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Bioengineering

हस्तक्षेप से मुक्त माइक्रो / Nanoparticle सेल इंजीनियरिंग के लिए microfluidic बफर एक्सचेंज

doi: 10.3791/54327 Published: July 10, 2016

Summary

इस प्रोटोकॉल एक जड़त्वीय microfluidics आधारित बफर विनिमय रणनीति के उपयोग का वर्णन अपार कणों की कुशल कमी के साथ सूक्ष्म / nanoparticle इंजीनियर कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए।

Abstract

सक्रिय घटक से भरी हुई सूक्ष्म / नैनोकणों के साथ इंजीनियरिंग कोशिकाओं (एनपीएस), देशी चिकित्सीय गुणों को बढ़ाने के लिए जैव इमेजिंग सक्षम और सेल phenotype नियंत्रित करने के लिए एक तेजी से लोकप्रिय तरीका बनता जा रहा है। एक महत्वपूर्ण अभी तक अपर्याप्त संबोधित मुद्दा कणों कि सेल लेबलिंग जो आसानी से पारंपरिक centrifugation द्वारा नहीं हटाया जा सकता है के बाद अपार रहने के महत्वपूर्ण संख्या है। यह जैव इमेजिंग पृष्ठभूमि शोर में वृद्धि हो जाती है और पड़ोसी गैर लक्ष्य कोशिकाओं पर परिवर्तनकारी प्रभाव प्रदान कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एक जड़त्वीय microfluidics आधारित बफर विनिमय रणनीति डीन प्रवाह Fractionation (डीएफएफ) के रूप में कहा कुशलता से एक उच्च throughput ढंग से मुक्त एनपीएस से लेबल की कोशिकाओं को अलग करने के लिए उपस्थित थे। विकसित सर्पिल microdevice, शुद्ध कोशिकाओं (THP-1 और MSCs) नई बफर समाधान में निलंबित की सतत संग्रह (> 90% सेल वसूली) की सुविधा है, जबकि अपार फ्लोरोसेंट रंजक या डाई-लोडेड एनपीएस (एसआईएल के> 95% की कमी को प्राप्त करनेआईसीए या पीएलजीए)। यह एकल कदम, आकार के आधार पर सेल शुद्धि रणनीति उच्च सेल प्रसंस्करण throughput (10 6 कोशिकाओं / मिनट) सक्षम बनाता है और सूक्ष्म / nanoparticle इंजीनियर कोशिकाओं की बड़ी मात्रा सेल शुद्धि हस्तक्षेप से मुक्त नैदानिक ​​आवेदन प्राप्त करने के लिए अत्यधिक उपयोगी है।

Introduction

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एजेंट से भरी हुई सूक्ष्म / नैनोकणों (एनपीएस) द्वारा कोशिकाओं इंजीनियरिंग bioimaging क्षमता बढ़ाने के लिए और बढ़ाने / पुनर्योजी चिकित्सा में इसके मूल चिकित्सीय गुणों के पूरक के लिए एक सरल, जीनोमिक एकीकरण से मुक्त, और बहुमुखी विधि है। 1-3 सेलुलर संशोधनों लेबल करके प्राप्त कर रहे हैं प्लाज्मा झिल्ली या एजेंट से भरी हुई एनपीएस की एक अतिरिक्त एकाग्रता के साथ कोशिका द्रव्य बाध्यकारी साइटों तर करने के लिए। हालांकि, इस पद्धति की एक बड़ी खामी परिवर्तनकारी युक्त एनपीएस में अपार सेल लेबलिंग प्रक्रियाओं के बाद समाधान में शेष कणों की मात्रा महत्वपूर्ण है, जो संभवतः कण-इंजीनियर कोशिकाओं की सटीक पहचान उलझाना या चिकित्सीय परिणामों को मुश्किल। 4,5 इसके अलावा कर सकते हैं, जोखिम है एजेंट (वृद्धि कारक है, corticosteroids, आदि) के लिए जरूरत से ज्यादा उच्च एकाग्रता में cytotoxicity और misdirected जोखिम का कारण गैर लक्ष्य कोशिकाओं पर अनपेक्षित परिणाम उत्पन्न हो सकता है कर सकते हैं। यहाँ तक कि कण ओ जिसमें वाहकएफ "biocompatible" सामग्री [जैसे, पाली (लैक्टिक सह एसिड), पीएलजीए] कुछ शर्तों के तहत शक्तिशाली प्रतिरक्षा सेल प्रतिक्रिया के रूप में अच्छी तरह से उत्तेजित कर सकते हैं। 6 यह बिगड़ा प्रतिरोधक क्षमता (जैसे, रुमेटी गठिया) जो संभावित देरी के साथ व्यक्तियों में विशेष रूप से जोखिम भरा है प्रणालीगत nanoparticle निकासी। 7 इस प्रकार, पूर्व कण-इंजीनियर कोशिकाओं की शुरूआत करने के लिए स्वतंत्र कणों के कुशल हटाने विषाक्तता प्रोफ़ाइल को कम करने और इन विवो में एजेंट से भरी हुई कणों को गलत दिशा में जोखिम कम करने के लिए बहुत महत्व का है।

परम्परागत ढाल centrifugation अक्सर मुक्त कणों से इंजीनियर कोशिकाओं को अलग करने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन श्रमसाध्य है और बैच मोड में संचालित है। इसके अलावा, कतरनी तनाव उच्च गति centrifugation के दौरान कोशिकाओं और घनत्व ढाल मध्यम सेल अखंडता और / या प्रभाव सेल व्यवहार समझौता हो सकता है के घटकों द्वारा अनुभव किया। 8 Microfluidics सेव के साथ एक आकर्षक विकल्प हैनियतात्मक पार्श्व विस्थापन (DLD) 9, 10,11 और 12 dieletrophoresis छोटे कणों जुदाई और बफर विनिमय अनुप्रयोगों के लिए विकसित acoustophoresis सहित आम जुदाई प्रौद्योगिकियों। हालांकि, इन तरीकों कम throughput से ग्रस्त (1-10 μl · मिनट - 1) और मुद्दों clogging से ग्रस्त हैं। ऐसे dielectrophoresis आधारित विधियों के रूप में चर्चित विभाजन भी आंतरिक dielectrophoretic सेल phenotypes या जुदाई को प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त सेल लेबलिंग चरणों में मतभेद की आवश्यकता होती है। भर कणों या कोशिकाओं के पार्श्व प्रवास इसकी उच्च प्रवाह की स्थिति और बेहतर आकार संकल्प के कारण उच्च रेनॉल्ड्स संख्या (रे) 13 पर प्रमुख लिफ्ट बलों (एफ एल) के कारण अलग-अलग पदों पर ध्यान केंद्रित करने की सुव्यवस्थित - एक और अधिक आशाजनक दृष्टिकोण जड़त्वीय microfluidics शामिल है। , यह अक्सर 16-18 आकार के आधार पर सेल जुदाई 14,15 और बफर विनिमय अनुप्रयोगों के लिए शोषण किया गया है। Howeveआर, बफर विनिमय प्रदर्शन ~10-30% दूषित पदार्थों को समाधान के साथ गरीब बना रहता है के रूप में अलग कोशिकाओं को आमतौर पर मूल और नए बफर समाधान के बीच सीमा के करीब रहते हैं। 16-18 इससे भी महत्वपूर्ण बात, लक्ष्य कोशिकाओं के आकार के वितरण के लक्ष्य को हासिल करने के लिए समान हो गया है सटीक जड़त्वीय ध्यान केंद्रित है और मूल बफर समाधान है जो विशेष रूप से (MSCs) ऐसे mesenchymal स्टेम कोशिकाओं के रूप में विषम आकार प्रकार की कोशिकाओं के प्रसंस्करण में एक मुद्दा बन गया है से जुदाई। 19

हम पहले से विकसित किया है एक नया जड़त्वीय microfluidics सेल छँटाई तकनीक एक 2-इनलेट, 2-आउटलेट सर्पिल microchannel डिवाइस का उपयोग कर घूम ट्यूमर कोशिकाओं (CTCs) 20 और बैक्टीरिया 21 पूरे रक्त से अलग-थलग करने के लिए डीन प्रवाह Fractionation (डीएफएफ) करार दिया। इस वीडियो प्रोटोकॉल में, हम लेबलिंग THP-1 (मानव तीव्र monocytic ल्यूकेमिया सेल लाइन) निलंबन monocytic कोशिकाओं (~ 15 माइक्रोन) और calcein-एल के साथ MSCs (10-30 माइक्रोन) की प्रक्रिया का वर्णन करेंगेoaded एनपीएस, निर्माण और लेबल की कोशिकाओं और अपार एनपीएस के हटाने के कुशल वसूली के लिए डीएफएफ सर्पिल microdevice के आपरेशन के द्वारा पीछा किया। 22 यह भी कदम शुद्धि रणनीति लेबल निलंबन और centrifugation बिना ताजा बफर समाधान में निलंबित कर दिया पक्षपाती कोशिकाओं की निरंतर वसूली सक्षम बनाता है। इसके अलावा, यह 10 मिलियन कोशिकाओं · मिलीलीटर -1, एक सेल घनत्व पुनर्योजी चिकित्सा अनुप्रयोगों के लिए उत्तरदायी तक की प्रक्रिया कर सकते हैं।

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Protocol

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1. नैनोकणों (एनपीएस) mesenchymal स्टेम सेल और monocytes की लेबलिंग

  1. संस्कृति mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) में लेबलिंग से पहले ≥80% confluency करने के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक। इसी तरह, संस्कृति THP-1 कोशिकाओं (ATCC) रोसवेल पार्क मेमोरियल संस्थान (RPMI) में 1,640 मध्यम ~ 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व को 10% FBS के साथ पूरक।
  2. लोड सिलिका एनपीएस (~ 500 माइक्रोन) calcein डाई समाधान (200 माइक्रोन) के रात भर सरगर्मी का उपयोग के साथ। बनाना पीएलजीए-calcein AM (सीएएम) एक प्रोटोकॉल पहले से वर्णित का उपयोग कर। 22
    1. 250 माइक्रोग्राम सीएएम और 4 डिग्री सेल्सियस पर क्लोरोफॉर्म में 100 मिलीग्राम पीएलजीए (50:50) भंग।
    2. कमरे के तापमान पर एक उच्च गति homogenizer (13,600 XG, 60 सेकंड) का उपयोग कर एक पायस एनपीएस उत्पन्न करता है। , (3400 5 मिनट के लिए XG) centrifugation का उपयोग धोने (डबल disti संग्रह से पहले एक रासायनिक हुड (≥3 एचआर) में क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जानाlled पानी), फ्रीज सुखाने और भंडारण -20 डिग्री सेल्सियस में।
  3. 20 मिनट - सीएएम-पीएलजीए एनपीएस (1 मिलीग्राम) या 0.01% पाली एल लाइसिन (पीएलएल) कमरे के तापमान पर 15 के लिए समाधान में calcein सिलिका एनपीएस (150 माइक्रोग्राम) सेते हैं।
  4. 5 मिनट के लिए 3400 XG पर अपकेंद्रित्र संबंधित संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में एनपीएस मेजबान से पहले अतिरिक्त पीएलएल सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  5. लगभग 24 घंटा (0.1 मिलीग्राम · मिलीलीटर -1 लेबलिंग एकाग्रता) के लिए - कोशिकाओं (कुल 2 एक्स 10 6 कोशिकाओं MSCs या THP-1, ~ 1) के साथ एनपीएस सेते हैं।
  6. अलग कर देना और फसल 0.25% trypsin (5 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस) के 2 मिलीलीटर का उपयोग लेबल पक्षपाती MSCs और DMEM के 6 मिलीलीटर के साथ बुझा लेते हैं। Microfluidic प्रसंस्करण के लिए 10 6 कोशिकाओं / एमएल - 10 5 की एकाग्रता के लिए कोशिकाओं पर (1000 XG, 4 मिनट) और resuspend स्पिन। Microfluidics शुद्धि के लिए सीधे - (10 6 कोशिकाओं / एमएल 10 5) लेबल THP-1 कोशिकाओं का प्रयोग करें।

2. Microfluidic डिवाइस तैयारी

  1. उपकरण निर्माण
    1. Microfluidic सर्पिल डिवाइस बनाना (500 माइक्रोन (डब्ल्यू) × 115 माइक्रोन (ज)) एक वाणिज्यिक किट मानक नरम लिथोग्राफी कदम का उपयोग करने से polydimethylsiloxane (PDMS) के साथ। 23
    2. आधार prepolymer की 30 ग्राम और 3 जी एक वजन नाव में अच्छी तरह से इलाज एजेंट मिलाएं। डी-गैस 60 मिनट के लिए एक desiccator में मिश्रण किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए।
    3. 10 मिमी - ध्यान की ~ 5 ऊंचाई तक सिलिकॉन वेफर मास्टर मोल्ड सर्पिल चैनल डिजाइन के साथ नमूनों पर PDMS मिश्रण डालो।
    4. डी-गैस 60 मिनट के लिए एक desiccator शून्य में मिश्रण फिर किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए। प्रक्रिया को दोहराएं जब तक सभी बुलबुले को समाप्त हो जाते हैं।
    5. 2 घंटे के लिए एक 80 डिग्री सेल्सियस ओवन में PDMS मिश्रण इलाज जब तक PDMS सेट है। सुनिश्चित करें वेफर एक निरंतर डिवाइस ऊंचाई है की इलाज के दौरान झुका नहीं है।
    6. PDMS सर्पिल एक छुरी का उपयोग कर डिवाइस बाहर कट और ध्यान से मास्टर मोल्ड से PDMS स्लैब छील।
    7. trएक छुरी के साथ डिवाइस के किनारों im संबंधों के लिए चिकनी सतह सुनिश्चित करने के लिए।
    8. inlets के लिए दो छेद (1.5 मिमी) और दो छेद (1.5 मिमी) PDMS डिवाइस एक 1.5 मिमी बायोप्सी छेदने का उपयोग करने पर दुकानों के लिए पंच।
    9. isopropanol (आईपीए) के साथ डिवाइस धो 5 मिनट के लिए एक 80 डिग्री सेल्सियस ओवन में किसी भी मलबे को हटाने और डिवाइस को सुखाने के लिए।
    10. PDMS डिवाइस (चैनल सुविधाओं के साथ) के नीचे की सतह मास्किंग टेप का उपयोग कर साफ करें।
    11. एक गिलास स्लाइड (2 "3 से") की साफ एक तरफ मास्किंग टेप का उपयोग कर।
    12. ध्यान रखें और एक प्लाज्मा क्लीनर के चैंबर में बेनकाब PDMS डिवाइस और गिलास स्लाइड की साफ सतहों और उन्हें 60 सेकंड के लिए वैक्यूम के अधीन। इसके बाद, अधिकतम करने के लिए प्लाज्मा सत्ता पर स्विच और चैम्बर दबाव कम जब तक चैम्बर रंग में गुलाबी हो जाता है।
      1. 60 सेकंड के लिए हवा प्लाज्मा सतहों बेनकाब। प्लाज्मा पर PDMS और कांच जो तंग संबंध में सक्षम बनाता है की सतहों उजागर प्रतिक्रियाशील प्रजातियों जब जिस्मानी में लाया बनाता हैअल संपर्क करें। प्लाज्मा बिजली बंद करें और प्लाज्मा क्लीनर से दबाव डिवाइस और गिलास स्लाइड को पुन: प्राप्त करने के लिए जारी।
    13. कसकर प्लाज्मा सतहों उजागर दबाने और यह सुनिश्चित करना है कि कोई बुलबुले दो सतहों के बीच फंस रहे हैं द्वारा एक साथ PDMS डिवाइस और गिलास स्लाइड बांड।
    14. बंधुआ डिवाइस एक hotplate 2 घंटे के लिए 80 डिग्री सेल्सियस पर सेट संबंधों को मजबूत करने का उपयोग कर गर्मी।
  2. डिवाइस ऑपरेशन
    1. इनलेट सीरिंज के लिए 20 सेमी और प्रत्येक ट्यूबिंग के एक छोर पर एक सिरिंज टिप (गेज 23) देते हैं - ~ ​​15 का (1.52 मिमी आयुध डिपो) ट्यूबिंग के दो टुकड़े काटें।
    2. दुकानों के लिए 10 सेमी और PDMS डिवाइस के आउटलेट छेद को देते हैं - ~ ​​5 (1.52 मिमी आयुध डिपो) ट्यूबिंग के दो टुकड़े काटें।
    3. चल नमूना करने के लिए मैन्युअल प्रधानमंत्री एक सिरिंज 70% इथेनॉल युक्त साथ डिवाइस जब तक यह आउटलेट ट्यूबिंग से बाहर बहती है पहले। डिवाइस बाँझ 1 मिनट 30 सेकंड के लिए इथेनॉल एसआईटी की अनुमति दें।
    4. फ़िल्टर की 30 मिलीलीटर लोड(0.2 माइक्रोन ताकना) म्यान बफर (फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) 0.1% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के साथ) 60 मिलीलीटर सिरिंज में और एक सिरिंज पंप पर सिरिंज सुरक्षित। सही सेटिंग्स के लिए पंप (: 60 मिलीलीटर, खंड: 60,000 μl सिरिंज आकार) सेट करें।
      नोट: पीबीएस के लिए बीएसए के अलावा सेल सेल बाध्यकारी और गैर विशिष्ट कोशिकाओं और PDMS डिवाइस के बीच बाध्यकारी को कम से कम करने के लिए है।
    5. लोड 3 मिलीलीटर सिरिंज में लेबल की कोशिकाओं के 3 मिलीलीटर और एक अलग सिरिंज पंप पर सिरिंज सुरक्षित। सही सेटिंग्स के लिए पंप (: 3 मिलीग्राम, खंड: 3,000 μl सिरिंज आकार) सेट करें।
    6. जाँच करें कि कोई हवाई बुलबुले सीरिंज में फंस रहे हैं एक स्थिर प्रवाह को सुनिश्चित करने के लिए। धीरे नोक से बाहर तरल की कुछ बूँदें बाहर खदेड़ना द्वारा किसी भी हवाई बुलबुले निकालें।
    7. सीरिंज के लिए इनलेट सिरिंज सुझावों और ट्यूबिंग कनेक्ट करें, और उन्हें डिवाइस (म्यान और नमूना इनलेट) के संबंधित inlets में डालें। सुनिश्चित करें ट्यूबिंग साथ कोई बुलबुले देखते हैं कि।
    8. एक औंधा पर उपकरणों माउंटसेल छँटाई प्रक्रिया के दौरान वास्तविक समय इमेजिंग के लिए एड चरण विपरीत माइक्रोस्कोप।
    9. एक छोटे से बेकार बीकर और दो 15 मिलीलीटर ट्यूबों खुर्दबीन मंच चिपकने का उपयोग करने पर डिवाइस के करीब सुरक्षित।
    10. आउटलेट tubings बेकार बीकर में रखें।
    11. (उदाहरण 1:10 म्यान बफर करने के लिए नमूने के लिए प्रवाह अनुपात निर्धारित और छंटनी की प्रक्रिया शुरू करने के लिए दोनों सिरिंज पंप शुरू: 120 μl / मिनट नमूना सिरिंज और 1,200 μl के लिए / मिनट म्यान सिरिंज के लिए; चैनल प्रवाह वेग ~ 0.38 मीटर / सेकंड )।
    12. 1.5 मिनट के लिए डिवाइस को चलाने के प्रवाह की दर को स्थिर करने के लिए। यह एक उच्च गति कैमरे का उपयोग चरण विपरीत साथ उज्ज्वल क्षेत्र के तहत चैनल भीतरी दीवार के पास inertially ध्यान केंद्रित कोशिकाओं की उपस्थिति से इसकी पुष्टि की जा सकती है (~ 5000 - प्रति सेकंड 10,000 फ्रेम (एफपीएस), जोखिम समय: 10-50 μsec)।
    13. अलग ट्यूबों में आउटलेट tubings स्थिति सेल आउटलेट और अपशिष्ट आउटलेट से eluents इकट्ठा करने के लिए।

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Representative Results

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जैव इमेजिंग एजेंट से भरी हुई एनपीएस के साथ रात भर कोशिकाओं लेबलिंग के बाद, लेबल की कोशिकाओं (मुक्त कणों से युक्त) काटा और डीएफएफ सर्पिल microdevice द्वारा शुद्ध एक भी कदम प्रक्रिया (चित्रा 1 ए) में मुफ्त एनपीएस को दूर करने के लिए कर रहे हैं। 2-इनलेट, 2-आउटलेट सर्पिल microchannel इंजीनियरिंग सॉफ्टवेयर द्वारा डिजाइन और SU-8 photoresist का उपयोग कर microfabricated है। नमूनों सिलिकॉन वेफर PDMS तो प्रतिकृति नरम लिथोग्राफी तकनीक (चित्रा 1 बी) का उपयोग कर ढलाई के लिए एक टेम्पलेट के रूप में प्रयोग किया जाता है। जबकि भीतरी दीवार इनलेट एक उच्च प्रवाह की दर (1:10) पर ताजा बफर समाधान सेल नमूना प्रवाह चुटकी चलाता सेल छँटाई करने के लिए, सेल नमूना सर्पिल microdevice की बाहरी दीवार इनलेट में पंप है। पृथक्करण जड़त्वीय भीतरी दीवार और बाहरी दीवार (2A चित्रा) की ओर छोटे अपार एनपीएस के डीन प्रेरित recirculation पर बड़े लेबल की कोशिकाओं का ध्यान केंद्रित करके हासिल की है। डिवाइस पहले appli थाएड फ्लोरोसेंट सिलिका एनपीएस calcein के साथ लोड से लेबल निलंबन monocytic कोशिकाओं (THP-1) सुलझाने के लिए (~ आकार में 500 एनएम)। के रूप में उच्च गति इमेजिंग (2A चित्रा) से इसकी पुष्टि की और विश्लेषण (चित्रा 2 बी) के प्रवाह cytometry उच्च जुदाई क्षमता प्राप्त किया गया। THP-1 कोशिकाओं से - (5 माइक्रोन ~ 1) से डिवाइस सेल आउटलेट एकत्र eluents की छवियाँ भी सिलिका और पीएलजीए एनपीएस के कुशल हटाने का संकेत दिया। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति इमेजिंग दिखाया लेबल THP-1 कोशिकाओं में भाँति एनपीएस में अच्छी तरह से डीएफएफ शुद्धि (insets) (चित्रा 3) के दौरान बनाए रखा गया है। एमएससी आकार विविधता की वजह से, सर्पिल microchannel ज्यामिति बाद में चैनल ऊंचाई और विभाजन डिजाइन बदलने MSCs (चित्रा 4) के कुशल संग्रह सक्षम करने के द्वारा संशोधित किया गया था।

आकृति 1
चित्रा 1 (ए) Ovनिलंबन और पक्षपाती कोशिकाओं के बाद लेबलिंग डीन प्रवाह Fractionation (डीएफएफ) microfluidic प्रौद्योगिकी का उपयोग करने से तेजी से एकल कदम सूक्ष्म / nanoparticle (एनपीएस) को हटाने के लिए erall कार्यप्रवाह। (बी) डीएफएफ सर्पिल डिवाइस इंजीनियरिंग सॉफ्टवेयर द्वारा डिजाइन और microfabrication का उपयोग कर सिलिकॉन वेफर पर नमूनों है। PDMS उपकरणों बाद में नरम लिथोग्राफी तरीके से उत्पादित कर रहे हैं। प्रायोगिक स्थापना 2 सिरिंज पंप लेबल की कोशिकाओं और निरंतर शोधन और लेबल की कोशिकाओं की वसूली के लिए डिवाइस में विभिन्न प्रवाह दरों पर ताजा खारा बफर तर करने के लिए होते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. नैनोकणों डीएफएफ के माध्यम से लेबल THP-1 कोशिकाओं से हटाने की। (ए) का चित्रणडीएफएफ जुदाई सिद्धांत। बड़ी लेबल की कोशिकाओं को मजबूत जड़त्वीय लिफ्ट बलों (एफ एल, लाल तीर) और डीन खींचें बलों (एफ डी, पीले तीर) का अनुभव है और microchannel भीतरी दीवार के पास ध्यान केंद्रित। छोटे एनपीएस और बफर समाधान पूरी तरह डीन खींचें से प्रभावित और जुदाई को प्राप्त करने के लिए बाहरी दीवार के लिए recirculate रहे हैं। प्रतिनिधि उच्च गति और THP-1 कोशिकाओं (लाल तीर) और सिलिका एनपीएस आउटलेट क्षेत्र में calcein डाई के साथ लोड के पदों संतुलन का संकेत प्रतिदीप्ति छवियों। आधारित आकार (एफएससी-ए) और विघटन (एसएससी-ए) विशेषताओं से निर्धारित gating साथ प्रवाह cytometry विश्लेषण पर (बी) के पृथक्करण प्रदर्शन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र तीन। > का लेबल THP-1 कोशिकाओं (लाल तीर) और एनपीएस हटाने दक्षता का उपयोग कर डीएफएफ। Insets संबंधित चरण अनुबंध (ऊपर) और व्यक्ति की कोशिकाओं के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी छवियों को दिखाने के शुद्ध प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें चित्रा।

चित्रा 4
चित्रा 4. नैनोकणों mesenchymal स्टेम सेल (MSCs) डीएफएफ के माध्यम से। (ए) प्रतिनिधि उच्च गति छवि कुशल अलग दुकानों में MSCs की जुदाई (लाल तीर) और पीएलजीए एनपीएस (नीले तीर) illustrating से हटाने की। पीला लाइनों microchannel दीवारों की अनुमानित स्थिति का संकेत धराशायी। (बी) के पृथक्करण सिलिका और पीएलजीए एनपीएस से MSCs का प्रदर्शन।पीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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डीएफएफ सेल शोधन तकनीक के साथ साथ वर्णित एक उच्च throughput तरीके से लेबल कोशिकाओं का तेजी से और निरंतर जुदाई में सक्षम बनाता है। इस जुदाई दृष्टिकोण बड़ा नमूना मात्रा या उच्च सेल एकाग्रता नमूना प्रसंस्करण के लिए आदर्श है, और पारंपरिक झिल्ली आधारित निस्पंदन जो बढ़ाया उपयोग के बाद clogging की संभावना है की तुलना में बेहतर है। इसी तरह, समानता आधारित चुंबकीय जुदाई अतिरिक्त सेल लेबलिंग कदम है जो श्रमसाध्य और महंगे हैं की आवश्यकता है। शुद्ध कोशिकाओं चैनल के भीतर कम निवास समय के कारण उनके लेबल एजेंटों और सेल आकृति विज्ञान अच्छी तरह से (चित्रा 3) के न्यूनतम प्रवाह / कतरनी प्रेरित प्रभाव के साथ (कतरनी तनाव τ, ~ 200-250 डाएन / 2 सेमी) बनाए रखने के लिए (दिखाए गए हैं < 1 सेकंड) 20,24। इसके अलावा, उपयोगकर्ता बस इच्छित मीडिया या बफर समाधान के साथ म्यान बफर (खारा) प्रतिस्थापन के अनुसार क्रमबद्ध लेबल की कोशिकाओं के eluted समाधान का चयन कर सकते हैं।

ऐसा नहीं है कि महत्वपूर्ण हैवहाँ कोई गंदगी या microchannel से पहले उपयोग जो प्रतिकूल सेल ध्यान केंद्रित व्यवहार को प्रभावित कर सकते में मलबे है। इस इनलेट छेद आईपीए के साथ अच्छी तरह से सफाई, साथ ही मास्किंग टेप का उपयोग प्लाज्मा संबंध पहले PDMS सतह को साफ करने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। चूंकि microdevice उच्च प्रवाह शर्तों के तहत संचालित (~ 1 - 1.5 मिलीग्राम / मिनट), यह भी महत्वपूर्ण है एक hotplate पर बंधुआ PDMS उपकरणों गर्म करने के लिए PDMS और कांच स्लाइड के बीच मजबूत संबंध सुनिश्चित करने के लिए है। डिवाइस ऑपरेशन के दौरान, यदि कोशिकाओं में अच्छी तरह से ध्यान केंद्रित नहीं कर रहे हैं, इसका मतलब है कि प्रवाह की दर पर्याप्त नहीं हैं। एक डिवाइस इनलेट क्षेत्र और सिरिंज सुझाव दिए जाँच सुनिश्चित करने के लिए कोई लीकेज देखते हैं कि से निवारण कर सकते हैं।

लेबल की कोशिकाओं से अपार एनपीएस के हटाने आम प्रयोगशाला जुदाई तकनीक (जैसे, centrifugation) के बाद से तुच्छ नहीं है नहीं कर सकते हैं अलग कणों / विभिन्न आकारों (जैसे, अपार कणों और लेबल की कोशिकाओं) की कोशिकाओं। एक यह है कि बार-बार धोने के तर्क दे सकते हैंऔर संस्कृति मीडिया के बदलते, एक निश्चित सीमा तक पक्षपाती कोशिकाओं से मुक्त एनपीएस को दूर कर सकते प्रक्रिया निलंबन सेल संस्कृतियों के लिए श्रमसाध्य और अप्रभावी है। डीएफएफ microfluidic युक्ति आकार आधारित छँटाई इस्तेमाल करता है और क्योंकि यह दोनों निलंबन और पक्षपाती कोशिकाओं के एक बड़े आकार की सीमा के साथ, साथ ही हटाने की विभिन्न सामग्रियों की एनपीएस के लिए इस्तेमाल किया जा सकता अत्यधिक बहुमुखी है। लक्ष्य कोशिकाओं विभिन्न आकार के हैं, डीएफएफ डिवाइस प्रवाह की स्थिति या चैनल ज्यामिति (जैसे, चैनल ऊंचाई और भीतरी और बाहरी चैनल चौड़ाई का अनुपात) को बदलने कुशल जुदाई को प्राप्त करने से अनुकूलित किया जा सकता। यह पहले से प्रदर्शन किया गया है डीएफएफ न्यूनतम सेल हानि के साथ एनपीएस को हटाने में पारंपरिक centrifugation की तुलना में बेहतर है। 22 इसके अलावा, सेल वसूली प्रदर्शन उच्च बनी (> 90%) जब नमूना एकाग्रता 10 7 कोशिकाओं / एमएल की वृद्धि हुई थी। यह मौजूदा जड़त्वीय microfluidic सेल जुदाई तरीकों जो सामान्य कर रहे हैं पर एक महत्वपूर्ण सुधार हैLy कारण सेल सेल बातचीत और सेल संतुलन पदों पर भीड़भाड़ के लिए 10 5 कोशिकाओं / एमएल क्षमता को सीमित कर दिया। 25

जबकि डीएफएफ प्रौद्योगिकी आकार अंतर के आधार पर जुदाई को प्राप्त होता है, यह सेल आकार में नगण्य परिवर्तन के कारण इस तरह के लेबल और लेबल हटाया गया कोशिकाओं की जुदाई के रूप में अन्य सेल इंजीनियरिंग प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। समानता के आधार पर छंटाई और अन्य आम तौर तरीकों जुदाई (चुंबकीय संवेदनशीलता और विद्युत चालकता) के लिए कोशिका की सतह मार्करों इस तरह के संभावित अनुप्रयोगों के लिए विचार किया जा सकता है। डीएफएफ तकनीक भी मल्टिप्लेक्स सेल प्रतिदीप्ति पर आधारित छँटाई के लिए उपयुक्त नहीं है। एक बेहतर विकल्प के विभिन्न प्रतिदीप्ति जो उच्च throughput पर चल रही है साथ लेबल की कोशिकाओं के एकल चरण छँटाई के लिए (FACS) छँटाई प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल का उपयोग करने के लिए हो सकता है, लेकिन महंगा और भारी उपकरणों की आवश्यकता होगी।

अंत में, इस प्रोटोकॉल इंजीनियर कोशिकाओं जब की शुद्धि के लिए अत्यधिक उपयोगी हैपरिवर्तनकारी एजेंट (वृद्धि कारक है, दवाओं, corticosteroids, आदि) युक्त एनपीएस bioimaging और / या सेल थेरेपी के लिए उपयोग किया जाता है। इसका कारण यह है बचे हुए मुक्त एनपीएस पड़ोसी कोशिकाओं या प्रतिरक्षा कोशिकाओं जब विवो में इंजेक्ट किया है कि इन विदेशी कणों का जवाब पर बंद लक्ष्य परिवर्तनकारी प्रभाव लागू कर सकते हैं। यह भी संकेत है कि अनजाने में bioimaging के दौरान गुमराह किया जा सकता उत्पन्न हो सकता है। प्रायर उपयोग करने के लिए इन मुक्त एनपीएस का हटाया जाना इस प्रकार, गैर लक्ष्य कोशिकाओं के लिए जोखिम को कम करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली में संकलन कम करने, और कोशिकाओं के अनुक्रमिक लेबलिंग / इंजीनियरिंग के दौरान कदम के बीच संक्रमण के मुद्दों को कम। इसके सफल क्रियान्वयन बहुत सेल लेबलिंग की सुविधा और चिकित्सा में कण आधारित सेल इंजीनियरिंग के हस्तक्षेप से मुक्त उपयोग के लिए सक्षम बनाता है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell lines & Media
Mesenchymal Stem Cells (MSCs) Lonza PT-2501
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) Lonza 12-614F
Fetal Bovine Serum (FBS) Gibco 10270-106
THP-1 monocyte cells (THP-1) ATCC TIB-202
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media Lonza 12-702F
Reagents & Materials
0.01% poly-L-lysine (PLL) Sigma-Aldrich P8920
3 ml Syringe BD 302113 Syringe 3 ml Luer-Lock
60 ml Syringe BD 309653 Syringe 60 ml Luer-Lock
Bovine Serum Albumin (BSA) Biowest P6154-100GR
Calcein, AM (CAM) Life Technologies C1430
Calcein Sigma-Aldrich C0875
Isopropanol Fisher Chemical #P/7507/17 HPLC Grade 2.5 L
Phosphate-Buffered Saline (PBS) Lonza 17-516Q/12
Plain Microscope Slides Fisher Scientific FIS#12-550D 75 x 25 x 1 mm3
Polydimethylsiloxane (PDMS) Dow Corning SYLGARD® 184
Scotch tape 3M 21200702044 18 mm x 25 m
Silica NPs (∼200 μm) Sigma-Aldrich 748161 Pore size 4 nm
Syringe Tip JEC Technology 7018302 23 G 0.013 x 0.25
Trypsin-EDTA (0.25%) Life Technologies 25200-056
Tygon Tubing Spectra-Teknik 06419-01 0.02 x 0.06" 100
Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) Sigma-Aldrich P2191
Equipment
Biopsy punch Harris Uni-Core 69036-15 1.50 mm
Dessicator Scienceware 111/4 IN OD
High-speed Camera Phantom  V9.1
Inverted phase-contrast microscope  Nikon Eclipse Ti
Plasma cleaner Harrick Plasma PDC-002
Syringe Pump Chemyx CX Fusion 200

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References

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हस्तक्षेप से मुक्त माइक्रो / Nanoparticle सेल इंजीनियरिंग के लिए microfluidic बफर एक्सचेंज
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Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C., Xu, C., Hou, H. W. Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering. J. Vis. Exp. (113), e54327, doi:10.3791/54327 (2016).More

Tay, H. M., Yeo, D. C., Wiraja, C., Xu, C., Hou, H. W. Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering. J. Vis. Exp. (113), e54327, doi:10.3791/54327 (2016).

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