Summary
这个协议描述了使用惯性基于微流体缓冲交换策略的纯化微/纳米工程细胞与未结合的颗粒的有效消耗。
Abstract
与活性成分载微/纳米工程细胞（NPS）正在成为一个日益流行的方法，以提高本地治疗特性，使生物成像和控制细胞表型。一个关键尚未充分解决的问题是，仍无法通过常规的离心容易地除去细胞标记后未结合颗粒的显著数目。这导致增加的生物成像的背景噪声，并且可以赋予变革效应到相邻的非靶细胞。在这个协议中，我们提出称为院长流分离（DFF）惯性微流体为基础的缓冲区交换策略，以高通量的方式免费纳米粒子标记细胞有效地分离。发达螺旋微型装置便于悬浮在新的缓冲溶液纯化的细胞（THP-1和干细胞）的连续集合（> 90％细胞回收），同时实现未结合的荧光染料或染料加载纳米粒（SIL的> 95％的耗尽ICA或PLGA）。这个单步，基于大小的细胞纯化策略使高细胞处理吞吐量（10 6个细胞/分），并且是微/纳米工程细胞大容积细胞纯化以实现无干扰的临床应用是非常有用的。
Introduction
由代理加载微/纳米颗粒（纳米颗粒）的工程细胞是一种简单的，基因组整合-自由，和通用的方法，以提高生物成像能力和增加/再生医学补充其天然的治疗性质。1-3蜂窝修改都通过标记所获得的质膜或细胞质剂加载纳米粒的过量浓度以饱和结合位点。然而，这种方法的主要缺点是留在溶液中后细胞标记过程未结合颗粒的显著数量时，其可以潜在地混淆颗粒工程细胞的精确识别或4,5-复杂化的治疗效果。此外，接触含变革纳米粒在浓度过高剂（生长因子，皮质类固醇等 ）可导致细胞毒性和误导暴露可引起对非靶细胞意想不到的后果。甚至包括o颗粒载体F“生物相容性”的材料[ 例如 ，聚（乳酸共乙醇酸），PLGA]可以煽动在某些条件下，以及有效的免疫细胞反应。6这与免疫功能受损（ 例如 ，类风湿性关节炎），其潜在的延迟个体特别危险全身纳米间隙。7因此，现有的引入颗粒的工程细胞的高效去除游离颗粒是非常重要的，以减少毒性和降低误导暴露于体内剂加载颗粒。
常规梯度离心常被用来改造的细胞从游离颗粒中分离，但是费力的和在批处理模式操作。此外，通过高速离心期间细胞和密度梯度介质可能损害细胞的完整性和/或影响细胞行为的组分经历剪切应力。8微流体是与SEV一个有吸引力的替代方案ERAL分离技术，包括确定性的横向位移（DLD）9，dieletrophoresis 10,11和acoustophoresis为小颗粒分离和缓冲交换应用开发12。然而，这些方法从低通量遭受（1-10微升·分钟- 1），并容易堵塞的问题。活性分离如基于介电电泳的方法还需要在固有的介电电泳细胞表型或其他细胞标记的步骤来实现的分离的差异。一个更有前景的方法包括惯性微流体-颗粒或细胞的横向迁移跨越简化集中在由于在高雷诺数（Re）13显性升力（F L）不同的位置由于其高流动条件和优越的尺寸分辨率。 ，它经常被利用的规模为基础的细胞分离14,15和缓冲交换应用。16-18 HoweveR，缓冲液交换性能仍然很差与~10-30％污染物的溶液，作为分离的细胞通常保持接近原始和新的缓冲液之间的边界。16-18更重要的是，靶细胞的大小分布是相似的实现精确惯性聚焦和分离从其中提出了一个问题特别是在异质大小的细胞类型，如间充质干细胞（MSC）的处理的原缓冲溶液19中
我们先前已开发出一种新的惯性微流体细胞分选技术称为迪安流分离（DFF），用于使用一个2入口，2-插座螺旋微器件隔离循环肿瘤细胞（的CTC）从全血20和细菌21。在此视频协议中，我们将描述标签的THP-1（人急性单核细胞白血病细胞系）的悬浮液单核细胞（〜15微米）和干细胞（10-30微米）用钙黄绿素-L的方法oaded纳米粒，其次是DFF螺旋微型为标记的细胞和除去未纳米粒的有效回收的制造和操作。22这种单一步骤纯化策略使标记的悬浮液，悬浮于新鲜缓冲液中没有离心粘附细胞连续恢复。此外，它可以处理高达10万个细胞·毫升-1，细胞密度为顺应再生医学应用。
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Protocol
间充质干细胞和单核细胞的纳米1.（NPS）标签
- 在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养间充质干细胞（MSCs）补充有10％胎牛血清（FBS）和抗生素，以≥80％汇合标记之前。类似地，培养的THP-1细胞（ATCC）在罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）1640培养基中补充有10％FBS的至〜10 6个细胞/ ml的密度。
- 负载二氧化硅纳米粒子（〜500微米）用搅拌一夜钙黄绿素染料溶液（200微米）。制造使用前述协议PLGA-AM钙黄绿素（CAM）。22
- 溶解250微克的CAM和100mg PLGA（50:50）的氯仿，在4℃。
- 生成在室温下使用高速均化器（13600 XG，60秒）的单乳剂纳米粒。使用离心分离（3400×g离心5分钟），洗涤（双分销商蒸发在收集之前的化学罩（≥3小时）的氯仿LLED水），冷冻干燥和储存于-20℃。
- 孵育CAM-PLGA纳米颗粒（1毫克），或钙黄绿素的二氧化硅纳米粒子（150微克）在0.01％聚-L-赖氨酸（PLL），在室温下溶液15 - 20分钟。
- 离心机在3400×g离心5分钟以在1毫升各自培养基的纳米颗粒再悬浮之前除去过量的PLL上清液。
- 孵育细胞（MSC或THP-1，〜1 - 2×10 6个细胞在总）的纳米颗粒约24小时（0.1毫克·毫升-1贴标浓度）。
- 分离并收获使用2毫升0.25％胰蛋白酶（5分钟，37℃）的标记的粘附MSC和用6ml DMEM中淬灭。在细胞（1000 xg离心，4分钟），并悬浮降速至10 5的浓度- 10 6个细胞/毫升的微流体的处理。使用标记的THP-1细胞（10月5日至10月6日细胞/ ml）直接用于微流体的净化。
2.微流体器件的制备
- 器件制造
- 制造微流体螺旋装置（500微米（W）×115微米（h））进行与来自使用标准软光刻步骤的商业试剂盒聚二甲基硅氧烷（PDMS）。23
- 拌30 G碱基预聚物和3克在称量舟彻底固化剂。解气体中60分钟的干燥器将混合物以除去任何气泡。
- 倒入PDMS混合到与螺旋通道设计图案的硅片模具师傅细心的〜5的高度 - 10mm以下。
- 解气体在干燥器真空60分钟将混合物再次以除去任何气泡。重复这个过程，直到所有的气泡被淘汰。
- 固化在80℃的炉中的PDMS混合物2小时，直到PDMS被设置。确保在晶片的固化具有恒定装置高度期间不倾斜。
- 剪下用手术刀PDMS螺旋装置并小心剥离从母模的PDMS板。
- TR即时通讯装置的边缘用手术刀以确保表面平滑以便键合。
- 冲床入口两个孔（1.5毫米），两洞（1.5 mm）适用使用1.5毫米活检冲床的PDMS设备上的插座。
- 用异丙醇（IPA）冲洗设备以除去任何碎片和干燥设备在80℃的烘箱中5分钟。
- 清洁使用胶带将PDMS设备（与通道功能）的底面。
- 用遮蔽胶带的载玻片（2“3”）的清洁一侧。
- 小心放置和暴露PDMS设备和载玻片的清理过的表面在等离子体清洁器的腔室，并使其受到真空60秒。接下来，打开等离子最大功率，直到室变成了粉红色的颜色降低室内的压力。
- 暴露表面以空气等离子体60秒。当进入物理等离子体创建的PDMS和玻璃使紧粘结的暴露表面上反应性物质人接触。关闭等离子体功率和释放来自等离子体清洁器的压力来检索设备和载玻片。
- 通过紧紧按压暴露于等离子体的表面，并确保没有气泡被困在两个表面之间粘合的PDMS设备和载玻片在一起。
- 加热使用加热板2小时设定在80℃，以加强键合的键合设备。
- 设备操作
- 油管切割两片（1.52毫米外径）的约15 - 20厘米对进口注射器和每个管子的一端固定一个注射器尖端（表23）。
- 切管两片（1.52毫米外径）的〜5 - - 10厘米为网点和附加到PDMS设备的出口孔。
- 事先，直到其流出的出口管的样品运行，手动素用含70％乙醇的注射器设备。允许乙醇坐30秒至1分钟来灭菌装置。
- 负载30毫升过滤（0.2微米孔径）鞘缓冲液（磷酸盐缓冲盐水（PBS）中含有0.1％牛血清白蛋白（BSA））转换成60毫升注射器和固定在注射器泵的注射器。将泵的正确设置（注射器尺寸：60毫升，容量60,000微升）。
注：加入的BSA的PBS中是最小化的细胞 - 细胞的结合和非特异性细胞和PDMS设备之间的结合。 - 负载3毫升标记细胞进3毫升注射器并固定在一个单独的注射泵的注射器。将泵的正确设置（注射器尺寸：3毫升，体积：3000微升）。
- 检查没有气泡被截留在注射器以确保稳定的流动。轻轻喷射液体滴出，喷嘴去除气泡。
- 入口注射器提示和管路连接到注射器，并把它们插入到设备（鞘和样品入口）各自的入口。保证有沿管子无气泡。
- 安装设备到一个反转在细胞分选过程中编相位差显微镜即时成像。
- 安全小烧杯浪费和两个15毫升管靠近设备上使用粘合剂的显微镜阶段。
- 放置出口管路进入废物烧杯中。
- 对样品鞘缓冲流动比率设置为1:10并同时启动注射泵启动排序过程（例如：120微升/ min的样品注射器和1200微升/ min的护套的注射器;渠道流速〜0.38米/秒）。
- 运行设备1.5分钟的流量稳定。这可以通过在明场通道内壁附近惯性聚焦细胞存在相衬使用高速摄像机进行确认（5000〜 - 每10,000个帧（fps），曝光时间：10-50微秒）。
- 定位的出口管路成不同的管，以从细胞出口和废弃物出口收集洗脱液。
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Representative Results
标记与生物显像剂装载纳米粒过夜细胞后，将标记的细胞（含有自由粒子）收获并通过DFF螺旋微型纯化以除去游离的NP在单一步骤的过程（ 图1A）。该2入口，2出口螺旋微通道是由工程软件设计和使用微制造SU-8光刻胶。然后将图案化的硅晶片被用作用于使用软光刻技术（ 图1B）的PDMS复制品成型的模板。来执行细胞分选，而内壁入口运行在一个较高的流速（1:10）的新鲜缓冲溶液捏细胞样品流动细胞样品泵入螺旋微型装置的外壁的入口。分离是通过惯性聚焦较大标记的细胞在内壁和朝向外壁（ 图2A）小未结合的纳米粒子的迪安-引起的回流来实现。该器件是第一APPLI编辑从装有荧光钙黄绿素纳米颗粒二氧化硅悬浮标记细胞的单核细胞（THP-1）进行排序（〜大小500纳米）。通过高速摄像（ 图2A），为确认和流式细胞术分析（ 图2B），获得较高的分离效率。从设备细胞出口收集洗脱液的图像还表明有效地除去二氧化硅和PLGA纳米颗粒 - 从THP-1细胞（〜1 5微米）。此外，荧光成像显示，在标记的THP-1细胞内化的NP DFF纯化（插图）（ 图3）中被很好地保留。因为MSC大小异质性，螺旋微通道的几何形状随后通过改变通道的高度和分岔设计，以使干细胞（ 图4）的有效收集改性。
图1（A）OVerall工作流程，利用院长流分离（DFF）微流控技术的悬架和贴壁细胞后快速标签单步微/纳米粒子（NPS）的去除。 （B）中的DFF螺旋装置由工程软件设计并使用微加工的硅晶片上形成图案。 PDMS设备由软光刻方法以后产生。实验装置由2个注射泵注入标记细胞在不同的流量转化为持续的净化和标记细胞的采集设备的新鲜生理盐水缓冲液中。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 纳米粉体通过DFF标记THP-1细胞去除。（A）的插图DFF分离原理。较大的标记细胞出现强劲的惯性升力（F L，红色箭头）和Dean阻力（F D，黄色箭头），并专注于微通道内壁附近。较小的纳米粒和缓冲溶液仅受迪安阻力和再循环到外壁达到分离。代表性的高速和表示THP-1细胞（红色箭头）和二氧化硅纳米粒子在出口区域装载有钙黄绿素染料的平衡位置的荧光图像。基于流式细胞术通过门控大小（FSC-A）和粒度（SSC-A）特性所决定的分析（B）的分离性能。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3。
图4.从纳米粒子间充质干细胞（MSCs）通过DFF。（A）代表高速图像说明干细胞的有效分离（红色箭头）和PLGA纳米粒（蓝色箭头）到不同网点的去除 。黄色虚线指示微通道壁的大致位置。 （B）分离干细胞从二氧化硅和PLGA纳米粒性能。PG“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文所描述的DFF细胞纯化技术使以高通量的方式标记的细胞的快速和连续分离。这种分离方法非常适合于大样本容量或高浓度的细胞样本处理，比传统的基于膜过滤是容易长时间使用后堵塞更好。同样，基于亲和力的磁选需要这是费力又昂贵的附加细胞标记的步骤。纯化的细胞被示为在通道内保持它们的标记，由于停留时间短剂和细胞形态以及（ 图3）以最小流量/剪切诱导的作用（剪切应力τ，〜200-250达因/厘米2）（< 1秒）20,24。此外，用户可以通过简单地代与所需介质或缓冲溶液鞘缓冲液（盐水）选择排序标记的细胞的洗脱溶液中。
这是至关重要的有一个在微通道之前使用它可以细胞集中行为产生不利的影响没有灰尘或碎屑。这可以通过彻底用IPA清洗入口孔，以及使用掩蔽胶带清洁等离子体接合之前与PDMS表面来实现。由于微型高流量条件下运行（〜1 - 1.5毫升/分钟），它也是重要的加热在电炉上键合的PDMS装置，确保与PDMS和载玻片之间的强粘接。在器件操作中，如果细胞不聚焦良好，这意味着流率是不充分的。人们可以通过检查设备的入口区域和注射器提示，以确保没有泄漏故障排除。
从标记细胞绑定纳米粒子的去除是不是因为常见的实验室分离技术（如离心）琐碎不能单独颗粒/不同大小（ 例如，未结合的颗粒和标记细胞）细胞。尽管人们可以争辩说，反复清洗和培养基的变化可以去除从贴壁细胞游离纳米颗粒在一定程度上，这个过程是费力的和无效的悬浮细胞培养物。该DFF微流体装置利用基于大小的排序和是高度通用的，因为它可以同时用于悬浮和贴壁细胞具有大尺寸范围，以及去除不同的材料的NP的。如果靶细胞是不同的尺寸，所述DFF设备可以通过改变流动条件或通道几何结构（ 例如，通道高度以及内和外通道宽度的比率），以实现有效的分离进行优化。先前已表明，相比于在纳米粒子除去具有最小细胞损失常规离心DFF优越。22此外，细胞恢复性能仍然很高（> 90％）时的样品浓度增加到10 7个细胞/ ml。这是在现有的惯性微流体细胞分离方法这是一般的关键改进LY限于10 5个细胞/毫升容量由于细胞-细胞相互作用和细胞在平衡位置过分拥挤。25
而DFF技术实现基于大小差异的分离，它不能被用于其它细胞工程方法如标记和未标记的细胞的分离，由于在小区大小可忽略的变化。对于基于亲和力的排序和其它常用的分离方式（磁化率和导电率）的细胞表面标记物，可考虑这样的潜在的应用。 DFF技术也并不适合基于荧光多路复用细胞分选。一个更好的选择是使用荧光激活细胞为标记的细胞与在高吞吐量操作不同的荧光的单步排序分选（FACS），但需要昂贵和笨重的设备。
最后，该协议是用于工程细胞时的纯化是非常有用的含变革剂（生长因子，药物，皮质类固醇等 ）纳米粒子被用于生物成像和/或细胞疗法。这是因为残留的NP自由能发挥上， 在体内注射时对这些外来颗粒响应邻近细胞或免疫细胞脱靶变革效应。它也可能会无意中产生信号生物成像过程中可能会产生误导。之前使用这些游离纳米粒子的除去从而风险降低到非靶细胞，最小化在免疫系统汇编，并减少细胞的连续标记/工程中的步骤之间的污染的问题。其成功的实施大大方便细胞标记，使在治疗基于粒子细胞工程的无干扰的使用情况。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
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