ميكروفلويديك تبادل العازلة لمايكرو / الجسيمات النانوية هندسة الخلايا خالية من التدخل

Summary

يصف هذا البروتوكول استخدام استراتيجية الصرف عازلة القائم على microfluidics بالقصور الذاتي لتنقية الصغير / جسيمات متناهية الصغر خلايا هندسيا مع نضوب الفعال للجزيئات غير منضم.

Abstract

خلايا الهندسة مع الصغير تحميل النشط العنصر / النانوية (NPS) أصبحت وسيلة شعبية متزايدة لتعزيز الخصائص العلاجية الأم، تمكين التصوير الحيوية والسيطرة على النمط الظاهري الخلية. ثمة مسألة حاسمة بعد تلقى العناية الكافية لعدد كبير من الجسيمات التي لا تزال غير منضم بعد خلية وضع العلامات التي لا يمكن إزالتها بسهولة عن طريق الطرد المركزي التقليدي. وهذا يؤدي إلى زيادة في الضوضاء الخلفية التصوير الحيوي، ويمكن نقلها آثار تحول إلى خلايا غير المستهدفة المجاورة. في هذا البروتوكول، ونحن تقديم استراتيجية بالقصور الذاتي القائم على microfluidics عازلة الصرف توصف بأنها دين تدفق التقطير (الأمر الواقع) للفصل بين كفاءة الخلايا المسمى من مصادر القدرة النووية حرة بطريقة إنتاجية عالية. وmicrodevice دوامة المتقدمة يسهل جمع المستمر (> الانتعاش خلية 90٪) من الخلايا تنقيته (THP-1 واللجان الدائمة) معلقة في حل العازلة الجديد، في حين تحقيق نضوب> 95٪ من صبغة الفلورسنت غير منضم أو مصادر القدرة النووية صبغ تحميل (سيلالحلف أو PLGA). هذه خطوة واحدة، تمكن استراتيجية تنقية الخلايا القائم على حجم الخلية عالية التجهيز الإنتاجية (10 ⁶ خلية / دقيقة)، ومفيدة للغاية لتنقية الخلايا حجم كبير من جسيمات متناهية الصغر هندسيا خلايا / الدقيقة لتحقيق التطبيق السريري مجانا للتدخل.

Introduction

هندسة الخلايا الصغيرة / النانوية محملة كيل (NPS) هو بسيط الجيني خالية من التكامل، وتنوعا طريقة، لتعزيز قدرة bioimaging وزيادة / تكملة خصائصه العلاجية المحلية في مجال الطب التجديدي. وتتحقق ^1-3 التعديلات الخلوية التي كتبها وصفها غشاء البلازما أو الهيولى مع التركيز الزائد من مصادر القدرة النووية محملة كيل لتشبع مواقع الربط. ومع ذلك، فإن العيب الرئيسي لهذا الأسلوب هو كميات كبيرة من الجزيئات غير منضم المتبقية في حل بعد عمليات الخلية وضع العلامات، والتي من المحتمل أن نخلط التحديد الدقيق للخلايا المهندسة الجسيمات أو تعقيد النتائج العلاجية. ^4،5 وبالإضافة إلى ذلك، والتعرض لمصادر القدرة النووية التي تحتوي التحويلية وكلاء (عوامل النمو، القشرية، وما إلى ذلك) في تركيز عال بشكل مفرط يمكن أن يسبب السمية الخلوية والتعرض المهدورة ربما تتسبب في عواقب غير مقصودة على الخلايا غير المستهدفة. حتى لشركات الطيران الجسيمية التي تضم سو المواد "حيويا" [على سبيل المثال، بولي (اللبنيك المشترك حمض الجليكوليك)، PLGA] يمكن أن تحرض على استجابات الخلايا المناعية فعالة في ظل ظروف معينة أيضا. ⁶ وهذا أمر محفوف بالمخاطر وخاصة في الأشخاص الذين يعانون ضعف المناعة (مثل التهاب المفاصل الروماتويدي) التي يحتمل التأخير النظامية إزالة جسيمات متناهية الصغر. ⁷ وهكذا، وإزالة فعالة من جزيئات حرة قبل إدخال الخلايا المهندسة الجسيمات ذات أهمية كبيرة لتقليل سميته والحد من التعرض للاساءة الى جزيئات محملة عامل في الجسم الحي.

وكثيرا ما يستخدم التقليدي التدرج الطرد المركزي لفصل خلايا هندستها من جزيئات حرة ولكن شاقة وتشغيلها في دفعة واسطة. وعلاوة على ذلك، اجهادات القص التي تمر بها الخلايا أثناء عالية السرعة الطرد المركزي ومقومات المتوسطة الكثافة التدرج قد تعرض سلامة الخلية و / أو سلوك الخلية النفوذ. ⁸ على microfluidics هو بديلا جذابا مع بغازيتكنولوجيات الفصل األطراف بما في ذلك النزوح الأفقي القطعية (DLD) ^9، dieletrophoresis ^10،11 وacoustophoresis ¹² ضعت لفصل جزيئات صغيرة والتطبيقات الصرف العازلة. ومع ذلك، هذه الأساليب تعاني من سرعة منخفضة (1-10 ميكرولتر · دقيقة ^{- 1)} وتكون عرضة للانسداد القضايا. تتطلب فصل النشطة مثل أساليب تعتمد على dielectrophoresis أيضا اختلافات في الظواهر خلية dielectrophoretic الجوهرية أو خطوات إضافية خلية وضع العلامات لتحقيق الانفصال. ويشمل اتباع نهج أكثر واعدة على microfluidics بالقصور الذاتي - الهجرة الجانبية للجزيئات أو خلايا عبر يبسط إلى التركيز على مواقع متميزة نظرا لقوات رفع المهيمنة (F _L) في ارتفاع عدد رينولدز (إعادة) ¹³ نظرا لظروف تدفق عالية، وقرار حجم متفوقة. وكثيرا ما تم استغلاله لتطبيقات الصرف على أساس حجم فصل الخلية ^14،15 والعازلة. ^16-18 Howeveص، يبقى أداء البورصة عازلة الفقراء مع حل الملوثات ~10-30٪ كما تبقى عادة الخلايا فصل على مقربة من الحدود بين الحلول الأصلية وعازلة جديد ^16-18 الأهم من ذلك أن توزيع حجم الخلايا المستهدفة أن تكون مماثلة لتحقيق بالقصور الذاتي الدقيق التركيز والانفصال عن حل العازلة الأصلي الذي يطرح قضية لا سيما في معالجة أنواع غير متجانسة الحجم الخلايا مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة). ¹⁹

لقد سبق وضعها تقنية جديدة خلية على microfluidics بالقصور الذاتي الفرز ووصف عميد تدفق التقطير (الأمر الواقع) لعزل تعميم الخلايا السرطانية (CTCs) ²⁰ والبكتيريا ²¹ من الدم الكامل باستخدام 2-مدخل، 2-منفذ جهاز متناهية دوامة. في هذا البروتوكول الفيديو، فإننا سوف وصف عملية وضع العلامات THP-1 الخلايا (الإنسان حاد خط خلية سرطان الدم الوحيدات) تعليق حيدي (~ 15 ميكرون)، واللجان الدائمة (10-30 ميكرون) مع calcein-Loaded مصادر القدرة النووية، يليه تصنيع وتشغيل microdevice دوامة قوات الأمر الواقع لاستعادة كفاءة من الخلايا المسمى وإزالة تلك المصادر غير منضم. تمكن ²² هذه الاستراتيجية تنقية خطوة واحدة الانتعاش المستمر للتعليق وصفت والخلايا الملتصقة مع وقف التنفيذ في حل العازلة جديدة دون الطرد المركزي. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن معالجة ما يصل إلى 10 مليون خلية · مل ^-1، وكثافة الخلايا قابلة للتطبيقات الطب التجديدي.

Protocol

1. النانوية (NPS) وصفها من الخلايا الجذعية الوسيطة وحيدات

1. ثقافة الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) في المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل الجنين البقري (FBS) والمضادات الحيوية ل≥80٪ confluency قبل وضع العلامات. وبالمثل، ثقافة THP-1 الخلايا (آي تي سي سي) في معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 المتوسطة تستكمل مع FBS 10٪ لكثافة ~ 10 ⁶ خلية / مل.
2. مصادر القدرة النووية الحمل السيليكا (~ 500 ميكرون) مع الحل calcein صبغ (200 ميكرومتر) باستخدام التحريك بين عشية وضحاها. افتعال PLGA-calcein AM (CAM) باستخدام بروتوكول سبق وصفها. ²²
   1. حل 250 CAM ميكروغرام و 100 ملغ PLGA (50:50) في الكلوروفورم في 4 درجات مئوية.
   2. توليد مصادر القدرة النووية مستحلب واحدة باستخدام الخالط عالية السرعة (13600 x ج، 60 ثانية) في درجة حرارة الغرفة. تتبخر الكلوروفورم في غطاء الكيميائية (≥3 ساعة) قبل المجموعة باستخدام الطرد المركزي (3400 x ج لمدة 5 دقائق)، وغسل (disti مزدوجةالمياه lled)، وتجميد التجفيف والتخزين في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
3. احتضان كام PLGA مصادر القدرة النووية (1 ملغ) أو مصادر القدرة النووية السيليكا calcein (150 ميكروغرام) في 0.01٪ بولي-L-ليسين (PLL) الحل في درجة حرارة الغرفة ل15-20 دقيقة.
4. أجهزة الطرد المركزي في 3400 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة الزائد PLL طاف قبل إعادة تعليق NPS في 1 مل من مستنبت منها.
5. احتضان مصادر القدرة النووية مع الخلايا (اللجان الدائمة أو THP-1، ~ 1-2 × 10 ⁶ خلايا في المجموع) لحوالي 24 ساعة (0.1 ملغ · تركيز مل ^-1 التوسيم).
6. فصل وحصاد اللجان الدائمة ملتصقة المسمى باستخدام 2 مل من 0.25٪ التربسين (5 دقائق، 37 ° C) وإرواء مع 6 مل من DMEM. تدور باستمرار في الخلايا (1000 x ج، 4 دقيقة) و resuspend إلى تركيز من ¹⁰ مايو - 10 يونيو خلية / مل لمعالجة ميكروفلويديك. استخدام المسمى THP-1 الخلايا ⁽¹⁰ مايو - 10 يونيو خلية / مل) مباشرة لتنقية على microfluidics.

2. إعداد جهاز ميكروفلويديك

1. تصنيع جهاز
   1. افتعال الجهاز دوامة ميكروفلويديك (500 ميكرون (ث) × 115 ميكرون (ح)) مع (PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان من مجموعة تجارية باستخدام معيار خطوات الطباعة الحجرية الناعمة. ²³
   2. خلط 30 غراما من prepolymer قاعدة و 3 ز وكيل علاج تماما في قارب وزنها. دي الغاز الخليط في مجفف لمدة 60 دقيقة لإزالة أي فقاعات الهواء.
   3. يصب الخليط PDMS على القالب الرئيسي رقاقة السيليكون نمط مع تصميم قناة دوامة بعناية إلى ارتفاع ~ 5-10 ملم.
   4. دي الغاز الخليط في فراغ مجفف لمدة 60 دقيقة مرة أخرى لإزالة أي فقاعات الهواء. كرر العملية حتى يتم القضاء على كل الفقاعات.
   5. علاج خليط PDMS في C الفرن 80 درجة لمدة 2 ساعة حتى يتم تعيين PDMS. ضمان عدم إمالة رقاقة خلال علاج لارتفاع الجهاز مستمر.
   6. قطع الجهاز دوامة PDMS باستخدام مشرط وقشر بعناية بلاطة PDMS من القالب الرئيسي.
   7. آرايم حواف الجهاز مع مشرط لضمان سطح أملس للارتباط.
   8. لكمة اثنين من الثقوب (1.5 ملم) لمداخل واثنين من الثقوب (1.5 ملم) لمنافذ على الجهاز PDMS باستخدام خزعة الناخس 1.5 مم.
   9. غسل الجهاز مع الأيزوبروبانول (IPA) لإزالة أي حطام وتجفيف الجهاز في الفرن 80 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
   10. تنظيف السطح السفلي من الجهاز PDMS (مع ميزات القناة) باستخدام الشريط اللاصق.
   11. نظيف جانب واحد من شريحة زجاجية (2 "ب 3") باستخدام الشريط اللاصق.
   12. بعناية وضع وفضح السطوح تنظيف الجهاز PDMS وشريحة زجاجية في غرفة نظافة البلازما وإخضاعها لفراغ لمدة 60 ثانية. بعد ذلك، تبديل على السلطة البلازما إلى الحد الأقصى وخفض ضغط الغرفة حتى تتحول الغرفة وردي اللون.
       1. كشف السطوح لالبلازما الجوية لمدة 60 ثانية. يخلق البلازما أنواع رد الفعل على السطوح المكشوفة من PDMS والزجاج والتي تمكن الرابطة ضيق عندما جلبت الى عالجآل الاتصال. إيقاف الطاقة البلازما والافراج عن الضغط من نظافة البلازما لاسترداد الجهاز والشريحة الزجاجية.
   13. السندات الجهاز PDMS وشريحة زجاجية معا عن طريق الضغط على الأسطح المعرضة للبلازما بإحكام والتأكد من عدم وجود فقاعات محاصرون بين سطحين.
   14. حرارة الجهاز المستعبدين باستخدام موقد وضعت في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة لتعزيز الترابط.
2. جهاز تشغيل
   1. قطع قطعتين من الأنابيب (1.52 مم OD) من ~ 15-20 سم للمحاقن مدخل وإرفاق طرف الحقنة (قياس 23) على نهاية واحدة من كل الأنابيب.
   2. قطع قطعتين من الأنابيب (1.52 مم OD) من ~ 5-10 سم للمنافذ ونعلق على ثقوب منفذ الجهاز PDMS.
   3. قبل أخذ عينات التوالي، رئيس يدويا للجهاز مع حقنة تحتوي على 70٪ من الإيثانول حتى يتدفق من الأنبوب منفذ. السماح للاعتصام الإيثانول لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة لتعقيم الجهاز.
   4. تحميل 30 مل من تصفيتها(0.2 ميكرومتر المسام) العازلة غمد (الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) بنسبة 0.1٪ الأبقار مصل الزلال (BSA)) في حقنة 60 مل وتأمين حقنة على ضخ حقنة. ضبط مضخة إلى الإعدادات الصحيحة (حجم الحقنة: 60 مل، المجلد: 60،000 ميكرولتر).
      ملاحظة: إضافة BSA لبرنامج تلفزيوني هو تقليل خلية خلية ملزم وغير محددة ملزمة بين الخلايا والجهاز PDMS.
   5. تحميل 3 مل من الخلايا المسمى في حقنة 3 مل وتأمين حقنة على ضخ حقنة منفصلة. ضبط مضخة إلى الإعدادات الصحيحة (حجم الحقنة: 3 مل، المجلد: 3000 ميكرولتر).
   6. تأكد من عدم وجود فقاعات الهواء محاصرون في الحقن لضمان تدفق مستقر. إزالة أي فقاعات الهواء عن طريق إخراج بلطف بضع قطرات من السائل من فوهة.
   7. ربط نصائح مدخل حقنة وأنابيب للحقن، وإدراجها في مداخل كل من الجهاز (غمد وعينة مدخل). تأكد من عدم وجود فقاعات على طول الأنبوب.
   8. تركيب الأجهزة على وقلبإد المجهر المرحلة على النقيض من التصوير في الوقت الحقيقي خلال خلية عملية الفرز.
   9. تأمين كوب النفايات الصغيرة واثنين من 15 مل أنابيب قريب من الجهاز على المسرح المجهر باستخدام مواد لاصقة.
   10. وضع الأنابيب منفذ في الكأس النفايات.
   11. تعيين نسبة تدفق لعينة لعازلة غمد إلى 1:10 وتبدأ كل من مضخات حقنة لبدء عملية الفرز مثال (: 120 ميكرولتر / دقيقة لعينة حقنة و1،200 ميكرولتر / دقيقة لحقنة غمد، سرعة تدفق قناة ~ 0.38 متر / ثانية ).
   12. تشغيل الجهاز لمدة 1.5 دقيقة لمعدل التدفق لتحقيق الاستقرار. ويمكن التأكد من ذلك من خلال وجود خلايا inertially مركزة بالقرب من الجدار الداخلي قنوات تحت مشرق الميدان مع مرحلة التباين باستخدام كاميرا عالية السرعة (~ 5000 - 10000 لقطة في الثانية (fps)، وقت التعرض: 10-50 μsec).
   13. ضع الأنابيب منفذ في أنابيب مختلفة لجمع eluents من مأخذ خلية ومنفذ النفايات.

Representative Results

بعد وصفها الخلايا مع الحيوي التصوير NPS-تحميل عامل بين عشية وضحاها، ويتم حصاد الخلايا المسمى (التي تحتوي على جزيئات الحرة) وتنقيته من قبل قوات الأمر الواقع دوامة microdevice لإزالة مصادر القدرة النووية الحرة في العملية خطوة واحدة (الشكل 1A). تم تصميم 2-مدخل، متناهية لولبية 2-منفذ عن طريق هندسة البرمجيات وmicrofabricated باستخدام SU-8 مقاومة للضوء. ثم يتم استخدام رقاقة السيليكون نمط كنموذج لصب متماثلة PDMS باستخدام تقنيات الطباعة الحجرية الناعمة (الشكل 1B). لإجراء فرز الخلايا، يتم ضخ عينة خلية في مدخل الجدار الخارجي للmicrodevice دوامة بينما مدخل الجدار الداخلي يعمل حل العازلة الطازجة بمعدل تدفق أعلى (01:10) لقرصة تدفق عينة الخلية. ويتحقق الانفصال من خلال التركيز بالقصور الذاتي من الخلايا المسمى أكبر في الجدار الداخلي وإعادة تدوير الناجم عن عميد لمصادر القدرة النووية غير منضم صغيرة نحو الجدار الخارجي (الشكل 2A). وكان جهاز تطبيق صحيفة الأولىإد لفرز الخلايا تعليق المسمى الوحيدات (THP-1) من مصادر القدرة النووية السيليكا الفلورسنت محملة calcein (~ 500 نانومتر في الحجم). وقد تم الحصول على الكفاءات فصل عالية وهو ما أكدته التصوير سرعة عالية (الشكل 2A) والتدفق الخلوي تحليل (الشكل 2B). وأشار الصور من eluents التي تم جمعها من منفذ خلية الجهاز أيضا إزالة فعالة من السيليكا وPLGA مصادر القدرة النووية (~ 1-5 ميكرومتر) من THP-1 الخلايا. وبالإضافة إلى ذلك، أظهر التصوير مضان أن مصادر القدرة النووية المنضوية في الخلايا THP-1 المسمى تم الإبقاء جيدا خلال تنقية قوات الأمر الواقع (إدراجات) (الشكل 3). بسبب MSC حجم التجانس، تم تعديل هندسة دوامة متناهية في وقت لاحق عن طريق تغيير ارتفاع قناة وتصميم التشعب لتمكين مجموعة فعالة من اللجان الدائمة (الشكل 4).

الشكل 1. (أ) ربوتكأسير العمل erall لخطوة واحدة صغيرة / جسيمات متناهية الصغر (NPS) الإزالة السريعة من الايقاف والخلايا الملتصقة بعد وضع العلامات باستخدام عميد تدفق التقطير (الأمر الواقع) تكنولوجيا الموائع الدقيقة. تم تصميم (B) الجهاز دوامة قوات الأمر الواقع من قبل البرامج الهندسية ونقوش على رقاقة السيليكون باستخدام التصنيع الدقيق. ويتم إنتاج الأجهزة PDMS في وقت لاحق من قبل وسائل الطباعة الحجرية الناعمة. يتكون الإعداد التجريبية من 2 مضخات حقنة للبث الخلايا المسمى وعازلة المالحة العذبة في معدلات تدفق مختلفة في الجهاز لتنقية مستمرة ومجموعة من الخلايا المسمى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم إزالة 2. النانوية من المسمى THP-1 الخلايا عن طريق قوات الأمر الواقع. (A) رسم توضيحي لمبدأ الفصل قوات الأمر الواقع. الخلايا المسمى أكبر تجربة القوات قوية بالقصور الذاتي رفع (F _L، السهام الحمراء)، وسحب القوات عميد (F _D، الأسهم الصفراء) وتركز قرب متناهية الجدار الداخلي. مصادر القدرة النووية الصغيرة وحل العازلة تتأثر فقط من قبل عميد سحب وإعادة توزيع على الجدار الخارجي لتحقيق الانفصال. تمثيلية عالية السرعة والصور مضان تشير مواقف توازن THP-1 الخلايا (السهام الحمراء) والسيليكا مصادر القدرة النووية محملة صبغ calcein في منطقة منفذ. الأداء (ب) الفصل على أساس تحليل التدفق الخلوي مع النابضة يحدده حجم (FSC-A) وتحبب (SSC-A) الخصائص. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3). > التمثيلية الصور الحقل مشرقة من النقاء وصفت THP-1 الخلايا (السهام الحمراء) ومصادر القدرة النووية كفاءة الإزالة باستخدام قوات الأمر الواقع. تظهر الأشكال العقد مرحلة منها (أعلاه) والصور مضان المجهر الخلايا الفردية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الرقم إزالة 4. النانوية من الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة) عن طريق قوات الأمر الواقع. (A) التمثيلية صورة بسرعة عالية يوضح الفصل كفاءة اللجان الدائمة (الأسهم الحمراء)، وPLGA مصادر القدرة النووية (الأسهم الزرقاء) إلى وسائل مختلفة. متقطع أصفر خطوط تدل على موقف التقريبي للجدران متناهية. (ب) أداء فصل اللجان الدائمة من السيليكا وPLGA مصادر القدرة النووية.خريج "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

التكنولوجيا قوات الأمر الواقع تنقية الخلايا الموصوفة هنا تمكن فصل سريع ومتواصل من الخلايا المسمى بطريقة إنتاجية عالية. هذا النهج فصل مثالية لحجم العينة كبير أو ارتفاع تركيز خلية تجهيز العينات، وأفضل من الترشيح التي تعتمد على الأغشية التقليدية التي هي عرضة للانسداد بعد الاستخدام الموسعة. وبالمثل، يتطلب الفصل المغناطيسي القائم على تقارب خطوات إضافية خلية العلامات التي هي شاقة ومكلفة. وتظهر الخلايا النقاء للاحتفاظ كلاء وصفت ومورفولوجيا الخلايا بشكل جيد (الشكل 3) مع الحد الأدنى من آثار تدفق / الناجم عن القص (τ إجهاد القص، ~ 200-250 داين / سم ²⁾ وذلك بسبب الوقت القصير الإقامة داخل القناة (< 1 ثانية) ^20،24. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمستخدم اختيار الحل مزال من الخلايا المسمى فرزها ببساطة عن طريق استبدال العازلة غمد (المالحة) مع وسائل الإعلام المطلوبة أو حل العازلة.

ومن الأهمية بمكان أنلا يوجد أي أوساخ أو الحطام في الاستخدام السابق متناهية التي يمكن أن تؤثر سلبا على الخلايا السلوك التركيز. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق تنظيف فتحات مدخل تماما مع خطة العمل الفورية، وكذلك استخدام اخفاء الشريط لتنظيف السطح PDMS قبل الرابطة البلازما. منذ microdevice تعمل في ظل ظروف تدفق عالية (~ 1-1،5 مل / دقيقة)، من المهم أيضا لتسخين PDMS الأجهزة المستعبدين على موقد لضمان الترابط القوي بين PDMS وشريحة زجاجية. خلال عملية الجهاز، إذا كانت الخلايا لا يركز جيدا، فهذا يعني أن معدلات التدفق ليست كافية. يمكن للمرء أن استكشاف عن طريق فحص الجهاز منطقة مدخل ونصائح حقنة لضمان عدم وجود أي تسرب.

إزالة تلك المصادر غير منضم من الخلايا المسمى ليست تافهة منذ تقنيات الفصل مختبر مشترك (على سبيل المثال، الطرد المركزي) لا يمكن جزيئات منفصلة / خلايا مختلفة الأحجام (على سبيل المثال، الجزيئات غير منضم والخلايا المسمى). في حين يمكن للمرء أن يجادل بأن الغسيل المتكرروتغيير ثقافة وسائل الإعلام يمكن إزالة مصادر القدرة النووية خالية من الخلايا الملتصقة إلى حد ما، عملية شاقة وغير فعالة لمزارع الخلايا تعليق. الجهاز ميكروفلويديك قوات الأمر الواقع يستخدم الفرز القائم على حجم ومرنة للغاية لأنها يمكن أن تستخدم في كل تعليق والخلايا الملتصقة مع مجموعة كبيرة الحجم، وكذلك إزالة تلك المصادر من مواد مختلفة. إذا كانت الخلايا المستهدفة هي من أحجام مختلفة، وجهاز قوات الأمر الواقع يمكن أن يكون الأمثل عن طريق تغيير الظروف تدفق أو هندسة قناة (على سبيل المثال، ارتفاع القناة ونسبة من الاعراض قناة الداخلي والخارجي) لتحقيق الانفصال كفاءة. وقد تجلى ذلك في وقت سابق ان قوات الأمر الواقع متفوقة مقارنة الطرد المركزي التقليدية في إزالة مصادر القدرة النووية مع فقدان الخلية الحد الأدنى. ²² وعلاوة على ذلك، ظل الأداء الانتعاش خلية عالية (> 90٪) عندما تمت زيادة تركيز العينة إلى 10 ⁷ خلية / مل. وهذا يمثل تحسنا رئيسيا على طرق بالقصور الذاتي القائمة ميكروفلويديك فصل الخلية التي هي عامةتقتصر لاي ل10 ⁵ خلية / مل القدرة بسبب التفاعل خلية خلية وخلية الازدحام في مواقف التوازن. ²⁵

في حين أن التكنولوجيا قوات الأمر الواقع تحقق الفصل على أساس اختلاف حجم، فإنه لا يمكن أن تستخدم لعمليات هندسة الخلايا الأخرى مثل فصل الخلايا المسمى وغير المسماة بسبب تغيرات طفيفة في حجم الخلية. ويمكن اعتبار علامات سطح الخلية لفرز القائمة على تقارب وغيرها من طرائق الفصل المشترك (القابلية المغناطيسية والتوصيل الكهربائي) لمثل هذه التطبيقات المحتملة. التكنولوجيا قوات الأمر الواقع هي أيضا ليست مناسبة لفرز الخلايا المضاعفة على أساس مضان. ومن شأن خيار أفضل يتمثل في استخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) لخطوة واحدة الفرز من الخلايا المسمى مع مضان مختلفة والتي تعمل على إنتاجية عالية، ولكنها تتطلب معدات باهظة الثمن وضخمة.

وأخيرا، وهذا البروتوكول هو مفيد للغاية لتنقية الخلايا المهندسة عندماوتستخدم مصادر القدرة النووية تحتوي على عناصر التحويلية (عوامل النمو، والمخدرات، القشرية، الخ) لbioimaging و / أو العلاج بالخلايا. وذلك لأن مصادر القدرة النووية المجانية المتبقية يمكن أن يؤدي الى تأثيرات خارج الهدف تحولي على الخلايا المجاورة أو الخلايا المناعية التي تستجيب لهذه الجسيمات الأجنبية عند حقنه في الجسم الحي. كما أنها قد تولد عن غير قصد الإشارات التي يمكن أن تكون مضللة خلال bioimaging. إزالة هذه مصادر القدرة النووية حرة قبل الاستخدام وبالتالي تقليل المخاطر لخلايا غير المستهدفة، تقليل مصنفات في الجهاز المناعي، والحد من قضايا التلوث بين الخطوات خلال متتابعة وضع العلامات / هندسة الخلايا. في التنفيذ الناجح يسهل إلى حد كبير وضع العلامات الخلية ويمكن استخدام خالية من التدخل من الجسيمات هندسية مقرها خلية في العلاج.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs)	Lonza	PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Lonza	12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1)	ATCC	TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media	Lonza	12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL)	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml Syringe	BD	302113	Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe	BD	309653	Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA)	Biowest	P6154-100GR
Calcein, AM (CAM)	Life Technologies	C1430
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Isopropanol	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS)	Lonza	17-516Q/12
Plain Microscope Slides	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Dow Corning	SYLGARD® 184
Scotch tape	3M	21200702044	18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm)	Sigma-Aldrich	748161	Pore size 4 nm
Syringe Tip	JEC Technology	7018302	23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%)	Life Technologies	25200-056
Tygon Tubing	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50)	Sigma-Aldrich	P2191
Equipment
Biopsy punch	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 mm
Dessicator	Scienceware	111/4 IN OD
High-speed Camera	Phantom	V9.1
Inverted phase-contrast microscope	Nikon	Eclipse Ti
Plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-002
Syringe Pump	Chemyx	CX Fusion 200