Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung eines Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie zu Mikro- / Nanopartikel manipulierten Zellen mit einer effizienten Abbau von nicht gebundenen Partikel zu reinigen.
Abstract
Engineering-Zellen, die mit wirkstoffbeladenen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist ein zunehmend beliebte Methode nativen therapeutischen Eigenschaften zu verbessern, Bio-Bildgebung ermöglichen und Zell-Phänotyp steuern. Eine kritische noch unzureichend angesprochen Problem ist die beträchtliche Anzahl von Teilchen, die nach der Zellmarkierungs ungebunden bleiben, die nicht leicht durch herkömmliche Zentrifugation entfernt werden kann. Dies führt zu einer Erhöhung der bio Abbildungshintergrundrauschen und transformierende Wirkung auf benachbarte Nicht-Zielzellen vermitteln. In diesem Protokoll präsentieren wir ein Trägheits Mikrofluidik-basierten Pufferaustausch Strategie bezeichnet als Dean Flow Fractionation (DFF), um effizient markierten Zellen von freien Nanopartikeln in einem hohen Durchsatz Weise trennen. Die entwickelte Spiralmikrovorrichtung ermöglicht eine kontinuierliche Sammlung (> 90% Zell recovery) von gereinigten Zellen (THP-1 und MSCs) in neue Pufferlösung suspendiert, während> 95% Abreicherung von ungebundenen Fluoreszenzfarbstoff zu erreichen oder farbstoffbeladenen NPs (silica oder PLGA). Dieses einstufige, größenbasierte Zellreinigungsstrategie ermöglicht hohe Zellverarbeitungsdurchsatz (10 6 Zellen / min) und ist sehr nützlich für die großvolumige Zelle Reinigung von Mikro- / Nanopartikel - Zellen entwickelt , störungsfreie klinische Anwendung zu erzielen.
Introduction
Zellen , die durch agenten geladen Mikro- / Nanopartikel (NPs) ist eine einfache, genomische Integration frei und vielseitige Methode zur Bioimaging - Fähigkeit zu verbessern und zu erweitern / Ergänzung seiner nativen therapeutischen Eigenschaften in der regenerativen Medizin - Engineering. 1-3 Cellular Modifikationen erreicht werden durch die Kennzeichnung Plasmamembran oder Zytoplasma mit einem Überschuss Konzentration des Mittels belasteten NPs die Bindungsstellen zu sättigen. Jedoch ist ein Hauptnachteil dieses Verfahrens , die signifikante Mengen an ungebundenen Partikel in Lösung verbleibt nach dem Zellmarkierungsverfahren, die möglicherweise eine genaue Identifizierung von partikel manipulierten Zellen vermengen können oder therapeutische Ergebnisse erschweren. 4,5 Zusätzlich Exposition gegen NPs enthält transformierende Mittel (Wachstumsfaktoren, Kortikosteroide, etc.) bei zu hoher Konzentration kann Zytotoxizität und misdirected Exposition verursachen unerwünschte Folgen auf nicht-Zielzellen induzieren kann. partikuläre Träger Selbst umfassend of "biokompatibel" Materialien [zB Poly (milch co-Glykolsäure), PLGA] kann auch potente Immunzell - Reaktionen unter bestimmten Bedingungen anstiften. 6 Dieses bei Personen mit eingeschränkter Immunität besonders riskant ist (zB rheumatoide Arthritis) , die möglicherweise Verzögerungen systemische Clearance Nanopartikels. 7 somit effiziente Entfernung von freien Teilchen vor der Einführung des partikel manipulierten Zellen ist von großer Bedeutung Toxizitätsprofil zu minimieren und misdirected Exposition gegenSubstanz beladenen Partikel in vivo reduzieren.
Herkömmliche Gradientenzentrifugation wird oft zu trennen manipulierten Zellen von freien Teilchen verwendet, ist aber umständlich und im Batch-Modus betrieben werden. Darüber hinaus kann durch Zellen erfahrenen Scherspannungen während des hochtourigen Zentrifugation und die Bestandteile des Dichtegradientenmedium kompromittieren Integrität Zelle und / oder Beeinflussung des Zellverhaltens. 8 Microfluidics ist eine attraktive Alternative mit sevrere Trenntechnologien einschließlich deterministische seitliche Verschiebung (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 und acoustophoresis 12 kleine Partikel Trennung und Pufferaustausch - Anwendungen entwickelt wurde. Jedoch leiden diese Methoden von geringem Durchsatz (1-10 & mgr; l · min - 1) und sind anfällig für Probleme zu verstopfen. Aktive Trennungen wie Dielektrophorese-basierten Verfahren benötigen auch Unterschiede in der intrinsischen dielektrophoretischen Zellphänotypen oder zusätzliche Zellmarkierungsschritte zur Trennung erzielen. Ein vielversprechender Ansatz beinhaltet Trägheits Mikrofluidik - die seitliche Wanderung der Partikel oder Zellen über rationalisiert an bestimmten Positionen durch dominante Auftriebskräfte (F L) bei hohen Reynolds - Zahl (Re) 13 Aufgrund der hohen Strömungsverhältnisse und überlegene Größe Auflösung zu konzentrieren. ist es oft für größenbasierte Zellseparation 14,15 und Pufferaustausch - Anwendungen genutzt werden . 16-18 However, Pufferaustauschleistung bleibt mit ~10-30% Verunreinigung Lösung schlecht wie die getrennten Zellen in der Regel zwischen ursprünglichen und neuen Pufferlösungen an die Grenze dicht bleiben. 16-18 Noch wichtiger ist , hat auf die Größenverteilung von Zielzellen ähnlich sein zu erreichen , präzise Trägheits Fokussierung und Trennung von der ursprünglichen Pufferlösung , die ein Problem insbesondere bei der Verarbeitung von heterogenen großen Zelltypen wie mesenchymalen Stammzellen (MSCs) darstellt. 19
Wir haben bereits eine neue Trägheits Mikrofluidik Zellsortierung Technik bezeichnet Dean Flow Fractionation (DFF) zur Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) 20 und Bakterien 21 aus Vollblut unter Verwendung eines 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanalgerät entwickelt. In diesem Video-Protokoll, werden wir den Prozess der Etikettierung THP-1 (humane akute monozytäre Leukämie-Zelllinie) Suspension monozytären Zellen (~ 15 & mgr; m) und MSCs (10-30 & mgr; m) mit Calcein-l beschreibenoaded NPs, gefolgt von der Herstellung und dem Betrieb der DFF Spiralmikrovorrichtung zur effizienten Rückgewinnung von markierten Zellen und das Entfernen von ungebundenem NPs. 22 Diese einstufigen Reinigungsstrategie ermöglicht eine kontinuierliche Rückgewinnung von markiertem Suspension und haft in frische Pufferlösung ohne Zentrifugation suspendierten Zellen. Darüber hinaus kann es bis zu 10 Millionen Zellen verarbeiten · ml -1, eine Zelldichte zugänglich für die regenerative Medizin - Anwendungen.
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Protocol
1. Nanopartikel (NPs) Kennzeichnung von mesenchymalen Stammzellen und Monozyten
- Kultur von mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) vor der Markierung mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) und Antibiotika zu ≥80% Konfluenz ergänzt. Ähnlich Kultur THP-1 - Zellen (ATCC) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 - Medium mit 10% FBS auf eine Dichte von ~ 10 6 Zellen / ml ergänzt.
- Last Silica-Nanopartikel (~ 500 & mgr; m) mit Calceinfarbstoff-Lösung (200 & mgr; M) über Nacht Rühren mit. Fabrizieren PLGA-Calcein AM (CAM) mit einem Protokoll zuvor beschrieben. 22
- Man löst 250 ug CAM und 100 mg PLGA (50:50) in Chloroform bei 4 ° C.
- Generieren Sie einzelne NPs Emulsion, die eine High-Speed-Homogenisator (13.600 · g, 60 sec) bei Raumtemperatur. Man dampft das Chloroform in einer chemischen Haube (≥3 hr) vor Sammlung mit Zentrifugation (3.400 × g für 5 min), Waschen (Doppel distiWasser gefüllt), Gefriertrocknung und Lagerung bei -20 ° C.
- CAM-PLGA NPs (1 mg) oder Calcein Siliciumdioxid NPs (150 ug) in 0,01% Poly-L-Lysin (PLL) Lösung bei Raumtemperatur inkubieren 15 - 20 min.
- Zentrifuge bei 3.400 xg für 5 min überschüssige PLL Überstand vor NPs Resuspension in 1 ml der jeweiligen Kulturmedium zu entfernen.
- Inkubieren der NPs mit Zellen (MSCs oder THP-1, ~ 1 - 2 mal 10 6 Zellen insgesamt) für etwa 24 Stunden (0,1 mg · ml -1 Markierungskonzentration).
- Dissoziieren und Ernte der markierten anhaftende MSCs unter Verwendung von 2 ml von 0,25% Trypsin (5 min, 37 ° C) und Abschrecken mit 6 ml DMEM. Drehen , um die Zellen bei (1000 xg, 4 min) und resuspendieren zu einer Konzentration von 10 5 - 10 6 Zellen / ml für mikrofluidische Verarbeitung. Verwenden Sie markierten THP-1 - Zellen (10. Mai - 10. JUNI Zellen / ml) direkt für die Mikrofluidik Reinigung.
2. Mikrofluidik-Vorrichtung Vorbereitung
- Vorrichtung Fabrication
- Fabrizieren die mikrofluidische Spiraleinrichtung (500 & mgr; m (w) × 115 & mgr; m (h)) mit Polydimethylsiloxan (PDMS) von einem kommerziellen Kit unter Verwendung von Standard weichen Lithographieschritte. 23
- Mischen Sie 30 g Base Prepolymers und 3 g Mittel gründlich in einem Wägeschiffchen aushärtet. De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator für 60 Minuten alle Luftblasen zu entfernen.
- Gießen Sie die PDMS-Mischung auf den Siliziumwafer Masterform mit dem spiralförmigen Kanal Design strukturiert sorgfältig zu einer Höhe von ~ von 5 bis 10 mm.
- De-Gas das Gemisch in einem Exsikkator Vakuum erneut 60 min alle Luftblasen zu entfernen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Blasen beseitigt werden.
- Härten des PDMS-Mischung in einem Ofen bei 80ºC für 2 Stunden, bis das PDMS eingestellt ist. Sicherstellen, dass der Wafer nicht während der Aushärtung haben eine konstante Bauhöhe gekippt wird.
- Schneiden Sie die PDMS-Spirale Gerät mit einem Skalpell und vorsichtig schälen die PDMS-Platte aus der Urform.
- Trim, die Kanten der Vorrichtung mit einem Skalpell zum Bonden glatte Oberfläche zu gewährleisten.
- Stanzen zwei Löcher (1,5 mm) für die Einlässe und zwei Löcher (1,5 mm) für die Auslässe auf der PDMS-Gerät mit einem 1,5 mm-Biopsie Tanze verwendet wird.
- Waschen Sie das Gerät mit Isopropanol (IPA) alle Ablagerungen zu entfernen und das Gerät in einem 80 ° C Ofen für 5 Minuten trocknen lassen.
- Reinigen Sie die Bodenfläche der PDMS-Gerät (mit Kanalfunktionen) unter Verwendung von Klebeband.
- Sauber einer Seite eines Glasobjektträger (2 "von 3") unter Verwendung von Klebeband.
- Vorsichtig legen und die gereinigten Oberflächen der PDMS-Gerät und Glasträger in der Kammer eines Plasmareiniger aussetzen und unterziehen sie für 60 Sekunden Vakuum. Als nächstes schalten Sie die Plasmaleistung auf Maximum und den Kammerdruck zu senken, bis die Kammer rosa Farbe dreht.
- Expose die Oberflächen Luftplasma für 60 Sekunden. Das Plasma erzeugt reaktive Spezies auf den freiliegenden Oberflächen der PDMS und Glas, die feste Bindung ermöglicht, wenn sie in Physic gebrachtal Kontakt. Schalten Sie den Plasma-Gerät aus und lassen Sie den Druck aus dem Plasma-Reiniger das Gerät und Glasträger abzurufen.
- Bond, die PDMS-Gerät und Glasobjektträger zusammen mit dem Plasma ausgesetzten Oberflächen fest gedrückt und sicherzustellen, dass keine Luftblasen zwischen den beiden Oberflächen gefangen sind.
- Erhitzen Sie das gebundene Gerät eine Heizplatte eingestellt bei 80 ° C für 2 Stunden mit der Bindung zu stärken.
- Gerätebetrieb
- Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 15 bis 20 cm für die Einlass- Spritzen und Befestigen einer Spritzenspitze (Gauge 23) an einem Ende jedes Schlauch.
- Geschnitten, um zwei Schlauchstücke (1,52 mm OD) von ca. 5 - 10 cm für die Auslässe und heften sich an den Austrittsöffnungen des PDMS-Gerät.
- Vor Laufen zu probieren, das Gerät manuell prime mit einer Spritze 70% Ethanol enthält, bis sie aus dem Ablaufschlauch fließt. Ermöglichen das Ethanol sit für 30 sec bis 1 min, das Gerät zu sterilisieren.
- Last 30 ml gefilterter(0,2 um Poren) Mantel-Puffer (Phosphat-gepufferte Saline (PBS) mit 0,1% Rinderserumalbumin (BSA)) in die 60 ml-Spritze und sichern die Spritze auf Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 60 ml, Volumen: 60.000 ul).
Anmerkung: Die Zugabe von BSA zu PBS ist Zell-Zell-Bindung und unspezifischer zwischen Zellen und der PDMS-Gerät Bindung zu minimieren. - Last 3 ml der markierten Zellen in die 3-ml-Spritze und sichern Sie die Spritze auf einem separaten Spritzenpumpe. Stellen Sie die Pumpe auf die richtigen Einstellungen (Spritzengröße: 3 ml, Volumen: 3000 ul).
- Überprüfen Sie, dass keine Luftblasen in den Spritzen gefangen sind, eine stabile Strömung zu gewährleisten. Entfernen Sie alle Luftblasen durch vorsichtiges paar Tropfen Flüssigkeit Ausstoßen aus der Düse.
- Schließen Sie die Einlass Spritze Spitzen und Schläuche an die Spritzen und fügen Sie sie in die jeweiligen Einlässe der Vorrichtung (Hülle und Probeneingang). Stellen Sie sicher, dass es keine Blasen entlang dem Schlauch sind.
- Montieren Sie die Geräte auf einen Inverted Phasenkontrastmikroskop für die Echtzeitbildgebung während der Zellsortierprozess.
- Sichern Sie sich einen kleinen Abfallbecher und zwei 15-ml-Röhrchen bei dem Gerät auf dem Mikroskoptisch unter Verwendung von Klebstoffen.
- Die Austrittsschläuche in den Abfallbecher.
- Stellen Sie den Stromverhältnis für die Probe zu Hülle Puffer bis 1:10 und starten die beiden Spritzenpumpen den Sortierprozess zu initiieren (Beispiel: 120 ml / min für die Probenspritze und 1200 ml / min für die Hülle Spritze; Kanalströmungsgeschwindigkeit ~ 0,38 m / sec ).
- Führen Sie das Gerät für 1,5 min für die Strömungsgeschwindigkeit zu stabilisieren. Dies kann durch die Anwesenheit von inertially fokussierten Zellen in der Nähe der Kanalinnenwand unter Hellfeld mit Phasenkontrast mit einer Hochgeschwindigkeitskamera (-: 10-50 us 10.000 Frames pro Sekunde (fps), Belichtungszeit ~ 5000) bestätigt werden.
- Positionieren Sie die Austrittsschläuche in verschiedene Röhrchen, die die Eluenten aus der Zelle Auslass und Abfallausgang zu sammeln.
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Representative Results
Nach der Markierung NPs die Zellen mit Bio - Bildgebungsmittel beladene über Nacht, die markierten Zellen (die freie Teilchen) werden geerntet und gereinigt durch DFF Spirale Mikroeinrichtung zum freien NPs in einem einstufigen Verfahren (1A) zu entfernen. Der 2-Eingang, 2-Auslass Spiralmikrokanal wird durch Engineering-Software entwickelt und mikro Su-8 verwenden. Die strukturierte Silizium - Wafer wird dann als Vorlage für die PDMS Replik Formen mit weichen Lithographietechniken (1B) verwendet. Zur Zellsortierung durchzuführen, wird die Zellprobe in die Außenwand Einlasses des Spiralmikrovorrichtung gepumpt, während die Innenwand Einlass läuft frische Pufferlösung mit einer höheren Strömungsrate (1:10), um die Zellprobe Strömungs einzuklemmen. Die Trennung wird erreicht durch Trägheits an der Innenwand und Dean-induzierte Rezirkulation von kleinen ungebundenen NPs in Richtung der äußeren Wand (2A) größeren markierten Zellen konzentriert. Das Gerät wurde zum ersten Mal Anwened an monozytäre Zellen (THP-1) von fluoreszierend markierten Kieselsäure NPs sortieren Suspension beladen mit Calcein (~ 500 nm groß). Hohe Abscheidegrade wurden durch Hochgeschwindigkeits - Bildgebung (2A) und Durchflusszytometrie - Analyse (2B) bestätigt erhalten. Bilder von Eluenten von Vorrichtungszelle Auslass gesammelt zeigte auch eine effiziente Entfernung von Kieselsäure und PLGA-Nanopartikel (~ 1 bis 5 & mgr; m) von THP-1-Zellen. Darüber hinaus zeigte Fluoreszenz - Bildgebung , dass internalisierte NPs in den markierten THP-1 - Zellen wurden auch während der DFF - Reinigung (Einschübe) (Abbildung 3) beibehalten. Aufgrund der MSC Grßenheterogenität wurde die spiral Mikrokanalgeometrie anschließend durch Ändern der Kanalhöhe und Bifurkation Entwurf modifiziert , um eine effiziente Sammlung von MSCs (Abbildung 4) ermöglichen.
Abbildung 1. (A) Overall Workflow für schnelle einstufige Mikro- / Nanopartikel (NPs) Entfernung aus Suspension und anhaftenden Zellen nach der Markierung mit Dean Flow Fractionation (DFF) mikrofluidischen Technologie. (B) Die DFF Spiral Gerät wird von Engineering - Software und strukturiert auf Silizium - Wafer unter Verwendung von Mikrofabrikations entworfen. PDMS-Geräte werden anschließend durch weiche Lithographieverfahren erzeugt. Versuchsaufbau besteht aus zwei Spritzenpumpen markierten Zellen und frische Salzpuffer bei unterschiedlichen Strömungsgeschwindigkeiten in die Vorrichtung zur kontinuierlichen Reinigung und Sammlung von markierten Zellen ziehen lassen. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Nanopartikel Entfernung von markierten THP-1 - Zellen über DFF. (A) AbbildungDFF Trennprinzip. Größere markierten Zellen erleben starke Trägheitsauftriebskräfte (F L, rote Pfeile) und Dean Widerstandskräfte (F D, gelbe Pfeile) und konzentrieren sich in der Nähe der Mikrokanalinnenwand. Kleinere NPs und Pufferlösung allein durch Dean drag beeinflusst und an der Außenwand rezirkulieren Trennung zu erreichen. Repräsentative hoher Geschwindigkeit und Fluoreszenzbilder anzeigt, Gleichgewichtspositionen von THP-1-Zellen (rote Pfeile) und Silica-Nanopartikel, beladen mit Calceinfarbstoff am Austrittsbereich. (B) Trennleistung basierend auf der Durchflusszytometrie - Analyse mit nach Größe bestimmt Gating (FSC-A) und Granularität (SSC-A) Eigenschaften. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3.
Abbildung 4. Nanopartikel Entnahme aus mesenchymalen Stammzellen (MSCs) über DFF. (A) Repräsentative Hochgeschwindigkeits - Bild illustriert eine effiziente Trennung von MSCs (rote Pfeile) und PLGA - NPs (blaue Pfeile) in verschiedene Steckdosen. Yellow gestrichelten Linien die ungefähre Position der Mikrokanalwände an. (B) Trennleistung von MSCs aus Siliciumdioxid und PLGA - NPs.pg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das DFF Zellreinigung hier beschriebene Technologie ermöglicht eine schnelle und kontinuierliche Trennung der markierten Zellen in einem Hochdurchsatz Weise. Diese Trennung Ansatz ist ideal für große Probenvolumen oder hohe Zellkonzentration Probenverarbeitung und ist besser als herkömmliche Membranbasis Filtration, die zu einer Verstopfung nach längerem Gebrauch anfällig ist. In ähnlicher Weise Affinität basierende magnetische Trennung erfordert eine zusätzliche Markierung von Zellen Schritte, die aufwendig und teuer sind. Die gereinigten Zellen werden gezeigt , um ihre markierten Mitteln und Zellmorphologie beibehalten gut (3) mit minimaler Strömungs / Scherung induzierten Effekte (Scherspannung τ ~ 200-250 dyne / cm 2) aufgrund der kurzen Verweilzeit innerhalb des Kanals (< 1 sec) 20,24. Darüber hinaus kann der Benutzer die eluierte Lösung der sortierten markierten Zellen durch einfaches Substituieren des Mantelpuffer (Kochsalzlösung) mit den gewünschten Medien oder Pufferlösung wählen.
Es ist wichtig, dasses gibt keinen Schmutz oder Ablagerungen in den Mikrokanal vor Gebrauch die Zelle Fokussierungsverhalten negativ beeinflussen können. Dies kann durch Reinigen der Einlasslöcher gründlich mit IPA, sowie unter Verwendung von Abdeckband zum Reinigen der PDMS-Oberfläche vor der Plasma Bonden erreicht werden. Da die Mikrovorrichtung unter hohen Strömungsbedingungen arbeitet (~ 1 bis 1,5 ml / min), ist es auch wichtig, die gebundenen PDMS Vorrichtungen auf einer Heizplatte zu erwärmen, eine starke Bindung zwischen den PDMS und dem Glasträger zu gewährleisten. Bei der Gerätebetrieb, wenn die Zellen nicht gut konzentrieren, bedeutet dies, dass die Strömungsgeschwindigkeiten nicht ausreichend sind. Man kann durch Prüfen der Geräteeintrittsbereich zu beheben und die Spritze Tipps, um sicherzustellen, dass es keine Lecks gibt.
Das Entfernen von ungebundenen Nanopartikeln aus markierten Zellen ist nicht trivial , da gemeinsame Labortrenntechniken (zB Zentrifugation) nicht trennen kann Partikel / Zellen unterschiedlicher Größe (zB ungebundene Partikel und markierte Zellen). Während man kann, dass wiederholtes Waschen argumentierenund der Kulturmedien zu ändern können freie NPs von anhaftenden Zellen in einem gewissen Ausmaß zu entfernen, das Verfahren ist mühsam und ineffektiv für Suspensionszellkulturen. Das DFF mikrofluidischen Vorrichtung verwendet größenbasierte Sortier- und ist sehr vielseitig, da es sowohl für Suspensions- und adhärente Zellen mit einem großen Grßenbereich verwendet werden können, sowie die Entfernung von NPs unterschiedlicher Materialien. Wenn die Zielzellen in verschiedenen Größen sind, kann die DFF Vorrichtung durch Änderung der Strömungsverhältnisse oder Kanalgeometrie (beispielsweise Kanalhöhe und dem Verhältnis der inneren und äußeren Kanalbreiten) optimiert werden , um eine effiziente Trennung zu erzielen. Es wurde bereits gezeigt , dass DFF überlegen ist im Vergleich zu herkömmlichen Zentrifugation in NPs Entfernung mit minimalem Zellverlust. 22 Des weiteren Erholung der Zellen Leistung hoch blieb (> 90%) , wenn die Probenkonzentration wurde auf 10 7 Zellen / ml erhöht. Dies ist eine wichtige Verbesserung gegenüber bestehenden Trägheits mikrofluidischen Zelltrennungsverfahren, die allgemein sindbis 10 & sup5 ; Zellen / ml Kapazität durch Zell-Zell - Interaktion und Zellüberfüllung an Gleichgewichtspositionen ly begrenzt. 25
Während die DFF-Technologie Trennung auf Größenunterschied erreicht basiert, kann sie nicht für andere Zell Engineering-Prozesse verwendet werden, wie beispielsweise Trennung von markierten und unmarkierten Zellen aufgrund vernachlässigbare Veränderung in der Zellgröße. Zelloberflächenmarker für Affinitäts-Sortier- und andere gemeinsame Trennung Modalitäten (magnetische Suszeptibilität und elektrische Leitfähigkeit) könnte für eine solche mögliche Anwendungen in Betracht gezogen werden. DFF-Technologie ist auch nicht geeignet für Multiplex-Zellsortierung basierend auf Fluoreszenz. Eine bessere Option wäre fluorescence activated cell verwenden (FACS) Sortieranlage für einstufige Sortieren von markierten Zellen mit unterschiedlichen Fluoreszenz, die bei hohem Durchsatz arbeitet, erfordert jedoch teure und sperrige Ausrüstung.
Schließlich ist dieses Protokoll für die Reinigung von manipulierten Zellen sehr nützlich, wennNPs Transformationsmittel (Wachstumsfaktoren, Arzneimittel, Kortikosteroide, etc.) enthalten , werden für bioimaging und / oder Zelltherapie verwendet. Dies liegt daran , Überbleibsel frei NPs ausüben kann Off-Target - transformierende Auswirkungen auf benachbarte Zellen oder Immunzellen, die auf diese Fremdpartikel reagieren , wenn sie in vivo injiziert. Es kann auch unbeabsichtigt Signale erzeugen, die während des Bioimaging irreführend sein kann. Die Entfernung dieser frei NPs vor dem Gebrauch so Risiko für Nicht-Zielzellen zu reduzieren, minimieren Compilations in Immunsystem und Kontaminationsprobleme zwischen den einzelnen Schritten bei der sequentiellen Kennzeichnung / Engineering von Zellen zu reduzieren. Ihre erfolgreiche Umsetzung erleichtert Markierung von Zellen und ermöglicht die störungsfreie Nutzung der Partikel basierten Zell-Engineering in der Therapie.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
