Summary
Denne protokol beskriver anvendelsen af et inertial mikrofluidik-baserede bufferskift strategi til oprensning mikro / nanopartikel manipulerede celler med effektiv udtømning af ubundne partikler.
Abstract
Engineering celler med aktiv-ingrediens-loaded mikro- / nanopartikler (NPS) bliver en stadig mere populær metode til at forbedre indfødte terapeutiske egenskaber, aktivere bio imaging og styre celle fænotype. En kritisk endnu utilstrækkeligt behandlet problem er det store antal partikler, der forbliver ubundet efter cellemærkning, som ikke let kan fjernes ved konventionel centrifugering. Dette fører til en stigning i bio imaging baggrundsstøj og kan give transformative virkninger onto nabolande uden for målgruppen celler. I denne protokol, præsenterer vi en inerti mikrofluidik-baserede buffer udveksling strategi betegnes som Dean Flow Fraktionering (DFF) til effektivt at separere mærkede celler fra frie nationale parlamenter på en high throughput måde. Den udviklede spiral microdevice letter kontinuerlig samling (> 90% celleindvinding) renset celler (THP-1 og MSC) suspenderet i ny bufferopløsning, og samtidig opfylde> 95% depletering af ubundet fluorescerende farvestof eller Dye-loaded NP'er (silICA eller PLGA). Denne enkelt trin, størrelse-baserede celle rensning strategi giver høj celle behandling gennemløb (10 6 celler / min) og er yderst nyttigt for store mængder celle rensning af mikro- / nanopartikel manipuleret celler for at opnå fejlfri klinisk anvendelse.
Introduction
Engineering celler ved agent-loaded mikro- / nanopartikler (NPS) er en enkel, genomisk integration-fri, og alsidig metode til at forbedre bioimaging kapacitet og forøge / supplere sine indfødte terapeutiske egenskaber i regenerativ medicin. 1-3 Cellular modifikationer opnås ved mærkning af plasmamembranen eller cytoplasmaet med et overskud koncentrationen af midlet-loaded NP'er at mætte bindingsstederne. Men en stor ulempe ved denne metode er de betydelige mængder af ubundne partikler tilbage i opløsning efter mærkning celle processer, som potentielt kan forvirre præcis identifikation af partikel-celler eller komplicere terapeutiske resultater. 4,5 Desuden, eksponering for nationale parlamenter, der indeholder transformative midler (vækstfaktorer, kortikosteroider, etc.) ved for høj koncentration kan forårsage cytotoksicitet og fejlrettet eksponering kan fremkalde utilsigtede konsekvenser på ikke-målceller. Selv partikelformige bærere, der omfatter of "biokompatible" materialer [f.eks, poly (mælkesyre co-glycolsyre), PLGA] kan opildne potente immun celle responser visse betingelser samt. 6 Dette er især risikabelt hos personer med svækket immunitet (fx leddegigt) som potentielt forsinkelser systemisk nanopartikel clearance. 7 således effektiv fjernelse af frie partikler forud for indførelsen af partikel-modificerede celler er af stor betydning at minimere toksicitetsprofil og reducere fejldirigeret eksponering for agent-loaded partikler in vivo.
Konventionel gradientcentrifugering anvendes ofte til at adskille manipulerede celler fra frie partikler, men er besværlig og drives i batch-mode. Desuden forskydningsspændinger opleves af celler under høj hastighed centrifugering og bestanddele af densitetsgradient medium kan kompromittere celle integritet og / eller indflydelse celle adfærd. 8 Microfluidics er et attraktivt alternativ med sevrale teknologier separation herunder deterministisk sideforskydning (DLD) 9, dieletrophoresis 10,11 og akustoforese 12 udviklet til små partikler separation og bufferudskiftning applikationer. Imidlertid lider disse fremgangsmåder fra lille produktion (1-10 pi · min - 1) og er tilbøjelige til tilstopning problemer. Aktive separationer såsom dielektroforese-baserede metoder kræver også forskelle i iboende dielektroforetisk celle fænotyper eller yderligere skridt mærkning celle for at opnå separation. En mere lovende tilgang involverer inerti mikrofluidik - den laterale vandring af partikler eller celler på tværs strømliner at fokusere på forskellige positioner på grund af dominerende lift kræfter (F L) ved høje Reynolds tal (Re) 13 På grund af sin høje strømningsforhold og overlegen størrelse opløsning. det er ofte blevet udnyttet til størrelse-baserede celleseparation 14,15 og buffer udvekslingsprogrammer. 16-18 However, buffer udveksling ydeevne forbliver fattige med ~10-30% forurenende løsning, da de adskilte celler normalt forbliver tæt på grænsen mellem originale og nye bufferopløsninger. 16-18 Vigtigere, størrelsesfordelingen af target-celler skal være ens for at opnå præcis inertial fokusering og adskillelse fra den oprindelige pufferopløsning, der udgør et problem, især i behandlingen af heterogene størrelse celletyper såsom mesenkymale stamceller (MSC'er). 19
Vi har tidligere udviklet en ny inertial mikrofluidik cellesortering teknik betegnet Dean Flow Fraktionering (DFF) til isolering af cirkulerende tumorceller (CTCs) 20 og bakterier 21 fra fuldblod under anvendelse af en 2-indløb, 2-udløb spiral mikrokanal enhed. I denne video protokol, vil vi beskrive processen med mærkning THP-1 (human akut monocytisk leukæmi cellelinje) suspension monocytiske celler (~ 15 pm) og MSC'er (10-30 um) med calcein-loaded nationale parlamenter, efterfulgt af fremstilling og drift af DFF spiral microdevice for effektiv inddrivelse af mærkede celler og fjernelse af ubundne NP'er. 22 Denne enkelt trin rensning strategi muliggør kontinuerlig genvinding af mærket suspension og adhærente celler suspenderet i frisk bufferopløsning uden centrifugering. Det kan desuden behandle op til 10 millioner celler · ml-1, en celletæthed medgørlige til regenerativ medicin applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nanopartikler (NP) Mærkning af mesenchymale stamceller og monocytter
- Kultur mesenchymstamceller (MSC'er) i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og antibiotika til ≥80% sammenflydning før mærkning. Tilsvarende kultur THP-1-celler (ATCC) i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% FBS til en densitet på ~ 10 6 celler / ml.
- Load silica NP (~ 500 um) med calcein farveopløsning (200 uM) ved anvendelse omrøring natten over. Fabrikere PLGA-calcein AM (CAM) anvendelse af en protokol tidligere beskrevet. 22
- Opløs 250 ug CAM og 100 mg PLGA (50:50) i chloroform ved 4 ° C.
- Generere single emulsions NP anvende højhastigheds-homogenisator (13.600 x g, 60 sek) ved stuetemperatur. Inddampes chloroform i en kemisk hætte (≥3 timer) før samling ved hjælp af centrifugering (3400 xg i 5 min), vask (dobbelt fornelled vand), frysetørring og lagring i -20 ° C.
- Inkuber CAM-PLGA NP'er (1 mg) eller calceinholdige silica NP (150 ug) i 0,01% poly-L-lysin (PLL) opløsning ved stuetemperatur i 15 - 20 min.
- Centrifuger ved 3.400 xg i 5 min for at fjerne overskydende PLL supernatant før NP'er resuspension i 1 ml respektive dyrkningsmedium.
- Inkubér nationale parlamenter med celler (MSC eller THP-1, ~ 1 - 2 x 10 6 celler i alt) i cirka 24 timer (0,1 mg · koncentration ml -1 mærkning).
- Dissociere og høste de mærkede adhærente MSC'er 2 ml 0,25% trypsin (5 min, 37 ° C) og stands med 6 ml DMEM. Spin ned cellerne ved (1.000 xg, 4 min) og resuspender til en koncentration på 10 5 - 10 6 celler / ml for mikrofluid forarbejdning. Brug mærkede THP-1-celler (10 5 - 10 6 celler / ml) direkte til mikrofluidik oprensning.
2. mikrofluidapparat Fremstilling
- enhed Fabrication
- Fabrikere den mikro spiral indretning (500 um (w) × 115 um (h)) med polydimethylsiloxan (PDMS) fra et kommercielt kit under anvendelse af standard bløde litografi trin. 23
- Bland 30 g af base præpolymer og 3 g hærder grundigt i et vejebåd. De-gas blandingen i en ekssikkator i 60 minutter for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Hæld PDMS blandingen på siliciumskiven mastermodel mønstret med den spiralformede kanal design omhyggeligt til en højde på ~ 5 - 10 mm.
- De-gas blandingen i en ekssikkator vakuum i 60 min igen for at fjerne eventuelle luftbobler. Gentag processen, indtil alle bobler er elimineret.
- Helbrede PDMS blandingen i en 80 ° C ovn i 2 timer, indtil PDMS er indstillet. Sikre waferen ikke hælder under hærdning at have en konstant enhed højde.
- Klip PDMS spiral enheden ved hjælp af en skalpel og skræl forsigtigt PDMS plade fra master mug.
- trim kanter enhed med en skalpel for at sikre jævn overflade til limning.
- Punch to huller (1,5 mm) til indløb og to huller (1,5 mm) til de afsætningsmuligheder på PDMS enheden ved hjælp af en 1,5 mm biopsi puncher.
- Vask enheden med isopropanol (IPA) for at fjerne eventuelle rester og tør enheden i en 80 ° C ovn i 5 minutter.
- Rengør bundflade PDMS indretning (med kanalfunktioner) under anvendelse afdækningstape.
- Ren ene side af en glasplade (2 "med 3") ved anvendelse af afdækningstape.
- Forsigtigt placere og eksponere de rengjorte overflader af PDMS enhed og objektglas i kammeret af et plasma renere og underkaste dem til vakuum i 60 sek. Dernæst tænde plasma magt til maksimum og sænke trykket i kammeret, indtil kammeret bliver lyserød farve.
- Udsætte overfladerne for luft plasma i 60 sek. Plasmaet skaber reaktive arter på de eksponerede overflader af PDMS og glas, som gør det stramme binding når de bringes i fysikal kontakt. Sluk plasma magt og frigøre trykket fra plasma renere at hente enheden og objektglasset.
- Binde PDMS enhed og objektglas sammen ved at trykke på plasma-eksponerede overflader stramt og sikre, at er fanget nogen bobler mellem de to overflader.
- Varm bundne enhed under anvendelse af en varmeplade indstillet til 80 ° C i 2 timer for at styrke bindingen.
- Device Operation
- Skær to stykker af rør (1,52 mm OD) af ~ 15 - 20 cm til indløbs- sprøjter og vedlægge en sprøjte spids (gauge 23) på den ene ende af hver slange.
- Skær to stykker rør (1,52 mm OD) af ~ 5 - 10 cm for afsætningsmulighederne og tillægger outlet huller i PDMS-enheden.
- Forud for prøve kører, manuelt prime enheden med en sprøjte indeholdende 70% ethanol, indtil den strømmer ud af udløbet slangen. Tillad ethanol sidde i 30 sek til 1 min at sterilisere indretningen.
- Indlæse 30 ml filtreret(0,2 um porestørrelse) kappe puffer (phosphatpufret saltvand (PBS) med 0,1% bovint serumalbumin (BSA)) i 60 ml sprøjte og fastgør sprøjte på en sprøjtepumpe. Indstil pumpen til de korrekte indstillinger (Sprøjte størrelse: 60 ml, Volume: 60.000 pi).
Bemærk: Tilsætning af BSA til PBS er at minimere celle-celle-binding og ikke-specifik binding mellem celler og PDMS enheden. - Load 3 ml mærkede celler i 3 ml sprøjte og sikre sprøjten på en separat sprøjtepumpe. Indstil pumpen til de korrekte indstillinger (Sprøjte størrelse 3 ml, Volume: 3000 pi).
- Kontroller, at der ikke luftbobler er fanget i sprøjterne at sikre et stabilt flow. Fjern eventuelle luftbobler ved forsigtigt at skubbe par dråber væske ud af dysen.
- Tilslut indløb sprøjte tips og slanger til sprøjterne, og indsætte dem i de respektive indløb af enheden (kappe og prøve indløb). Sørg for, at der ikke er nogen bobler langs slangen.
- Monter enhederne på en inverted fasekontrastmikroskop til tidstro billeddannelse under cellesortering proces.
- Fastgør et lille spild bæger og to 15 ml rør tæt på enheden på mikroskopet scenen ved hjælp lim.
- Placer outlet slangerne ind i affaldet bægeret.
- Indstille flowet ratio for prøve til sheath buffer til 1:10 og starte begge sprøjtepumper at indlede sorteringsprocessen (Eksempel: 120 pl / min for prøvesprøjten og 1.200 pl / min for kappe sprøjte; kanal flowhastighed ~ 0,38 m / sek ).
- Kør enheden i 1,5 min for strømningshastigheden at stabilisere sig. Dette kan bekræftes ved tilstedeværelsen af inertimæssigt fokuserede celler nær kanalens indre væg under lyse-felt med fase kontrast ved hjælp af en high-speed kamera (~ 5.000 - 10.000 billeder i sekundet (fps), eksponeringstid: 10-50 psek).
- Placer outlet slangerne i forskellige rør til at indsamle eluenter fra cellen stikkontakten og afløb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter mærkning af cellerne med bio billeddannende middel-loaded NP'er natten de mærkede celler (indeholdende frie partikler) høstes og oprenses ved DFF spiral microdevice at fjerne frie NP'er i et enkelt trin proces (Figur 1A). Den 2-indløb, 2-stikkontakt spiral mikrokanalplade er designet af engineering-software og mikrofabrikerede hjælp SU-8 fotoresist. Den mønstrede siliciumskive anvendes derefter som template til PDMS replika støbning med bløde litografiteknikker (figur 1b). For at udføre cellesortering, er celleprøven pumpes ind i den ydre væg indløb af spiralen microdevice medens den indre væg indløb kører frisk pufferopløsning ved en højere strømningshastighed (1:10) for at klemme celleprøven flow. Adskillelse opnås ved inertielle fokusering af større mærkede celler ved den indre væg og Dean-induceret recirkulation af små ubundne NP'er mod den ydre væg (figur 2A). Enheden var første ansøged at sortere mærkede suspension monocytiske celler (THP-1) fra fluorescerende silica NP lastet med calcein (~ 500 nm i størrelse). Effektiviteter høje separation blev opnået som bekræftet ved høj hastighed imaging (figur 2A) og flowcytometri-analyse (figur 2B). Billeder af eluenter indsamlet fra enhed celle stikkontakt oplyste også effektiv fjernelse af silica og PLGA nationale parlamenter (~ 1 - 5 pm) fra THP-1 celler. Desuden viste fluorescensafbildning at internaliserede NP'er i de mærkede THP-1-celler var godt bibeholdes under DFF oprensning (mellemværker) (figur 3). På grund af MSC størrelse heterogenitet blev spiral mikrokanalplade geometri efterfølgende modificeret ved at skifte kanal højde og bifurkation design for at muliggøre effektiv opsamling af MSC'er (Figur 4).
Figur 1. (A) Overall workflow til hurtig fjernelse enkelt trin mikro / nanopartikel (NP) fra suspension og adhærente celler efter mærkning ved hjælp af Dean Flow Fraktionering (DFF) mikrofluid teknologi. (B) DFF spiral enhed er designet af engineering-software og mønstrede på silicium wafer hjælp mikrofabrikation. PDMS-enheder efterfølgende produceret af bløde litografi metoder. Eksperimentel opsætning består af 2 sprøjtepumper at indgyde mærkede celler og frisk saltvand buffer ved forskellige flowhastigheder i enheden til kontinuerlig rensning og opsamling af mærkede celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Nanopartikler fjernelse fra mærkede THP-1-celler via DFF. (A) Illustration afDFF adskillelse princip. Større mærkede celler oplever stærke inerti lift kræfter (F L, røde pile) og Dean trækkræfter (F D, gule pile) og fokusere nær mikrokanalplade indre væg. Mindre NP'er og pufferopløsning udelukkende påvirket af Dean træk og recirkuleres til den ydre væg for at opnå separation. Repræsentative høj hastighed og fluorescens billeder angiver ligevægtsstillinger af THP-1-celler (røde pile) og silica NP'er lastet med calcein farvestof ved udløbet region. (B) Separation ydeevne baseret på flowcytometri analyse med gating bestemmes af størrelse (FSC-A) og kornethed (SSC-A) karakteristika. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3.
Figur 4. Nanopartikler fjernelse fra mesenkymale stamceller (MSC'er) via DFF. (A) repræsentative højhastigheds billede illustrerer effektiv separation af MSC'er (røde pile) og PLGA NP'er (blå pile) i forskellige forretninger. Gul stiplede linjer angiver den omtrentlige position af mikrokanalplader vægge. (B) Separation ydeevne MSC'er fra silica og PLGA nationale parlamenter.pg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DFF celle rensning teknologi beskrevet heri muliggør hurtig og kontinuerlig adskillelse af mærkede celler i et højt gennemløb måde. Denne adskillelse tilgang er ideel til store prøvevolumen eller høj koncentration celle prøve behandling, og er bedre end konventionel membran-baserede filtrering, som er tilbøjelige til at tilstopning efter længere tids brug. Tilsvarende affinitet-baserede magnetisk separation kræver yderligere trin mærkning celle, som er besværlig og dyr. De oprensede celler er vist at bevare deres mærkede agenter og cellemorfologi godt (figur 3) med minimal flow / shear-induceret virkninger (shear stress τ, ~ 200-250 dyn / cm2) på grund af kort opholdstid inden i kanalen (< 1 sek) 20,24. Derudover kan brugeren vælge den eluerede opløsning af de sorterede mærkede celler ved blot at erstatte hylsteret buffer (saltvand) med de ønskede medier eller pufferopløsning.
Det er kritisk,der er ingen snavs eller skidt i mikrokanalplade tidligere brug, som kan påvirke celle fokus adfærd. Dette kan opnås ved at rense indgangshullerne grundigt med IPA, samt bruge afdækningstape at rengøre PDMS overflade før plasma limning. Da microdevice opererer under høje strømningsforhold (~ 1 - 1,5 ml / min), er det også vigtigt at opvarme de bundne PDMS enheder på en kogeplade at sikre stærk binding mellem PDMS og objektglasset. Under enhedens drift, hvis cellerne ikke fokuserer godt, betyder det, at strømningshastighederne ikke er tilstrækkelige. Man kan foretage fejlfinding ved at kontrollere enhedens indløb regionen og sprøjten tips til at sikre, at der ikke er utætheder.
Fjernelse af ubundne NP'er fra mærkede celler er ikke trivielt, da fælles laboratorium separationsteknikker (fx centrifugering) kan ikke adskilte partikler / celler i forskellige størrelser (f.eks ubundne partikler og mærkede celler). Mens man kan argumentere for, at gentagen vaskog ændring af dyrkningsmedier kan fjerne frie NP'er fra adhærente celler i et vist omfang, processen er besværlig og ineffektiv for suspension cellekulturer. DFF mikrofluidanordning udnytter størrelse baseret sortering og er meget alsidige, da den kan anvendes til både suspension og adhærente celler med et stort størrelsesområde, samt fjernelse af NP'er af forskellige materialer. Hvis målcellerne er af forskellig størrelse, kan DFF indretningen optimeres ved at ændre strømningsforholdene eller kanal geometri (fx kanal højde og forholdet mellem indre og ydre kanalbredder) for at opnå en effektiv adskillelse. Det er tidligere blevet påvist, at DFF er overlegen i forhold til konventionelle centrifugering i NP'er fjernelse med minimalt celletab. 22 Endvidere celleindvinding var fortsat høj (> 90%), når koncentrationen prøven blev forøget til 10 7 celler / ml. Dette er en vigtig forbedring i forhold til de eksisterende inerti mikrofluide celle adskillelse metoder, som er genereltly begrænset til 10 5 celler / ml kapacitet på grund af celle-celle-interaktion og celle overbelægning ved ligevægt positioner. 25
Mens DFF teknologi opnår separation baseret på størrelse forskel, kan det ikke anvendes til andre celle tekniske processer såsom adskillelse af mærkede og umærkede celler på grund af ubetydelig ændring i cellestørrelse. Celleoverflademarkører for affinitet-baserede sortering og andre modaliteter fælles separation (magnetisk susceptibilitet og elektrisk ledningsevne), kan anses for sådanne potentielle anvendelser. DFF teknologi er heller ikke egnet til multipleksede cellesortering baseret på fluorescens. En bedre løsning ville være at anvende fluorescensaktiveret cellesortering (FACS) for enkelt-trins sortering af mærkede celler med forskellig fluorescens, som arbejder ved højt gennemløb, men kræver dyrt og omfangsrigt udstyr.
Endelig er denne protokol er meget nyttig til oprensning af manipulerede celler, nårNP'er indeholder transformative midler (vækstfaktorer, lægemidler, corticosteroider, etc.) anvendes til bioimaging og / eller celleterapi. Dette skyldes rest frie nationale parlamenter kan udøve off-target transformative virkninger på omkringliggende celler eller immunceller, der reagerer på disse udenlandske partikler, når injiceres in vivo. Det kan også utilsigtet generere signaler, der kan være vildledende under bioimaging. Fjernelse af disse gratis nationale parlamenter forud for brugen således reducere risikoen for ikke-målceller, minimere kompilationer i immunsystemet, og mindske forurening problemer mellem trin under sekventiel mærkning / engineering af celler. Dens vellykket gennemførelse i høj grad letter celle mærkning og gør det muligt for støjfri brug af partikel baseret manipulation i terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell lines & Media | |||
| Mesenchymal Stem Cells (MSCs) | Lonza | PT-2501 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Lonza | 12-614F | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 monocyte cells (THP-1) | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 media | Lonza | 12-702F | |
| Reagents & Materials | |||
| 0.01% poly-L-lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml Syringe | BD | 302113 | Syringe 3 ml Luer-Lock |
| 60 ml Syringe | BD | 309653 | Syringe 60 ml Luer-Lock |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Biowest | P6154-100GR | |
| Calcein, AM (CAM) | Life Technologies | C1430 | |
| Calcein | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| Isopropanol | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC Grade 2.5 L |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Lonza | 17-516Q/12 | |
| Plain Microscope Slides | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 mm3 |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Dow Corning | SYLGARD® 184 | |
| Scotch tape | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| Silica NPs (∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | Pore size 4 nm |
| Syringe Tip | JEC Technology | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon Tubing | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 x 0.06" 100 |
| Poly (D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA; 50:50) | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| Equipment | |||
| Biopsy punch | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| Dessicator | Scienceware | 111/4 IN OD | |
| High-speed Camera | Phantom | V9.1 | |
| Inverted phase-contrast microscope | Nikon | Eclipse Ti | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| Syringe Pump | Chemyx | CX Fusion 200 |
References
- Wiraja, C., et al. Aptamer technology for tracking cells' status & function. Mol. Cell. Ther. 2, 33 (2014).
- Yeo, D. C., Wiraja, C., Mantalaris, A., Xu, C. Nanosensors for Regenerative Medicine. J. Biomed. Nanotech. 10, 2722-2746 (2014).
- Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat. Biotechnol. 32, 804-818 (2014).
- Soenen, S. J., et al. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano Today. 6, 446-465 (2011).
- Donaldson, K., Poland, C. A. Nanotoxicity: challenging the myth of nano-specific toxicity. Curr. Opin. Biotechnol. 24, 724-734 (2013).
- Veiseh, O., et al. Size- and shape-dependent foreign body immune response to materials implanted in rodents and non-human primates. Nat. Mater. 14, 643-651 (2015).
- Jones, S. W., et al. Nanoparticle clearance is governed by Th1/Th2 immunity and strain background. J. Clin. Invest. 123, 3061-3073 (2013).
- Marchi, L. F., Sesti-Costa, R., Chedraoui-Silva, S., Mantovani, B. Comparison of four methods for the isolation of murine blood neutrophils with respect to the release of reactive oxygen and nitrogen species and the expression of immunological receptors. Comp. Clin. Pathol. 23, 1469-1476 (2014).
- Morton, K. J., et al. Hydrodynamic metamaterials: Microfabricated arrays to steer, refract, and focus streams of biomaterials. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 105, 7434-7438 (2008).
- Hu, X., et al. Marker-specific sorting of rare cells using dielectrophoresis. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 102, 15757-15761 (2005).
- Cummings, E. B. Streaming dielectrophoresis for continuous-flow microfluidic devices. IEEE Eng. Med. Biol. Mag. 22, 75-84 (2003).
- Augustsson, P., Persson, J., Ekstrom, S., Ohlin, M., Laurell, T. Decomplexing biofluids using microchip based acoustophoresis. Lab Chip. 9, 810-818 (2009).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 104, 18892-18897 (2007).
- Hur, S. C., Henderson-MacLennan, N. K., McCabe, E. R. B., Di Carlo, D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. Lab Chip. 11, 912-920 (2011).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol. Bioengin. 107, 302-311 (2010).
- Gossett, D. R., et al. Inertial manipulation and transfer of microparticles across laminar fluid streams. Small. 8, 2757-2764 (2012).
- Amini, H., et al. Engineering fluid flow using sequenced microstructures. Nat. Commun. 4, 1826 (2013).
- Sollier, E., et al. Inertial microfluidic programming of microparticle-laden flows for solution transfer around cells and particles. Microfluid. Nanofluid. 19, 53-65 (2015).
- Lee, W. C., et al. Multivariate biophysical markers predictive of mesenchymal stromal cell multipotency. Proc. Natl. Acad. of Sci USA. 111, E4409-E4418 (2014).
- Hou, H. W., et al. Isolation and retrieval of circulating tumor cells using centrifugal forces. Sci. Rep. 3, 1259 (2013).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15, 2297-2307 (2015).
- Yeo, D. C., et al. Interference-free Micro/nanoparticle Cell Engineering by Use of High-Throughput Microfluidic Separation. ACS Appl. Mater. Inter. 7, 20855-20864 (2015).
- Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angew. Chem. Int. Edit. 37, 550-575 (1998).
- Lee, W. C., et al. High-throughput cell cycle synchronization using inertial forces in spiral microchannels. Lab Chip. 11, 1359-1367 (2011).
- Kuntaegowdanahalli, S. S., Bhagat, A. A., Kumar, G., Papautsky, I. Inertial microfluidics for continuous particle separation in spiral microchannels. Lab Chip. 9, 2973-2980 (2009).
