Summary
Ce protocole décrit l'utilisation d'une stratégie d'échange de tampon inertielle à base microfluidique pour purifier les cellules modifiées micro / nanoparticules avec l'épuisement efficace des particules non liées.
Abstract
cellules d'ingénierie avec micro ingrédient actif chargé / nanoparticules (IP) devient une méthode de plus en plus populaire pour améliorer les propriétés thérapeutiques indigènes, activer bio imagerie et contrôler le phénotype cellulaire. Une question cruciale encore insuffisamment abordée est le nombre important de particules qui restent non liés après marquage des cellules qui ne peuvent pas être facilement éliminé par centrifugation classique. Cela conduit à une augmentation de la bio bruit imagerie de fond et peut donner des effets transformateurs sur des cellules non-cibles voisines. Dans ce protocole, nous présentons un tampon stratégie d'échange inertiel à base microfluidique appelé comme Dean flux Fractionnement (DFF) pour séparer efficacement les cellules marquées de NPs libres d'une manière à haut débit. Le microdispositif spirale développé facilite la collecte continue (> de récupération des cellules de 90%) des cellules purifiées (THP-1 et CSM) en suspension dans une nouvelle solution tampon, tout en atteignant> 95% épuisement de colorant fluorescent non lié ou NPs colorant chargé (silique ou PLGA). Cette seule étape, la stratégie de purification de cellules basée sur la taille permet de haute cellule de traitement débit (10 6 cellules / min) et est très utile pour un grand volume de purification de cellules de micro cellules / nanoparticulaires conçue pour parvenir à une application clinique sans interférence.
Introduction
Ingénierie des cellules par l' agent chargé des micro / nanoparticules (NP) est une méthode sans intégration, et polyvalent simple, génomique pour améliorer la capacité de bioimagerie et d' augmenter / compléter ses propriétés thérapeutiques indigènes en médecine régénérative. 1-3 modifications cellulaires sont atteints par l' étiquetage de la membrane plasmique ou le cytoplasme avec une concentration supérieure à NPs __gVirt_NP_NN_NNPS<__ agents chargés pour saturer les sites de liaison. Cependant, un inconvénient majeur de cette méthode est que les quantités importantes de particules libres restant en solution après les processus d'étiquetage des cellules, ce qui peut potentiellement confondre l' identification précise des cellules de particules-ingénierie ou compliquer les résultats thérapeutiques. 4,5 En outre, l' exposition aux NPs contenant transformatrice agents (facteurs de croissance, corticoïdes, etc.) à trop forte concentration peut causer la cytotoxicité et l' exposition mal dirigée peut induire des conséquences inattendues sur les cellules non-cibles. Même comprenant des supports particulaires of matériaux "biocompatibles" [par exemple, le poly (acide co-glycolique), PLGA] peuvent inciter les réponses des cellules immunitaires puissantes dans certaines conditions ainsi. 6 Ceci est particulièrement risquée chez les personnes souffrant d'une déficience de l' immunité (par exemple, la polyarthrite rhumatoïde) qui potentiellement retards clairance systémique de nanoparticules. 7 Ainsi, une élimination efficace des particules libres avant l'introduction de cellules de particules conçu est d' une grande importance pour réduire au minimum le profil de toxicité et de réduire l' exposition mal acheminés aux particules d'agent chargé in vivo.
Classique centrifugation à gradient est souvent utilisée pour séparer les cellules modifiées à partir de particules libres, mais est laborieux et exploité en mode par lots. En outre, les contraintes de cisaillement subies par les cellules lors de centrifugation à grande vitesse et les constituants du milieu de gradient de densité peut compromettre l' intégrité des cellules et / ou le comportement des cellules influence. 8 microfluidique est une alternative intéressante avec sevles technologies de séparation , y compris plu- déplacement latéral déterministe (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 et acoustophorèse 12 développé pour les petites particules de séparation et les applications d'échange de tampon. Cependant, ces méthodes souffrent d' une faible débit (1-10 pi · min - 1) , et sont sujettes à des problèmes de colmatage. séparations actives telles que les méthodes basées sur diélectrophorèse nécessitent également des différences dans les phénotypes cellulaires diélectrophorétique intrinsèques ou des étapes de marquage des cellules supplémentaires pour atteindre la séparation. Une approche plus prometteuse consiste à microfluidique inertielle - la migration latérale des particules ou des cellules à travers rationalise de se concentrer sur des positions distinctes en raison de forces de portance dominantes (F L) à haute nombre de Reynolds (Re) 13 En raison de ses conditions d'écoulement élevées et la résolution de taille supérieure. , il a souvent été exploitée pour des applications d'échange basés sur la taille de séparation des cellules 14,15 et tampon. 16-18 However, la performance d'échange de tampon reste pauvre avec une solution contaminant ~10-30% comme les cellules séparées restent généralement à proximité de la frontière entre des solutions originales et de nouveaux tampons. 16-18 Plus important encore , la distribution de taille des cellules cibles doit être similaire pour atteindre inertielle mise au point précise et la séparation de la solution tampon initiale qui pose un problème particulier dans le traitement des types de cellules hétérogènes telles que la taille des cellules souches mésenchymateuses (CSM). 19
Nous avons déjà mis au point une nouvelle technique cellule microfluidique inertielle de tri appelé Dean flux Fractionnement (DFF) pour isoler les cellules tumorales circulantes (CTC) 20 et les bactéries 21 du sang entier en utilisant un 2-entrée, dispositif de microcanaux spirale 2-sortie. Dans ce protocole vidéo, nous allons décrire le processus de cellules d'étiquetage THP-1 (lignée humaine de cellules de leucémie monocytaire aiguë) suspension monocytes (~ 15 um) et MSCs (10-30 um) avec calcéine-lNPs oaded, suivie par la fabrication et le fonctionnement du microdispositif en spirale FFD pour la récupération efficace des cellules marquées et l' élimination des IP non liées. 22 Cette stratégie unique de purification de l' étape permet la récupération en continu de suspension marqué et les cellules adhérentes en suspension dans une solution tampon frais sans centrifugation. En outre, il peut traiter jusqu'à 10 millions de cellules · ml -1, une densité de cellules qui se prêtent à des applications en médecine régénérative.
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Protocol
1. Nanoparticules (NPs) Étiquetage des Cellules souches mésenchymateuses et monocytes
- Les cellules souches mésenchymateuses de la culture (MSC) dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et des antibiotiques à ≥80% de confluence avant l'étiquetage. De même, la culture des cellules THP-1 (ATCC) à Roswell Memorial Institute Park (RPMI) 1640 complété avec 10% de FBS à une densité de ~ 10 6 cellules / ml.
- NPs de silice de charge (~ 500 um) avec une solution de colorant calcéine (200 uM) en utilisant une nuit d'agitation. Fabriquez PLGA-calcéine AM (CAM) en utilisant un protocole décrit précédemment. 22
- Dissoudre 250 pg CAM et 100 mg de PLGA (50:50) dans le chloroforme à 4 ° C.
- Générer NPs d'émulsion unique en utilisant un homogénéisateur à grande vitesse (13600 xg, 60 sec) à la température ambiante. Evaporer le chloroforme dans une hotte chimique (≥3 h) avant la collecte par centrifugation (3400 xg pendant 5 min), le lavage (DISTI doubleseau remplie), la lyophilisation et le stockage dans -20 ° C.
- Incuber CAM-PLGA IP (1 mg) ou IP de silice calcéine (150 pg) dans le poly-L-lysine (PLL), solution à 0,01% à la température ambiante pendant 15 - 20 min.
- Centrifuger à 3400 xg pendant 5 min pour éliminer le surnageant PLL en excès avant la remise en suspension NPs dans 1 ml de milieu de culture respective.
- Incuber les NPs avec des cellules (MSCS ou THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 cellules au total) pendant environ 24 heures (0,1 mg · concentration ml -1 étiquetage).
- Se dissocie et récolter les cellules souches mésenchymateuses adhérentes marquées à l'aide de 2 ml de trypsine à 0,25% (5 min, 37 ° C) et étancher avec 6 ml de DMEM. Centrifuger les cellules à (1000 xg, 4 min) et remise en suspension à une concentration de 10 5 - 10 6 cellules / ml pour le traitement microfluidique. Utiliser marqués cellules THP-1 (10 5 - 10 6 cellules / ml) directement pour la purification de la microfluidique.
2. microfluidique Préparation de l'appareil
- Fabrication de périphériques
- Fabriquer le dispositif microfluidique en spirale (500 um (w) x 115 um (h)) avec le polydiméthylsiloxane (PDMS) à partir d' un kit commercial en utilisant des étapes de lithographie douce standard. 23
- Mélanger 30 g de prépolymère de base et 3 g agent de durcissement à fond dans un bateau de pesage. Dégazer le mélange dans un dessicateur pendant 60 min pour éliminer les bulles d'air.
- Verser le mélange PDMS sur le moule maître de la plaquette de silicium à motif avec la conception du canal en spirale avec précaution à une hauteur de environ 5 - 10 mm.
- Dégazer le mélange sous vide dessicateur pendant 60 min à nouveau pour éliminer les bulles d'air. Répétez le processus jusqu'à ce que toutes les bulles sont éliminées.
- Cure le mélange PDMS dans un four C 80 ° pendant 2 heures jusqu'à ce que le PDMS est réglé. Vérifiez que la plaquette est pas incliné lors de la cuisson pour avoir une hauteur de périphérique constante.
- Découpez le dispositif en spirale PDMS en utilisant un scalpel et éplucher soigneusement la dalle PDMS du moule maître.
- Trim les bords de l'appareil avec un scalpel pour assurer que la surface lisse pour le collage.
- Poinçonner deux trous (1,5 mm) pour les entrées et deux trous (1,5 mm) pour les sorties de l'appareil PDMS à l'aide d'une biopsie perforateur 1,5 mm.
- Laver l'appareil avec de l'isopropanol (IPA) pour enlever les débris et sécher l'appareil dans un four à 80 ° C pendant 5 min.
- Nettoyer la surface inférieure du dispositif de PDMS (avec des caractéristiques de canal) en utilisant du ruban adhésif.
- Nettoyer un côté d'une lame de verre (2 "par 3") en utilisant du ruban adhésif.
- Placez soigneusement et d'exposer les surfaces nettoyées du dispositif de PDMS et lame de verre dans la chambre d'un nettoyeur à plasma et les soumettre à vide pendant 60 sec. Ensuite, allumer la puissance du plasma au maximum et abaisser la pression de la chambre jusqu'à ce que la chambre devient rose en couleur.
- Exposer les surfaces à plasma d'air pendant 60 secondes. Le plasma crée des espèces réactives sur les surfaces exposées des PDMS et du verre qui permet une liaison étanche lorsqu'elle est mise en physical contact. Coupez l'alimentation de plasma et de libérer la pression du nettoyeur à plasma pour récupérer la lame de l'appareil et le verre.
- Coller le dispositif de PDMS et lame de verre en pressant ensemble les surfaces exposées au plasma hermétiquement et faire en sorte que l'absence de bulles sont piégées entre les deux surfaces.
- Chauffer le dispositif lié à l'aide d'une plaque fixée à 80 ° C pendant 2 heures pour renforcer la liaison.
- Fonctionnement de l' appareil
- Coupez deux morceaux de tube (1,52 mm OD) de ~ 15 - 20 cm pour les seringues d'entrée et de joindre un embout de la seringue (jauge 23) sur une extrémité de chaque tube.
- Coupez deux morceaux de tube (1,52 mm OD) de ~ 5 - 10 cm pour les sorties et fixer aux trous de sortie du dispositif PDMS.
- Avant l'exécution de l'échantillon, le premier dispositif manuellement avec une seringue contenant 70% d'éthanol jusqu'à ce qu'il coule hors de la tubulure de sortie. Laisser reposer l'éthanol pendant 30 s à 1 min pour stériliser l'appareil.
- Charger 30 ml de filtre(0,2 um pores) du tampon de gaine (tampon phosphate salin (PBS) contenant 0,1% de sérumalbumine bovine (BSA)) dans la seringue de 60 ml et fixer la seringue sur une pompe à seringue. Réglez la pompe pour les paramètres corrects (taille de seringue: 60 ml, Volume: 60 000 pi).
Remarque: L'addition de BSA PBS est de minimiser la liaison cellule-cellule et la liaison non spécifique entre les cellules et le dispositif de PDMS. - Charge 3 ml de cellules marquées dans la seringue de 3 ml et fixer la seringue sur une pompe à seringue séparée. Réglez la pompe pour les paramètres corrects (taille de seringue: 3 ml, Volume: 3000 pi).
- Vérifiez qu'il n'y a pas de bulles d'air piégées dans les seringues pour assurer un flux stable. Éliminer les bulles d'air en éjectant doucement quelques gouttes de liquide hors de la buse.
- Connecter les conseils d'entrée de seringue et un tube pour les seringues, et les insérer dans les entrées respectives du dispositif (gaine et entrée de l'échantillon). Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles le long du tube.
- Monter les dispositifs sur un invertied microscope à contraste de phase pour l'imagerie en temps réel durant le processus de tri cellulaire.
- Fixer un petit bécher de déchets et deux tubes de 15 ml à proximité de l'appareil sur la platine du microscope en utilisant des adhésifs.
- Placer les tubes de sortie dans le bécher de déchets.
- Réglez le rapport d'écoulement pour l'échantillon de tampon de gaine à 1:10 et démarrer les deux pompes à seringue pour amorcer le processus de tri (Exemple: min pour seringue d'échantillon et 1200 ul min pour la gaine seringue 120 pi / /; la vitesse d'écoulement du canal ~ 0,38 m / sec ).
- Faire fonctionner l'appareil pendant 1,5 min pour le débit se stabiliser. Cela peut être confirmé par la présence de cellules inertially ciblées près de la paroi interne canal sous champ lumineux avec un contraste de phase en utilisant une caméra à haute vitesse (~ 5000 - 10.000 images par seconde (fps), le temps d'exposition: 10-50 microsecondes).
- Positionner les tubes de sortie dans les différents tubes pour recueillir les éluats de la sortie de la cellule et à la sortie des déchets.
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Representative Results
Après marquage des cellules avec bio imagerie IP de l' agent chargé d'une nuit, les cellules marquées (contenant des particules libres) sont récoltées et purifiées par FFD spirale microdispositif pour éliminer les IP libres dans un processus en une seule étape (figure 1A). Le 2-entrée, microcanaux spirale 2-sortie est conçu par des logiciels d'ingénierie et de microfabriqué utilisant SU-8. La plaquette de silicium à motif est ensuite utilisé comme matrice pour le moulage PDMS réplique en utilisant des techniques de lithographie douce (figure 1B). Pour effectuer le tri de cellules, l'échantillon de cellules est pompée dans l'entrée de la paroi extérieure du microdispositif en spirale tandis que l'entrée de la paroi interne exécute une solution tampon frais à un débit plus élevé (1:10) pour pincer le flux d'échantillon de cellules. La séparation est obtenue par focalisation d' inertie de grandes cellules marquées à la paroi intérieure et la recirculation de Dean-induite des petites non consolidées PN vers la paroi externe (figure 2A). Le dispositif a été la première applied pour trier les cellules en suspension marqué monocytes (THP-1) de NPs de silice fluorescentes chargées de calcéine (~ 500 nm de taille). De hauts rendements de séparation ont été obtenus comme confirmé par imagerie à grande vitesse (figure 2A) et l' analyse par cytométrie de flux (figure 2B). Les images de sortie éluants collectées à partir de cellules de dispositif a également indiqué une élimination efficace de la silice et PLGA (NP ~: 1 - 5 pm) de cellules THP-1. En outre, l' imagerie de fluorescence a montré que les IP internalisés dans les étiquetés cellules THP-1 ont été bien conservées lors de la purification DFF (empiècements) (Figure 3). En raison de l' hétérogénéité du MSC taille, la géométrie spirale de microcanaux a ensuite été modifiée en changeant la hauteur du canal et la conception de bifurcation pour permettre une collecte efficace des cellules souches mésenchymateuses (figure 4).
Figure 1. (A) Ovworkflow ERALL pour une seule étape micro / nanoparticules (NPs) élimination rapide de la suspension et des cellules adhérentes post-marquage utilisant Dean flux Fractionnement (DFF) la technologie microfluidique. (B) Le dispositif en spirale DFF est conçu par des logiciels d'ingénierie et de motifs sur la plaquette de silicium en utilisant microfabrication. dispositifs PDMS sont ensuite produits par des procédés de lithographie douce. Dispositif expérimental se compose de 2 pompes à seringue pour infuser les cellules marquées et un tampon de sérum frais à des taux différents dans le dispositif pour la purification et la collecte de cellules marquées en continu flux. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Nanoparticules retrait de étiquetés cellules THP-1 via FFD. (A) Illustration deprincipe de séparation DFF. Grandes cellules marquées éprouvent de fortes forces d' inertie de levage (F L, flèches rouges) et les forces de traînée Dean (F D, flèches jaunes) et se concentrent près de la paroi intérieure de microcanaux. Les petits IP et la solution tampon sont uniquement affectés par Dean glisser recirculer à la paroi extérieure pour réaliser la séparation. Représentant haute vitesse et des images de fluorescence indiquant des positions de cellules THP-1 (flèches rouges) et silice NPs chargées de calcéine colorant à la zone de sortie équilibre. La performance (B) de séparation basée sur l' analyse de cytométrie de flux avec gating déterminé par la taille (FSC-A) et la granularité (SSC-A) caractéristiques. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
La figure 3.
Figure 4. Nanoparticules retrait de cellules souches mésenchymateuses (CSM) par l' intermédiaire de facto. (A) l' image à haute vitesse représentant illustrant une séparation efficace des cellules souches mésenchymateuses (flèches rouges) et PLGA NPs (flèches bleues) dans différents points de vente. Jaune lignes pointillées indiquent la position approximative des murs de microcanaux. (B) la performance de séparation des cellules souches mésenchymateuses à partir de silice et de PLGA NPs.pg "target =" _ blank "> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La technologie de purification des cellules DFF décrit ici permet une séparation rapide et continue de cellules marquées d'une manière à haut débit. Cette approche de séparation est idéale pour un grand volume d'échantillon élevé ou le traitement des échantillons de concentration cellulaire, et est meilleure que la filtration à membrane à base conventionnelle qui est sujette à l'encrassement, après une utilisation prolongée. De même, la séparation magnétique basée sur l'affinité nécessite des étapes d'étiquetage des cellules supplémentaires qui sont laborieux et coûteux. Les cellules purifiées sont présentés à conserver leurs agents marqués et la morphologie des cellules puits (Figure 3) avec des effets d'écoulement minimale / induite par cisaillement (contrainte de cisaillement τ, ~ 200-250 dyne / cm 2) en raison de peu de temps de séjour dans le canal (< 1 sec) 20,24. En outre, l'utilisateur peut choisir la solution éluée de cellules marquées triées par simple remplacement du tampon de la gaine (solution saline) avec les fluides désirés ou une solution tampon.
Il est essentiel queil n'y a pas de saleté ou de débris dans le microcanal usage antérieur qui peut affecter négativement le comportement en se concentrant sur les cellules. Ceci peut être réalisé par le nettoyage des trous d'entrée à fond avec de l'IPA, ainsi que l'utilisation du ruban adhésif pour nettoyer la surface avant la liaison PDMS plasma. Étant donné que le microdispositif fonctionne dans des conditions de débit élevé (~ 1 à 1,5 ml / min), il est également important de chauffer les dispositifs PDMS collés sur une plaque chauffante afin d'assurer une liaison forte entre le PDMS et la lame de verre. Pendant le fonctionnement de l'appareil, si les cellules ne se concentrent pas bien, ce qui signifie que les débits ne sont pas suffisants. On peut résoudre les problèmes en vérifiant la zone d'entrée de l'appareil et les embouts de seringue pour assurer qu'il n'y a pas de fuites.
L' élimination des NPs non liés des cellules marquées est pas trivial puisque des techniques de séparation de laboratoire commun (par exemple, centrifugation) ne peut pas séparer les particules / cellules de tailles différentes (par exemple, des particules non liées et les cellules marquées). Si l'on peut soutenir que les lavages répétéset l'évolution des milieux de culture peut supprimer les IP libres de cellules adhérentes dans une certaine mesure, le processus est laborieux et inefficace pour les cultures de cellules en suspension. Le dispositif microfluidique DFF utilise le tri par taille et est très polyvalent car il peut être utilisé aussi bien pour la suspension et les cellules adhérentes avec une gamme de grande taille, ainsi que la suppression des IP de différents matériaux. Si les cellules cibles sont de tailles différentes, le dispositif DFF peut être optimisée en modifiant les conditions d'écoulement ou de la géométrie du canal (par exemple, la hauteur de canal et le rapport des largeurs de canal interne et externe) pour obtenir une séparation efficace. Il a été précédemment démontré que la bascule DFF est supérieure par rapport à une centrifugation classique en retrait IP avec une perte de cellules minimal. 22 En outre, la performance de la récupération des cellules est restée élevée (> 90%) lorsque la concentration de l' échantillon a été porté à 10 7 cellules / ml. Ceci est une amélioration par rapport aux méthodes clés microfluidiques inertiels existantes de séparation des cellules qui sont en généralment limitée à 10 5 cellules / ml de capacité , due à l' interaction cellule-cellule et cellule surpopulation au niveau des positions d'équilibre. 25
Bien que la technologie DFF réalise une séparation basée sur la différence de taille, il ne peut pas être utilisé pour d'autres procédés d'ingénierie cellulaire telles que la séparation des cellules marquées et non marquées en raison du changement négligeable dans la taille des cellules. marqueurs de surface cellulaire pour le tri par affinité et d'autres modalités de séparation commune (de susceptibilité magnétique et conductivité électrique) pourraient être envisagées pour ces applications potentielles. la technologie FFD est également pas adapté pour le tri cellulaire multiplexé basée sur la fluorescence. Une meilleure option serait d'utiliser cellulaire activé par fluorescence (FACS) pour une seule étape de tri des cellules marquées avec fluorescence différente qui fonctionne à haut débit, mais nécessite un équipement coûteux et encombrant.
Enfin, ce protocole est très utile pour la purification de cellules modifiées lorsqueIP contenant des agents de transformation (facteurs de croissance, les médicaments, les corticoïdes, etc.) sont utilisés pour bioimagerie et / ou la thérapie cellulaire. En effet , les IP libres restantes peuvent exercer hors-cible transformatrice effets sur les cellules voisines ou des cellules immunitaires qui répondent à ces particules étrangères lorsqu'elles sont injectées in vivo. Il peut également générer involontairement des signaux qui peuvent être trompeuses au cours bioimagerie. La suppression de ces NPs libres avant l'utilisation de réduire ainsi le risque pour les cellules non-cibles, minimiser les compilations dans le système immunitaire, et de réduire les problèmes de contamination entre les étapes au cours séquentielle étiquetage / ingénierie des cellules. Sa mise en œuvre réussie facilite grandement le marquage cellulaire et permet l'utilisation sans interférence des particules à base de l'ingénierie cellulaire en thérapie.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
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