. Tumour Biol. 35 (9), 8483-8523 (2014).
- Roudsari, L. C., West, J. L. Studying the influence of angiogenesis in in vitro cancer model systems. Adv Drug Deliv Rev. , (2016).
- Bill, R., Christofori, G. The relevance of EMT in breast cancer metastasis: Correlation or causality. FEBS Lett. 589 (14), 1577-1587 (2015).
- Kimlin, L. C., Casagrande, G., Virador, V. M. In Vitro Three-Dimensional (3D) Models in Cancer Research: an Update. Mol Carcinog. 52 (3), 167-182 (2013).
- Obenauf, A. C., Massagué, J. Surviving at a Distance Organ-Specific Metastasis. Trends Cancer. 1 (1), 76-91 (2015).
- Sykes, J. A. Separation of Tumor Cells from Fibroblasts. Human Tumor Cells In Vitro. Fogh, J. 1, Chapter 1 1-22 (1975).
- Lang, S. H., Stark, M., Collins, A., Paul, A. B., Stower, M. J., Maitland, N. J. Experimental Prostate Epithelial Morphogenesis in Response to Stroma and Three-Dimensional Matrigel Culture. Cell Growth Differ. 12 (12), 631-640 (2001).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and Oncogenesis of MCF-10A Mammary Epithelial Acini Grown In Three-Dimensional Basement Membrane Cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
- Shaw, L. M. Tumor cell invasion assays. Methods Mol. Biol. 294, 97-105 (2005).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Modeling Dynamic Reciprocity: Engineering Three-Dimensional Culture Models of Breast Architecture, Function, and Neoplastic Transformation. Semin Cancer Biol. 15 (5), 342-352 (2005).
- Hedlund, T. E., Duke, R. C., Miller, G. J. Three-Dimensional Spheroid Cultures of Human Prostate Cancer Cell Lines. Prostate. 41 (3), 154-165 (1999).
- Le, V. M., Lang, M. D., Shi, W. B., Liu, J. W. A Collagen-Based Multicellular Tumor Spheroid Model for Evaluation of the Efficiency of Nanoparticle Drug Delivery. Artif. Cells Nanomed Biotechnol. 15, 1-5 (2014).
- Neto, A. I., et al. A Novel Hanging Spherical Drop System for the Generation of Cellular Spheroids and High Throughput Combinatorial Drug Screening. Biomater Sci. 3 (4), 581-585 (2015).
- Janvier, R., Sourla, A., Koutsilieris, M., Doillon, C. J. Stromal Fibroblasts are Required for PC-3 Human Prostate Cancer Cells to Produce Capillary-like Formation of Endothelial Cells in a Three-dimensional Co-culture System. Anticancer Res. 17 (3A), 1551-1557 (1997).
- Doillon, C. J., Gagnon, E., Paradis, R., Koutsilieris, M. Three-dimensional Culture System as a Model for Studying Cancer Cell Invasion Capacity and Anticancer Drug Sensitivity. Anticancer Res. 24 (4), 2169-2177 (2004).
- Gobeil, S., Zhu, X., Doillon, C. J., Green, M. R. A Genome-Wide shRNA Screen Identifies GAS1 as a Novel Melanoma Metastasis Suppressor Gene. Genes Dev. 22 (21), 2932-2940 (2008).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation Of Ready-To-Use, Storable And Reconstituted Type I Collagen From Rat Tail Tendon For Tissue Engineering Applications. Nat Protoc. 1 (6), 2753-2758 (2007).
- Horie, M., et al. Characterization of Human Lung Cancer-associated Fibroblasts in Three-dimensional In Vitro Co-culture Model. Biochem Biophys Res Commun. 423 (1), 158-163 (2012).
- Banyard, J., et al. Identification of Genes Regulating Migration and Invasion Using a New Model of Metastatic Prostate Cancer. BMC Cancer. 30 (14), 387 (2014).
- Palumbo, J. S., Degen, J. L. Fibrinogen and Tumor Cell Metastasis. Haemostasis. 31, Suppl. 1 11-15 (2001).
- Dvorak, H. F. Tumor Stroma, Tumor Blood Vessels, and Antiangiogenesis Therapy. Cancer J. 21 (4), 237-243 (2015).
- Luoto, K. R., Kumareswaran, R., Bristow, R. G. Tumor Hypoxia as a Driving Force in Genetic Instability. Genome Integr. 4 (1), 5 (2013).
- Das, V., Bruzzese, F., Konečný, P., Iannelli, F., Budillon, A., Hajdúch, M. Pathophysiologically Relevant In Vitro Tumor Models for Drug Screening. Drug Discov Today. 20 (7), 848-855 (2015).
- Longati, P., et al. 3D Pancreatic Carcinoma Spheroids Induce a Matrix-rich, Chemoresistant Phenotype Offering a Better Model for Drug Testing. BMC Cancer. 13 (95), (2013).
- Tan, P. H., Chia, S. S., Toh, S. L., Goh, J. C., Nathanm, S. S. Three-dimensional Spatial Configuration of Tumour Cells Confers Resistance to Chemotherapy Independent of Drug Delivery. J Tissue Eng Regen Med. , (2013).
- Koutsilieris, M., Reyes-Moreno, C., Choki, I., Sourla, A., Doillon, C., Pavlidis, N. Chemotherapy Cytotoxicity of Human MCF-7 and MDA-MB 231 Breast Cancer Cells is Altered by Osteoblast-Derived Growth Factors. Mol Med. 5 (2), 86-97 (1999).
- Lang, N. R., et al. Biphasic Response of Cell Invasion to Matrix Stiffness in Three-Dimensional Biopolymer Networks. Acta Biomater. 13, 61-67 (2015).
